CN110714034A

CN110714034A - 发酵生产l-赖氨酸的方法

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Publication number: CN110714034A
Application number: CN201910633604.2A
Authority: CN
Inventors: T·贝克尔; F·施耐德; G·蒂尔巴赫; K·福斯
Original assignee: Wingchuang Degusai Co Ltd
Current assignee: Wingchuang Degusai Co Ltd; Evonik Operations GmbH
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2020-01-21
Also published as: BR102019014297A2; RU2019121815A; US20200017893A1; EP3594355A1

Abstract

本发明提供了使用具有分泌L‑赖氨酸的能力的物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的细菌发酵生产L‑赖氨酸的新方法，在所述细菌的染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列特定位置处的氨基酸被不同的蛋白原氨基酸取代。

Description

发酵生产L-赖氨酸的方法

L-赖氨酸用于人类医学、制药工业、食品工业、以及特别用于动物营养。L-赖氨酸是通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株的发酵产生的。由于经济上的重要性，正在不断进行改善生产方法的工作。改善可能涉及发酵技术，例如搅拌和供应氧气，或涉及营养培养基的组合物，例如发酵过程中的糖浓度，或涉及将发酵液通过例如干燥和造粒发酵液或离子交换色谱加工成合适的产品形式，或者可能涉及微生物本身的固有性能特性。

用于改善这些微生物的性能特性的方法是那些诱变、选择和筛选突变体的方法。以这种方式获得的菌株对于抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷的，并产生L-赖氨酸。熟知的抗代谢物是L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(参见例如Tosaka et al.:Agricultural and Biological Chemistry 42(4),745-752,(1978))。

多年来，通过修饰(即增强或减弱)单个涉及L-赖氨酸生物合成的基因并研究对L-赖氨酸生产的影响，重组DNA技术的方法同样用于改善物种谷氨酸棒杆菌的产L-赖氨酸菌株。

已经分别公开了各种细菌或物种谷氨酸棒杆菌菌株的染色体的核苷酸序列，以及它们的分析。该信息可在公共可访问的数据库中获得，并可用于菌株开发目的。一个这样的数据库是NCBI(National Center for Biotechnology Information，U.S.NationalLibrary of Medicine 8600 Rockville Pike，Bethesda MD，20894USA)的GenBank数据库。

在针对生物体测序的染色体注释过程期间，通过向数据库提供信息的提供者，向鉴定的结构例如基因或编码序列提供称为locus_tag的唯一标识符。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由Ikeda and Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))描述并在EP1108790中描述。该信息可在NCBI以登录号NC_003450获得。在以登录号NC_003450公开的染色体序列中，locus_tag NCgl0458标识编码转录抗终止蛋白NusG的核苷酸序列。多肽的氨基酸序列可在标识符NP_599720.1下获得。在EP1108790中，编码序列公开于序列532(参见GenBank登录号AX120616)。

Kalinowski等人独立地描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析(Journal of Biotechnology 104(1-3)，5-25(2003))。该信息可在NCBI以登录号NC_006958获得。Locus_tag CGTRNA_RS02440标识编码转录终止/抗终止蛋白NusG的核苷酸序列。old_locus_tag名称cg0562也在本领域中使用。多肽的氨基酸序列可在标识符WP_011013678下获得。该多肽的氨基酸序列也可在登录号CAF19189下获得，其中其被描述为转录抗终止蛋白NusG。

locus_tag NCgl0458和CGTRNA_RS02440的核苷酸序列是相同的。

抗终止是一种控制细菌中RNA聚合酶的转录的机制。在抗终止期间，RNA聚合酶的活性被修饰，使得其越过转录终止子读取位于所述终止子下游的基因。

遗传学、基因组学、蛋白质组学和信息学百科全书(Springer,Dordrecht,2008；DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-4020-6754-9_978)指出：“抗终止允许RNA聚合酶忽略转录终止指令例如细菌的rho，并因此继续通过终止信号。”

细菌遗传学中已知的经典抗终止子是大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体λ(lambda)的抗终止子蛋白N。所述抗终止子蛋白N允许噬菌体基因的表达，从而允许病毒启动其裂解期。噬菌体λ的蛋白N与修饰RNA聚合酶活性所需的称为Nus(N(噬菌体λ蛋白)利用物质)因子的宿主蛋白形成复合体，以这种方式，其不再响应终止子。这些Nus因子之一分别是蛋白质或多肽NusG。大肠杆菌的EcoCyc数据库(SRI International(Stanford ResearchInstitute),Menlo Park,US,CA)在登录号EG10667下总结了由nusG基因编码的多肽：转录终止因子NusG是某些种类的Rho依赖性终止以及转录抗终止所需的。

关于转录终止和抗终止的进一步资料可以在微生物学、分子生物学或遗传学的教科书中找到，例如在Jocelyn E.Krebs,Elliot S.Goldstein and Stephen T.Kilpatrick的教科书Lewin’s Genes XII(Jones&Bartlett Learning,Burlington MA(US),2018)中。

Barreiro等人(Applied and Environmental Microbiology 67(5)，2183-2190,2001)报道了包含nusG基因的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)六基因簇的组构和转录分析。Barreiro等人称编码的多肽为抗终止子蛋白NusG。

编码NusG多肽的基因称为nusG。有关谷氨酸棒杆菌中转录信号的信息(例如nusG基因(old_locus_tag cg0562)的启动子的(一个或多个)-10区或(一个或多个)转录起始位点)可以在Pfeifer-Sancar等人(BMC Genomics 14：888(2013))或Barreiro等人中找到。

本领域将NusG多肽描述为转录抗终止子。因此，NusG多肽分别具有参与转录的多肽的活性或转录因子的活性。

本发明的目标是提供通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的细菌发酵生产L-赖氨酸的新措施。

为了实现上述目标，本发明提供了使用具有分泌L-赖氨酸能力的物种谷氨酸棒杆菌的细菌发酵生产L-赖氨酸的新方法，在所述谷氨酸棒杆菌的染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列位置210处的氨基酸含有不同于天冬酰胺的任何蛋白原氨基酸，优选天冬氨酸或谷氨酸代替天冬酰胺。

本发明进一步提供了从发酵液中制备含有所述L-赖氨酸的产物的方法。

因此，本发明提供以下内容：

一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包含以下步骤：

a)提供一种具有分泌L-赖氨酸能力的物种谷氨酸棒杆菌的细菌，在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，并且所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中位置210处的氨基酸天冬酰胺被不同的蛋白原氨基酸取代，优选被谷氨酸或天冬氨酸取代，特别优选被天冬氨酸取代，

b)在合适的条件下的合适的培养基中培养所述细菌，以及

c)在所述培养基中积累L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。

发现与未修饰的细菌相比，根据本发明的方法提供的修饰的细菌在合适的发酵条件下以关于选自以下一个或多个参数增长的方式将L-赖氨酸分泌到合适的培养基中：产物浓度(即分别为每体积或每质量单位培养基/发酵液产生的L-赖氨酸的量(例如g/l或g/kg))、产物产量(即产生的L-赖氨酸的量每碳源消耗(例如g/g或kg/kg))、产物形成率(即分别为每体积或每质量单位培养基/发酵液产生的L-赖氨酸的量和单位时间(例如g/l×h或g/kg×h))和具体产物形成率(即每单位时间产生的L-赖氨酸的量和生产者的质量单位(例如g/h×g干质量)。

明显的是，更高的产物浓度有利于产品制备，例如纯化和分离。增加的产物产量减少了所需的原料量。增加的产物形成率减少了发酵运行所需的时间，因此增加了给定发酵罐的可用性。

因此，根据本发明的方法有助于制备L-赖氨酸或含L-赖氨酸产物技术和经济方面的改善。

在一组优选实施方案中，本发明提供以下内容：

在优选的实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的位置375至1328的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat，优选gac。

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的位置375至1331的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat，优选gac。

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的位置114至1331的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat，优选gac。

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的位置114至1402的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat，优选gac。

除了位置1002处的核碱基外，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列相同。SEQ ID NO：1的位置1002处的核碱基是腺嘌呤。SEQ ID NO：3的位置1002处的核碱基是鸟嘌呤。因此，SEQ ID NO：3的位置1002至1004的核碱基是gac(天冬氨酸的密码子)。因此，SEQ ID NO：4的氨基酸序列在位置210处含有氨基酸天冬氨酸。

在另一组优选实施方案中，本发明考虑了遗传密码的简并性并提供以下内容：

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5的位置375至1328的核苷酸序列。

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5的位置375至1331的核苷酸序列。

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5的位置114至1331的核苷酸序列。

在另一优选实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5的位置114至1402的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：3的核苷酸序列相同，但具有以下例外：SEQ ID NO：5的位置995处的核碱基是胞嘧啶，产生氨基酸序列的位置207处氨基酸苯丙氨酸的密码子ttc。SEQ ID NO：5的位置998处的核碱基是胞嘧啶，产生氨基酸序列的位置208处氨基酸缬氨酸的密码子gtc。SEQ ID NO：5的位置1001处的核碱基是胞嘧啶，产生氨基酸序列的位置209处氨基酸甘氨酸的密码子ggc。SEQ ID NO：5的位置1004处的核碱基是胸腺嘧啶，产生氨基酸序列的位置210处氨基酸天冬氨酸的密码子gat。

因此，由SEQ ID NO：5的核苷酸序列位置375至1328编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列与由SEQ ID NO：3的核苷酸序列位置375至1328编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列相同。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列在位置210处含有氨基酸天冬氨酸。

