CN110699329A - 基因缺失的减毒伪狂犬病病毒及其作为疫苗的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可作为疫苗的基因缺失减毒伪狂犬病毒及疫苗以及构建方法,具体提供了一种减毒伪狂犬病病毒(PRV),其Us区域的Us3基因全部或部分的缺失。经实验表明所述毒株在犬、水貂、狐狸及貉子等皮毛动物上对亲本PRV毒性病毒攻击具有100%保护的诱导,该减毒PRV毒株可作为安全和有效的防控皮毛动物的伪狂犬病(PR)疫情的疫苗,具有极大的社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及减毒的伪狂犬病病毒,及此类病毒用于治疗和/或预防家畜及野生动物的急性传染病,还涉及减毒的伪狂犬病病毒疫苗。
背景技术
伪狂犬病(PR,Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(PRV,Pseudorabies virus) 引起的一种急性、高致病性传染病,以发热、奇痒、脑脊髓炎、呼吸和神经***障碍为主要特征。除自然宿主猪外,牛、羊、犬、貂、兔子、獾、貉、北极熊等多种家养动物和野生动物均对该病原易感。自2010年以来,PR疫情波及了欧洲、美国和我国等多个地区、国家,并呈现蔓延趋势,2011年至2015年期间先后波及了我国的22个省市,病毒可能出现毒力反强或者变异,导致经典的商品化疫苗对流行的强毒感染的动物无法提供有效的保护。
CN10580292A公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株,该毒株缺失gE、gI及TK三个基因;CN105343877A公开了一种5基因缺失的伪狂犬病重组病毒活疫苗,其中同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因、TK基因和部分UL49.5基因;CN104862286A公开了一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株,其中
该毒株的gI、gE、11K/28K蛋白失活;CN105018433A公开了一种猪伪狂犬病毒弱毒株,该毒株是不能表达TK、gE、gI蛋白的猪伪狂犬并毒株;CN107129999A 公开了一种利用稳转CRISPR/Cas9***对病毒基因组进行靶向编辑的方法,其中 GE和TK基因被修饰;CN106282128A公开了一种猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒株,该毒株的UL区的TK基因、US区的gI gE Us9 Us2等片段缺失;CN101186902A公开了伪狂犬病病毒SA215和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗,其缺失部分为TK gI、28K 基因序列和全部的gE、11k基因序列。这些基因缺失毒株主要是针对来自自然宿主猪的病毒。从这些研究中发现,即使是采用相同的毒力基因缺失策略,不同基因型的致弱效果差别很大。
近几年,由于病毒变异致使其宿主适应范围更广,水貂、狐狸和貉子等毛皮动物大面积暴发PR疫情的报道逐年增加,发病迅速、致死率高达80%。致使皮毛动物产业受到较大影响,目前我国市场尚无专门用于毛皮动物防控PR的疫苗,偶有养殖单位使用猪PR疫苗来防控疫情的发生流行,但由于新病毒株的毒力改变以及疫苗对毛皮动物安全性不明确,疫苗使用的效果并不理想。
因此研制相关疫苗十分迫切,尤其要注意安全性和有效性指标。
发明内容
针对已有伪狂犬病病毒疫苗对犬、水貂、狐狸及貉子等皮毛动物的免疫力低下,安全性不明确,使用效果不理想等情况,本发明在分析本实验室分离到的多株PRV流行毒株的生物学特性的基础上,发现PRV病毒基因组Us区域的Us3基因的缺失导致毒性病毒的减毒以及在犬、水貂、狐狸及貉子等皮毛动物上对亲本 PRV毒性病毒攻击的100%保护的诱导。
因此,在第一方面,本发明提供了一种减毒伪狂犬病病毒(PRV),其缺乏以下基因的功能性形式:
在伪狂犬病毒(PRV)基因组上的基因组位置118520至119524基因位点全部或部分缺失,其相应的DNA序列为PRV 118520-119524-SEQ ID NO.1,称为Us3 基因,进一步可表述为Us区域的Us3基因全部或部分的缺失;
进一步优选包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9的基因全部或部分缺失;更进一步优选包括gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。
