CN110734989A - 一种药用植物共生微生物鉴定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药用植物的生物信息学研究技术领域，特别涉及一种基于高通量测序，针对微生物16S rRNA基因的V3、V4区的生物信息学分析鉴定方法，包括如下步骤：采集样本，进行预处理操作；采用高通量测序的方法，获取样本中微生物16S rRNA基因的V3、V4区序列双链测序数据；借助FastQC软件筛选合格数据；借助Mothur软件对总链文件进行质控处理得到质控文件；借助Qiime软件对质控文件进行分析；借助R软件和LEfSe软件绘制可视化结果分析图表；对比结果，鉴别样本微生物。该方法通过可以快速鉴别样本微生物，从而可以进行中药材种植方式的鉴定和中药材具体作用机制的探究，进而为最大程度利用中药材的药效提供了可能，具有鉴别周期短、结果准确性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物信息学研究技术领域，特别涉及一种基于高通量测序的药用植物共生微生物鉴定方法及其应用。
背景技术
高通量测序又称为第二代测序技术，通常所采用的有Roche/454FLX、 Illummina/GenomeAnalyzer/Hiseq/Miseq，Applied Biosystems SOLID等测序平台。基于高通量测序技术的微生物16S rRNA研究方法是目前认识、分析微生物混合体系结构和功能最有效、最重要的方法之一。随着现代基因组学、蛋白质组学、代谢组学等“组学”理论的发展，***生物学视角的引入以及生物信息学的应用，通过对物种的相关RNA、16S rRNA测序数据的分析可以得到物种内代谢通路、代谢靶点以及物种间差异等相关信息，这些信息的获取带来了对植物研究的重大变革，特别是对植物中的药物研究领域带来了新的机遇。
中药药材的主要成分含量对于用药宿主的健康有着不可忽视的影响，药物的根际微生物对于药材主要成分含量的影响也不容小觑。利用高通量测序方法可以相对全面地检测微生物的物种组分，鉴别微生物对于植物中所含成分的含量及其效果，进而最大程度地对植物进行利用。
但是，现有分析方法存在分析速度慢、准确度不佳、整个分析鉴别周期较长等缺点，而且由于分析方法具有统计分析的意义，其结果不一定科学实用等。因此，有必要研究一种基于***生物学的理论、基因组学与生物信息学等理论研究的分析方法，最大限度的利用植物，特别是药用植物的活性成分。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供一种药用植物共生微生物鉴定方法，该方法通过可以快速鉴别样本微生物，在中药材应用领域，从而可以进行中药材种植方式的鉴定和中药材具体作用机制的探究，进而为最大程度利用中药材的药效提供了可能，具有鉴别周期短、结果准确性高等特点。
本发明采用以下技术方案来实现：
一种药用植物共生微生物鉴定方法，包括如下步骤：
S1，采集样本，并进行预处理操作；
S2，采用高通量测序的方法，获取样本中微生物16S rRNA基因的V3、V4区序列双链测序数据；
S3，借助FastQC软件筛选出合格的测序数据，将合格的测序数据的正向链和反向链合成得到总链文件，通过Mothur软件对总链文件进行质控处理得到质控文件；
S4，借助Qiime软件对质控文件进行分析得到微生物物种丰度表，借助R软件和LEfSe 软件绘制样本中微生物的可视化结果分析图表，通过对比分析结果来鉴别样本微生物。
优选的方案，步骤S1中，所述预处理操作的具体步骤为：采集待检测样本，根据RNA酶易变性远离，对所有样本进行液氮处理并储存于干冰盒。
优选的方案，步骤S3中，所述质控处理包括找嵌合体和去除嵌合体操作。
优选的方案，步骤S3中，所述对总链文件进行质控处理前，需要用脚本去除高通量测序中加入的接头序列，所述接头序列为：
-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
-A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT。