本文提及的术语L-赖氨酸，特别是在产物形成的情况下，还包含它们的离子形式和盐，例如L-赖氨酸单盐酸盐或L-赖氨酸硫酸盐。

为了实施本发明，使用物种谷氨酸棒杆菌的细菌。棒状杆菌属(Corynebacterium)和该属包含的物种谷氨酸棒杆菌的描述可以在K.A.Bernard and G.Funke在Bergey'sManual of Systematics of Archaea and Bacteria(Bergey's Manual Trust,2012)中的文章“Corynebacterium”中找到。

用于本发明的方法的合适的细菌是谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株，例如从菌株ATCC13032等通过一或若干步菌株开发获得的并如本发明所描述进行修饰的L-赖氨酸分泌菌株。

菌株ATCC13032(也可以DSM20300获得)是物种谷氨酸棒杆菌的分类类型菌株。基于DNA-DNA杂交的这组细菌的分类学研究由Liebl等人完成(International Journal ofSystematic Bacteriology 41(2)，255-260,1991)。Yang and Yang(BMC Genomics 18(1)：940)提供了基于基因组序列分析的物种谷氨酸棒杆菌的各种菌株的比较分析。

在过去几十年中，从菌株例如ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869等开始，在本领域中获得了多种棒状杆菌属(Corynebacterium)(特别是物种谷氨酸棒杆菌)的L-赖氨酸分泌菌株。它们是由于菌株开发程序获得的，所述程序尤其使用方法如经典诱变、抗代谢物抗性的选择以及通过遗传工程方法对L-赖氨酸的生物合成途径的基因进行扩增和启动子修饰。总结可以在L.Eggeling and M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRCPress,2005)或H.Yukawa and M.Inui(Corynebacterium glutamicum Biology andBiotechnology,Springer Verlag,2013)或A.Yokota and M.Ikeda(Amino AcidFermentation,Springer Verlag,2017)中找到。

物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株在本领域中是广泛已知的，并且可以如本发明所描述的进行修饰。例如Blombach等人(Applied and Environmental Microbiology75(2),419-427,2009)描述了菌株DM1933，其根据布达佩斯条约以保藏号DSM25442保藏。通过菌株开发的几个步骤从ATCC13032获得菌株DM1933。此外，可以使用根据布达佩斯条约以DSM32514保藏的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株DM2031。菌株DM2031是DM1933进一步开发的衍生物，其具有增强的L-赖氨酸分泌能力。其他L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株在例如WO2008033001和EP0841395中描述。

物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株通常含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸。反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体是指当与野生形式的酶(其包含在野生菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中)比较时，分别对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如各自10mM)或L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mMS-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)的抑制较不敏感或脱敏的天冬氨酸激酶。天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体的谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的描述例如在US5688671、US6844176和US6893848中给出。总结列表尤其可以在WO2009141330中找到。本领域中用于编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号是lysC。在基因编码反馈抗性多肽变体的情况下，本领域通常使用符号如lysC^fbr，其中fbr表示反馈抗性。

因此，如本发明所描述的修饰的物种谷氨酸棒杆菌的所述L-赖氨酸分泌菌株优选含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的多核苷酸的至少(≥)一个拷贝。

SEQ ID NO：7显示了菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列，并且SEQ ID NO：8显示了所编码多肽的氨基酸序列。本领域已知(参见US6893848)，用Ile交换SEQ ID NO：8的位置311处的氨基酸Thr赋予酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制的反馈抗性。

因此，优选所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在位置311处含有异亮氨酸的SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

通过交换SEQ ID NO：7的位置932处的核碱基胞嘧啶(c)以得到胸腺嘧啶(t)，可以实现所述氨基酸交换。因此，苏氨酸的密码子acc被改变为异亮氨酸的密码子atc。

本领域进一步已知，用atg交换天冬氨酸激酶多肽的编码序列的起始密码子gtg增强所述多肽的表达(参见例如EP2796555)。

因此，优选编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的序列以起始密码子atg开始。

关于谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株育种的总结尤其可以在L.Eggeling andM.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)，V.F.Wendisch(Amino Acid Biosynthesis–Pathways,Regulation and Metabolic Engineering,Springer Verlag,2007)，H.Yukawa and M.Inui(Corynebacterium glutamicum Biologyand Biotechnolgy，Springer Verlag，2013)，以及Eggeling and Bott(AppliedMicrobiology and Biotechnology 99(9),3387-3394,2015)中找到。

术语DSM表示位于德国不伦瑞克(Braunschweig,Germany)的保藏单位德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen)。术语ATCC表示位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯(Manasass,Virginia,US)的保藏单位美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。

关于存在于活的物体例如细菌如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)中的多核苷酸和多肽的生物化学和化学结构的细节，尤其可以在例如Berg等人的教科书“Biochemie”(Spektrum Akademischer VerlagHeidelberg,Berlin,Germany,2003；ISBN 3-8274-1303-6)中找到。

由含有核碱基或各个腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)碱基的脱氧核糖核苷酸单体组成的多核苷酸，被称为脱氧核糖多核苷酸或脱氧核糖核酸(DNA)。由含有核碱基或各个腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)碱基的核糖核苷酸单体组成的多核苷酸，被称为核糖多核苷酸或核糖核酸(RNA)。所述多核苷酸中的单体通过3',5'-磷酸二酯键彼此共价连接。按照惯例，单链多核苷酸从5'至3'方向书写。因此，多核苷酸具有5'-端和3'-端。多核苷酸中核苷酸单体的顺序通常称为核苷酸序列。因此，多核苷酸的特征在于其核苷酸序列。出于本发明的目的，优选脱氧核糖多核苷酸。在细菌例如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌中，DNA通常以双链形式存在。因此，DNA分子的长度通常以碱基对(bp)给出。编码具体多肽的核苷酸序列称为编码序列(cds)。用于翻译的指定氨基酸或终止信号的核苷酸三联体称为密码子。指定不同氨基酸的密码子是本领域熟知的。

从化学观点来看，基因是多核苷酸，优选脱氧核糖多核苷酸。

DNA可以通过亚磷酰胺方法从头合成(McBride and Caruthers：TetrahedonLetters 24(3)245-248(1983))。关于从头DNA合成的总结可以在Kosuri and Chruch的综述文章(Nature Methods 11(5)，499-507(2014))或在P.Fu and S.Panke的书“SystemsBiology and Synthetic Biology”(John Wiley，US，2009，pp 411-438)中Graf等人的文章中找到。

术语基因是指包含编码具体多肽的核苷酸序列(编码序列)和相邻终止密码子的多核苷酸。在更广泛的意义上，该术语包括编码序列之前和之后的调节序列。之前的序列位于编码序列的5'端，也称为上游序列。启动子是位于编码序列5'的调节序列的实例。编码序列之后的序列位于其3'端，也称为下游序列。转录终止子是位于编码序列3'的调节序列的实例。

多肽由通过肽键连接的L-氨基酸单体组成。对于L-氨基酸的缩写，使用IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)的单字母代码和三字母代码。由于多肽生物合成的性质，多肽具有氨基末端和羧基末端，也称为N-末端和C-末端。多肽中L-氨基酸或L-氨基酸残基各自的顺序通常称为氨基酸序列。多肽也称为蛋白质。

此外，本领域已知编码序列的起始密码子(start codon)或起始密码子(initiation codon)gtg以及atg分别编码氨基酸甲硫氨酸。本领域已知所编码多肽的N-末端氨基酸甲硫氨酸可在翻译期间或之后被氨肽酶除去(Jocelyn E.Krebs，ElliottS.Goldstein and Stephan T.Kilpatrick：Lewin's Genes X，Jones and BartlettPublishers，US，2011)。WO0202778描述了对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的苹果酸脱氢酶进行分离、纯化和N-末端测序。

蛋白原L-氨基酸应理解为指天然蛋白质(即微生物、植物、动物和人类的蛋白质)中存在的L-氨基酸。蛋白原L-氨基酸包含L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸，在某些情况下包含L-硒代半胱氨酸和L-吡咯赖氨酸。在本领域中通常提到这些蛋白原L-氨基酸而不暗示L-氨基酸的α碳原子上的L构型；例如L-天冬酰胺可以简单地称为天冬酰胺，L-天冬氨酸可以简称为天冬氨酸等。

关于多核苷酸的处理和实验工作的教导和信息尤其可以在J.Sambrook等人的手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，C.R.Newton and A.Graham的教科书(PCR，Spektrum Akademischer Verlag，1994)和D.Rickwood and B.D.Hames的手册(Gel electrophoresis of nucleic acids,apractical approach,IRL Press,1982)中找到。

对于多核苷酸和多肽的序列分析，可以使用例如序列比对Clustal W程序(Larkin等人：Clustal W and Clustal X version 2.0.In:Bioinformatics 23,2947-2948(2007))或公共软件如CLC Genomics Workbench(Qiagen，Hilden，Germany)或由EuropeanBioinformatics Institute(EMBL-EBI，Hinxton，UK)提供的程序MUSCLE。

谷氨酸棒杆菌，特别是菌株ATCC13032和在菌株开发程序期间由其获得的L-赖氨酸分泌菌株，在它们的染色体中含有(特别是一个)编码具有转录因子(在本领域中也称为转录抗终止子)活性并且包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的基因。编码序列显示于SEQ ID NO：1的位置375至1328。编码序列可含有不改变NusG多肽的氨基酸序列的沉默突变。该情况在本领域也称为遗传密码的简并性。在序列表中描述了启动子和本领域中描述的指示终止子的茎-环结构。