进一步,gE/gI/TK/US3四基因缺失株PRV GL已于2019年7月18日进行专利程序的保藏,保藏单位代码:CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京室朝阳区北辰西路1号院,保藏号CGMCC No:18178,分类命名:伪狂犬病毒。
本发明的减毒病毒可以从有毒力的PRV病毒株通过缺失以下基因制备获得:
Us区域的Us3基因全部或部分的缺失;进一步优选包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9的基因全部或部分缺失;更进一步优选包括 gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。
当施用受试者时,减毒PRV病毒可诱导针对随后用有毒力的PRV病毒攻击的保护性免疫应答。
在第二方面,本发明提供了包含根据本发明第一方面的减毒PRV病毒的疫苗。所述疫苗可以包含多种不同基因型的减毒PRV病毒。进一步,本发明还提供了用于递送疫苗制剂的试剂盒,其包含减毒PRV病毒疫苗和疫苗递送装置。
在第三方面,本发明提供根据本发明的疫苗,其用于治疗或预防犬、水貂、狐狸及貉子等皮毛动物的伪狂犬病。疫苗可诱导针对多种PRV病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
在第四方面,本发明提供了制备减毒伪狂犬病病毒的方法,其包括全部或部分缺失以下基因的表达:Us区域的Us3基因全部或部分的缺失;进一步优选包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9的基因全部或部分缺失;更进一步优选包括gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。
在第五方面,本发明提供了用于治疗和/或预防受试者中的伪狂犬病的方法,其包括向受试者施用有效量的根据本发明第二方面的疫苗的步骤。受试者可以是猪、牛、羊、犬、貂、兔子、獾、貉、北极熊等多种家养动物和野生动物。疫苗可以通过初免-加强免疫方案施用。
在第六方面,本发明提供用于伪狂犬病的治疗和/或预防的减毒PRV病毒,其通过肌肉注射、鼻内施用或其他给予动物的常规施用方法施用。
本发明通过基因工程手段,获得了Us3基因缺失的PRV弱毒株,该毒株制备的疫苗对犬、水貂、狐狸、貉子、猪等均具有明确、良好的安全性。
说明书附图
图1:rPRV-delgE/gI/TK/US3重组病毒的鉴定,rPRV-delgE/gI的gE/gI基因发生缺失(图1A);rPRV-delgE/gI/TK的TK基因发生缺失(图1B); rPRV-delgE/gI/TK/US3的US3基因发生缺失(图1C);重组病毒 rPRV-delgE/gI/TK/US3这四个基因均不能表达,证明病毒构建成功(图1D)。
图2:rPRV-delgE/gI/TK/US3重组病毒生长特性的鉴定。
图3:rPRV-delgE/gI/TK/US3重组病毒对动物致病性分析。
图4:rPRV-delgE/gI/TK/US3重组病毒对动物免疫保护的评价。
具体实施方式
伪狂犬病毒属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、水痘疱疹病毒属成员,是双链DNA病毒,DNA分子量为150kb,到目前为止,伪狂犬病毒至少有11种糖蛋白,包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gJ、gK、gL、gM和gN,其中gB、gC、gD、gE、 gI与伪狂犬病毒的毒力有关,而胸苷激酶(TK)在伪狂犬病毒的致病性中也扮演主要角色。这些蛋白相对应的基因gB、gC、gD、gE、gG、gH、gJ、gK、gL、gM 和gN,其中gB、gC、gD、gE、gI以及TK基因都属于毒性基因,在减毒病毒的制备中缺失或中断。
本发明的实施方式中进一步证明了Us3基因为毒性基因,尤其在犬、水貂、狐狸、貉子的PRV感染中。Us3基因在PRV基因组上的基因组位置为118520至 119524,DNA序列为PRV118520-119524-SEQ ID NO.1。
本发明的减毒伪狂犬病毒毒株(PRV)可以衍生自野生型PRV病毒分离株,但在其基因组中包括其缺失以下基因的功能性形式:Us区域的Us3基因全部或部分的缺失;进一步优选包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9 的基因全部或部分缺失;更进一步优选包括gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。所述衍生病毒毒株进一步具体优选HB-98、SA215、HB2000、或GL毒株。