优选的方案，步骤S4中，借助Qiime软件对质控文件进行分析时采用“pick_de_novo_otus.py”或“pick_closed_reference_otus.py”的分析流程；作为更进一步优选的方案，借助Qiime软件对质控文件进行分析时采用“pick_closed_reference_otus.py”的分析流程
优选的方案，步骤S4中，所述借助Qiime软件对质控文件进行分析得到物种丰度表的步骤，包括通过进行OTU的聚类分析得到微生物样本的OTU表、进行微生物物种多样性分析得到α-多样性数据表和β-多样性数据表、以及进行相对丰度的分析得到相对丰度表。
优选的方案，所述微生物样本的OTU表和相对丰度表需与生物分类学名称数据进行匹配，便于R作图在属水平上分析根际与根系土壤微生物的差异，以及便于LEfSe软件进行 Biomarker的分析。
优选的方案，步骤S4中，所述可视化结果分析图表包括PCoA差异性分析图、相对丰度组成分析图和分类Biomarker分析图。
优选的方案，步骤S4中，所述对比分析结果的操作包括对比微生物的丰度组成和Biomarker。
上述的药用植物共生微生物鉴定方法在鉴定甘草根际微生物与根系土壤微生物中的应用。所述甘草为植物药材，是甘草中药制剂的主要成分，且甘草在中华人民共和国药典中有记载；甘草的根际微生物能产生次级代谢产物，对寄主植物的生长发育具有调节和促进作用已有记载；所述甘草根际微生物的药用植物共生微生物鉴定方法在目前的研究文献中未记载。
上述的药用植物共生微生物鉴定方法在鉴定甘草种植方式中的应用。所述甘草种植方式的药用植物共生微生物鉴定方法在目前的研究文献中未记载。
上述的药用植物共生微生物鉴定方法在解析中药复方治疗疾病的作用机制中的应用。所述中药复方药物的各组分在中华人民共和国药典中有记载；所述中药复方的组分及活性成分能对相应疾病产生治疗作用已有记载；所述的中药复方对于宿主的肠道菌群的改变机制及通过改变肠道菌群达到治疗作用的机制未记载。
LEfSe软件分析即LDA Effect Size软件分析，是一种用于发现和解释高维度数据生物标识(基因、通路和分类单元等)的分析工具，可以进行两个或多个分组的比较，它强调统计意义和生物相关性，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标识(Biomarker)，基于LEfSe软件可进行的Biomarker分析是本发明鉴别甘草根际微生物和根系土壤微生物必须采用的软件，其优点是：A.首先在多组样本中采用的非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种，可以得到统计学可靠的差异性结论；B.再利用Wilcoxon 秩和检验检查在显著差异物种类中的所有亚种比较是否都趋同于同一分类级别，保证差异性结论的准确性；C.最后用线性判别分析(LDA)对数据进行降维和评估差异显著的物种的影响力(即LDA score)，评估Biomarkers的辨识度和提高Biomarker的可读性。
本发明以植物，特别是药用植物作为研究对象，基于***生物学思路，利用生物信息学的理论与技术进行研究，达到最大限度利用其活性成分的作用。
本发明的有益效果是：
1、本发明的药用植物共生微生物鉴定方法，利用计算机软件进行数据处理和分析，具有速度快、准确度高等特点，整个鉴别周期短，在一个实施例中，待鉴定的甘草的根际微生物和根系土壤微生物样本共151个，数据大小为21.73GB，在23天内能完成全部数据处理及后续分析流程，与市场上相关公司的鉴定时间相比，该方法用时较短，分析深度更高。
2、本发明的药用植物共生微生物鉴定方法，通过高通量测序的方法，能够得到具有统计意义的分析数据，与传统的方法相比，更具有准确性和实用性。
3、本发明的药用植物共生微生物鉴定方法，探究根际微生物对于甘草苷、甘草酸含量的影响，从而为探究根际微生物对于甘草苷、甘草酸含量的影响，进而最大程度利用甘草的药效提供了可能。
4、本发明的药用植物共生微生物鉴定方法中，Fastq、Mothur、Qiime等计算机软件被本领域研究人员所认可，例如Nature、Science、Cell等各高影响因子期刊杂志均承认这些计算机软件的准确性和有效性，具有权威性和普遍性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是药用植物共生微生物鉴定方法的流程示意图。
图2是甘草样本的FastQC软件正链质量报告示例的部分示意图。
