CN110669844B

CN110669844B - 一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒

Info

Publication number: CN110669844B
Application number: CN201911117779.4A
Authority: CN
Inventors: 毕国澍; 詹成; 尹嘉成; 范虹; 王群; 梁嘉琪; 胡正阳; 卞赟艺
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110669844A

Abstract

本发明公开了一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒，其包括：hsa‑miR‑6077检测体系，记载用于确定hsa‑miR‑6077表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当生物样本中hsa‑miR‑6077表达量不高于所述标准时，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感；反之当高于所述标准时，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗不敏感。本发明的试剂盒能够用于判断肺腺癌患者是否适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗方案，从而实现精准医疗。

Description

一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒，具体涉及一种通过检测生物样本中hsa-miR-6077来判断肺腺癌患者是否适合采用培美曲塞+顺铂治疗的试剂盒。

背景技术

肺癌作为最为常见、死亡率最高的肿瘤，发病率和死亡率均排名所有肿瘤第一位。其中非小细胞肺癌占据了肺癌的绝大多数，而肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的一种亚型。培美曲塞是一种多靶点的抗叶酸药物，能够对多种叶酸依赖性酶起到抑制作用，从而达到抗肿瘤的功效。培美曲塞与顺铂联合化疗是肺腺癌的一线治疗方案，但由于耐药患者的存在，并非所有肺腺癌患者都可以从该治疗中获益。因此，准确地预判肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂联合化疗的敏感程度，对于提高患者的治疗效果、减轻社会的负担有着极为重要的意义。

目前已有部分报道提出一些可能的生物标志物(如胸苷酸合酶等)用于预判肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂联合化疗的敏感性，但由于成本高昂、流程繁琐、准确率低等原因，并未能广泛用于临床，仍可能有着具备更高敏感性、特异性和应用价值的标志物可以应用于肺腺癌患者个体化化疗方案的制定。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20～25个核苷酸。miRNA参与各种各样的调节途径，在肿瘤生成、增殖、代谢、凋亡中都发挥着极为重要的作用，在肿瘤诊断和监测等方面也有着广阔的发展前景。从miRNA中发掘出用于预判特定药物适用性即患者对特定药物治疗敏感性的生物标志物，将会有助于实现针对患者的精准医疗。

发明内容

发明人通过对肺腺癌miRNA图谱的全面***的分析验证，发现hsa-miR-6077中可用于预判肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂治疗的敏感性，填补了这一领域的空白，从而构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括如下技术方案：

一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒，其包括：hsa-miR-6077检测体系，用于检测生物样本中hsa-miR-6077的表达量；记载用于确定hsa-miR-6077表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当生物样本中hsa-miR-6077表达量不高于所述标准时，提示患者适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗，即患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感；反之，当生物样本中hsa-miR-6077表达量高于所述标准时，提示患者不适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗，即患者对培美曲塞+顺铂治疗不敏感。其中hsa-miR-6077的核苷酸序列为：

5’-GGGAAGAGCUGUACGGCCUUC-3’(SEQ ID NO:1)。

上述数学模型为：生物样本中hsa-miR-6077表达量表示为qPCR.Ct＝qPCR.Ct.miR.6077-qPCR.Ct.U6，即从生物样本中提取的hsa-miR-6077进行定量PCR的Ct值与内参的Ct值之差；所述标准为：qPCR.Ct取3.2为临界值，如果≥3.2，则hsa-miR-6077低表达，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感，不耐药，适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗；如果＜3.2，则hsa-miR-6077高表达，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗不敏感，耐药，不适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗。

优选地，上述内参可以是U6或者看家基因GAPDH，更优选U6作为内参对照。U6为一种细胞内表达稳定的小核酸RNA(small nuclear RNA，snRNA)，在miRNA的qPCR中常用作为内参使用。