本发明还提供了包含本发明减毒PRV病毒的疫苗组合物,所述减毒PRV病毒在其基因组中包括其缺失以下基因的功能性形式:Us区域的Us3基因全部或部分的缺失;进一步优选包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9 的基因全部或部分缺失;更进一步优选包括gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。所述疫苗组合物还可以进一步包含其他多种减毒病毒,该减毒病毒株可以是PRV的其他减毒毒株或不同病毒种属的其他减毒病毒如分离自犬、水貂、狐狸、貉子等皮毛动物或野生动物感染的病毒并进一步通过基因工程手段毒力至弱的减毒病毒。
本发明还提供了联合疫苗,所述联合疫苗含有本发明的减毒PRV病毒以及其他减毒病毒。
本发明的疫苗组合物可以引发对几种或基本上所有PRV病毒的交叉保护性免疫应答。进一步本发明的疫苗组合物可以引发对所包含的不同病毒株的同时保护性免疫应答。
本发明提供了相应功能基因的全部或部分缺失,所述缺失可以是连续的或不连续的,具体为包括几个不连续的序列区段,在部分缺失中所述缺失应以去除足够量的核苷酸序列,使得基因不再编码功能性蛋白质。
本发明还提供了包含本发明的减毒PRV病毒的“疫苗”,所述“疫苗”是指当施用于受试者时诱导或刺激保护性免疫应答的制剂。疫苗可以使生物体对特定疾病免疫,在本发明中包括对伪狂犬病毒带来的疾病。因此,本发明的疫苗在受试者中诱导针对随后的PRV病毒攻击的保护性免疫应答。
本发明的疫苗进一步任选地含有一种或多种佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
本发明还提供了通过施用有效量的本发明的减毒病毒或疫苗来预防和/或治疗受试者中的包括PRV感染的方法。受试者可以是对PRV感染易感的任何动物,包括猪,牛、羊、犬、貂、兔子、獾、貉、北极熊等多种家养动物和野生动物。进一步优选犬、貂、兔子、獾、貉、北极熊等皮毛动物。
本发明的疫苗可以通过任何方便的途径施用,例如通过肌肉注射,其他合适的施用途径包括鼻内、口服、皮下、透皮等,在一个实施方案中,口服施用包括将疫苗添加至动物饲料或饮水中。疫苗可以采用初免-加强免疫的方案施用,例如在第一次接种后,受试者可以在一段时间后接受第二次加强施用,通常,加强施用的剂量高于初免施用的剂量。
本发明还提供了伪狂犬病毒的减毒方法,所述方法包括缺失以下功能基因的表达步骤:
Us区域的Us3基因全部或部分的缺失;进一步优选包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9的基因全部或部分缺失;更进一步优选包括 gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。Us3基因在PRV基因组上的基因组位置为118520至119524,DNA序列为PRV118520-119524-SEQ ID NO.1。
用于缺失病毒基因的方法是本领域已知的:例如,可以使用同源重组,其中创建转移载体,该载体中缺失相关基因并用于转染病毒感染的细胞。然后可以选择表达序列的新部分的重组病毒。
本发明还提供了用于递送疫苗制剂的试剂盒,其包含:a)减毒的PRV病毒疫苗;和b)递送装置。
所述的递送装置包括肌肉注射的注射器,鼻内给药的滴管,气雾剂装置或单位剂量粉末分配器或双剂量粉末分配器。
现在将通过实施例进一步描述本发明,这些实施例意图帮助本领域普通技术人员实施本发明,而不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
本实施例选择PRV GL株为亲本毒株,采用基因工程手段,获得四基因 (gE/gI/TK/US3)缺失毒株。该毒株对犬、水貂、狐狸及貉子均具有良好的安全性。
实验材料:PRV-GL株由本实验室分离、鉴定并保存;VERO和PK-15细胞由本实验室保存;转染试剂2000购自Invitrogen公司;Dual Luciferase ReporterGene Assay Kit购自Promega公司;小分子化合物购自Sigma 公司。
PRV-GL毒株的Us3基因DNA序列为SEQ ID NO.1。
实施例1:PRV特异性sgRNA的设计
设计针对gE、gI、TK及US3基因序列的sgRNA(设计见表1)。
表1靶向PRV-GL基因组的CRISPR/Cas9 sgRNA序列
实施例2:构建CRISPR/Cas9载体
将实施例1设计的6组sgRNA-gE的2条引物95℃加热5min,自然冷却,使之退火形成双两链结构,将退火产物克隆至经BbsI酶切后的PX330载体,转化感受态DH5α。对测序正确的菌液扩大培养进行抽提质粒,备用。