图3是药用植物共生微生物鉴定方法中FastQC软件和Mothur软件的流程示意图。
图4是鉴定过程中Qiime软件、R软件和LefSe软件的流程示意图。
图5是不同种植方式下甘草样本微生物相对丰度PcoA图。
图6是不同栽培方式下甘草样本属水平微生物相对丰度多样性分析。
其中，图5和图6中，CMTN为栽培三年生甘草根际微生物，CMTP为栽培一年生甘草根际微生物，CSTN为栽培三年生甘草根系土壤微生物，CSTP为栽培一年生甘草根系土壤微生物，WMWT为野生甘草根际微生物，WSWT为野生甘草根系土壤微生物，CM为栽培甘草根际微生物，CS为栽培甘草根系土壤微生物，WS为野生甘草根系土壤微生物。
图7是甘草根际微生物和根系土壤微生物的生物标志物分析，即biomarker分析。
图8是全麦饮食小鼠结肠中甜菜碱的水平，图8a中，按照小鼠的喂食成分，HF表示高脂对照饮食，R1表示天然黑麦麸，R2表示生物加工的黑麦麸，A1表示天然小麦糊粉，A4 表示磨碎和生物加工的小麦糊粉，星号，即*，表示单向方差分析的p值，即HF与所有富含麸皮饮食相比的值，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p＜0.001；图8b中，按照小鼠的喂食成分，HF表示高脂对照饮食，HFLF表示交替高脂低脂对照饮食，LF表示低脂对照饮食的小鼠盲肠内容物中微生物组成的主成分分析(PCA)，A1和A4表示富含小麦糊粉的饲料，R1和R2表示富含黑麦麸的饲料。
图9是甜菜碱化合物、饮食方式、属水平微生物之间的RDA分析，三角形的nominalenvironmental variable表示名义环境变量，圆点的sanmple表示样本，粗箭头的bacterial phylun 表示指向细菌名称，细箭头的metabolite指向代谢物名称，箭头的bran-enriched diets表述富含麸皮饮食组，箭头contral diets表示控制饮食的对照组，包括HF、HFLF和LF，其中，HF 表示高脂对照饮食组，HFLF表示交替高脂低脂对照饮食组，LF表示低脂对照饮食组。
图10是48种微生物及其与甜菜碱化合物、饮食方式相关性热图分析，其中，左图表示， HF和麸皮饮食组中小鼠盲肠内容物中微生物分类单元的相对丰度与盲肠组织中甜菜碱化合物之间的相关性，Pearson相关性，p<0.05带有圆圈；中间图表示，所有饮食组的比较， Kruskal-Wallis单向方差分析，p<0.05带有圆圈标记，和富含麸皮的治疗饮食与对照饮食之间，黑麦麸之间的微生物分类群相对丰度的倍数变化以及富含小麦糊粉的饮食，以及含有未加工和生物加工的黑麦麸或小麦糊粉的饮食之间，Mann–Whitney U检验，p<0.05带有圆圈；右图表示，每个饮食组中的标准化平均细菌丰度。
图11是C57BL/6J小鼠取食不同饮食下的盲肠菌群α多样性分析，其中，左图表示根据Shannon's指数测得的α多样性，右图表示根据Shannon's指数测得的α多样性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参考图1，一种药用植物共生微生物鉴定方法在鉴定甘草根际微生物与根系土壤微生物中的应用，采用一种药用植物共生微生物鉴定方法实现，该方法包括如下步骤：
S1，根据种植方式的不同，采集野生甘草和栽培甘草的根际样本，以及相应的根系土壤样本，并将所有样本浸泡于液氮罐中冷冻后，最终储存于干冰盒，具体操作如下：
采集盐池县高沙窝镇施记圈村的野生甘草和栽培甘草的根际样本，以下分别简称为野生样本和栽培样本，其中，野生样本25个，栽培一年生样本和栽培三年生样本各25个；以及相应的根系土壤样本，以下简称土壤样本，所述土壤样本的数量均为25个。
采集时，可以测定土壤样本的温度和pH，便于对当地土壤的理化特征进行分析。
将根际样本剪成5-10cm长度，土壤样本则装入标记好的密封袋，所有样本浸泡于液氮罐五分钟最终储存于干冰盒；
本实施例中，所述根际样本的编号及土壤样本的测试数据分别如表1、表2、表3所示，每个表格包括根际样本的编号信息以及壤样本的测试数据信息；
表1野生甘草及相应的根系土壤样本的数据信息
表2栽培一年生甘草及相应的根系土壤样本的数据信息
表3栽培三年生甘草及相应的根系土壤样本的数据信息