上述载体可以是纸质说明书例如带有APP下载窗口比如二维码的说明书，或者是计算机程序储存装置或***比如U盘、网盘等。

在一种优选的实施方式中，上述试剂盒中还包括RNA提取分离体系，用于从生物样本中提取分离miRNA。

例如，上述RNA提取分离体系可以是天根生化科技(北京)有限公司的miRcutemiRNA提取分离试剂盒(DP501)。

在一种实施方式中，上述hsa-miR-6077检测体系可以是天根生化科技(北京)有限公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211)和miRcute^TM增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(FP411)。

上述hsa-miR-6077检测体系中hsa-miR-6077的PCR扩增引物序列为：

正向引物：5’-AACAAGGGGAAGAGCTGTACGG-3’(SEQ ID NO:2)；

反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO:3)。

上述作为内参的U6的实时定量PCR引物序列为：

正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO:4)，

反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO:5)。

上述生物样本可以选自下组：肺癌组织、血液、血浆、血清、体液、细胞。例如，上述生物样本可以是肺癌组织。

本发明的试剂盒可以检测患者样本中hsa-miR-6077的表达水平，判断肺腺癌患者是否对培美曲塞+顺铂的组合敏感，是否耐药，是否适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗方案，以免耽误患者的治疗，实现精准医疗的目的。

附图说明

图1是肺腺癌细胞株A549中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA(NC19和NC22)后分别用培美曲塞处理后细胞的生长曲线图。其中NC19是由锐博生物公司生产的一种miRNA对照mimic，产品编号为NC19(miR1N0000003-1-5)，长度为19nt；NC22是由锐博生物公司生产的另一种miRNA对照mimic，产品编号为NC22(miR1N0000001-1-5)，长度为22nt。

图2是肺腺癌细胞株A549中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA(NC19和NC22)后分别用顺铂处理后细胞的生长曲线图。

图3是肺腺癌细胞株A549中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA(NC19和NC22)后分别用培美曲塞和顺铂联合处理后细胞的生长曲线图。

图4是肺腺癌细胞株H1975中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA(NC19和NC22)后分别用培美曲塞处理后细胞的生长曲线图。

图5是肺腺癌细胞株H1975中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA(NC19和NC22)后分别用顺铂处理后细胞的生长曲线图。

图6是肺腺癌细胞株H1975中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA(NC19和NC22)后分别用培美曲塞和顺铂联合处理后细胞的生长曲线图。

图7是对34例肺腺癌患者根据hsa-miR-6077表达水平分类后使用R语言中的survminer包、survival包及ggplot2包绘制的生存曲线。其中最佳截断值由R的survminer包确定，截断值设定为3.235765。高于此值这设为低hsa-miR-6077表达组，低于此值者设定为高hsa-miR-6077表达组。求得C指数为0.64。

具体实施方式

在本发明中，术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”表示相同的意义，可以互换，它们都是指微小RNA，即非编码单链RNA分子。

本发明首次发现了hsa-miR-6077这种miRNA可以应用于肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感性的判断中，从而作为预判患者是否适合于接受培美曲塞+顺铂联合治疗的生物标志物。

在从miRNA中发掘该用途的生物标志物时，发明人应用Crispr/Cas9全基因组高通量耐药基因筛选技术研究了A549细胞内近2000种miRNA，比较它们与肺腺癌对培美曲塞联合顺铂治疗敏感程度的相关性，发现hsa-miR-6077基因敲除后肺腺癌细胞的增殖活性更加受到培美曲塞+顺铂的抑制。随后我们在转染hsa-miR-6077的肺腺癌细胞中检测对培美曲塞或顺铂的耐药能力，发现hsa-miR-6077表达水平提升后肺腺癌细胞对培美曲塞或顺铂耐药能力显著增高。由此推断其适合于作为预后指标判断肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂联合治疗的敏感性。随后我们采用qPCR的方法检测34例接受培美曲塞+顺铂治疗的患者手术切除标本中hsa-miR-6077的表达情况，并分析其预后情况，发现hsa-miR-6077低表达的患者对培美曲塞+顺铂治疗较高表达患者更为敏感，预后较好，从而确定了该miRNA在肺腺癌患者中的表达差异，在判断肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感程度或耐药性方面具有应用价值。

