CN110714008A - 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,步骤为:靶向设计sgRNAqingqin oligo序列,两端加BsmBI质粒酶切位点,构建重组质粒,转化,铺板,挑单克隆,提质粒,测序,序列比对,经鉴定,构建成功。本发明采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒,可以精准靶向编辑(包括删除、***及突变)ISS序列,也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果,从而显著促进SMN2外显子7列入,而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达发挥作用,一次性转染即可,是治疗相关遗传性疾病最有潜力的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体设计一种sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法。
背景技术
SMN2基因外显子7列入对于脊髓性肌肉萎缩症(SMA)病人的重要性:研究表明SMA是由于第五号染色体上运动神经元生存1 (survival of motor neuron 1, SMN1)基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长SMN蛋白。和动物不同,人类因为染色体5q13区的倒转复制(inverted duplication)产生了一个SMN1的平行同源基因称作SMN2;而两个基因包含9个外显子(1、2a、2b、3、4、5、6、7、8),编码完全相同294个氨基酸的SMN蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由SMN1中的C转变为SMN2中的T(C6T),虽然没有造成翻译中氨基酸的改变,却严重影响了外显子7的列入 (exon 7 inclusion)。SMN2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7,而没有外显子7的蛋白(称作SMNΔ7)基本没有功能且极不稳定。SMN2表达的少量全长SMN蛋白虽然不足以补偿SMN1基因的缺陷,却对病人的生存至关重要。
CRISPR/Cas9精准靶向编辑基因改善基因功能的相关研究:随着生物技术的飞速发展,CRISPR/Cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志(Science),频繁报道CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy, DMD)基因治疗的论文,以DMD动物模型-mdx小鼠为研究对象,进行动物体内试验。借助AAV载体运载基因编辑的CRISPR/Cas9进入体内细胞,做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子,形成永久性不含外显子23的DMD基因。治疗后肌肉病理得到改善,肌肉细胞膜上重新出现Dystrophin蛋白,小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在SMA小鼠的治疗中尚没有相关研究报道,急需要开展新方法的探索研究。
在人类体内表达SMN蛋白有两个基因,SMN1和SMN2,但是起主要作用的SMN1基因突变失去功能后,由于SMN2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量SMN全长基因,少量SMN有功能蛋白,目前最有效的方法是ASO反义寡核苷酸,精准靶向互补内含子7第10-27序列,比如16年在美国上市的寡核苷酸药物Spinraza,靶向封闭内含子7剪接沉默子ISS序列,从而显著促进外显子7列入比例,但是ASO半衰期较短,必须持续性给药。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒,可以精准靶向编辑(包括删除、***及突变)ISS序列,也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果,从而显著促进SMN2外显子7列入,而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内,在细胞内持续性表达,一次性转染即可。
为解决上述技术问题,本发明的实施例提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,步骤为:靶向设计sgRNAqingqin oligo序列,两端加商业化质粒酶切位点,构建重组质粒,转化,铺板,挑单克隆,提质粒,测序,序列比对,经鉴定,构建成功。
上述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法包括如下具体步骤:
(1)BsmBI酶切Lenti CRISPR空载:Restrietion Enzyme 1uL,质粒DNA 5 ug,10×buffer 5 uL,补灭菌去离子水至50 uL,55℃酶切30min,然后80℃,酶切20min;
(2)将步骤(1)的酶切产物纯化备用;