S2，将野生样本和栽培样本的根际样本微生物和相应的土壤样本微生物分别进行DNA 提取、扩增及基于Illuminal Miseq 300仪器的高通量测序下16S rRNA基因的V3、V4区分析，进而得知不同种植方式下根际样本和根系土壤样本的微生物组分；具体操作如下：
将野生样本、栽培样本相应的土壤样本共150个，从干冰盒取出并对其微生物分别进行 DNA提取、扩增及Illuminal Miseq 300仪器的高通量测序下16S rRNA基因的V3、V4区分析，进而得知两种种植方式下根际样本和根系土壤样本的微生物组分，例如，栽培一年生甘草土壤样本CM18TN1前十行数据如下：
@M04670:191:000000000-BVBHP:1:1101:13958:1454 1:N:0:GTTAGCGC+AGTCACGA
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@M04670:191:000000000-BVBHP:1:1101:15916:1458 1:N:0:GTTAGCGC+AGTCACGA
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+
步骤S2的操作可以委托金唯智公司进行，例如委托苏州金唯智生物科技有限公司，其中高通量测序方法选用Illuminal Miseq 300仪器进行的高通量测序的方法，包括如下步骤：1、样本准备(sample fragmentation)；2、文库构建(library preparation)；3、测序反应(sequencing reaction)；4、数据分析(data an1alysis)等步骤。
S3，借助FastQC软件对数据进行质量分析，其目的是筛选出满足分析要求的合格数据，通过本步骤的操作，能够生成网页版的数据质量分析报告，参考图2，网页版的数据质量分析报告以下简称：“报告1”，根据“报告1”的内容即可挑选出所有合格的微生物双端测序数据，以下简称：“数据1”，然后进行下一步质控分析；
本实施例中，所述“数据1”的数据量总共为150个；
S4，参考图3，将全部样本“数据1”的正向链和反向链分别合成为这两条链的总文件；
例如，可以将正向链文件命名为“A.fasta”，将反向链文件命名为“B.fasta”；
然后将“A.fasta”和“A.fasta”合并为总链文件(group文件)，例如，所述总链文件可以命名为“AB.fasta”，并用Mothur软件进行所述质控处理，所述质控处理包括找嵌合体和去除嵌合体操作；
在质控处理前需要用脚本去除高通量测序中加入的接头序列，本实施例中，所述接头序列为：
-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
-A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT。
去除嵌合体后生成总的fasta格式文件，即为质控文件，对质控文件进行加入样本编号行的操作以便下一步的数据分析；
S5，参考图4，激活Linux的Qiime环境，对去除了嵌合体的数据进行进一步分析；
包括如下几个步骤：1、对质控文件进行OTU聚类分析，得到微生物样本的OTU表；2、对质控文件进行α-多样性分析和β-多样性分析，得到α-多样性数据表和β-多样性数据表；3、在属水平对质控文件进行相对丰度组成的分析，得到相对丰度表；
在此过程中，可使用pick_de_novo_otus.py或pick_closed_reference_otus.py的分析流程，两种方法的差异在于Qiime软件对于聚类OTU的方法不同：1、“pick_de_novo_otus.py”的分析流程是对所有reads进行聚类，不支持数据并行，速度较慢，当没有相应的参考序列时必须采用该方法；2、“pick_closed_reference_otus.py”的分析流程是reads被聚类到参考序列中，没有比对上的reads被剔除，不参与后续分析，速度快，且在建树和物种注释中更准确；
本发明的药用植物共生微生物鉴定方法中，采用“pick_de_novo_otus.py”和“pick_closed_reference_otus.py”两种聚类OTU的方法均可以鉴别出甘草的种植方式。
本实施例中，采用“pick_closed_reference_otus.py”的分析流程以鉴别出甘草的种植方式；