在本发明的工作期间，发现与未修饰的细菌相比，通过用不同的蛋白原氨基酸(优选天冬氨酸或谷氨酸，特别优选天冬氨酸)交换SEQ ID NO：2所示的NusG多肽的编码氨基酸序列的位置210处的氨基酸天冬酰胺来修饰物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌，增加了它们在发酵过程中分泌L-赖氨酸的能力。

本领域技术人员知道如何在谷氨酸棒杆菌中实现所述修饰的许多诱变方法。

根据本发明的突变细菌可以使用诱变物质(例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍或紫外光)通过对谷氨酸棒杆菌菌株的细胞群进行的经典体内诱变来获得。

可以使用选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的引物通过PCR扩增nusG基因内包含诱变位点的核苷酸序列。通过对PCR产物测序，鉴定出所需的突变体。关于该方法的细节尤其可以在US7754446中找到。与FRET杂交探针组合的实时PCR也可用于突变检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。Cyril D S Mamotte(The Clinical Biochemist Reviews 27,63-75(2006))综述了使用该方法鉴定单核苷酸取代。关于该方法的进一步总结可以在Jocelyn E.Krebs,Elliott S.Goldstein and Stephan T.Kilpatrick的教科书Lewin'sGenes XII(Jones and Bartlett Publishers，US，2018)或本领域其他地方找到。

另一种诱变方法是Jiang等人描述的CRISPR-Cpf1辅助基因组编辑(NatureCommunications|8:15179|DOI:10.1038/ncomms15179)或Cho等人(MetabolicEngineering,2017Jul；42:157-167.doi:10.1016/j.ymben.2017.06.010.)、Peng等人(Microbial Cell Factories,2017 Nov 14；16(1):201.doi:10.1186/s12934-017-0814-6.)和Liu等人(Microbial Cell Factories,2017Nov 16；16(1):205.doi:10.1186/s12934-017-0815-5.)描述的CRISPR-Cas9辅助基因组编辑。

另一种突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是Schwarzer and Pühler描述的基因置换方法(Bio/Technology 9,84-87(1991))，并由等人进一步阐述(Gene 145,69-73(1994))。

Peters-Wendisch等人(Microbiology 144,915-927(1998))使用基因置换方法失活谷氨酸棒杆菌编码丙酮酸羧化酶的pyc基因。在US7585650中，将该方法应用于zwf基因以实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的氨基酸序列的位置321处的氨基酸交换。在US7754446中，将该方法应用于rel基因以实现GTP-焦磷酸激酶多肽的氨基酸序列的位置38处的氨基酸交换。

在基因置换方法中，通过包含所讨论基因的核苷酸序列或其含有突变的部分的分离的多核苷酸提供突变，例如缺失、***或取代至少一个核碱基。

在本发明的情况中，所讨论基因的核苷酸序列是nusG基因。

在本发明的情况中，突变是取代位于指定NusG多肽的编码氨基酸序列(参见SEQID NO：1和SEQ ID NO：2)的位置210处的氨基酸天冬酰胺的密码子中的至少一个核碱基。

作为所述突变的结果，密码子指定了与天冬酰胺不同的蛋白原氨基酸，优选天冬氨酸或谷氨酸，特别优选天冬氨酸。指定天冬氨酸的密码子是gac或gat。优选密码子gac。

位置210处的氨基酸的密码子在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中具有位置1002至1004。位置1002至1004的核苷酸序列，特别是位置1002处的核苷酸，也可称为突变位点。

所讨论基因的突变的核苷酸序列或其含有突变的部分包含i)突变位点5'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为5'-侧翼序列或上游序列，ii)突变位点3'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为3'-侧翼序列或下游序列，和iii)i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。

同源重组所需的所述5'-侧翼序列和3'-侧翼序列通常具有至少200bp、至少400bp、至少600bp或至少800bp的长度。最大长度通常为1000bp、1500bp或2000bp。

在本发明的情况中，突变的核苷酸序列的实例包含SEQ ID NO：1中位置114至1402所示的核苷酸序列，其中鸟嘌呤位于位置1002，或者包含SEQ ID NO：3中位置114至1402所示的核苷酸序列。

在本发明的情况中，突变的核苷酸序列的另一个实例分别包含SEQ ID NO：1中位置205至1802所示的核苷酸序列，其中鸟嘌呤位于位置1002，或者包含SEQ ID NO：3中位置205至1802所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9的位置8至1605的核苷酸序列与SEQ ID NO：3的位置205至1802的核苷酸序列相同。SEQ ID NO：9在5'端和3'端含有用于克隆目的的限制性内切核酸酶XbaI的识别位点。

所述5'-侧翼序列由SEQ ID NO：9的位置8至804的核苷酸序列组成。3'-侧翼序列由SEQ ID NO：9的位置806-1605的核苷酸序列组成。突变位点位于SEQ ID NO:9的位置805。

将提供的突变的核苷酸序列克隆到不能在谷氨酸棒杆菌中自主复制的质粒载体(例如

等人(Gene 145,69-73(1994)所描述的pK18mobsacB)中。随后通过使用电穿孔的转化或接合将包含所述突变的核苷酸序列的所述质粒载体转移到所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。在两个同源重组事件(包含由质粒载体与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列提供的5'-侧翼序列内的重组事件，和由质粒载体与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列提供的3'-侧翼序列内的重组事件，其中一个影响所述质粒载体的整合，一个影响所述质粒载体的切除)之后，该突变掺入谷氨酸棒杆菌染色体中。因此，包含在所述所需菌株的染色体中的所讨论基因的核苷酸序列被突变的核苷酸序列置换。然后确认所需菌株中突变的存在，例如，通过如上所述的核苷酸序列分析或使用FRET的实时PCR。

同源重组事件也可称为交换(crossing over)。

优选本发明的方法提供的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株在合适的条件下在合适的培养基中具有分泌≥0.25g/l，优选≥0.5g/l，特别优选≥1.0g/l，非常特别优选≥2.0g/l的L-赖氨酸的能力。

在根据本发明的发酵方法中，根据本发明修饰并具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌在合适的条件下在合适的培养基中培养。由于所述分泌所述L-赖氨酸的能力，L-赖氨酸的浓度在发酵方法过程中在培养基中增加并积累，因此生产L-赖氨酸。

发酵方法可以是不连续方法如分批方法或补料分批方法或连续方法。关于发酵方法的一般性质的总结可在H.Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik，SpektrumAkademischer Verlag，2011)，C.Ratledge and B.Kristiansen的教科书(BasicBiotechnology，Cambridge University Press，2006)或在V.C.Hass and R.

的教科书(Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag,2011)中找到。

用于通过发酵方法生产L-赖氨酸的合适培养基含有碳源、氮源、磷源、无机离子和其他所需的有机化合物。

合适的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖以及相应的原料如淀粉水解产物、糖蜜或高果糖玉米糖浆。

可以使用有机含氮化合物如蛋白胨、肉提取物、大豆水解产物或尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨气或氨水作为氮源。

可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。

无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其它微量元素等，以硫酸、磷酸或盐酸的盐提供。

其他有机化合物是指必需生长因子如维生素，例如硫胺素或生物素或L-氨基酸例如L-高丝氨酸。

培养基组分可以以单批的形式加入培养物中，或在培养过程中以合适的方式补料。

在发酵方法过程中，培养物的pH可以以合适的方式通过使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。通常将pH的值调节至6.0至8.5，优选6.5至8.0。为了控制发泡，可以使用消泡剂，例如聚乙二醇脂肪酸酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，例如抗生素。发酵方法优选在需氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。在适当的情况下，在升高的压力(例如在0.03-0.2MPa的升高的压力)进行发酵方法。培养物温度通常为25℃至40℃，优选30℃至37℃。在不连续方法中，继续培养直至形成足以回收的L-赖氨酸的量。然后完成培养。这个目标通常在10小时到160小时内完成。在连续方法中，更长的培养时间是可能的。

合适的培养基和培养条件的实例尤其可以在L.Egegeling and M.Bott(Handbookof Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)和专利文献US5770409、US5990350、US5275940、US5763230和US6025169中找到。

因此，发酵方法产生含有所需L-赖氨酸的发酵液。

然后将含有L-赖氨酸的产物从发酵液中以液体或固体形式回收或制备。

“发酵液”是指培养基，在其中培养本发明所述的谷氨酸棒杆菌一定时间并在某些条件下培养。

当发酵方法完成时，所得的发酵液因此包含：

a)本发明的谷氨酸棒杆菌的生物质(细胞质量)，所述生物质是由于所述谷氨酸棒杆菌的细胞的繁殖而产生的，

b)在发酵方法过程中积累的所需L-赖氨酸，

c)在发酵方法过程中积累的有机副产物，和

d)在发酵方法中所使用的培养基未被消耗的组分。

除了产生L-赖氨酸外，有机副产物包括在发酵方法过程中可由本发明的谷氨酸棒杆菌形成的化合物。

从培养容器或发酵罐中移出发酵液，在适当时收集，并用于提供液体或固体形式的含有L-赖氨酸的产物。表述“回收含L-赖氨酸的产物”也用于此。在最简单的情况下，已从发酵罐中移出的含L-赖氨酸的发酵液本身构成回收的产物。

随后可以对发酵液进行一种或多种选自下组的措施：

a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除水，

b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除生物质，任选地后者在去除前失活，

c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除在发酵方法过程中形成的有机副产物，和

d)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％，≥99.3％，≥99.7％)分别去除在发酵方法中未被消耗掉的所使用培养基的残余组分或残余输入材料。