(3)目标Oligo sgRNA退火:sgRNA F(100um) 2uL,sgRNA R(100um) 2uL,10×T4ligation buffer 2uL,T4 PNK 1 uL,补灭菌去离子水至20uL,37℃退火30min,然后95℃退火5min,每分钟降1~6℃,梯度退至20℃火;
(4)将步骤(3)退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释;
(5)链接反应:步骤(1)的BsmBI酶切Lenti CRISPR 2~8uL,步骤(4)的Oligo sgRNA 1~3uL,10×T4 ligation buffer 1~3uL,T4 ligase 1~3uL,补灭菌去离子水至20 uL,4℃过夜链接;
(6)取步骤(5)的链接产物2~8uL,与100uL感受态细胞混匀,冰浴10min,42℃热激90s,冰浴30min,加入LB液体培养基200uL,200rpm 搅拌45min,取120 uL 涂氨苄板,37℃倒置培养过夜;
(7)挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管,加入3~8mL(含1/1000氨苄)LB液培,37℃,200rpm 过夜摇菌;
(8)质粒提取:按照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书操作提取质粒,OD值检测质粒浓度,然后送公司测序;
(9)对测序结构进行分析,鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒。
其中,构建的CRISPR重组质粒选用:
sgRNAqingqin oligo核苷酸序列(5’ CACCGAAGATTCACTTTCATAATGC 3’, 3’CTTCTAAGTGAAAGTATTACGCAAA5’)。
步骤(2)中利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNAPurification试剂盒将酶切产物纯化。
本发明的上述技术方案的有益效果如下:本发明采用CRISPR case 9sgRNAqingqin重组质粒,可以精准靶向编辑(包括删除、***及突变)ISS序列,也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果,从而显著促进SMN2外显子7列入,而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达,一次性转染即可。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图;
图2为本发明中进行PCR测序时的示意图;
图3为本发明中sgRNAqingqin精准靶向编辑ISS序列从而显著促进SMN2外显子7列入比例的示意图;
图4为在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgRNAqingqin重组质粒促进SMN2外显子7列入比例的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒精准靶向编辑ISS序列的方法,sgRNAqingqin oligo构建的CRISPR重组质粒能够精准靶向SMN2内含子7剪接沉默子ISS序列(图1A红色斜体),该沉默子附近恰好存在CRISPR能够识别的NGG对应序列(图1A 下划线序列),而且通过基因组序列查重,设计的sgRNAqingqin序列(图1A黑色方框内)在人类基因组内是唯一的,也就是特异性序列。本发明的步骤为:靶向设计sgRNAqingqin oligo序列(图1C),两端加商业化质粒酶切位点(图1B BsmBI),构建重组质粒,转化,铺板,挑单克隆,提质粒,测序,序列比对,经鉴定,构建成功(图1D)。
本发明的sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒精准靶向编辑ISS序列的方法包括如下具体步骤:
(1)BsmBI酶切Lenti CRISPR空载:Restrietion Enzyme 1uL,质粒DNA 5 ug,10×buffer 5 uL,补灭菌去离子水至50 uL,55℃酶切30min,然后80℃,酶切20min;
(2)利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNA Purification试剂盒将步骤(1)的酶切产物纯化备用;
(3)目标Oligo sgRNA退火:sgRNA F(100um)2uL,sgRNA R(100um) 2uL,10×T4ligation buffer 2uL,T4 PNK 1uL,补灭菌去离子水至20uL,37℃ 退火30min,95℃ 退火5min,每分钟降3℃,梯度退火至20℃;
(4)将步骤(3)退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释;
(5)链接反应:步骤(1)的BsmBI酶切Lenti CRISPR 4uL,步骤(4)的Oligo sgRNA 1~3uL,10×T4 ligation buffer 2uL,T4 ligase 2uL,补灭菌去离子水至20 uL,4℃过夜链接;
(6)取步骤(5)的链接产物4uL,与100uL top 10感受态混匀,冰浴10min,42℃热激90s(将质粒转入感受态细胞),冰浴30min,加入LB液体培养基200uL,200rpm 搅拌45min,取120uL 涂氨苄板,37℃倒置培养过夜;