参考图4，借助Qiime软件对质控文件进行分析得到微生物物种丰度表，借助R软件和 LEfSe软件绘制甘草样本中微生物的可视化结果分析图表，通过对比分析结果来鉴别样本微生物。
借助R软件和LEfSe软件绘制甘草根际微生物与根系土壤微生物的PCoA图、相对丰度图和Biomarker分析图等可视化结果分析图表；
部分结果参见图5和图6，通过比较丰度组成及Biomarker，得出甘草根际微生物和根系土壤微生物的差别，从而来鉴别甘草种植方式。
图中，CMTN为栽培三年生甘草根际微生物，CMTP为栽培一年生甘草根际微生物，CSTN 为栽培三年生甘草根系土壤微生物，CSTP为栽培一年生甘草根系土壤微生物，WMWT为野生甘草根际微生物，WSWT为野生甘草根系土壤微生物，CM为栽培甘草根际微生物，CS为栽培甘草根系土壤微生物，WS为野生甘草根系土壤微生物。
由图5可知，不同种植方式下甘草的根际微生物、根系土壤微生物差异性很大。
由图6可知，不同组别样本微生物相对丰度组成在属水平有很明显的差异，具体物种的名称见图注英文部分，该图总相对丰度值为0.7，剩余0.3为Other部分。
由图7可知，甘草根际微生物和根系土壤微生物(根系土壤微生物在图7中表示为土壤微生物)biomarker差异明显，LDA值(Linear Discriminant Analysis)大于3.6。
本实施例中，待鉴定的甘草的根际微生物和根系土壤微生物样本共151个，数据大小为 21.73GB，在23天内能完成全部数据处理及后续分析流程，与市场上相关公司的鉴定时间相比，该方法用时较短，分析深度更高。
实施例2
一种药用植物共生微生物鉴定方法在鉴定甘草种植方式中的应用，通过实施例1所述的方法完成，由图5～图7可知，不同种植方式下甘草的根际微生物、根系土壤微生物差异性很大，根据比对微生物丰度组成的结果完成对待测定的甘草种植方式的鉴别。
实施例3
一种药用植物共生微生物鉴定方法在解析中药复方治疗疾病的作用机制中的应用，通过如下方法实现，该方法包括以下步骤：
S1，采集中药样本、受试者基因组样本、受试者服用该中药样本前的粪便样本和受试者服用该中药样本后的粪便样本，并进行预处理操作；
所述预处理操作的具体步骤为：采集中药样本、受试者基因组样本、受试者服用该中药样本前的粪便样本和受试者服用该中药样本后的粪便样本，并将所有样本进行-60℃以下冷冻处理并保存储存于干冰盒中，所述冷冻处理的具体操作为将所有样本浸泡于液氮罐中冷冻。
S2，对中药样本进行化学分析，并查询相关资料获取该中药样本的主要活性及主治功能；
采用高通量测序的方法，获取受试者基因组样本、受试者服用该中药样本前的粪便样本和受试者服用该中药样本后的粪便样本中肠道菌群16S rRNA基因的双链测序数据；
S3，借助FastQC软件对数据进行质量分析，其目的是筛选出满足分析要求的合格数据，通过本步骤的操作，能够生成网页版的数据质量分析报告，参考图2，网页版的数据质量分析报告以下简称：“报告1”，根据“报告1”的内容即可挑选出所有合格的微生物双端测序数据，以下简称：“数据1”，然后进行下一步质控分析；
S4，参考图3，将全部样本“数据1”的正向链和反向链分别合成为这两条链的总文件；
例如，可以将正向链文件命名为“A.fasta”，将反向链文件命名为“B.fasta”；
然后将“A.fasta”和“A.fasta”合并为总链文件(group文件)，例如，所述总链文件可以命名为“AB.fasta”，并用Mothur软件进行所述质控处理，所述质控处理包括找嵌合体和去除嵌合体操作；
在质控处理前需要用脚本去除高通量测序中加入的接头序列，本实施例中，所述接头序列为：
-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
-A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTA。
去除嵌合体后生成总的fasta格式文件，即为质控文件，对质控文件进行加入样本编号行的操作以便下一步的数据分析；
S5，参考图4，激活Linux的Qiime环境，对去除了嵌合体的数据进行进一步分析；
包括如下几个步骤：1、对微生物样本数据的OTU进行聚类，得到微生物样本的OTU表； 2、对样本进行α-多样性分析和β-多样性分析，得到α-多样性数据表和β-多样性数据表；3、在属水平上微生物样本的相对丰度组成的分析，得到相对丰度表；
