CN110726836B - 一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条 - Google Patents

一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条，属于免疫学检测技术领域，所述试纸条顺次包括加样区、结合区和检测区，所述检测区顺次包括第1检测线、第2检测线和质控线，第1检测线包被有四环素人工抗原或诺氟沙星人工抗原，第2检测线包被有诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原，所述结合区平铺有Eu‑时间分辨荧光纳米微球标记的抗体Eu‑四环素单抗和Eu‑诺氟沙星单抗。采用定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条能够快速定量检测样品中的四环素和诺氟沙星，检测限低、灵敏度高和重复性好。

Description

一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试 纸条
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条。
背景技术
四环素(tetracycline,TC)是一类广谱抗生素，主要通过抑制细菌蛋白质合成达成抗菌效果，被广泛应用于畜禽生产中。然而，四环素容易在畜禽体内残留，通过食物链进而危害人体健康。四环素类抗生素会与骨骼中的钙离子结合，影响牙齿和骨骼的发育，同时能够引起消化道和肝肾损害，人类若大量服用，往往具有很大的风险性。四环素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、强力霉素(doxycycline,DC)等均属于四环素类药物(tetracyclines,TCs)均具有氢化骈四苯环基本结构。
诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)是第三代氟喹诺酮类药物，具有抗菌谱广、作用迅速、组织穿透力强、价格低廉等优点，广泛用于禽兽及水产养殖疾病的治疗和预防。其抑菌机制主要是抑制细菌拓扑异构酶IV和DNA螺旋酶活性，从而阻碍细菌DNA复制、转录、修复和重组，诺氟沙星具有一定的毒副作用，长期摄入含有诺氟沙星的动物源食品，会导致抗生素在人体内残留蓄积，使人体产生耐药性并影响人体健康，严重时会对食用者产生直接毒性及潜在“三致”作用(致癌、致畸、致突变)目前，诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)、洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星等为市面上主要流通的氟喹诺酮类药物。
目前，四环素和诺氟沙星药物的检测有毛细管电泳法(CE)，薄层色谱法(TLC)，气相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)，气质联用法(GC-MS)，液质联用法(LC-MS),反射性免疫法(RIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，胶体金免疫层析法(GICA)等。GC法，HPLC法涉及的检测方法灵敏度高但需要较为贵重的仪器和检测成本不能够扩大应用。ELISA法、GICA法等方法，操作较为简单便捷但稳定性差，重复性低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条，能够快速定量检测样品中的四环素和诺氟沙星。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条，顺次包括加样区、结合区和检测区，所述检测区顺次包括第1检测线、第2检测线和质控线，所述第1检测线包被有四环素人工抗原或诺氟沙星人工抗原，所述第2检测线包被有诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原，所述结合区平铺有Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的抗体Eu-四环素单抗和Eu-诺氟沙星单抗。
优选的，所述四环素人工抗原的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL；
所述四环素人工抗原的喷涂用量为1.5～2.5μL/cm。
优选的，所述抗体Eu-四环素单抗的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL；
所述抗体Eu-四环素单抗的喷涂用量为4.5～5.5μL/cm。
优选的，所述诺氟沙星人工抗原的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL。
优选的，所述诺氟沙星人工抗原的喷涂用量为1.5～2.5μL/cm；
所述抗体Eu-诺氟沙星单抗的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL。
优选的，所述抗体Eu-诺氟沙星单抗的喷涂用量为4.5～5.5μL/cm。
优选的，所述相邻两条检测线之间的距离为8～12mm。
优选的，邻近质控线的检测线与质控线的距离为8～12mm。
优选的，所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的发光物质为铕；
所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的表面基团为聚苯乙烯-羧基。