实施例3:重组病毒的获得
将3μg的PRV-GL基因组和各0.5μg的pX330-gE/gI sgRNA1/2质粒共转染单层VERO细胞(6孔板)。转染48h后即可看见典型细胞病变(CPE),72h后收获转染细胞上清液,接种PK-15细胞,进行蚀斑纯化筛选;在荧光显微镜下挑取蚀斑,经过10轮的纯化,将获得的病毒命名为rPRV-delgE/gI。同样,将3μg 的rPRV-delgE/gI基因组和各0.5μg的pX330-TKsgRNA1/2质粒共转染至单层 VERO细胞(6孔板),进行再次蚀斑筛选得到rPRV-delgE/gI/TK(三基因缺失重组病毒)。最后,将rPRV-delgE/gI/TK与pX330-US3 sgRNA1/2共转染,得到rPRV-delgE/gI/TK/US3(四基因缺失重组病毒)。
实施例4:重组病毒的鉴定
(1)rPRV-delgE/gI重组病毒的鉴定:分别提取重组病毒rPRV-delgE/gI和野毒株PRV-GL的基因组作为模板,针对所缺失的gE/gI基因设计引物(表2),进行PCR鉴定。
(2)rPRV-delgE/gI/TK重组病毒的鉴定:分别提取重组病毒 rPRV-delgE/gI/TK、rPRV-delgE/gI和野毒株PRV-GL的基因组作为模板,针对所缺失的TK基因设计引物(表2),进行PCR鉴定。
(3)rPRV-delgE/gI/TK/US3重组病毒的鉴定:分别提取重组病毒 rPRV-delgE/gI/TK/US3、rPRV-delgE/gI/TK、rPRV-delgE/gI和野毒株PRV-GL的基因组作为模板,针对所缺失的US3基因设计引物(表2),进行PCR鉴定。将重组病毒rPRV-delgE/gI/TK/US3、rPRV-delgE/gI/TK、rPRV-delgE/gI和亲本毒株 PRV-GL均以MOI=0.1感染Vero细胞,同时设置未感染组作为空白对照,感染后24h裂解细胞,验证gE、gI、TK、US3基因表达情况。
表2重组病毒鉴定用引物
分别提取rPRV-delgE/gI、rPRV-delgE/gI/TK和rPRV-delgE/gI/TK/US3重组病毒基因组DNA,经PCR鉴定显示rPRV-delgE/gI的gE/gI基因发生缺失(图1A); rPRV-delgE/gI/TK的TK基因发生缺失(图1B);rPRV-delgE/gI/TK/US3的US3 基因发生缺失(图1C)。将病毒感染Vero细胞24h后裂解细胞,通过Western blotting验证gE、gI、TK、US3基因表达结果显示:重组病毒rPRV-delgE/gI/TK/US3 这四个基因均不能表达,证明病毒构建成功(图1D)。
实施例5:遗传稳定性验证
纯化后的重组毒rPRV-delgE/gI/TK/US3在PK-15细胞上连续继传10代,用检测引物进行PCR检测,检测重组病毒的4个缺失基因都没有恢复。
实施例6:重组病毒生长特性鉴定
分别取亲本病毒PRV-GL和重组病毒rPRV-delgE/gI/TK、 rPRV-delgE/gI/TK/US3以MOI=1接种VERO细胞,分别在感染后的12h、24h、 36h和48h收获细胞上清,按Reed-Muench方法计算不同时间点收获病毒的病毒滴度(TCID50),每个时间点重复测定三次。以病毒的感染时间为横坐标,以病毒在不同时间点的TCID50对数值为纵坐标,绘制病毒的生长曲线。
以相同剂量接种VERO细胞,分别在感染后的12h、24h、36h和48h收获细胞上清,测定细胞上清病毒滴度。结果显示(图2):在感染后12h,野生病毒与重组病毒复制没有差异;而在感染后24h至48h重组病毒增殖水平弱于野生病毒。其中四基因缺失病毒(rPRV-delgE/gI/TK/US3)复制低于三基因缺失病毒 (rPRV-delgE/gI/TK)。
实施例7:对动物致病性分析
为了验证四基因缺失病毒(rPRV-delgE/gI/TK/US3)和三基因缺失病毒 (rPRV-delgE/gI/TK)毒株的毒力是否减弱,分别选取PRV抗体及抗原均为阴性的健康犬、水貂、貉、狐狸各11只,每种动物随机分成3组,其中对照2只,感染组3只。通过颈部肌肉注射1×103PFU/500μL的PRV GL或 rPRV-delgE/gI/TK/US3或rPRV-delgE/gI/TK;使用DMEM(500μL)作为对照。接种后每天观察各动物的临床症状,在感染2周内测量体温,记录临床症状以及死亡情况。
