CN110702642B - 一种微井结构SPRi芯片的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微井结构SPRi芯片的制备方法及其产品和应用,属于生物检测领域。本发明首先在金膜芯片上生长厚度为15~100nm的聚多巴胺薄膜,然后放置掩膜在紫外光条件下照射下形成微井结构SPRi芯片,能实现高效SPRi多组分检测和并行分析,将表面电子共振波汇聚于检测区域(微井内),提高了该区域的SPRi检测本征灵敏度的同时降低背景信号,另外还构建了区域明确的微阵列点阵,方便检测信号的提取与分析。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种微井结构SPRi芯片的制备方法及其产品和应用。
背景技术
表面等离子共振成像(surface plasmon resonance imaging,SPRi)是一种新型光学检测技术,具有实时在线、无需标记、可并行检测等突出的优点,近年来广泛应用于DNA分析、免疫检测、生物分子相互作用研究等生化分析方面,在基础研究和药物筛选、食品检测、环境监测等应用领域有着重要的应用。目前利用SPRi进行多组分并行分析的方式主要有两类:其一是直接使用图案化的金岛阵列芯片,在各金岛上固定不同探针分子,进行多组分并行检测;其二是利用普通连续金膜芯片(由覆盖在光学玻璃表面的厚度约50nm的连续平整金膜组成),结合微点样技术在连续金膜芯片上固定探针分子阵列,进行多组分分析检测。然而两种方式各有缺点:第一类方式中的金岛阵列芯片存在着加工程序复杂、成本高、且检测通量有限的缺点;而第二种方式的普通连续金膜芯片虽然具有成本较低、检测通量高的优点,但存在传感区和背景区界限不清、背景区噪音大、所得SPRi照片对比度不高等问题,从而导致SPRi检测性能的下降。
因此需要研究制备一种具有微井结构的新型SPRi芯片,使其具有更高的灵敏度,同时能获得检测区域清晰的高对比度SPRi图像,方便检测信号的提取与分析,并且相比金岛阵列芯片又具有加工成本低、使用方便、可用通量高等突出优势。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种微井结构SPRi芯片的制备方法;本发明的目的之二在于提供一种微井结构SPRi芯片;本发明的目的之三在于提供一种微井结构SPRi芯片在SPRi免疫检测方面的应用。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1、一种微井结构SPRi芯片的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)在金膜芯片上生长厚度为15~100nm的聚多巴胺薄膜,得到聚多巴胺修饰的连续金膜芯片;
(2)在步骤(1)中得到的聚多巴胺修饰的连续金膜芯片上放置光掩模,在紫外光条件下照射10~120min,依次用酒精和二次水充分冲洗,氮气吹干,即可得到一种微井结构SPRi芯片。
优选的,所述金膜芯片由覆盖在光学玻璃表面的厚度为45~55nm的连续平整金膜组成。
优选的,所述连续平整金膜的厚度为50nm。
优选的,步骤(1)中所述生长的具体方法为:
(1)将洁净的金膜芯片浸没在含多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液中,从溶液中取出芯片,用二次水冲洗,氮气吹干;
(2)将步骤(1)中氮气吹干的金膜重复进行步骤(1)的操作,使金膜芯片上的聚多巴胺薄膜厚度达到15~100nm即可。
优选的,所述含聚多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液中聚多巴胺的浓度为:2mg/mL,所述含聚多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液的pH为8.5。
优选的,步骤(2)中所述紫外光条件下照射的方法为:在配Hg-Xel光源的紫外清洗仪中,设置功率110W、波长范围为185~254nm。
2、根据上述制备方法制备得到的一种微井结构SPRi芯片。
3、上述一种微井结构SPRi芯片在SPRi免疫检测中的应用。
优选的,所述检测的方法为:
(1)将所述微井结构SPRi芯片浸泡在含多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液中5~60min,在所述微井结构SPRi芯片继续生长形成聚多巴胺薄膜;