(7)挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管,加入约5mL(含1/1000氨苄) LB液培,37℃,200rpm 过夜摇菌;
(8)质粒提取:按照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书操作提取质粒,OD值检测质粒浓度,然后送公司测序;
(9)对测序结构进行分析,鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列,即鉴定目标sgRNA序列是否***载体。
下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
转染HEK293细胞,用puromycin筛选稳定株,提DNA进行PCR(图2A)测序,证明sgRNA2***发挥了case9对SMN2基因组有编辑的作用,箭头向后有碱基的缺失或者***(图2B),从PAM位点向下游有套峰的出现,通过TA克隆蓝白斑筛选,单克隆测序,结果表明基因编辑的部位恰好是我们设计的sgRNA NGG下游SMN2 剪接沉默子(ISS)区域(图2C和图2D),以上证明本发明构建的重组质粒精准靶向编辑成功。而且通过PCR电泳,加入3ul DdeI酶切过夜,2%琼脂糖凝胶电泳检测,灰度值统计学分析,按照以下公式:
统计学分析结果显示exon7列入比例提高约10%,差异具有统计学意义(图3A和图3B),SMN2基因外显子7列入比例提高了近10个百分点,而且,在脊髓性肌肉萎缩小鼠原代培养软骨细胞中sgRNAqingqin重组质粒从而显著促进SMN2全长基因的表达(图4A和图4B)。
本发明sgRNAqingqin构建的CRISPR重组质粒可以精准靶向编辑ISS序列(删除、***及突变),可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果,从而显著促进SMN2外显子7的列入,该方法从基因组水平编辑,从决定蛋白表达最根本的基因组水平纠正,并且重组质粒可以整合到基因组中持续表达。
本发明关键点是设计的sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒能够精准靶向编辑ISS序列,从而显著促进SMN2基因外显子7的例如比例。对于通过改变sgRNAqingqin序列中的某个或者少量碱基也能起到相同作用,所以碱基和该序列排序以及重复率也应视为本发明的保护范围。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,其特征在于,步骤为:靶向设计sgRNAqingqin oligo序列,两端加BsmBI质粒酶切位点,构建重组质粒,转化,铺板,挑单克隆,提质粒,测序,序列比对,经鉴定,构建成功。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,其特征在于,包括如下具体步骤:
(1)BsmBI酶切Lenti CRISPR空载:Restrietion Enzyme 1uL,质粒DNA 5 ug,10×buffer 5 uL,补灭菌去离子水至50 uL,55℃ 酶切30min,然后80℃,酶切20min;
(2)将步骤(1)的酶切产物纯化备用;
(3)目标Oligo sgRNA退火:sgRNA F 2uL,sgRNA R 2uL,10×T4 ligation buffer2uL,T4 PNK 1 uL,补灭菌去离子水至20uL,37℃ 退火30min,然后95℃ 退火5min,每分钟降1~6℃,梯度退火至20℃;
(4)将步骤(3)退火后的Oligo sgRNA在1:50~1:100之间稀释;
(5)链接反应:步骤(1)的BsmBI酶切Lenti CRISPR 2~8uL,步骤(4)的Oligo sgRNA 1~3uL,10×T4 ligation buffer 1~3uL,T4 ligase 1~3uL,补灭菌去离子水至20 uL,4℃过夜链接;
(6)取步骤(5)的链接产物2~8uL,与100uL感受态细胞混匀,冰浴10min,42℃热激90s,冰浴30min,加入LB液体培养基200uL,200rpm 搅拌45min,取120 uL 涂氨苄板,37℃倒置培养过夜;
(7)挑取单个菌斑与枪头一起放入15mL离心管,加入3~8mL LB液培,37℃,200rpm 过夜摇菌;
(8)质粒提取:提取质粒,OD值检测质粒浓度,然后测序;
(9)对测序结构进行分析,鉴定sgRNAqingqin oligo核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,其特征在于,构建的CRISPR重组质粒选用:
sgRNAqingqin oligo核苷酸序列(5’ CACCGAAGATTCACTTTCATAATGC 3’, 3’CTTCTAAGTGAAAGTATTACGCAAA5’)。
4.根据权利要求2所述的核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法,其特征在于,步骤(2)中利用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit for Genonomic DNAPurification试剂盒将酶切产物纯化。
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