本领域可获得关于措施a)、b)、c)和d)的大量技术指导。

除去水(措施a))尤其可以通过蒸发(例如使用降膜蒸发器)、通过反渗透或纳滤来实现。由此获得的浓缩物可以通过喷雾干燥或喷雾造粒进一步处理。同样可以使用喷雾干燥或喷雾造粒直接干燥发酵液。

因此，根据本发明的方法包含从所述发酵液中提取或基本上消除水。特别地从发酵液中提取至少40％(w/w)、优选至少90％(w/w)、更优选至少95％(w/w)的水。

除去生物质(措施b))尤其可以通过离心、过滤或倾析或其组合来实现。

除去有机副产物(措施c))或除去培养基的残余组分(措施d)尤其可以通过色谱(例如离子交换色谱)、用活性炭处理或结晶来实现。如果培养基的有机副产物或残余组分以固体存在于发酵液中，则可通过措施b)除去它们。

因此，根据本发明的L-赖氨酸产物的制备包含纯化步骤，优选选自离子交换色谱、用活性炭处理或结晶。

因此可获得例如含有L-赖氨酸×HCl的产物，优选含有≥80％L-赖氨酸×HCl，特别优选≥90％L-赖氨酸×HCl或≥95％L-赖氨酸×HCl。

关于分离、纯化和造粒方法的一般说明尤其可以在R.Ghosh的书“Principles ofBioseperation Engineering”(World Scientific Publishing，2006)，F.J.Dechow的书“Seperation and Purification Techniques in Biotechnology”(Noyes Publications,1989)，Shaeiwitz等人的文章“Bioseparation”(Ullmann's Encyclopedia of IndustrialChemistry，Wiley-VCH，2012)和P.Serno等人的书“Granulieren”(Editio Cantor Verlag，2007)中找到。

L-赖氨酸产物的下游加工方案可以在R.Kelle等人的文章“L-lysineProduction”(L.Eggeling and M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRCPress,2005))中找到。US5279744教导了通过离子交换色谱制备纯化的L-赖氨酸产物。US5431933教导了干燥L-氨基酸产物(例如L-赖氨酸产物)的制备，其含有发酵液的大部分构成。

因此，实现了L-赖氨酸的浓缩或纯化，并提供了具有所需所述L-赖氨酸含量的产物。

可以通过利用离子交换色谱，优选阳离子交换色谱分离L-赖氨酸来进行L-赖氨酸的分析以测定其在发酵过程中的一个或多个时间的浓度，随后使用茚三酮进行柱后衍生来进行，如Spackman等人所述(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生。关于离子交换色谱的概述文章可以在Pickering(LC.GC(Magazine of Chromatographic Science 7(6)：484-487(1989))中找到。同样可以进行柱前衍生，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，并可以通过反相色谱法(RP)(优选以高效液相色谱法(HPLC)的形式)分馏所得的氨基酸衍生物。这种类型的方法描述于例如Lindroth等人(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))。通过光度测定(吸收，荧光)进行检测。关于氨基酸分析的综述尤其可以在Lottspeich and Zorbas的教科书“Bioanalytik”(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany 1998)中找到。

实验部分

A)材料和方法

本文简要描述了所用的分子生物学试剂盒、引物和化学品以及所应用方法的一些细节。

1.抗生素和化学品

a.卡那霉素：来自Sigma Aldrich的卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)的卡那霉素溶液(St.Louis，USA，目录号K0254)。

b.萘啶酮酸：来自Sigma Aldrich的萘啶酮酸钠盐(St.Louis，USA，目录号N4382)。

c如果没有另外说明，则所有化学品均是购自Merck(Darmstadt，Germany)，SigmaAldrich(St.Louis，USA)或Carl-Roth(Karlsruhe，Germany)的分析纯。

2.培养

如果没有另外说明，则所有培养/孵育程序如下进行：

a.来自Merck的LB培养液(MILLER)(Darmstadt,Germany；目录号110285)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/含有3个挡板的100mlErlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中以37℃和200rpm孵育。

b.来自Merck的LB琼脂(MILLER)(Darmstadt,Germany目录号110283)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。将琼脂平板于37℃在来自VWR(Radnor，USA)的INCU-

小型培养箱中孵育。

c.来自Merck的脑心浸液培养液(BHI)(Darmstadt,Germany；目录号110493)用于在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中以33℃和200rpm孵育。

d.来自Merck的脑心琼脂(BHI-琼脂)(Darmstadt,Germany；目录号113825)用于在琼脂平板上培养谷氨酸棒杆菌菌株。将琼脂平板于33℃在来自Heraeus Instruments的具有温度控制器(Hanau，Germany)的培养箱中孵育。

3.测定光密度

a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，Germany)的BioPhotometer在600nm(OD600)测定摇瓶培养物中细菌悬浮液的光密度。

b.使用来自Tecan Group AG(

Switzerland)的GENios^TM读板仪在660nm(OD660)测定Wouter Duetz(WDS)微发酵***(24孔板)中产生的细菌悬浮液的光密度。

4.离心

a.台式离心机离心体积达2ml的反应管

使用Eppendorf 5417R离心机，使用1ml或2ml反应管(例如Eppendorf

3810X)使最大体积为2ml的细菌悬浮液沉淀(以13,000rpm离心5分钟)。

b.台式离心机离心体积达50ml的管

使用Eppendorf 5810R离心机，使用15ml或50ml离心管(例如Falcon^TM50ml锥形离心管)，以4000rpm离心10分钟，使最大体积为50ml的细菌悬浮液沉淀。

5.使用FRET检测突变

给定突变(例如核碱基交换)的存在通过实时PCR联用FRET杂交探针检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。使用来自Roche

的Lightcycler作为实时PCR仪器(见下文)。

这种方法被例如M.J.Lay and C.T.Wittwer(Clinical Chemistry 42(12),2262-2267(1997))用于因子V Leiden的基因型分型。Cyril DS Mamotte(The ClinicalBiochemist Reviews 27,63-75(2006)综述了使用这种方法进行单核苷酸取代的基因型分型。关于这种方法的总结可以在Jocelyn E.Krebs，Elliott S.Goldstein and StephanT.Kilpatrick的教科书Lewin's Genes XII(Jones and Bartlett Publishers，US，2018)，W.Edward Highsmith的Molecular Diagnostics,12Tests that changed everything(Humana Press，Springer，New York，2014)或本领域其他地方找到。

FRET杂交供体探针用荧光染料荧光素标记，受体探针用荧光染料LC-Red640标记。实质上，检测方法包括三个步骤：菌落PCR，探针杂交和随后的解链曲线分析。该方法在此简称为实时PCR。

a.引物和探针

使用的寡核苷酸由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，Germany)合成。

b.模板

使用菌落中含有的总DNA作为PCR模板。它是通过用牙签从琼脂平板上的菌落挑取细胞材料并将细胞材料直接放入PCR反应管中来制备的。将细胞材料在来自SEVERINGmbH(Sundern，Germany)的微波炉型号Mikrowave&Grill中用800W加热10秒，然后将PCR试剂加入到PCR反应管中的模板中。

b.反应混合物

来自Qiagen的Type-Fast SNP探针PCR试剂盒(Type-it Kit)(Hilden，Germany，目录号206045)用于实时检测突变。因此，将2.5μl的Qiagen Fast SNP Puffer(2x)与0.5μl的每种LC-PCR-引物[10μM]和0.5μl的每种以1：500稀释的受体和供体探针[100pmol/μl]混合获得实时PCR的mastermix。

表1：使用Light

(步骤1-3)和解链曲线分析(步骤4-6)进行PCR的热循环条件。

c.PCR循环仪

反应在Light

2.0仪器中进行，并用Roche Diagnostics(Rotkreuz，Switzerland)的Light

软件4.1分析。

6.大肠杆菌的化学转化

大肠杆菌K-12菌株S17-1用作结合转移基于pK18mobsacB的质粒的供体，从大肠杆菌到谷氨酸棒杆菌。Simon,R.等人描述了菌株S17-1(Bio/Technology 1,784-794,1983)。它可从美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC47055获得。

化学感受态大肠杆菌S17-1细胞如下制备：用100μl菌株S17-1的细菌悬浮液接种10ml LB培养基(10ml液体培养基/含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)的预培养物，并将培养物在37℃和250rpm孵育过夜约18小时。用300μl预培养物接种主培养物(含有3个挡板的250ml Erlenmeyer烧瓶中含有的70ml LB)，并在37℃孵育至OD600为0.5-0.8。将培养物以4℃和4000rpm离心6分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于20ml无菌冰冷的50mMCaCl₂溶液中并在冰上孵育30分钟。在另一次离心步骤后，将沉淀重悬于5ml冰冷的50mMCaCl₂溶液中并将悬浮液在冰上孵育30分钟。然后将细胞悬浮液用85％(v/v)无菌冰冷甘油调节至终浓度为20％甘油(v/v)。将悬浮液分成50μl等分试样并储存在-80℃。

为了转化S17-1细胞，使用根据Tang等人的方案(Nucleic Acids Res.22(14),2857-2858,1994)，并热休克45秒。

7.谷氨酸棒杆菌的接合

等人描述的pK18mobsacB质粒***(Gene 145,69-73,1994)用于将所需的DNA片段整合到谷氨酸棒杆菌的染色体中。

等人的修饰的接合方法(Journal ofBacteriology 172,1663-1666,1990)用于将各个质粒转移到所需的谷氨酸棒杆菌受体菌株中。

谷氨酸棒杆菌菌株的液体培养物在BHI培养基中于33℃进行。热休克在48.5℃进行9分钟。通过将接合批次铺板在EM8琼脂(表2)上来选择转接合子，所述EM8琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将EM8琼脂平板在33℃孵育72小时。