优选的，所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的粒径为90～110nm；
所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的激发光波长为340～360nm；
所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的发射光波长为610～630nm。
本发明提供了一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条，顺次包括加样区、结合区和检测区，所述检测区顺次包括第1第2检测线和质控线，第1检测线包被有四环素人工抗原或诺氟沙星人工抗原，第2检测线包被有诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原，所述结合区平铺有Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的抗体Eu-四环素单抗和Eu-诺氟沙星单抗。将待检样品液滴于加样区，在毛细层析的作用下流动至结合区上，待检样品液中若含有四环素和/或诺氟沙星，流至结合区与Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的特异抗体发生免疫反应后形成荧光复合物，随后一起迁移到检测区上，到达第1检测线时未结合的Eu-TC与第1检测线包被的人工抗原结合形成荧光复合物并富集截留于第1检测线处(样品中待测物质含量多时，第1检测线富集的荧光复合物少，荧光强度低；样品中待测物质含量少时，第1检测线富集的荧光复合物多，荧光强度高)，到达第2检测线时未结合的另一人工抗原与第2检测线包被的人工抗原结合形成荧光复合物并富集截留于第2检测线处(样品中待测物质含量多时，第2检测线富集的荧光复合物少，荧光强度低；样品中待测物质含量少时，第2检测线富集的荧光复合物多，荧光强度高)，到达质控线时Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的特异抗体与质控线包被的羊抗鼠IgG结合并富集截留于质控线处，在免疫荧光分析仪中检测获得检测结果，达到快速、定量检测的目的。
附图说明
图1为时间分辨荧光免疫层析试剂条原理图(试剂条试剂分区)；
图2为时间分辨荧光免疫层析试剂条原理图(阴性样本检测结果)；
图3为时间分辨荧光免疫层析试剂条原理图(阳性样本检测结果)；
图4为实施例4中的时间分辨荧光免疫层析试剂条四环素(TC)检测标准曲线；
图5为实施例4中的时间分辨荧光免疫层析试剂条诺氟沙星(NFLX)检测标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条，顺次包括加样区、结合区和检测区，所述检测区顺次包括第1检测线、第2检测线和质控线，第1检测线包被有四环素人工抗原或诺氟沙星人工抗原，第2检测线包被有诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原，所述结合区平铺有Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的抗体Eu-四环素单抗和Eu-诺氟沙星单抗。
在本发明中，所述抗体Eu-四环素单抗的喷涂浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；所述抗体Eu-诺氟沙星单抗的喷涂浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；在本发明中，所述抗体Eu-四环素单抗、抗体Eu-诺氟沙星单抗优选溶于抗体稀释液后再进行喷涂，所述抗体稀释液包含0.01M PBS、0.5％PVA、5％蔗糖和1％BSA；所述抗体Eu-四环素单抗和抗体Eu-诺氟沙星单抗按照体积比为1:1混合后进行喷涂，喷涂用量优选为4.5～5.5μL/cm，更优选为5μL/cm。本发明对所述抗体Eu-四环素单抗和抗体Eu-诺氟沙星单抗的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法制备即可。
在本发明中，所述四环素人工抗原的喷涂浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；所述四环素人工抗原的喷涂用量优选为1.5～2.5μL/cm；更优选为2μL/cm。在本发明中，所述四环素人工抗原优选溶于稀释液后再进行喷涂，所述稀释液包含0.01M PBS、5％蔗糖和1％BSA。本发明对所述四环素人工抗原的制备没有特殊限定，采用常规制备方法制备即可。
在本发明中，所述诺氟沙星人工抗原的喷涂浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；所述诺氟沙星人工抗原的喷涂用量优选为1.5～2.5μL/cm；更优选为2μL/cm。在本发明中，所述诺氟沙星人工抗原优选溶于稀释液后再进行喷涂，所述稀释液包含0.01MPBS、5％蔗糖和1％BSA。本发明对所述诺氟沙星人工抗原的制备没有特殊限定，采用常规制备方法制备即可。
在本发明中，所述质控线优选包被有羊抗鼠IgG，所述羊抗鼠IgG的喷涂浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；所述羊抗鼠IgG的喷涂用量优选为1.5～2.5μL/cm，更优选为2μL/cm。在本发明中，所述羊抗鼠IgG优选溶于稀释液后再进行喷涂，所述稀释液包含0.01M PBS、5％蔗糖和1％BSA。本发明对所述羊抗鼠IgG的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