(2)将探针分子滴加到所述微井结构SPRi芯片的微井中,在100%湿度条件下反应1~12h,使所述探针分子固定于所述微井结构SPRi芯片的微井中;
(3)用PBS和TBS缓冲液清洗步骤(2)中反应结束后的产物,以除去未固定的探针分子;
(4)将清洗后的产物浸泡于浓度不小于500μg/mL的非特异性蛋白溶液中,浸泡时间不小于15min,进行表面封闭;
(5)继续用用PBS和TBS缓冲液清洗并干燥,放入SPRi仪器进行检测,收集检测信号并分析即可检测得到检测结果。
优选的,所述探针分子为单克隆抗体。
优选的,所述非特异性蛋白为牛血清白蛋白或者赭曲霉毒素。
本发明的有益效果在于:本发明利用图案化的聚多巴胺薄膜修饰金膜芯片,制备得到一种微井结构SPRi芯片,能实现高效SPRi多组分检测和并行分析的目的,其有益效果主要有:
(1)将表面电子共振波汇聚于检测区域(微井内),提高了该区域的SPRi检测本征灵敏度;而背景区域由于聚多巴胺的存在,远离SPR共振条件,因此使检测信号中的背景信号极低;
(2)微井结构SPRi芯片中的微井结构构建了区域明确的微阵列点阵,方便检测信号的提取与分析;
(3)在用微井结构SPRi芯片进行检测的过程中比传统连续金膜芯片具有更高的灵敏度,同时能获得高对比度的SPRi图像,方便检测信号的提取与分析。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述,并且在某种程度上,基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的,或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作优选的详细描述,其中:
图1为一种微井结构SPRi芯片的制备流程图;
图2为实施例2中制备得到的微井结构SPRi芯片用于SPRi免疫检测示的意图;
图3为实施例2中制备得到的微井结构SPRi芯片用于检测牛血清白蛋白的结果图,其中a为SPRi检测角下的微井芯片SPRi成像图,b为线性强度分布;
图4为本发明实施例3制备的微井结构SPRi芯片与普通金膜芯、PDA膜芯片进行SPRi响应的对比图,其中a为微井芯片点、普通金膜芯片点和聚多巴胺(PDA)修饰芯片点对乙醇、乙二醇和甘油溶液的原位SPRi响应,b为微井芯片和普通金膜芯片对乙醇、乙二醇和甘油溶液的原位SPRi响应强度对比图,c为微井芯片点、普通金膜芯片点和聚多巴胺(PDA)修饰金膜芯片点对不同浓度NaCl溶液的原位SPRi响应,d为微井芯片和普通金膜芯片对不同浓度NaCl溶液的原位SPRi响应强度对比图;
图5为实施例1中的芯片与100μg mL-1OTA抗体溶液反应20min后获得的作差SPRi图像及其强度线性图;
图6为100μg mL-1的OTA抗体溶液在微井芯片传感点、微井芯片对照点和普通连续金膜芯片传感点进行原位SPRi响应结果图;
图7为在普通连续金膜芯片上检测100μg mL-1 OTA抗体溶液反应20min后获得的作差SPRi图像;
图8为普通金膜芯片和微井芯片上对OTA抗体进行SPRi检测时抗体的浓度-与检测强度的关系图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是,以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想,在不冲突的情况下,以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
制备微井结构SPRi芯片,制备过程如图1所示,制备方法如下:
(1)选取有覆盖在光学玻璃表面的厚度45nm的连续平整金膜组成芯片为金膜芯片;
(2)将上述洁净的金膜芯片浸没在含聚多巴胺、pH=8.5的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液(其中聚多巴胺的体积质量浓度为2mg/mL)中,从溶液中取出芯片,用二次水冲洗,氮气吹干;
(3)将上述氮气吹干的金膜重复进行步骤(2)的操作,使金膜芯片上的聚多巴胺薄膜厚度达到15nm即可,得到聚多巴胺修饰的连续金膜芯片;
(4)在制备得到的聚多巴胺修饰的连续金膜芯片上放置光掩模,在配Hg-Xe l光源的紫外清洗仪中,设置功率110W、波长为185nm的紫外光条件下照射10min,依次用酒精和二次水充分冲洗,氮气吹干,即可得到一种微井结构SPRi芯片。
实施例2
制备微井结构SPRi芯片,其制备方法如下:
(1)选取有覆盖在光学玻璃表面的厚度50nm的连续平整金膜组成芯片为金膜芯片;
(2)将上述洁净的金膜芯片浸没在含聚多巴胺、pH=8.5的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液(其中聚多巴胺的体积质量浓度为2mg/mL)中,从溶液中取出芯片,用二次水冲洗,氮气吹干;
(3)将上述氮气吹干的金膜重复进行步骤(2)的操作,使金膜芯片上的聚多巴胺薄膜厚度达到100nm即可,得到聚多巴胺修饰的连续金膜芯片;
(4)在制备得到的聚多巴胺修饰的连续金膜芯片上放置光掩模,在配Hg-Xe l光源的紫外清洗仪中,设置功率110W、波长为254nm的紫外光条件下照射30min,依次用酒精和二次水充分冲洗,氮气吹干,即可得到一种微井结构SPRi芯片。
实施例3
制备微井结构SPRi芯片,其制备方法如下:
(1)选取有覆盖在光学玻璃表面的厚度55nm的连续平整金膜组成芯片为金膜芯片;
(2)将上述洁净的金膜芯片浸没在含聚多巴胺、pH=8.5的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液(其中聚多巴胺的体积质量浓度为2mg/mL)中,从溶液中取出芯片,用二次水冲洗,氮气吹干;
(3)将上述氮气吹干的金膜重复进行步骤(2)的操作,使金膜芯片上的聚多巴胺薄膜厚度达到60nm即可,得到聚多巴胺修饰的连续金膜芯片;
(4)在制备得到的聚多巴胺修饰的连续金膜芯片上放置光掩模,在配Hg-Xe l光源的紫外清洗仪中,设置功率110W、波长为200nm的紫外光条件下照射120min,依次用酒精和二次水充分冲洗,氮气吹干,即可得到一种微井结构SPRi芯片。
实施例4
将实施例2中制备得微井结构SPRi芯片用于牛血清白蛋白的SPRi免疫检测,其检测示意图如图2所示,具体检测方法如下:
(1)将实施例2中制备的微井结构SPRi芯片浸泡在含多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液(聚多巴胺的浓度为:2mg/mL,缓冲溶液的pH为8.5)中20min,在微井结构SPRi芯片继续生长形成聚多巴胺薄膜;
(2)将单克隆抗体作为探针分子滴加步骤(1)中制备得到的微井结构SPRi芯片的微井中,在100%湿度条件下反应1h,使单克隆抗体的探针分子固定于微井结构SPRi芯片的微井中;
(3)用PBS和TBS缓冲液清洗步骤(2)中反应结束后的产物,以除去未固定的探针分子;
(4)将清洗后的产物浸泡于浓度不小于10μg/mL的牛血清白蛋白的非特异性蛋白溶液中,浸泡时间不小于15min,进行表面封闭;
(5)继续用用PBS和TBS缓冲液清洗并干燥,放入SPRi仪器进行检测,收集检测信号并分析即可检测得到检测结果。
经过检测得到在SPRi检测角下的微井芯片SPRi成像图(如图3中a所示)及线性强度分布(如图3中b所示)。可见在微井区域(检测区域)存在非常低的反射率,证明此区域有强烈的SPR耦合,导致反射光强度降低,因此在微井中对表面的生物分子吸脱附非常敏感;而在微井区域之外(背景区域),反射率近乎100%,说明此区域无SPR耦合,反射处于内全反射模式,因此此区域对表面的生物分子吸脱附完全不敏感,从而避免了大的背景扰动对SPRI检测的影响。
实施例5
将本发明实施例3制备的微井结构SPRi芯片与普通金膜芯、PDA膜芯片进行SPRi响应,其相应结果如图4所示,其中图4中a为微井芯片点、普通金膜芯片点和聚多巴胺(PDA)修饰芯片点对乙醇、乙二醇和甘油溶液的原位SPRi响应;图4中b为微井芯片和普通金膜芯片分别对乙醇、乙二醇和甘油溶液的原位SPRi响应强度对比图;图4中c为微井芯片点、普通金膜芯片点和聚多巴胺(PDA)修饰金膜芯片点对不同浓度NaCl溶液的原位SPRi响应;图4中d为微井芯片和普通金膜芯片对不同浓度NaCl溶液的原位SPRi响应强度对比图。
通过对图4中得到的相应数据分析,说明在微井结构芯片的微井内,SPR的本征灵敏度高于普通金膜芯片,其原因在于微井结构对表面SPR波的限定聚焦效应;同时,在微井芯片的背景区域,信号保持在极低水平,且不随溶液的变化而变化,说明此芯片背景信号小。
实施例6
将实施例1中制备得微井结构SPRi芯片用于赭曲霉毒素(OTA)的SPRi免疫检测,具体检测方法如下:
(1)将实施例2中制备的微井结构SPRi芯片浸泡在含多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液(聚多巴胺的浓度为:2mg/mL,缓冲溶液的pH为8.5)中20min,在微井结构SPRi芯片继续生长形成聚多巴胺薄膜;