在用miRNA检测试剂盒对生物样本中各miRNA的表达水平进行定量后，可用数学分析方法进行统计学处理，比如使用R语言中的survminer包实现生存分析，在此基础上获得具有样本分类意义的miRNA表达高/低分界标准分界标准。这样的数学方法优选由计算机完成，对患者进行分类，并建立数学模型。

为描述简便起见，本文中可以直接将公式qPCR.Ct＝qPCR.Ct.miR.6077-qPCR.Ct.U6简称为数学模型，本领域技术人员显然理解，其包含qPCR.Ct取3.2为分类临界值的标准，即＜3.2属于hsa-miR-6077高表达、≥3.2属于hsa-miR-6077低表达。

作为上述数学模型的具体应用方式，其允许以计算机软件(计算机程序)形式被输入基因检测设备比如基因测序仪的信息处理模块、或者被输入或者被输入PCR仪的信息处理模块。而且，上述数学模型还允许以计算机软件(计算机程序)形式被输入智能医疗***、或者被输入医生的电脑中，帮助医生确定肺腺癌治疗方案，实施精准医疗。

在优选的实施方式中，上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频APP下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如CD、U盘、网盘等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

实施例中所用的RNA提取试剂盒、miRNA定量检测试剂盒皆由天根生化科技(北京)有限公司提供，PCR所用DNA序列和引物由天根生化科技(北京)有限公司合成。按试剂盒说明书操作。

人肺腺癌细胞株A549和H1975由复旦大学附属中山医院提供，培养条件：在含10％FBS的DMEM/F12培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)中，于37℃、5％CO₂培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)中培养。

实施例1采用Crispr/Cas9技术进行全基因组高通量耐药基因筛选

1.1根据已有的Crispr/Cas9敲除文库构建一系列sgRNA，将其转染入肺腺癌细胞A549中，通过采用合适的病毒用量，保证每个细胞仅转入一种sgRNA或者未转入sgRNA，随后使用嘌呤霉素处理杀死未转入sgRNA的细胞。由此得到的每个A549细胞中都会有随机的某个基因(miRNA)被敲除。

1.2随后，使用化疗药物培美曲塞+顺铂对某个miRNA基因敲除后的细胞进行处理筛选，敏感细胞的增殖会受到抑制甚至死亡，而耐药细胞的正常增殖则不受影响。当敲除某个基因导致细胞对药物敏感性增加时，这种细胞以及该基因对应的sgRNA在所有细胞和所有sgRNA中比例将随着处理时间的延长而变得越来越低。通过分别对处理前和处理后的细胞中sgRNA进行高通量测序分析，我们可以推断敲除每种miRNA后细胞增殖情况的改变。经过这一步骤，我们研究了近2000种miRNA，发现其中一种miRNA基因即hsa-miR-6077敲除的细胞亚群在培美曲塞+顺铂处理后较对照显著减少。实验数据如下表1所示：

表1、hsa-miR-6077基因敲除的细胞亚群在培美曲塞+顺铂处理前后的变化

此处，Log(Fc)_p&c表示某种sgRNA在细胞经过培美曲塞+顺铂处理7天后与加药处理之前的表达值改变的倍数的对数值，而Log(Fc)_DMSO表示对照组，即同一种sgRNA在经过DMSO处理7天后与加药处理之前的表达值改变的对数值。由此可推断，hsa-miR-6077敲除后，肺腺癌细胞对培美曲塞+顺铂耐药能力减弱。

实施例2肺腺癌细胞转染入hsa-miR-6077后对培美曲塞+顺铂耐药性的改变

我们在A549和H1975肺腺癌细胞中分别转染入hsa-miR-6077和两种对照miRNA即N19、N22(锐博生物公司生产的两种miRNA对照NC19(miR1N0000003-1-5)和NC22(miR1N0000001-1-5))，随后分别用培美曲塞、顺铂和培美曲塞+顺铂对转染hsa-miR-6077后的细胞进行处理。处理后采用CCK8检测细胞增殖能力。实验结果如图1-图6所示。研究发现，与对照相比，转染入hsa-miR-6077的A549和H1975肺腺癌细胞在经过培美曲塞或顺铂处理后增殖能力显著强于对照组N19和N22。