表2：EM8琼脂的成分

使用无菌牙签将转接合子转移到BHI琼脂上，该琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将琼脂平板在33℃孵育20小时。然后将以这种方式产生的各个转接合子的培养物在33℃于含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中含有的10ml BHI培养基中进一步繁殖24小时。从适当稀释的液体培养物中取出等分试样并在补充有10％蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将琼脂平板在33℃孵育48小时。然后检查在含蔗糖琼脂平板上生长的菌落的表型卡那霉素敏感性。为此，使用牙签从菌落中移出细胞材料并将其转移到含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上，以及转移到含有10％蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃孵育60小时。利用实时PCR，检查证明对卡那霉素敏感并对蔗糖具有抗性的克隆中所需DNA片段的整合。

8.大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油原液

为了大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的长时间储存，制备甘油原液。将选择的大肠杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养。将选择的谷氨酸棒杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的2倍浓缩BHI培养基中培养。用50mg/l卡那霉素补充含质粒的大肠杆菌菌株的培养物。用25mg/l卡那霉素补充含质粒的谷氨酸棒杆菌菌株的培养物。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用取自菌落的一环细胞接种，且培养物在大肠杆菌的情况下在37℃和200rpm孵育约18小时，在谷氨酸棒杆菌的情况下在33℃和200rpm孵育约18小时。在所述孵育期后，向培养物中加入1.2ml 85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含甘油的细胞悬浮液等分成2ml部分，并储存在-80℃。

9.根据Wouter Duetz(WDS)的培养***

根据Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升级培养***用于研究构建的谷氨酸棒杆菌菌株的性能。为此目的，使用来自EnzyScreen BV的24深孔微孔板(24孔WDS板)(Heemstede,Netherlands；目录号CR1424)，其填充有2.5mL培养基。

菌株的预培养物在10ml的2倍浓缩BHI培养基中进行。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用100μl甘油原液培养物接种，并将培养物在33℃和200rpm孵育24小时。

在所述孵育期后，测定预培养物的光密度OD600。

通过用预培养物的等分式样接种24孔WDS板的含2.5ml培养基的孔使得光密度OD600为0.1来制作主培养物。

使用如Keilhauer等人描述的主培养物CGXII培养基(J.Bacteriol.1993Sep；175(17)：5595-5603)的培养基。为方便起见，CGXII培养基的成分如表3所示。

表3：Keilhauer的CGXII培养基的成分。

组分	浓度(g/l)
		MOPS(3-(N-***啉)丙磺酸)	42
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	20
		尿素	5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1
		K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	1
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.25
		CaCl<sub>2</sub>	0.01
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.01
		MnSO<sub>4</sub>H<sub>2</sub>O	0.01
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.001
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.0002
NiCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O	0.00002
		生物素(无菌过滤)	0.0002
原儿茶酸(无菌过滤)	0.03
		碳源(无菌过滤)	根据需要
用NaOH调节pH至7

将这些主培养物在来自Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HTMultitron标准培养箱摇床中于33℃和300rpm孵育约45小时，直至完全消耗葡萄糖。

用来自LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany)的血糖仪OneTouch

分析悬浮液中的葡萄糖浓度。

培养后，将培养物悬浮液转移到深孔微孔板中。适当稀释一部分培养物悬浮液以测量OD600。将培养物的另一部分离心，并分析上清液中的L-氨基酸，特别是L-赖氨酸和残余葡萄糖的浓度。

10.氨基酸分析仪

使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，Germany)的SYKAM S433氨基酸分析仪，通过离子交换色谱测定培养物上清液中的L-赖氨酸和其他L-氨基酸(例如L-缬氨酸)的浓度。使用来自SYKAM的具有球形聚苯乙烯基阳离子交换剂(Peek LCA N04/Na，尺寸150×4.6mm)的柱作为固相。取决于L-氨基酸，使用用于洗脱的缓冲剂A和B的混合物进行等度运行以进行分离，或使用所述缓冲剂通过梯度洗脱进行分离。使用20l含有263g柠檬酸三钠、120g柠檬酸、1100ml甲醇，100ml 37％HCl和2ml辛酸的水溶液(最终pH 3.5)作为缓冲剂A。使用20l含有392g柠檬酸三钠、100g硼酸和2ml辛酸的水溶液(最终pH 10.2)作为缓冲剂B。通过柱后衍生用茚三酮将游离氨基酸着色，并在570nm处用光度法检测。

11.用连续流动***(CFS)测定葡萄糖

使用来自SKALAR analytic GmbH(Erkelenz，Germany)的SANplus多通道连续流动分析仪测定上清液中葡萄糖的浓度。通过NADH形成用偶联酶测定(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶)检测葡萄糖。

B)实验结果

实施例1

谷氨酸棒杆菌菌株DM1933的nusG基因的序列

菌株DM1933是Blombach等人描述的L-赖氨酸生产者(Applied andEnvironmental Microbiology 75(2),419-427,2009)。它根据布达佩斯条约在DSMZ以保藏号DSM25442保藏。

通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.，San Diego，CA，US)测定菌株DM1933的染色体的核苷酸序列。参见例如Benjak et al.(2015)Whole-Genome Sequencingfor Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly.In:Parish T.,Roberts D.(eds)Mycobacteria Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol 1285.HumanaPress,NY,US)和Bennet,S.(Pharmacogenomics 5(4),433-438,2004)。

发现菌株DM1933的nusG编码序列的核苷酸序列(包括其上游和下游的核苷酸序列)与SEQ ID NO：1中所示的ATCC13032的核苷酸序列相同。

DM1933在其染色体中含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体。所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸序列，其中氨基酸序列位置311处的氨基酸苏氨酸(Thr)被异亮氨酸(Ile)置换。在US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”用于表示所述交换。Blombach等人使用缩写“lysC(T311I)”。

实施例2

构建质粒pK18mobsacB_nusG_N210D

构建质粒pK18mobsacB_nusG_N210D以使导致氨基酸交换N210D的突变掺入菌株DM1933的nusG编码序列的核苷酸序列中。该质粒基于

等人描述的可移动(mobilizable)载体pK18mobsacB(Gene 145,69-73,1994)。对于pK18mobsacB_nusG_N210D的构建，将SEQ ID NO：9中所示的nusG_N210D序列合成并通过GeneArt(Thermo FisherScientific(Waltham，USA))亚克隆到pK18mobsacB中。

为了组装质粒pK18mobsacB_nusG_N210D，将两种多核苷酸，即用XbaI切割的载体pK18mobsacB和合成的并用XbaI消化的多核苷酸nusG_N210D连接，并通过GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham，USA))在大肠杆菌中转化。

实施例3

菌株DM1933_nusG_V210D的构建

使用实施例2中获得的质粒pK18mobsacB_nusG_N210D，将导致氨基酸交换N210D(参见SEQ ID NO：3的核苷酸位置1002-1440或SEQ ID NO：9的核苷酸位置805-807)的突变(参见SEQ ID NO：1的位置1002)掺入L-赖氨酸生产者DM1933的染色体中。

用pK18mobsacB_nusG_N210D的质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1的化学感受态细胞。使用

等人(Journal of Bacteriology 172,1663-1666,1990)描述于材料和方法中的修饰的接合方法用于接合转移到菌株DM1933中，并且由于它们的蔗糖抗性和卡那霉素敏感性表型用于选择转接合子克隆。

使用Type-it Kit以及用于PCR扩增的引物N210D_for和N210D_rev以及用作解链曲线分析的受体探针的NCgl0458_N210D_C和供体探针的NCgl0458_N210D_A(表4)，通过实时PCR分析转接合子克隆。所述引物和探针也显示在序列表的SEQ ID NO：11、12、13和14中。

表4:实时PCR使用的引物和探针列表

名称	序列
		N210D_for	ACCTTGACATGCGTGCTCAG
N210D_rev	CATAGCCACAACCTGCTCAC
		NCgl0458_N210D_C<sup>1</sup>	TGCCCTCGTCACCCACAAAG
NCgl0458_N210D_A<sup>2</sup>	AACTTCGCAACATCGCGGTGCTTCACAGGAGTTGC

¹用LC-Red640在5’-端标记并在3’-端磷酸化的受体探针

²用荧光素在3’-端标记的供体探针

如此表征的转接合子克隆之一称为DM1933_nusG_N210D。制备转接合子克隆的甘油原液培养物并用作进一步研究的起始材料。

因此菌株DM1933的nusG基因被突变，其结果是编码NusG多肽的氨基酸序列的位置210处的氨基酸天冬酰胺被天冬氨酸置换。

实施例4

通过菌株DM1933_nusG_N210D生产L-赖氨酸

使用根据Wouter Duetz的培养***，通过分批培养分析实施例3中获得的菌株DM1933(参考)和DM1933_nusG_N210D从葡萄糖生产L-赖氨酸的能力。

使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的培养基CGXII。将培养物孵育45小时直至完全消耗葡萄糖，如通过使用血糖仪的葡萄糖分析所确认的，并测定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果如表5所示。

表5：菌株DM1933_nusG_N210D的L-赖氨酸生产。

¹以L-赖氨酸×HCl

该实验显示，与亲本菌株DM1933相比，菌株DM1933_nusG_N210D中L-赖氨酸的生产增加。

序列表

<110> 赢创德固赛有限公司

<120> 发酵生产L-赖氨酸的方法

<130> file: 201800170

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2001

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> nuclebase guanine at position 114

<220>

<221> misc_feature

<222> (148)..(153)

<223> - 10 region according to Pfeifer-Sancar et al. (2013)

<220>

<221> misc_feature

<222> (161)..(161)

<223> transcriptional start site according to Pfeifer-Sancar et al.