对犬、水貂、貉、狐狸的致病性分析结果显示(见图3):犬(A)感染野毒 4d内全部死亡,感染三基因缺失病毒rPRV-delgE/gI/TK 5d内全部死亡;水貂(B) 在感染野生病毒4d全部死亡,感染三基因缺失病毒rPRV-delgE/gI/TK 7d内全部死亡;貉(C)感染野生病毒4d后全部死亡,感染三基因缺失病毒rPRV-delgE/gI/TK 5d内全部死亡;狐狸(D)感染野生病毒4d后全部死亡,感染三基因缺失病毒 rPRV-delgE/gI/TK 6d内全部死亡。而rPRV-delgE/gI/TK/US3感染组的4种动物在 2周内没有发生死亡,全部存活。
实施例8:免疫保护评价
将rPRV-delgE/gI/TK/US3(滴度:2×107TCID50/mL)经β-丙内酯灭活后,添加MOTANIDE@GEL-02佐剂。免疫剂量为1mL,针对犬、水貂、貉、狐狸四种动物,每种动物6只,其中3只动物进行疫苗接种;另外3只作为对照组,免疫 MOTANIDE@GEL-02佐剂。
免疫及攻毒程序:一免后2周进行二免;二免后一周用PRV GL株(1×103 PFU)进行攻毒试验。攻毒后2周内每天观察并记录试验犬临床症状、死亡情况,并计算疫苗保护指数。
对犬、水貂、貉、狐狸的免疫保护试验结果显示(见图4):犬(A)、水貂 (B)、貉(C)、狐狸(D)在免疫DMEM后感染野生病毒4-6天全部死亡;而 rPRV-delgE/gI/TK/US3免疫组的4种动物在2周内没有发生死亡,全部存活。
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120>基因缺失的减毒伪狂犬病病毒及其作为疫苗的应用
<160>1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 1
atggccgacgccggaatccccgacgagatcctgtactcggacatcagcgacgacgagatcatcatcgacggcgacggcga
cagcagcggggacgaggacgacgatgacggggggctgacgcggcaggccgcgtcgcgcatcgccacggacctgggcttcg
aggtgctgcagcccctgcagtcgggctcggagggccgcgtcttcgtggcccgccggcccggcgaggcggacacggtggtg
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ccttccgctgatgagatactcaactttggaatgtggaccgtataa
Claims (10)
1.一种基因缺失减毒伪狂犬病毒,其特征在于,在狂犬病毒(PRV)基因组上的基因组位置118520至119524基因位点全部或部分缺失,其相应的DNA序列为PRV 118520-119524-SEQID NO.1,称为Us3基因。
2.根据权利要求1所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒,其特征在于,进一步包括Us区域的其他基因的全部或部分缺失,如Us2、Us9的基因全部或部分缺失。
3.根据权利要求1或2所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒,其特征在于,进一步包括gE、gI、和/或TK基因的全部或部分缺失。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒,其特征在于,所述狂犬病毒(PRV)选自HB-98、SA215、HB2000或GL毒株。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒,所述基因缺失病毒保藏号为18178。
6.一种伪狂犬病疫苗,其特征在于,其含有根据权利要求1至5任一项所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒。
7.如权利要求6所述的伪狂犬病疫苗,其特征在于,所述疫苗进一步含有一种或多种佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
8.如权利要求6或7所述的伪狂犬病疫苗,其特征在于,是与其他皮毛动物疫苗制备成联合疫苗。
9.一种制备根据权利要求1至5任一项所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒的方法,其特征在于:通过基因工程手段将原始毒株的U3基因序列,以及任选的包含Us区域的其他基因、gE、gI、和/或TK基因缺失以制备基因缺失减毒伪狂犬病毒。
10.权利要求1-5任一项所述的基因缺失减毒伪狂犬病毒在制备预防和/或治疗皮毛动物伪狂犬病的疫苗中的用途。
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