CN110721318B - 一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents

一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途，纳米颗粒由双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白组成，属于纳米药物载体技术领域。本发明还公开了该纳米颗粒的制备方法，首先将双硫仑溶液缓慢滴入纳米金属氧化物分散液中，持续搅拌后加入丝素蛋白溶液继续搅拌，最后加入3倍量的乙腈交联固化，旋转蒸发除去有机溶剂后冻干得到双硫仑纳米颗粒。本发明所制备的双硫仑纳米颗粒制备简单，载药量高，稳定性高，在较低剂量下即能有效抑制肿瘤细胞增殖，其抗肿瘤效果明显优于双硫仑药物，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于纳米药物载体和医药技术领域，具体是一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和在用于制备抗肿瘤治疗药物的用途。
背景技术
双硫仑(DSF)是一种由FDA批准的抗酒精中毒药物，是目前应用最多的传统戒酒药物。它能够抑制乙醛脱氢酶氧化代谢乙醛，使酒精代谢产物乙醛在体内蓄积，从而达到戒酒的目的。DSF具有较好的安全性，无明显的毒副作用。近几年来研究人员发现DSF在肿瘤研究治疗中显示出巨大的潜力，能够在体内外杀伤包括乳腺癌、直肠癌、黑色素瘤、脑胶质瘤等多种肿瘤细胞。相对于传统的化疗药物，DSF毒性低，价格低廉，应用前景广阔。但是目前DSF的剂型以口服为主，需要大量服用才能达到有效剂量，容易导致患者出现双硫仑样反应等副作用。此外，由于DSF在血液中高度不稳定，不能在肿瘤组中达到有效的治疗浓度，导致DSF在癌症治疗的临床应用中受到了极大的限制。因此，如何提高双硫仑在抗肿瘤方面的治疗效果，已经成为一个关键难题。
当前有多个研究已经证明DSF的抗癌作用是由于DSF在生理环境中代谢为二硫代氨基甲酸酯(DTC)，这个二硫二聚体是有效的金属螯合剂，并且已经有研究证实DSF的抗肿瘤活性是Cu2+或Zn2+等金属离子依赖的，DSF与金属离子一起作为抗癌药物取得了令人欣喜的进展。但是现有技术采用的铜补充剂很难直接提高药物在作用部位的铜离子浓度，导致临床上出现药物作用效果的个体差异性较大。目前有报道称可以采用共同递送金属离子以提高药物作用效果，但是其载药效率较低，特别是金属离子和双硫仑的共同递送对载体具有较高的要求。
金属纳米氧化材料，例如纳米氧化锌(ZnO)和氧化铜(CuO)已广泛应用于工业工具和化妆品等行业中，具有荧光性、压电性、吸收和散射紫外线能力。目前尚无关于纳米氧化锌或纳米氧化铜用于双硫仑药物递送的报道。但是金属纳米氧化材料具有一定的生物毒性，如何修饰其表面性质提高生物相容性至关重要。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用于抗肿瘤治疗药物的用途。
作为本发明的第一个方面，本发明提供一种双硫仑纳米颗粒，该双硫仑纳米颗粒由双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白组成,所述的纳米金属氧化物为纳米氧化锌、纳米氧化铜。
进一步设置是双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1：(0.2～5.0)：(0.5～4.0)。
进一步设置是所述双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1：(0.5～2.0)：(1.0～3.0)。
进一步设置是所述双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1：1：2。
进一步设置是所述的双硫仑纳米颗粒的粒径在50～200nm。
通过上述设置，本发明首次提出构建一种由丝素蛋白、双硫仑和纳米金属氧化物共同组成的双硫仑纳米颗粒。纳米金属氧化物在肿瘤酸性环境中可释放金属离子和活性氧，与双硫仑协同杀死肿瘤细胞。丝素蛋白的表面修饰可提高金属纳米氧化物的生物相容性，并提高双硫仑的体内外稳定性。这种有效的双硫仑给药体系在未来癌症治疗中具有潜力。本发明还公开了该纳米颗粒的制备方法，该方法简单易行，可操作性极强。目前对于将丝素蛋白、双硫仑和纳米氧化锌联用构建纳米递送体系是否能够提高双硫仑的抗肿瘤作用的研究国内外尚未见报道。