(2013)

<220>

<221> CDS

<222> (375)..(1328)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1004)

<223> aac codon for asparagine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1002)

<223> nucleobase adenine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1329)..(1331)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1332)..(1334)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1350)..(1402)

<223> nucleotide sequence for a stem-and-loop structure (see Fig. 2 of

Barreiro et al., 2001)

<400> 1

aagtccgtaa ggttatttgg cctactgcgc gccagatggt cacgtacacc cttgtcgttt 60

tgggattctt gattgttttg accgctttgg tgtctggtgt ggatttccta gctggtcttg 120

gagttgagaa gattctgact ccgtaggtag gatgtgtaac atcttttttg aaaagtcccg 180

ctggttccct ggaggagccg gcgggataat ttttgcccag gtggttggtt tggggcagcg 240

gttgcaattg gatgtaattg gttgtttgtc gcagtagcat gggacgaaag ctgttagata 300

gcatgttgca tccctgcgtt ggctgattat cgctgggttt tagggtcgat agataggttg 360

ggagaacacg catt atg agc gat gag aac att aac gag ttt gag cag gac 410

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp

1 5 10

gag gat ctg aac ttc ggc gcg agc ttt agt gat gaa ttc gca gat gac 458

Glu Asp Leu Asn Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp

15 20 25

gat ttc gat gca gaa gca gac gta gaa gca gat gct gct gca gag gcc 506

Asp Phe Asp Ala Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala

30 35 40

tct gcc ctg gaa gct gag cag gat ctg gaa gaa gag acc cta gat gct 554

Ser Ala Leu Glu Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala

45 50 55 60

cca gaa gaa gcc gca gaa gaa gct cct gct gct gca gag tcc gaa gct 602

Pro Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala

65 70 75

cca gta gaa gag gac gaa gag gct gac agc ctt gct cag gcg gct gct 650

Pro Val Glu Glu Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala

80 85 90

gca ctt ggt gac acc gat gag cag gac gcg gat gca gag tac aag gct 698

Ala Leu Gly Asp Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala

95 100 105

cgt ctg cgt aag ttc act cgt gag ctg aag aag cag cct ggt gtt tgg 746

Arg Leu Arg Lys Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp

110 115 120

tac atc att cag tgc tac tcc ggc tac gag aac aag gtg aag gcg aac 794

Tyr Ile Ile Gln Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn

125 130 135 140

ctt gac atg cgt gct cag acc ctt gag gtt gag gat gac atc ttt gag 842

Leu Asp Met Arg Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu

145 150 155

gtt gtt gtt cct atc gag cag gtc act gag atc cgt gat ggt aag cgc 890

Val Val Val Pro Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg

160 165 170

aag ctg gtt aag cgt aag ttg ctg ccg ggc tac gtt ttg gtc cgc atg 938

Lys Leu Val Lys Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met

175 180 185

gac atg aat gac cgc gtg tgg tct gtt gtt cgc gat aca cct ggt gtg 986

Asp Met Asn Asp Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val

190 195 200

acc agc ttt gtg ggt aac gag ggc aat gca act cct gtg aag cac cgc 1034

Thr Ser Phe Val Gly Asn Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg

205 210 215 220

gat gtt gcg aag ttc ttg atg cct cag gag cag gct gtt gtc acc ggt 1082

Asp Val Ala Lys Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly

225 230 235

gag gct gct gct gcg gct gcc gag ggt gag cag gtt gtg gct atg cct 1130

Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro

240 245 250

acc gat acc aag aag cct cag gtt gct gtg gac ttc act gtt ggt gag 1178

Thr Asp Thr Lys Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu

255 260 265

gct gtg acc att ctg act ggt gct ttc gct tct gtt tct gca acg att 1226

Ala Val Thr Ile Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile

270 275 280

tct tct atc gat cct gag ctg cag aag ctg gaa gtt ttg gtg tcc atc 1274

Ser Ser Ile Asp Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile

285 290 295 300

ttt ggt cgt gaa act cct gtt gat ctc agc ttc gac cag gtt gag aag 1322

Phe Gly Arg Glu Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys

305 310 315

gtt agc tagtagctaa actgcaccac ttaccccgca tttcctaggc cacatataag 1378

Val Ser

ggctttggtg atgcggggtt ttgcgtgtag ggtagacaat cgcgtgtttt ttaagcatgc 1438

tcaaaatcat tcatccccgg tggcccggtt acgtaaagat cagcaaagat gatcaactaa 1498

agcgatcatc tgaagttgta gcgggaccga gcatccggac ggttactagt ggggtttcat 1558

cgtcccagtt gtggccggta acaaggaagc aggtttaacg atggctccta agaagaagaa 1618

gaaggtcact ggcctcatca agctccagat ccaggcagga caggcaaacc ctgctcctcc 1678

agttggccca gcacttggtg ctcacggcgt caacatcatg gaattctgca aggcttacaa 1738

cgctgcgact gaaaaccagc gcggcaacgt tgttcctgtt gagatcaccg tttacgaaga 1798

ccgttcattc gacttcaagc tgaagactcc tccagctgca aagcttcttc tgaaggctgc 1858

tggcctgcag aagggctccg gcgttcctca cacccagaag gtcggcaagg tttccatggc 1918

tcaggttcgt gagatcgctg agaccaagaa ggaagacctg aacgctcgcg atatcgacgc 1978

tgctgcgaag atcatcgctg gta 2001

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 2

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp Glu Asp Leu Asn

1 5 10 15

Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp Asp Phe Asp Ala

20 25 30

Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ala Leu Glu

35 40 45

Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala Pro Glu Glu Ala

50 55 60

Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala Pro Val Glu Glu

65 70 75 80

Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala Arg Leu Arg Lys

100 105 110

Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp Tyr Ile Ile Gln

115 120 125

Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn Leu Asp Met Arg

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu Val Val Val Pro

145 150 155 160

Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg Lys Leu Val Lys

165 170 175

Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met Asp Met Asn Asp

180 185 190

Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val Thr Ser Phe Val

195 200 205

Gly Asn Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg Asp Val Ala Lys

210 215 220

Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly Glu Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro Thr Asp Thr Lys

245 250 255

Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu Ala Val Thr Ile

260 265 270

Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Asp

275 280 285

Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile Phe Gly Arg Glu

290 295 300

Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys Val Ser

305 310 315

<210> 3

<211> 2001

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> nucleobase guanine at position 114

<220>

<221> misc_feature

<222> (148)..(153)

<223> - 10 region according to Pfeifer-Sancar et al. (2013)

<220>

<221> misc_feature

<222> (161)..(161)

<223> transcriptional start site according to Pfeifer-Sancar et al.

(2013)

<220>

<221> CDS

<222> (375)..(1328)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1004)

<223> gac codon for aspartic acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1002)

<223> nucleobase guanine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1329)..(1331)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1332)..(1334)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1350)..(1402)

<223> nucleotide sequence for a stem-and-loop structure (see Fig. 2 of

Barreiro et al., 2001)