本实施例中，采用“pick_closed_reference_otus.py”的分析流程以鉴别出甘草的种植方式；
参考图4，借助Qiime软件对质控文件进行分析得到数据分析表，将得到的数据分析表与软件自动生成的生物分类学名称表格进行匹配后，借助R软件绘制甘草根际微生物与根系土壤微生物的PCoA图、相对丰度图和Biomarker分析图等可视化结果分析图表；
实施例4
本实施例是采用实施例3的方法，测试肠道菌群对小鼠饮食代谢的作用，不同之处在于，本实施例采用不同的饮食成分替换实施例3中的中药样本，测定参照对象为天然甜菜碱化合物的含量，测试结果表明：
图8a为全麦饮食小鼠结肠中甜菜碱的水平，其中，按照小鼠的喂食成分，HF表示高脂对照饮食，R1表示天然黑麦麸，R2表示生物加工的黑麦麸，A1表示天然小麦糊粉，A4表示磨碎和生物加工的小麦糊粉，星号(即*)表示单向方差分析的p值(即HF与所有富含麸皮饮食相比的值)，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p＜0.001。
图8b中，按照小鼠的喂食成分，HF表示高脂对照饮食，HFLF表示交替高脂低脂对照饮食，LF表示低脂对照饮食的小鼠盲肠内容物中微生物组成的主成分分析(PCA)，A1和 A4表示富含小麦糊粉的饲料，R1和R2表示富含黑麦麸的饲料。
从图8a可知，与喂食高脂饮食(HF)组小鼠相比，喂食全麦麸饮食小鼠的结肠中8种甜菜碱化合物的含量显著升高，8种甜菜碱化合物分别为5-氨基戊酸甜菜碱、丙氨酸甜菜碱、苯丙氨酸甜菜碱、哌啶酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、葫芦巴碱、色氨酸甜菜碱、缬氨酸甜菜碱；
且哌啶酸甜菜碱、苯丙氨酸甜菜碱、色氨酸甜菜碱仅在喂食全麦麸饮食小鼠的肠道中被检测出，后两种化合物仅限于喂食富含黑麦麸的饮食组中。
通过16S RNA测序分析，参考图8b，发现全麦麸饮食组(R1、R2、A1、A4)与对照组(HF、LF、HFLF)的小鼠肠道菌群组成没有显著性差异，对照组中的低脂饮食组(LF)小鼠肠道菌群构成更接近全麦麸饮食组小鼠。
参考图9、图10，RDA的分析结果表明，包括艾克曼菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、红蝽菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、毛螺旋菌属、瘤胃球菌属在内的微生物群的相对丰度在全麦麸饮食组小鼠体内更高，而另枝菌属、梭菌属、脱硫弧菌属、Mucispirillum属、Odoribacter杆菌属和理研菌属的相对丰度在对照组中更高。
与富含麦麸糊饮食组相比，富含黑麦麸的饮食导致另枝菌属、脱硫弧菌属、乳球菌属、毛螺菌科、消化球菌科细菌相对丰度显著提高。喂食加工后的小麦糊粉促使支原体属和紫单胞菌属两种细菌相对丰度提高，双歧杆菌属、毛螺菌属、乳杆菌属的相对丰度降低。而饲喂加工或未加工的黑麦麸饮食的实验组小鼠中，肠道菌群相对丰度无显著差异。
参考图11，α多样性分析的结果表明：基于小麦糊粉的A1、A4饮食组小鼠盲肠α多样性显著降低，与富含黑麦麸的R1、R2饮食组及高脂饮食组(HF)相比，对照组与富含黑麦麸饮食的实验组相比，α多样性无显著性差异。
在上述实施例1～4中，所述FastQC软件(v0.11.8)是一款基于Java的软件，它可以快速地对测序数据进行质量评估；
所述Mothur软件(v1.43.0)是一款可以配合Qiime进行OTU的聚类，并实现找嵌合体、去嵌合体的软件；
所述Qiime软件(v1.9.1)为目前微生物生物信息学数据分析领域中，最为权威且常用的数据分析软件，其功能特点包括：1、处理加工fastq格式序列文件生成OTU表；2、OTU表的处理；3、Alpha多样性分析；4、Beta多样性分析和分类学组成和丰度分析，如生成TaxaSummary图、丰度差异分析、关联性分析和核心物种分析等；
所述R软件(v3.5.3)为使用R语言对数据进行统计分析、绘图的操作环境是属于GNU ***的一个自由、免费、源代码开放的软件；