本发明的第二个方面是提供一种双硫仑纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将双硫仑用无水乙醇溶解后，配置成双硫仑溶液
(2)将双硫仑溶液缓慢滴入纳米金属氧化物分散液，持续搅拌一段时间得到混悬液；
(3)将得到的混悬液滴入丝素蛋白水溶液，继续搅拌一段时间得到混合液；
(4)在上述混合液中加入3倍量体积的乙腈充分混合搅拌，然后旋转蒸发除去有机溶剂后冻干得到双硫仑纳米颗粒。旋转蒸发除去有机试剂，
冻干除水得到的是固体粉末。
进一步设置是双硫仑在无水乙醇中的浓度为10mg/mL。
进一步设置是纳米金属氧化物分散液的浓度为1.25mg/mL～12.5mg/mL，丝素蛋白水溶液的浓度为10mg/mL～40mg/mL。纳米金属氧化物分散液的溶剂为水。
另外，本发明还提供一种抗肿瘤治疗药物，包括有所述的双硫仑纳米颗粒，所述的肿瘤为乳腺癌、肠道肿瘤、肝癌、***、卵巢癌、胃癌、脑部肿瘤、胆囊癌或血液***肿瘤。
进一步设置是还包括有药学上可接受的载体、赋形剂或药物制剂方面可接受的盐。
术语“药物制剂方面可接受的盐”意指对病人无害的盐类。这些盐类中包括药物制剂方面可接受的酸或碱的加成盐，金属盐，铵盐和烷基化铵盐，加成盐包括无机酸盐和有机酸盐。可接受的无机酸盐的代表包括盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，磷酸盐，磺酸盐，硝酸盐等类似无机酸盐类。可接受的有机酸典型例子包括甲酸，乙酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，苯甲酸，肉桂酸，柠檬酸，富马酸，甘露酸，乳酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，草酸，苦味酸，丙酮酸，水杨酸，琥珀酸，甲基磺酸，乙基磺酸，酒石酸，抗坏血酸，双羟萘酸，亚甲基双水杨酸，乙基二磺酸，葡萄糖酸，甲基顺丁烯二酸，天冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，乙二胺四乙酸，甘醇酸，对氨基苯甲酸，谷氨酸，苯磺酸，甲苯磺酸等等。药物制剂方面可接受的无机酸和有机酸加成盐包括药物制剂方面可接受的盐的更多例子在J.Pharm.Sci.1977，volume66，issue2中列举出来。金属盐的例子包括锂、钠、钾、镁盐等等。铵盐和烷基化铵盐的例子包括，铵，甲胺盐，二甲胺盐，三甲胺盐，乙胺盐，乙醇胺，二乙胺，丁基胺盐，四甲基胺盐等等。
本发明的药物组成可利用药物制剂方面可接受的载体或者赋形剂，例如那些在Remington公开的：The Science and Practice of Pharmacy，19th Edition，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995。
药物制剂方面可接受的载体包括惰性固体稀释剂或者填充剂，无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，环糊精，滑石粉，明胶，琼脂，果胶，***胶，硬脂酸镁，硬脂酸和纤维素的低级烷基醚。液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，磷脂，脂肪酸，脂肪酸胺，聚氧乙烯和水。此外，本发明的化合物可以与水或普通的有机溶剂形成溶剂化物。这样的溶剂化物也包含在本发明的范围之内。
有益效果：
本发明的纳米颗粒能够同步递送双硫仑和药物作用所必须的金属离子，有效解决传统的双硫仑制剂的瓶颈问题。
通过溶剂自组装法交联变性制备纳米颗粒，对双硫仑起到了增溶、稳定和金属离子控制释放的作用，提高了其在体内的半衰期，并有效提高了双硫仑的抗肿瘤作用。并且，整个制备过程操作简单，条件稳定，重现性良好。本发明通过大量试验发现所述双硫仑纳米颗粒对治疗恶性肿瘤效果好，毒副作用小，成本低廉。将有助于延缓病情进展恶化，还具有可操作性强，能显著降低患者及医疗机构的诊疗费用等优点。