<400> 3

aagtccgtaa ggttatttgg cctactgcgc gccagatggt cacgtacacc cttgtcgttt 60

tgggattctt gattgttttg accgctttgg tgtctggtgt ggatttccta gctggtcttg 120

gagttgagaa gattctgact ccgtaggtag gatgtgtaac atcttttttg aaaagtcccg 180

ctggttccct ggaggagccg gcgggataat ttttgcccag gtggttggtt tggggcagcg 240

gttgcaattg gatgtaattg gttgtttgtc gcagtagcat gggacgaaag ctgttagata 300

gcatgttgca tccctgcgtt ggctgattat cgctgggttt tagggtcgat agataggttg 360

ggagaacacg catt atg agc gat gag aac att aac gag ttt gag cag gac 410

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp

1 5 10

gag gat ctg aac ttc ggc gcg agc ttt agt gat gaa ttc gca gat gac 458

Glu Asp Leu Asn Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp

15 20 25

gat ttc gat gca gaa gca gac gta gaa gca gat gct gct gca gag gcc 506

Asp Phe Asp Ala Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala

30 35 40

tct gcc ctg gaa gct gag cag gat ctg gaa gaa gag acc cta gat gct 554

Ser Ala Leu Glu Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala

45 50 55 60

cca gaa gaa gcc gca gaa gaa gct cct gct gct gca gag tcc gaa gct 602

Pro Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala

65 70 75

cca gta gaa gag gac gaa gag gct gac agc ctt gct cag gcg gct gct 650

Pro Val Glu Glu Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala

80 85 90

gca ctt ggt gac acc gat gag cag gac gcg gat gca gag tac aag gct 698

Ala Leu Gly Asp Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala

95 100 105

cgt ctg cgt aag ttc act cgt gag ctg aag aag cag cct ggt gtt tgg 746

Arg Leu Arg Lys Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp

110 115 120

tac atc att cag tgc tac tcc ggc tac gag aac aag gtg aag gcg aac 794

Tyr Ile Ile Gln Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn

125 130 135 140

ctt gac atg cgt gct cag acc ctt gag gtt gag gat gac atc ttt gag 842

Leu Asp Met Arg Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu

145 150 155

gtt gtt gtt cct atc gag cag gtc act gag atc cgt gat ggt aag cgc 890

Val Val Val Pro Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg

160 165 170

aag ctg gtt aag cgt aag ttg ctg ccg ggc tac gtt ttg gtc cgc atg 938

Lys Leu Val Lys Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met

175 180 185

gac atg aat gac cgc gtg tgg tct gtt gtt cgc gat aca cct ggt gtg 986

Asp Met Asn Asp Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val

190 195 200

acc agc ttt gtg ggt gac gag ggc aat gca act cct gtg aag cac cgc 1034

Thr Ser Phe Val Gly Asp Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg

205 210 215 220

gat gtt gcg aag ttc ttg atg cct cag gag cag gct gtt gtc acc ggt 1082

Asp Val Ala Lys Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly

225 230 235

gag gct gct gct gcg gct gcc gag ggt gag cag gtt gtg gct atg cct 1130

Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro

240 245 250

acc gat acc aag aag cct cag gtt gct gtg gac ttc act gtt ggt gag 1178

Thr Asp Thr Lys Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu

255 260 265

gct gtg acc att ctg act ggt gct ttc gct tct gtt tct gca acg att 1226

Ala Val Thr Ile Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile

270 275 280

tct tct atc gat cct gag ctg cag aag ctg gaa gtt ttg gtg tcc atc 1274

Ser Ser Ile Asp Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile

285 290 295 300

ttt ggt cgt gaa act cct gtt gat ctc agc ttc gac cag gtt gag aag 1322

Phe Gly Arg Glu Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys

305 310 315

gtt agc tagtagctaa actgcaccac ttaccccgca tttcctaggc cacatataag 1378

Val Ser

ggctttggtg atgcggggtt ttgcgtgtag ggtagacaat cgcgtgtttt ttaagcatgc 1438

tcaaaatcat tcatccccgg tggcccggtt acgtaaagat cagcaaagat gatcaactaa 1498

agcgatcatc tgaagttgta gcgggaccga gcatccggac ggttactagt ggggtttcat 1558

cgtcccagtt gtggccggta acaaggaagc aggtttaacg atggctccta agaagaagaa 1618

gaaggtcact ggcctcatca agctccagat ccaggcagga caggcaaacc ctgctcctcc 1678

agttggccca gcacttggtg ctcacggcgt caacatcatg gaattctgca aggcttacaa 1738

cgctgcgact gaaaaccagc gcggcaacgt tgttcctgtt gagatcaccg tttacgaaga 1798

ccgttcattc gacttcaagc tgaagactcc tccagctgca aagcttcttc tgaaggctgc 1858

tggcctgcag aagggctccg gcgttcctca cacccagaag gtcggcaagg tttccatggc 1918

tcaggttcgt gagatcgctg agaccaagaa ggaagacctg aacgctcgcg atatcgacgc 1978

tgctgcgaag atcatcgctg gta 2001

<210> 4

<211> 318

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp Glu Asp Leu Asn

1 5 10 15

Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp Asp Phe Asp Ala

20 25 30

Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ala Leu Glu

35 40 45

Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala Pro Glu Glu Ala

50 55 60

Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala Pro Val Glu Glu

65 70 75 80

Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala Arg Leu Arg Lys

100 105 110

Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp Tyr Ile Ile Gln

115 120 125

Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn Leu Asp Met Arg

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu Val Val Val Pro

145 150 155 160

Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg Lys Leu Val Lys

165 170 175

Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met Asp Met Asn Asp

180 185 190

Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val Thr Ser Phe Val

195 200 205

Gly Asp Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg Asp Val Ala Lys

210 215 220

Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly Glu Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro Thr Asp Thr Lys

245 250 255

Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu Ala Val Thr Ile

260 265 270

Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Asp

275 280 285

Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile Phe Gly Arg Glu

290 295 300

Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys Val Ser

305 310 315

<210> 5

<211> 2001

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> nucleobase guanine at position 114

<220>

<221> misc_feature

<222> (148)..(153)

<223> - 10 region according to Pfeifer-Sancar et al. (2013)

<220>

<221> misc_feature

<222> (161)..(161)

<223> transcriptional start site according to Pfeifer-Sancar et al.

(2013)

<220>

<221> CDS

<222> (375)..(1328)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1004)

<223> gat codon for aspartic acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1002)

<223> nucleobase guanine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1329)..(1331)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1332)..(1334)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1350)..(1402)

<223> nucleotide sequence for a stem-and-loop structure (see Fig.2 of

Barreiro et al., 2001)

<400> 5

aagtccgtaa ggttatttgg cctactgcgc gccagatggt cacgtacacc cttgtcgttt 60

tgggattctt gattgttttg accgctttgg tgtctggtgt ggatttccta gctggtcttg 120

gagttgagaa gattctgact ccgtaggtag gatgtgtaac atcttttttg aaaagtcccg 180

ctggttccct ggaggagccg gcgggataat ttttgcccag gtggttggtt tggggcagcg 240

gttgcaattg gatgtaattg gttgtttgtc gcagtagcat gggacgaaag ctgttagata 300

gcatgttgca tccctgcgtt ggctgattat cgctgggttt tagggtcgat agataggttg 360

ggagaacacg catt atg agc gat gag aac att aac gag ttt gag cag gac 410

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp

1 5 10

gag gat ctg aac ttc ggc gcg agc ttt agt gat gaa ttc gca gat gac 458

Glu Asp Leu Asn Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp

15 20 25

gat ttc gat gca gaa gca gac gta gaa gca gat gct gct gca gag gcc 506

Asp Phe Asp Ala Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala

30 35 40

tct gcc ctg gaa gct gag cag gat ctg gaa gaa gag acc cta gat gct 554

Ser Ala Leu Glu Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala

45 50 55 60

cca gaa gaa gcc gca gaa gaa gct cct gct gct gca gag tcc gaa gct 602

Pro Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala

65 70 75

cca gta gaa gag gac gaa gag gct gac agc ctt gct cag gcg gct gct 650

Pro Val Glu Glu Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala

80 85 90

gca ctt ggt gac acc gat gag cag gac gcg gat gca gag tac aag gct 698

Ala Leu Gly Asp Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala

95 100 105

cgt ctg cgt aag ttc act cgt gag ctg aag aag cag cct ggt gtt tgg 746

Arg Leu Arg Lys Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp

110 115 120

tac atc att cag tgc tac tcc ggc tac gag aac aag gtg aag gcg aac 794

Tyr Ile Ile Gln Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn

125 130 135 140

ctt gac atg cgt gct cag acc ctt gag gtt gag gat gac atc ttt gag 842

Leu Asp Met Arg Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu

145 150 155

gtt gtt gtt cct atc gag cag gtc act gag atc cgt gat ggt aag cgc 890

Val Val Val Pro Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg

160 165 170

aag ctg gtt aag cgt aag ttg ctg ccg ggc tac gtt ttg gtc cgc atg 938

Lys Leu Val Lys Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met

175 180 185

gac atg aat gac cgc gtg tgg tct gtt gtt cgc gat aca cct ggt gtg 986

Asp Met Asn Asp Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val

190 195 200

acc agc ttc gtc ggc gat gag ggc aat gca act cct gtg aag cac cgc 1034

Thr Ser Phe Val Gly Asp Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg

205 210 215 220

gat gtt gcg aag ttc ttg atg cct cag gag cag gct gtt gtc acc ggt 1082

Asp Val Ala Lys Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly

225 230 235

gag gct gct gct gcg gct gcc gag ggt gag cag gtt gtg gct atg cct 1130

Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro

240 245 250

acc gat acc aag aag cct cag gtt gct gtg gac ttc act gtt ggt gag 1178

Thr Asp Thr Lys Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu

255 260 265

gct gtg acc att ctg act ggt gct ttc gct tct gtt tct gca acg att 1226

Ala Val Thr Ile Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile

270 275 280

tct tct atc gat cct gag ctg cag aag ctg gaa gtt ttg gtg tcc atc 1274

Ser Ser Ile Asp Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile

285 290 295 300

ttt ggt cgt gaa act cct gtt gat ctc agc ttc gac cag gtt gag aag 1322

Phe Gly Arg Glu Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys

305 310 315

gtt agc tagtagctaa actgcaccac ttaccccgca tttcctaggc cacatataag 1378

Val Ser

ggctttggtg atgcggggtt ttgcgtgtag ggtagacaat cgcgtgtttt ttaagcatgc 1438

tcaaaatcat tcatccccgg tggcccggtt acgtaaagat cagcaaagat gatcaactaa 1498

agcgatcatc tgaagttgta gcgggaccga gcatccggac ggttactagt ggggtttcat 1558

cgtcccagtt gtggccggta acaaggaagc aggtttaacg atggctccta agaagaagaa 1618

gaaggtcact ggcctcatca agctccagat ccaggcagga caggcaaacc ctgctcctcc 1678

agttggccca gcacttggtg ctcacggcgt caacatcatg gaattctgca aggcttacaa 1738

cgctgcgact gaaaaccagc gcggcaacgt tgttcctgtt gagatcaccg tttacgaaga 1798

ccgttcattc gacttcaagc tgaagactcc tccagctgca aagcttcttc tgaaggctgc 1858

tggcctgcag aagggctccg gcgttcctca cacccagaag gtcggcaagg tttccatggc 1918

tcaggttcgt gagatcgctg agaccaagaa ggaagacctg aacgctcgcg atatcgacgc 1978

tgctgcgaag atcatcgctg gta 2001

<210> 6

<211> 318

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 6

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp Glu Asp Leu Asn

1 5 10 15

Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp Asp Phe Asp Ala

20 25 30

Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ala Leu Glu

35 40 45

Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala Pro Glu Glu Ala

50 55 60

Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala Pro Val Glu Glu

65 70 75 80

Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala Arg Leu Arg Lys

100 105 110

Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp Tyr Ile Ile Gln

115 120 125

Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn Leu Asp Met Arg

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu Val Val Val Pro

145 150 155 160

Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg Lys Leu Val Lys

165 170 175

Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met Asp Met Asn Asp

180 185 190

Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val Thr Ser Phe Val

195 200 205

Gly Asp Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg Asp Val Ala Lys

210 215 220

Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly Glu Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro Thr Asp Thr Lys