由此可推断，在hsa-miR-6077表达水平增高后，肺腺癌细胞对培美曲塞+顺铂耐药能力增强，敏感程度减弱。

在确定了hsa-miR-6077基因与肺腺癌细胞对培美曲塞+顺铂耐药性的相关性之后，需要进一步考察hsa-miR-6077在接受培美曲塞+顺铂联合化疗的肺腺癌患者肿瘤组织中的表达情况和患者预后分析。

实施例3肺腺癌患者样本分析方案

我们采用qRT-PCR的方式，检测hsa-miR-6077在34例接受培美曲塞+顺铂联合化疗的肺腺癌患者肿瘤组织中的表达情况。随后对患者进行长达5年以上的随访，比较这些miRNA与患者预后的关联情况。为此，设计了如下具体步骤：

1.提取组织样本中的miRNA。

2.采用qRT-PCR检测hsa-miR-6077的表达。

3.随访患者生存情况(>5年)。

4.利用R语言中的survival包和ggplot2包绘制生存曲线，分析检测结果。

实施例4组织样本中miRNA提取

采用天根生化科技(北京)有限公司miRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501)提取肺癌组织样本中的miRNA。具体操作包括如下步骤：

4.1样品处理：将肺癌组织在液氮中磨碎，每30～50mg肺癌组织加1ml裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不超过裂解液MZ体积的十分之一。

4.2将匀浆样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

4.3在4℃、12,000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

4.4加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。

4.5在4℃、12,000rpm离心15min，样品分成三层：黄色的有机相、中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。

4.6量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入向吸附柱miRspin中，室温下12,000rpm离心30sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。

4.7量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温下12,000rpm离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。

4.8向吸附柱miRelute中加入500μl去蛋白液MRD，室温静置2min，室温下12,000离心30sec，弃废液。

4.9向吸附柱miRelute中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，室温下12,000rpm离心30sec，弃废液。重复该步骤。

4.10将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温下12,000rpm离心1min，去除残余液体。

4.11将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5ml离心管中，加15-30μlRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，室温下12,000rpm离心2min。

4.12将得到的miRNA在-70℃保存备用，以防降解。

实施例5加Poly尾和逆转录

使用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211)进行miRNA第一链cDNA的Poly加尾和反转录，具体操作包括如下步骤：

5.1在0.2ml离心管中加入2μl 10×Poly Buffer、4μl 5×rATP Solution、13.6μlRNA提取液、0.4μl Ecoli Poly聚合酶(最后加聚合酶)，用移液器混匀，短暂离心；37℃下60分钟。

5.2在0.2ml离心管中加入1μl RNasin、13.5μl加尾液、2μl 10×RT Buffer缓冲液、1μl Super Pure dNTP、2μl 10×RT Primer引物、0.5μl Quant RTase，用移液器混匀，短暂离心；37℃下60min；得到miRNA的加尾及逆转录产物cDNA。

实施例6实时定量PCR和miRNA定量分析

实时定量PCR：使用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute^TM增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(FP411)，通过实时定量PCR对cDNA进行扩增，具体操作如下：

6.1加入2μl Reverse Primer、2μl microRNA引物、1.6μl 50×ROX、10μl 2×Premix、4.4μl cDNA液，混匀；每个样本设置3个副孔。hsa-miR-6077的cDNA的PCR引物序列(5’-3’)如下所示：

正向引物：5’-AACAAGGGGAAGAGCTGTACGG-3’(SEQ ID NO:2)；

反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO:3)。

PCR条件为：94℃2分钟预热，94℃20秒+60℃34秒，共40个循环。

6.2采用天根公司所提供的miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒，在LifeTechnology公司所提供的7500HT荧光定量PCR仪上进行检测。