在本发明中，所述相邻两条检测线之间的距离优选为8～12mm，更优选为10mm；所述邻近质控线的检测线与质控线的距离优选为8～12mm，更优选为10mm。
在本发明中，所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的发光物质优选为铕，所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的表面基团优选为聚苯乙烯-羧基；所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的粒径优选为90～110nm；所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的激发光波长优选为340～360nm；所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的发射光波长优选为610～630nm。
在本发明中，所述定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条的制备方法优选包括：
将玻璃纤维素膜浸泡于结合垫处理液中，取出干燥后，得到干燥膜，将所述Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的抗体Eu-四环素单抗和Eu-诺氟沙星单抗喷涂于干燥膜上，得到结合垫；
将玻璃纤维素膜浸泡于样品垫处理液中，取出干燥后，得到样品垫；
在硝酸纤维素膜上划第1检测线、第2检测线和1条质控线，第1检测线上包被四环素人工抗原或诺氟沙星人工抗原，第2检测线包被有诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原，在质控线上包被羊抗鼠IgG，得到检测垫；
将所述样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫顺次搭接在底板上，得到测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条。在本发明中，所述检测区优选顺次包括检测垫和吸水垫。
在本发明中，所述结合垫处理液优选包含0.1M Tris-HCl、0.1％Tween-20、0.5％PVA、5％蔗糖和1％BSA。在本发明中，所述玻璃纤维素膜浸泡于结合垫处理液中的浸泡条件优选包括：4℃下浸泡14h后过夜。在本发明中，所述干燥的时间优选为2h，所述干燥的温度优选为37℃。
在本发明中，所述玻璃纤维素膜浸泡于样品垫处理液中的条件优选包括：4℃下浸泡14h后过夜。在本发明中，所述干燥的时间优选为2h，所述干燥的温度优选为37℃。在本发明中，所述样品垫处理液优选包含0.1M Tris-HCl、0.1％Tween-20和1％BSA。
在本发明中，所述吸水垫优选为吸水纸。本发明对所述底板的材质没有特殊限定，采用常规制作试纸条使用的底板材质即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人工抗原制备：
采用了重氮法将四环素(TC)和诺氟沙星(NFLX)药物与载体蛋白进行偶联。人工抗原制备如下表1所示：
表1人工抗原
Figure BDA0002249655600000061
1.溶液配制
(a)NaOH溶液：浓度为0.2mol/L；
(b)NaNO2溶液：质量分数为1％；
(c)HCl溶液：浓度为0.2mol/L；
(d)BSA溶液：100mg BSA溶于10mL 0.01mol/L的PBS(pH为7.2-7.6)；
(e)HSA溶液：50mg HSA溶于10mL 0.01mol/L的PBS(pH为7.2-7.6)。
2.小分子偶联载体蛋白
(1)称取适量四环素(TC)和诺氟沙星(NFLX)药物溶于1mL(a)中(等摩尔量)；
(2)将500μL(b)加入至(1)中的四环素(TC)和诺氟沙星(NFLX)药物溶液中，4℃水浴预冷；
(3)将(2)中溶液避光搅拌下滴加至1.5mL(c)中，4℃水浴，反应3h；
(4)将(d)/(e)置于4℃水浴预冷；
(5)将(4)滴加至(3)，调节pH为8.0，4℃反应过夜；
(6)将(5)所得反应产物于PBS中透析72h；
(7)将透析产物分装于-20℃保存。
实施例2
抗体制备
1.动物免疫：
选取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠为免疫对象，初次免疫前每只小鼠尾静脉采血，初次免疫时腹腔注射乳化后免疫原200μL(人工抗原A加完全佐剂)；在初免后第14天、第28天以相同方法进行第二次和第三次免疫(人工抗原A加不完全佐剂)，在第三次免疫后第5天对每只小鼠进行眼眶采血取血清评估抗体效价，在第三次免疫后第七天进行加强免疫，尾静脉注射免疫原100μL，加强免疫后第3天取脾淋巴细胞和Sp2/0(5:1的混合比例)进行细胞融合，融合采用PEG法。融合完成后用HAT培养基选择性培养。
2.亚克隆：
采用有限稀释法进行亚克隆。饲养细胞铺于96孔板中，将阳性孔中的杂交瘤细胞，计数，用HT培养基稀释成3个浓度，铺96孔板，每个浓度2列，使得每孔中细胞为1个/孔、3个/孔、10个/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养7-10天，选择阳性最强的孔连续进行2-3次亚克隆，进行转孔扩大培养。
3.单抗制备
单抗制备采用了体内法即小鼠腹腔接种法，采取小鼠腹腔的腹水，获得的抗体浓度高。取10周龄的Balb/c雌性小鼠，小鼠腹腔注射500μL已灭菌的液体石蜡。杂交瘤细胞经过收集离心，腹腔注射2×106个细胞/只小鼠。约1周左右小鼠腹部明显***，用注射器针头从腹腔采腹水。