本申请的创新机理：纳米氧化锌可以在肿瘤微环境的低pH条件下局部产生锌离子和ROS，可以协同双硫仑发挥抗肿瘤作用。双硫仑本身的抗肿瘤效果不佳，临床实验中采用铜离子补充剂的方式错开给药。在本设计中，纳米氧化锌或者纳米氧化铜，既作为双硫仑的纳米载体，通过金属络合作用提高载药量，又可以在肿瘤微环境中提供发挥抗肿瘤作用所必需的的金属离子，实现较好的抗肿瘤作用。丝素蛋白可以通过与纳米氧化锌及双硫仑的结合，修饰于双硫仑/氧化锌表面，以减少进入血液循环之后的蛋白吸附可以提高体循环时间并增加纳米载体肿瘤被动靶向作用，另外的话也可以改善普通金属纳米颗粒的生物相容性的问题。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述。
实施例双硫仑纳米颗粒的制备
制备方法参考例
蚕茧经过碳酸氢钠弱碱溶液脱胶以后，用溴化锂溶液完全溶解，在经过去离子水透析后得到再生丝素蛋白；将20mg双硫仑溶解在2mL无水乙醇中，得到10mg/mL的双硫仑溶液，将该溶液加入到6mL纳米氧化锌混悬液中，持续搅拌6小时后，缓慢滴入2mL丝素蛋白水溶液继续搅拌6小时，将所得到的混合液加入30mL的乙腈溶液，混合搅拌1小时后，旋转蒸发除去有机溶剂，冻干即得双硫仑纳米颗粒。
根据相同方法改变物料配比，获得以下实施例1-12的双硫仑纳米颗粒，并设置比例对照组1-7和替换对照组1-5。
表1双硫仑纳米颗粒处方(单位：mg)
Figure BDA0002280891530000051
Figure BDA0002280891530000061
注:*表示标注剂量的成分由括号内的成分所替代。
试验例：双硫仑纳米颗粒的粒径和表面电位
取实施例1中制备得到的双硫仑纳米颗粒，分别测定其粒径大小和包封率，结果见表2。取实施例1中制备得到的双硫仑纳米颗粒，用水分散后在室温条件下放置两周，分别测定其粒径大小和包封率，结果见表2。
表2双硫仑纳米颗粒的粒径和包封率
处方号 粒径 包封率 粒径 包封率
实施例1 92.8 89.2 102.3 88.7
实施例2 93.6 88.7 100.7 85.3
实施例3 76.6 86.4 78.3 80.1
实施例4 126.5 93.5 144.9 93.3
实施例5 104.8 90.3 110.3 88.7
实施例6 109.7 91.8 120.3 89.1
实施例7 105.2 65.3 107.2 58.7
实施例8 167.3 93.2 291.4 76.3
实施例9 122.4 95.9 198.3 80.2
实施例10 70.2 85.7 112.9 83.9
实施例11 130.6 88.1 140.1 86.4
实施例12 141.3 89.7 145.8 88.1
比例对照组1 80.7 - 87.3 -
比例对照组2 76.9 8.2 80.8 6.7
比例对照组3 350.4 76.2 400.7 47.2
比例对照组4 86.3 37.2 90.1 18.9
比例对照组5 131.6 93.1 175.3 80.2
比例对照组6 259.7 90.3 377.4 50.9
比例对照组7 124.5 91.3 133.9 90.6
替换对照组1 100.3 88.2 113.2 82.3
替换对照组2 94.2 60.4 103.2 50.9
替换对照组3 83.1 25.7 109.5 18.1
替换对照组4 109.1 80.9 183.1 63.2
替换对照组5 296.5 46.5 244.8 30.1
本发明的双硫仑纳米颗粒外观形态为球形，边缘平整光滑，粒径基本为正态分布。在本发明的实施例比例范围内(实施例1～12)，按照提供的制备方法可成功制备得到50～200nm之间的纳米粒，且具有较好的包封率(>50％)。本发明的双硫仑纳米颗粒(实施例1～12)具有良好的储存稳定性，在水中分散放置两周后，依然保持良好的纳米尺寸，并避免了活性药物的提前泄露。纳米金属氧化物可以显著提高双硫仑的包封率。丝素蛋白外部修饰可以提高双硫仑的稳定性，并避免纳米粒子聚集和药物的提前释放。
试验例：双硫仑纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用
取对数生长期的肿瘤细胞(4T1和C6)，用含10％FBS的DMEM培养液调整细胞浓度至6×104个/mL，接种于96孔细胞培养板中，100uL/孔，置于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中培养12h，然后在各孔中加入不同浓度双硫仑处方。加药后继续培养48小时后，在各孔中加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570nm处测定吸光度值，计算抑制率IC50。