获得hsa-miR-6077的Ct值。

6.3同样地，对于内参U6实施相同的操作。U6的实时定量PCR引物序列为：

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO:4)，

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO:5)。

获得U6的Ct值。

实施例7 hsa-miR-6077表达量高低标准的建立

随访接受培美曲塞+顺铂联合化疗的肺腺癌患者的生存情况，每年一次，连续5年以上，最长随访时间为10年。对34例肺腺癌患者根据hsa-miR-6077表达水平分类后使用R语言中的survminer包、survival包及ggplot2包绘制的生存曲线，参见图7。生存曲线中最佳截断值由R的survminer包确定，截断值设定为3.235765。高于此值这设为低hsa-miR-6077表达组，低于此值者设定为高hsa-miR-6077表达组，求得C指数为0.64。该生存曲线表明，miR-361-5p在肺腺癌组织中表达丰度较高，两组之间生存差异显著，可用于预判肺腺癌患者对培美曲塞+顺铂治疗的敏感性。

绘制图7所示生存曲线时，使用的survminer包的lung数据集如下表2所示。

表2、肺腺癌患者的统计数据

其中，survival表示患者生存时间，单位是月；status表示患者结局，0表示删失(即在研究结束后仍存活或者中途失访未随访到死亡)，1表示死亡；Low hsa-miR-6077表示hsa-miR-6077低表达，High hsa-miR-6077表示hsa-miR-6077高表达。

根据该表2中的数据，可以建立一种用于确定hsa-miR-6077表达量高/低分界标准的数学模型，该数学模型将hsa-miR-6077表达量表示为qPCR.Ct＝qPCR.Ct.miR.6077-qPCR.Ct.U6，即从生物样本中提取的hsa-miR-6077进行定量PCR的Ct值与内参的Ct值之差。表达量高/低分界标准可以是：qPCR.Ct取3.2为临界值是比较合理的，其为生存曲线中的截断值3.235765的简化值，如果≥3.2，则hsa-miR-6077低表达，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感，不耐药，适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗；如果＜3.2，则hsa-miR-6077高表达，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗不敏感，耐药，不适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗。

以上实验结果表明，本发明的试剂盒可用于检测患者样本中hsa-miR-6077的表达水平。肺腺癌患者肿瘤样本中hsa-miR-6077的表达低，则患者对培美曲塞+顺铂敏感；若hsa-miR-6077表达高，则患者对培美曲塞+顺铂耐药。因此借助上述数学模型，医生可以判断肺腺癌患者是否适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗方案，实现精准医疗。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> 一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒

<130> SHPI1910682

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人()

<400> 1

gggaagagcu guacggccuu c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aacaagggga agagctgtac gg 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cagtgcaggg tccgaggt 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗对肺腺癌患者适用性的试剂盒，其包括：hsa-miR-6077检测体系，用于检测生物样本中hsa-miR-6077的表达量；记载用于确定hsa-miR-6077表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当生物样本中hsa-miR-6077表达量不高于所述标准时，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感；反之，当生物样本中hsa-miR-6077表达量高于所述标准时，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗不敏感，所述hsa-miR-6077的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述数学模型是生物样本中hsa-miR-6077表达量表示为qPCR.Ct＝qPCR.Ct.miR.6077-qPCR.Ct.U6，即从生物样本中提取的hsa-miR-6077进行定量PCR的Ct值与内参的Ct值之差；所述标准为：qPCR.Ct取3.2为临界值，如果≥3.2，则hsa-miR-6077低表达；如果＜3.2，则hsa-miR-6077高表达。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内参是U6。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取分离体系，用于从生物样本中提取分离miRNA。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取分离体系是miRcute miRNA提取分离试剂盒DP501。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述hsa-miR-6077检测体系是miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒KR211和miRcute^TM增强型miRNA荧光定量检测试剂盒FP411。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述hsa-miR-6077检测体系中的PCR扩增引物序列为正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:3。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体是纸质说明书或者计算机程序储存装置或***。

9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物样本选自下组：肺癌组织、血液、血浆、血清、体液、细胞。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述生物样本是肺癌组织。