4.抗体纯化
采用了Protein G亲和层析柱进行抗体的纯化。用等体积的结合缓冲液稀释腹水，开始过柱，待样本完全流出，用适量结合缓冲液过柱，待液体完全流出用适量洗脱液过柱，同时用装有适量体积中和液的小离心管中和所接收的洗脱液，用考马斯亮蓝检测，收集蓝色较深的离心管抗体，装于透析袋中，透析3天，透析结束后检测蛋白浓度，置于-20℃保存。
所制备的抗体如下表2所示：
表2制备的抗体
Figure BDA0002249655600000071
Figure BDA0002249655600000081
实施例3
测定四环素和诺氟沙星药物残留时间分辨荧光免疫层析试剂条的Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的抗体(Eu-TC,Eu-NFLX)的制备步骤如下：
1.溶液配制
(a)MES溶液：浓度为50mmol/L，pH为6.5
(b)EDC溶液：浓度为1mg/mL
(c)海藻糖溶液：含量为40％
(d)封闭液：10g BSA溶于100mL 0.01mol/L的PBS(pH为7.2-7.6)
(e)保存液：0.1M Tris-HCl，1％BSA，40％海藻糖，pH7.5
2.荧光微球偶联抗体
(1)活化：取100μL时间分辨荧光微球加入1mL(a)溶液和100μL(b)溶液，反应30min，加入溶液(c)200μL。
(2)离心：将溶液(1)10000rpm离心20min，弃上清，沉淀用1mLPBS溶液重悬获得活化后的荧光微球溶液。
(3)偶联：将0.5mg抗体加入溶液(2)中，加入溶液(c)100μL，室温反应2.5h。
(4)离心：将溶液(3)10000rpm离心20min。
(5)封闭:将(4)所获得的沉淀用重悬于1mL溶液(d)，室温反应2.5h。
(6)保存：将溶液(5)10000rpm离心20min，弃上清，沉淀用溶液(e)重悬保存备用。
本发明涉及的测定四环素和诺氟沙星药物残留时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备步骤如下：
1配制相关溶液：
①样品垫处理液为0.1M Tris-HCl，0.1％Tween-20，1％BSA。
②结合垫处理液为：0.1M Tris-HCl，0.1％Tween-20，0.5％PVA，5％蔗糖，1％BSA。
③荧光抗原稀释液：0.01M PBS，0.5％PVA，5％蔗糖，1％BSA。
④T线、C线稀释液：0.01M PBS，5％蔗糖，1％BSA。
2.样品垫制备：将20mm宽的样品垫浸泡于样品垫处理液中，4℃条件下浸泡14小时过夜，取出后置于37℃恒温干燥箱中干燥2小时，室温干燥条件下保存。
3.结合垫制备：将10mm宽的结合垫浸泡于结合垫处理液中，4℃条件下浸泡14小时过夜，取出后置于37℃恒温干燥箱中干燥2小时，室温干燥条件下保存。用时间分辨荧光微球抗体稀释液浓度为1mg/mL喷膜于结合垫上，用量为5μL/cm。
T1线、T2线、C线划线：取30mm宽的NC膜上划T1线、T2线、C线，T1线和T2线的距离为10mm，T2线和C线的距离为10mm，T1线上包被有四环素人工抗原，T2线上包被有诺氟沙星人工抗原用稀释液调整浓度为1mg/mL，用量为2μL/cm，C线上包被有羊抗鼠IgG，用稀释液调整浓度为1mg/mL，用量为2μL/cm。
实施例4
测定食品中四环素和诺氟沙星药物残留时间分辨荧光免疫层析试剂条的性能分析
用四环素(TC)、诺氟沙星(NFLX)配置一系列浓度梯度的标准液(1号-6号)：0ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、取50μL滴加到对应检测免疫荧光试剂条上的样本窗，随后用检测仪读取T1线和T2线和C线的荧光强度，C线呈现荧光说明检测***正常，将各标准液T线荧光强度计为Fi，以0ng/mL浓度点3次荧光强度测定值的均值计为F0。
1.标准曲线：
分别将各检测线Fi/F0及对应的抗原浓度做拟合曲线。
表3试剂条系列标准液测定值
Figure BDA0002249655600000091
Figure BDA0002249655600000101
2.检测限
以试剂条检测值Fi/F0为0.9时所对应的浓度值为检测限
表4试剂条检测限(ng/mL)
项目 四环素(TC) 诺氟沙星(NFLX)
检测限 3.11 2.2
3.敏感度
以试剂条检测值Fi/F0为0.5时所对应的浓度值为敏感度
表5独立试剂条敏感度
项目 四环素(TC) 诺氟沙星(NFLX)
敏感度 16.44 13.37
4.重复性
用四环素(TC)、诺氟沙星(NFLX)配置重复性监测浓度点：40ng/mL，80ng/mL，取50μL滴加到对应检测免疫荧光试剂条上的样本窗，重复检测5次，计算Fi/F0，计算变异系数CV值。
表6各独立试剂条重复性
Figure BDA0002249655600000102
5.交叉反应性
用四环素类药物如：四环素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、强力霉素(doxycycline,DC)；喹诺酮类药物，如：诺氟沙星(norfloxacin,NFLX)、洛美沙星(lomefloxacin，LFLX)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFLX)、恩诺沙星(Enrofloxacin,EFLX)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CFLX)配置一系列浓度梯度的标准液：0ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL取50μL滴加到对应检测免疫荧光试剂条上的样本窗，随后用检测仪读取T1线、T2线，将各标准液T线荧光强度计为Fi，以0ng/mL浓度点3次荧光强度测定值的均值计为F0，以各试剂条检测值Fi/F0为0.5时所对应的浓度值为敏感度，以各试剂条对所有四环素类、喹诺酮类药物检测的敏感度的比值为交叉反应性。