所述LEfSe软件(LDA Effect Size、v1.0.8.post1)，可以实现多个分组之间的比较，还可在进行分组比较的内部进行亚组比较分析，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种，即 Biomaker。基于LEfSe软件可进行的Biomarker分析，LEfSe软件的优点是：A.首先在多组样本中采用的非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种，可以得到统计学可靠的差异性结论；B.再利用Wilcoxon秩和检验检查在显著差异物种类中的所有亚种比较是否都趋同于同一分类级别，保证差异性结论的准确性；C.最后用线性判别分析即LDA，对数据进行降维和评估差异显著的物种的影响力，即LDA score，评估Biomarkers 的辨识度和提高Biomarker的可读性。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。
Claims (10)
1.一种药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，采集样本，并进行预处理操作；
S2，采用高通量测序的方法，获取样本中微生物16S rRNA基因的V3、V4区序列双链测序数据；
S3，借助FastQC软件筛选出合格的测序数据，将合格的测序数据的正向链和反向链合成得到总链文件，通过Mothur软件对总链文件进行质控处理得到质控文件；
S4，借助Qiime软件对质控文件进行分析得到微生物物种丰度表，借助R软件和LEfSe软件绘制样本中微生物的可视化结果分析图表，通过对比分析结果来鉴别样本微生物。
2.根据权利要求1所述的药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述预处理操作的具体步骤为：采集待检测样本，对所有样本进行液氮处理并储存于干冰盒。
3.根据权利要求1所述的药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述对总链文件进行质控处理前，需要用脚本去除高通量测序中加入的接头序列，所述接头序列为：
-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
-A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT。
4.根据权利要求1所述的药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，借助Qiime软件对质控文件进行分析时采用“pick_de_novo_otus.py”或“pick_closed_reference_otus.py”的分析流程。
5.根据权利要求1所述的药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述借助Qiime软件对质控文件进行分析得到物种丰度表的步骤，包括通过进行OTU的聚类分析得到微生物样本的OTU表、进行微生物物种多样性分析得到α-多样性数据表和β-多样性数据表、以及进行相对丰度的分析得到相对丰度表。
6.根据权利要求5所述的药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述可视化结果分析图表包括PCoA差异性分析图、相对丰度组成分析图和分类Biomarker分析图。
7.根据权利要求6所述的药用植物共生微生物鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述对比分析结果的操作包括对比微生物的丰度组成和Biomarker。
8.权利要求1～7任一项所述的药用植物共生微生物鉴定方法在鉴定甘草根际微生物与根系土壤微生物中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述的药用植物共生微生物鉴定方法在鉴定甘草种植方式中的应用。
10.权利要求1～7任一项所述的药用植物共生微生物鉴定方法在解析中药复方治疗疾病的作用机制中的应用。
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