表3各实验组对肿瘤细胞的杀伤作用结果
Figure BDA0002280891530000081
根据结果(表3)，本发明的双硫仑纳米颗粒具有良好的抗肿瘤效果，显著降低了IC50值。该结果表明，本发明的双硫仑纳米颗粒的抗肿瘤结果与其处方组成具有相关性，在优选的比例范围内其抗肿瘤效果更为显著。
实施例4双硫仑纳米颗粒的体内抗肿瘤作用
4.1荷瘤小鼠模型的建立
按2×106个细胞每只将对数期紫杉醇耐药细胞(MCF-7/PTX)接种于体重18-20g，周龄5-6周的雌性BABL/c裸鼠腋下。观察测量，当移植瘤长至50～100mm3后开始随机分组。分组后的第2,4,6天分别静脉注射各双硫仑制剂(10mg/kg)。给药结束两周后停止实验，脱颈椎处死小鼠并称重，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率：抑瘤率％＝[1-(给药组平均瘤重/阴性组平均瘤重)]×100％。。
4.2实验分组
实验组按照生理盐水组，双硫仑溶液组(静脉注射)，双硫仑溶液组+口服铜补充剂和双硫仑纳米颗粒处方1，2，6，12及替换对照组4和5。
4.3实验结果和结论
表4双硫仑纳米颗粒对耐药性乳腺癌小鼠移植瘤瘤重和抑瘤率结果
组别 瘤重(g) 抑瘤率(％)
生理盐水 1.54 -
双硫仑溶液组 1.39 9.74
双硫仑溶液组+口服铜补充剂 1.08 29.87
纳米氧化锌混悬液组 1.47 4.54
样品1 0.83 59.09
样品2 0.75 64.28
样品6 0.94 38.96
样品12 1.03 33.11
替换对照组4 1.24 19.48
替换对照组5 1.35 12.3
结果如表4所示。本发明中双硫仑纳米颗粒(处方1，2，6，12)的抗肿瘤效果(＞50％)明显优于双硫仑溶液组(9.74％)及双硫仑+口服铜补充剂组(29.87％)。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种双硫仑纳米颗粒，其特征在于该双硫仑纳米颗粒由双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白组成,所述的纳米金属氧化物为纳米氧化锌或纳米氧化铜；
所述双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1：1：2。
2.根据权利要求1所述的双硫仑纳米颗粒，其特征在于：所述的双硫仑纳米颗粒的粒径在50~200 nm。
3.一种如权利要求1所述的双硫仑纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将双硫仑用无水乙醇溶解后，配置成双硫仑溶液；
（2）将双硫仑溶液缓慢滴入纳米金属氧化物分散液，持续搅拌一段时间得到混悬液；
（3）将得到的混悬液滴入丝素蛋白水溶液，继续搅拌一段时间得到混合液；
（4）在上述混合液中加入3倍量体积的乙腈充分混合搅拌，然后旋转蒸发除去有机溶剂后冻干得到双硫仑纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：双硫仑溶液的浓度为10mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：纳米金属氧化物分散液的浓度为1.25mg/mL ~12.5mg/mL，丝素蛋白水溶液的浓度为10 mg/mL ~40 mg/mL。
6.一种抗肿瘤治疗药物，其特征在于：包括有权利要求1-2之一所述的双硫仑纳米颗粒，所述的肿瘤为乳腺癌、肠道肿瘤、肝癌、***、卵巢癌、胃癌、脑部肿瘤、胆囊癌或血液***肿瘤。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤治疗药物，其特征在于：还包括有药学上可接受的载体、赋形剂或药物制剂方面可接受的盐。
CN201911140858.7A 2019-11-20 2019-11-20 一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途 Active CN110721318B (zh)

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