(2)将单克隆抗体作为探针分子滴加步骤(1)中制备得到的微井结构SPRi芯片的微井中,在100%湿度条件下反应12h,使单克隆抗体的探针分子固定于微井结构SPRi芯片的微井中;
(3)用PBS和TBS缓冲液清洗步骤(2)中反应结束后的产物,以除去未固定的探针分子;
(4)将清洗后的产物浸泡于浓度不小于100μg/mL的赭曲霉毒素(OTA)的非特异性蛋白溶液中,浸泡时间不小于15min,进行表面封闭;
(5)继续用用PBS和TBS缓冲液清洗并干燥,放入SPRi仪器进行检测,收集检测信号并分析即可检测得到检测结果。
经过检测得到实施例1中的芯片与100μg mL-1OTA抗体溶液反应20min后获得的作差SPRi图像及其强度线性图(如图5所示),同时将100μg mL-1的OTA抗体溶液在微井芯片传感点、微井芯片对照点和普通连续金膜芯片传感点进行原位SPRi响应,其结果如图6所示。对比图5和图6的检测结果,发明在微井结构芯片上能得到非常清晰、对比度高的SPRi检测图片,同时,在微井结构芯片的微井内,SPR的本征灵敏度高于普通连续金膜芯片,而微井芯片的背景区域信号保持在极低水平。
在普通连续金膜芯片上检测100μg mL-1OTA抗体溶液反应20min后获得的作差SPRi图像如图7所示,说明在普通连续金膜芯片得到的检测信号弱,且SPRi图像对比度低,检测区域不规则,难以准确提取信号进行定量分析。
在普通金膜芯片和微井芯片上对OTA抗体进行SPRi检测,其OTA抗体的浓度-与检测强度关系曲线如图8所示。
经过以上分析说明本发明利用图案化的聚多巴胺薄膜修饰金膜芯片,制备得到一种微井结构SPRi芯片,能实现高效SPRi多组分检测和并行分析的目的,其有益效果主要有:
(1)将表面电子共振波汇聚于检测区域(微井内),提高了该区域的SPRi检测本征灵敏度;而背景区域由于聚多巴胺的存在,远离SPR共振条件,因此使检测信号中的背景信号极低;
(2)微井结构SPRi芯片中的微井结构构建了区域明确的微阵列点阵,方便检测信号的提取与分析;
(3)在用微井结构SPRi芯片进行检测的过程中比传统连续金膜芯片具有更高的灵敏度,同时能获得高对比度的SPRi图像,方便检测信号的提取与分析。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种微井结构SPRi芯片的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)在金膜芯片上生长厚度为15~100nm的聚多巴胺薄膜,得到聚多巴胺修饰的连续金膜芯片,所述金膜芯片由覆盖在光学玻璃表面的厚度为45~55nm的连续平整金膜组成;
(2)在步骤(1)中得到的聚多巴胺修饰的连续金膜芯片上放置光掩模,在紫外光条件下照射10~120min,依次用酒精和二次水充分冲洗,氮气吹干,即可得到一种微井结构SPRi芯片。
2.根据权利要求1所述一种微井结构SPRi芯片的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述生长的具体方法为:
(1)将洁净的金膜芯片浸没在含聚多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液中,从溶液中取出芯片,用二次水冲洗,氮气吹干;
(2)将步骤(1)中氮气吹干的金膜重复进行步骤(1)的操作,使金膜芯片上的聚多巴胺薄膜厚度达到15~100nm即可。
3.根据权利要求2所述一种微井结构SPRi芯片的制备方法,其特征在于,所述含聚多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液中聚多巴胺的浓度为:2mg/mL,所述含聚多巴胺的三羟-盐酸甲基氨基甲烷缓冲溶液的pH为8.5。
4.根据权利要求1所述一种微井结构SPRi芯片的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述紫外光条件下照射的方法为:在配Hg-Xe l光源的紫外清洗仪中,设置功率110W、波长范围为185~254nm。
5.根据权利要求1~4任一项所述制备方法制备得到的一种微井结构SPRi芯片。
6.权利要求5所述一种微井结构SPRi芯片在SPRi免疫检测方面的应用。
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