表7独立试剂条对四环素类、喹诺酮类药物的交叉反应性
Figure BDA0002249655600000111
实施例5
样品添加回收率实验
动物肉类样品：取1.0g研磨后的鸡肉、猪肉、鱼肉样本于离心管中，加入4mL乙腈，涡旋振荡5min，4000rpm离心5min，取上清1.25mL，55℃下氮气吹干，加入1mL正己烷，涡旋振荡30s，加入1mLPBS涡旋振荡1min，4000rpm离心10min，取下层液相检测。
添加回收样品制备：四环素(TC)、诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)加入上述样品溶液中作为添加回收样品用于检测。
取50μL样品滴加到对应检测免疫荧光试剂条上的样本窗，随后用检测仪读取T1线，T2线将各标准液T线荧光强度计为Fi，以0ng/mL浓度点3次荧光强度测定值的均值计为F0，计算各试剂条样品检测值Fi/F0，根据标准曲线计算浓度值。添加回收样品浓度值与未添加样品浓度值差值和添加量的比值为添加回收率，各样品的添加回收率如表8所示。
表8试剂条各样品的添加回收率
Figure BDA0002249655600000112
Figure BDA0002249655600000121
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于定量测定四环素和诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试纸条，其特征在于，顺次包括加样区、结合区和检测区，所述检测区顺次包括第1检测线、第2检测线和质控线，所述第1检测线包被有四环素人工抗原或诺氟沙星人工抗原，所述第2检测线包被有诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原，所述结合区平铺有Eu-时间分辨荧光纳米微球标记的抗体Eu-四环素单抗和Eu-诺氟沙星单抗；
所述四环素人工抗原的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL；
所述四环素人工抗原的喷涂用量为1.5～2.5uL/cm；
所述诺氟沙星人工抗原的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL；
所述诺氟沙星人工抗原的喷涂用量为1.5～2.5uL/cm；
所述抗体Eu-四环素单抗的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL；
所述抗体Eu-四环素单抗的喷涂用量为4.5～5.5uL/cm；
所述Eu-诺氟沙星单抗的喷涂浓度为0.5～1.5mg/mL；
所述Eu-诺氟沙星单抗的喷涂用量为4.5～5.5uL/cm；
所述诺氟沙星人工抗原或四环素人工抗原为小分子偶联载体蛋白；
所述小分子偶联载体蛋白的制备方法为：
(1)分别称取四环素和诺氟沙星药物溶于1mL 0.2mol/LNaOH溶液中，四环素和诺氟沙星与氢氧化钠为等摩尔量；
(2)将500μL 1％NaNO2溶液加入至(1)中的四环素和诺氟沙星药物溶液中，4℃水浴预冷；
(3)将(2)中溶液避光搅拌下滴加至1.5mL的0.2mol/L HCl溶液中，4℃水浴，反应3h；
(4)将100mg BSA溶于10mL 0.01mol/L的pH为7.2～7.6的PBS，将50mg HSA溶于10mL0.01mol/L的pH为7.2～7.6的PBS中置于4℃水浴预冷；
(5)将(4)滴加至(3)，调节pH为8.0，4℃反应过夜；
(6)将(5)所得反应产物于PBS中透析72h；
(7)将透析产物分装于-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试纸条，其特征在于，相邻两条检测线之间的距离为8～12mm。
3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试纸条，其特征在于，邻近质控线的检测线与质控线的距离为8～12mm。
4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试纸条，其特征在于，所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的发光物质为铕；
所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的表面基团为聚苯乙烯-羧基。
5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试纸条，其特征在于，所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的粒径为90～110nm；
所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的激发光波长为340～360nm；所述Eu-时间分辨荧光纳米微球的发射光波长为610～630nm。
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