245 250 255

Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu Ala Val Thr Ile

260 265 270

Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Asp

275 280 285

Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile Phe Gly Arg Glu

290 295 300

Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys Val Ser

305 310 315

<210> 7

<211> 1266

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1263)

<400> 7

gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

gca ggc acc gga cgc taa 1266

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 8

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 8

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 9

<211> 1613

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Corynebacterium glutamicum DNA equipped with recognition sites

for the restriction endonuclease XbaI

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(9)

<223> recognition site for restriction endonuclease XbaI

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(1605)

<223> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(804)

<223> sequence upstream of the site of mutation (5'-flanking sequence)

<220>

<221> CDS

<222> (178)..(1131)

<220>

<221> misc_feature

<222> (805)..(807)

<223> gac codon for aspartic acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (805)..(805)

<223> nucleobase guanine

<220>

<221> misc_feature

<222> (806)..(1605)

<223> sequence downstream of the site of mutation (3'-flanking

sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1132)..(1134)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1135)..(1137)

<223> tag stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1605)..(1610)

<223> recognition site for restriction endonuclease XbaI

<400> 9

ggctctagat aatttttgcc caggtggttg gtttggggca gcggttgcaa ttggatgtaa 60

ttggttgttt gtcgcagtag catgggacga aagctgttag atagcatgtt gcatccctgc 120

gttggctgat tatcgctggg ttttagggtc gatagatagg ttgggagaac acgcatt 177

atg agc gat gag aac att aac gag ttt gag cag gac gag gat ctg aac 225

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp Glu Asp Leu Asn

1 5 10 15

ttc ggc gcg agc ttt agt gat gaa ttc gca gat gac gat ttc gat gca 273

Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp Asp Phe Asp Ala

20 25 30

gaa gca gac gta gaa gca gat gct gct gca gag gcc tct gcc ctg gaa 321

Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ala Leu Glu

35 40 45

gct gag cag gat ctg gaa gaa gag acc cta gat gct cca gaa gaa gcc 369

Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala Pro Glu Glu Ala

50 55 60

gca gaa gaa gct cct gct gct gca gag tcc gaa gct cca gta gaa gag 417

Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala Pro Val Glu Glu

65 70 75 80

gac gaa gag gct gac agc ctt gct cag gcg gct gct gca ctt ggt gac 465

Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Leu Gly Asp

85 90 95

acc gat gag cag gac gcg gat gca gag tac aag gct cgt ctg cgt aag 513

Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala Arg Leu Arg Lys

100 105 110

ttc act cgt gag ctg aag aag cag cct ggt gtt tgg tac atc att cag 561

Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp Tyr Ile Ile Gln

115 120 125

tgc tac tcc ggc tac gag aac aag gtg aag gcg aac ctt gac atg cgt 609

Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn Leu Asp Met Arg

130 135 140

gct cag acc ctt gag gtt gag gat gac atc ttt gag gtt gtt gtt cct 657

Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu Val Val Val Pro

145 150 155 160

atc gag cag gtc act gag atc cgt gat ggt aag cgc aag ctg gtt aag 705

Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg Lys Leu Val Lys

165 170 175

cgt aag ttg ctg ccg ggc tac gtt ttg gtc cgc atg gac atg aat gac 753

Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met Asp Met Asn Asp

180 185 190

cgc gtg tgg tct gtt gtt cgc gat aca cct ggt gtg acc agc ttt gtg 801

Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val Thr Ser Phe Val

195 200 205

ggt gac gag ggc aat gca act cct gtg aag cac cgc gat gtt gcg aag 849

Gly Asp Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg Asp Val Ala Lys

210 215 220

ttc ttg atg cct cag gag cag gct gtt gtc acc ggt gag gct gct gct 897

Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly Glu Ala Ala Ala

225 230 235 240

gcg gct gcc gag ggt gag cag gtt gtg gct atg cct acc gat acc aag 945

Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro Thr Asp Thr Lys

245 250 255

aag cct cag gtt gct gtg gac ttc act gtt ggt gag gct gtg acc att 993

Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu Ala Val Thr Ile

260 265 270

ctg act ggt gct ttc gct tct gtt tct gca acg att tct tct atc gat 1041

Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Asp

275 280 285

cct gag ctg cag aag ctg gaa gtt ttg gtg tcc atc ttt ggt cgt gaa 1089

Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile Phe Gly Arg Glu

290 295 300

act cct gtt gat ctc agc ttc gac cag gtt gag aag gtt agc 1131

Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys Val Ser

305 310 315

tagtagctaa actgcaccac ttaccccgca tttcctaggc cacatataag ggctttggtg 1191

atgcggggtt ttgcgtgtag ggtagacaat cgcgtgtttt ttaagcatgc tcaaaatcat 1251

tcatccccgg tggcccggtt acgtaaagat cagcaaagat gatcaactaa agcgatcatc 1311

tgaagttgta gcgggaccga gcatccggac ggttactagt ggggtttcat cgtcccagtt 1371

gtggccggta acaaggaagc aggtttaacg atggctccta agaagaagaa gaaggtcact 1431

ggcctcatca agctccagat ccaggcagga caggcaaacc ctgctcctcc agttggccca 1491

gcacttggtg ctcacggcgt caacatcatg gaattctgca aggcttacaa cgctgcgact 1551

gaaaaccagc gcggcaacgt tgttcctgtt gagatcaccg tttacgaaga ccgtctagag 1611

cc 1613

<210> 10

<211> 318

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 10

Met Ser Asp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Glu Gln Asp Glu Asp Leu Asn

1 5 10 15

Phe Gly Ala Ser Phe Ser Asp Glu Phe Ala Asp Asp Asp Phe Asp Ala

20 25 30

Glu Ala Asp Val Glu Ala Asp Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ala Leu Glu

35 40 45

Ala Glu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ala Pro Glu Glu Ala

50 55 60

Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ser Glu Ala Pro Val Glu Glu

65 70 75 80

Asp Glu Glu Ala Asp Ser Leu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Asp Glu Gln Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Lys Ala Arg Leu Arg Lys

100 105 110

Phe Thr Arg Glu Leu Lys Lys Gln Pro Gly Val Trp Tyr Ile Ile Gln

115 120 125

Cys Tyr Ser Gly Tyr Glu Asn Lys Val Lys Ala Asn Leu Asp Met Arg

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Glu Val Glu Asp Asp Ile Phe Glu Val Val Val Pro

145 150 155 160

Ile Glu Gln Val Thr Glu Ile Arg Asp Gly Lys Arg Lys Leu Val Lys

165 170 175

Arg Lys Leu Leu Pro Gly Tyr Val Leu Val Arg Met Asp Met Asn Asp

180 185 190

Arg Val Trp Ser Val Val Arg Asp Thr Pro Gly Val Thr Ser Phe Val

195 200 205

Gly Asp Glu Gly Asn Ala Thr Pro Val Lys His Arg Asp Val Ala Lys

210 215 220

Phe Leu Met Pro Gln Glu Gln Ala Val Val Thr Gly Glu Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ala Glu Gly Glu Gln Val Val Ala Met Pro Thr Asp Thr Lys

245 250 255

Lys Pro Gln Val Ala Val Asp Phe Thr Val Gly Glu Ala Val Thr Ile

260 265 270

Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser Val Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Asp

275 280 285

Pro Glu Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Val Ser Ile Phe Gly Arg Glu

290 295 300

Thr Pro Val Asp Leu Ser Phe Asp Gln Val Glu Lys Val Ser

305 310 315

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer N210D_for

<400> 11

accttgacat gcgtgctcag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer N210D_rev

<400> 12

catagccaca acctgctcac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> probe NCgl0458_N210D_C

<400> 13

tgccctcgtc acccacaaag 20

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> probe NCgl0458_N210D_A

<400> 14

aacttcgcaa catcgcggtg cttcacagga gttgc 35

201800170A 21

Claims

1.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包含以下步骤：

a)提供一种具有分泌L-赖氨酸的能力的物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的细菌，在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，并且所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中位置210处的氨基酸天冬酰胺被不同的蛋白原氨基酸取代，

b)在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，以及

c)在所述培养基中积累所述L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。

2.权利要求1的方法，其中在所提供的细菌中，在SEQ ID NO：2的氨基酸序列位置210处的所述氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

3.权利要求2的方法，其中在所提供的细菌中，在SEQ ID NO：2的氨基酸序列位置210处的所述氨基酸是天冬氨酸。

4.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的位置375至1328的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat。

5.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的位置375至1331的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat。

6.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的位置114至1331的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat。

7.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的位置114至1402的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat。

8.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：5的位置375至1328的核苷酸序列。

9.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：5的位置375至1331的核苷酸序列。

10.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：5的位置114至1331的核苷酸序列。

11.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：5的位置114至1402的核苷酸序列。