CN110669705B - 一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ca1及其在促进袖珍菇生长中的应用 - Google Patents

一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ca1及其在促进袖珍菇生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1及其在促进袖珍菇生长中的应用，涉及食用菌生物技术领域，该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)CA1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏编号CCTCC No:M 2019636，保藏地址：中国武汉武汉大学。将该细菌的发酵液添加到袖珍菇的培养料中，菌丝日生长量、菌盖长度、出菇产量均有明显提高，能够有效缩短袖珍菇的生产周期；同时由于促生细菌来源于袖珍菇根际细菌，利用促生细菌与袖珍菇的互作关系可有效减少辅料用量，具有高效、安全、无毒的特点。

Description

一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1及其在促进袖珍菇生长中的 应用
技术领域
本发明涉及食用菌生物技术领域，具体涉及一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1 及其在促进袖珍菇生长中的应用。
背景技术
袖珍菇：又名紫孢侧耳，别名小平菇、姬菇、黄白平菇，美味侧耳。秀珍菇子实体形态优美，菌盖厚实，质地脆嫩，味道鲜美，颇受消费者欢迎，是今后平菇生产的一个优良换代品种。含粗蛋白、碳水化合物、纤维、硫胺素、核黄素、烟酸、钙、铁、钾、钠、磷。其中蛋白质的含量，比目前国内栽培的平菇、双孢蘑菇、香菇和草菇都高，而且人体八种必需氨基酸全都具备，其含量占所有氨基酸总量的35％以上。所以经常食用袖珍菇，可以增强人体健康。另据最近研究证实，袖珍菇含有的一些生理活性物质，具有诱发干扰素的合成，提高人体免疫功能，具有防癌、抗癌的作用。袖珍菇含脂肪、淀粉很少，还有降低胆固醇的作用，是糖尿病人和肥胖症患者的理想食品、健康食品、安全食品。
虽然袖珍菇生产有栽培方法简单的特点，但是随着市场需求的多样化和健康生活理念的普及，市场对袖珍菇产量需求逐年增加。为了提高袖珍菇的产量，农户一般会采取追肥、覆土或覆草木灰、使用生长调节剂、喷洒杀虫剂等通过化学试剂来增加产量的措施。这些方法虽然能够使产量有所增加，但同时也会存在农药残留现象给消费者带来损害。
食用菌栽培料一般经巴氏杀菌、堆积发酵处理或采用生料，因此，培养料中存在着多种微生物，有些微生物对食用菌的生长发育具有促进作用，利用食用菌与促生细菌的互作关系可有效减少辅料用量，提高食用菌生产经济和社会效益，有效避免药物残留、环境污染等问题。所以寻找一种能够促进袖珍菇产量增加且不会造成人体健康危害和环境污染的微生物及其菌剂显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1，能够对袖珍菇的生长发育起到促进作用；本发明所要解决的另一技术问题是提供纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1在促进袖珍菇生长中的应用，以解决现有技术中化学肥料促生效率低，效果不明显，农药残留，污染环境的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，其分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)CA1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期： 2019年8月16日，保藏编号CCTCC No:M 2019636，保藏地址：中国武汉大学。
所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1在促进袖珍菇生长中的应用。
所述的应用，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1以发酵液的方式加入袖珍菇的培养料中。
所述培养料干燥状态下按照重量比例由以下原料组成：杂木屑55％、甘蔗渣40％、黄豆粉2％、石膏2％、过磷酸钙1％。
所述培养料中纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1的活菌数为1×104～107cfu/g。
所述发酵液由以下步骤制成：
1)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1菌株接种于NA培养基中，28℃培养3～ 4d，得到活化的菌株；
2)将步骤1)活化的菌株接种于NA液体培养基中，在28℃、180r/min 的条件下培养48h，制得细菌发酵液。
所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1发酵液在促进袖珍菇生长中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明从子实体、菌袋、覆土栽培食用菌的土样中筛选分离并鉴定了一种促进袖珍菇生长的细菌纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1，将该细菌的发酵液添加到袖珍菇的培养料中，菌丝日生长量、菌盖长度、出菇产量均有明显提高，能够有效缩短袖珍菇的生产周期；同时由于促生细菌来源于袖珍菇根际细菌，利用促生细菌与袖珍菇的互作关系可有效减少辅料用量，提高袖珍菇的生产经济和社会效益，具有高效、安全、无毒的特点。
附图说明
图1是纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1细菌活体本身与袖珍菇菌株在平板上共培养5d后的结果图；左图是细菌菌液组，右图是无菌水对照组；
图2是纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1细菌代谢物与袖珍菇菌株在平板上共培养5d后的结果图；左图是细菌菌液过滤液组，右图是无菌水对照组；
图3是纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1的革兰氏染色镜检图；
图4是纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1对袖珍菇子实体产量的影响图；
图5是纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1的***进化树图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
1)样品采集与保存
于济宁市常生源菌业有限公司随机采集袖珍菇子实体、菌袋、覆土栽培食用菌的土样，采用无菌操作取样，取样后分别放入无菌袋，-20℃保存。
2)细菌的纯化与保存
准确称取待测土样1g，放入装有9mL无菌水的已灭过菌试管中，置摇床上28℃，170r/min，振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸菌液使其混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸均匀，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。
取10-4、10-5、10-6三个梯度涂布平板，用无菌吸管吸取1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的NA培养基上(每个编号设三个重复)。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌涂布棒，更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒置，28℃恒温培养24h。
通过梯度稀释法，从根际土样中共分离得到78个细菌分离物，将其分别挑至NA培养基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15-20g、水1000mL， pH7.2-7.4)上进行划线操作，置于28℃下培养3-4d。
3)增菌培养
将初筛分离纯化后保存的菌株接入NA液体培养基(牛肉膏5g、蛋白胨10 g、氯化钠5g、水1000mL，pH7.2-7.4)的锥形瓶中，于28℃、180r/min摇床中培养48h，得到培养好的细菌菌液；
4)促生细菌的筛选
a.细菌活体本身的促生功能
用移液枪按无菌操作要求将细菌菌液各取0.2mL于加富培养基(葡萄糖20 g、马铃薯200g、蛋白胨10g、酵母膏3g、琼脂15-20g、水1000mL，pH7.0) 中，用涂布棒均匀涂抹，用打孔器取1厘米袖珍菇菌丝，放于涂好细菌的平板中央。对照组加入0.2mL的无菌水，接种后置于28℃培养箱培养，观察菌丝生长状况；培养5d时结果如图1所示。
b.细菌代谢物的促生功能
取培养好的细菌菌液20mL，通过过滤器(0.22μm)加入到无菌锥形瓶中，得到菌悬液，移液枪取0.2mL的菌悬液加入加富培养基中并涂布，用打孔器取袖珍菇菌丝，放于涂好菌悬液的平板中央。对照组加入0.2mL的无菌水，接种后置于28℃培养箱培养，观察菌丝的生长状况，培养5d时结果如图2所示。
待菌丝生长良好后，与对照组作比较，取较对照组生长更为旺盛(表1)的菌即为有促生功能的细菌。
表1菌株对袖珍菇菌丝生长的影响
菌丝生长情况 生长量(cm/d) 差异显著性(ê＝0.01)
细菌菌液 浓密、较粗壮 0.62 A
细菌菌液过滤液 浓密，较粗壮 0.59 A
对照组 稀疏、纤细 0.48 B
对该菌株进行16S rDNA序列进行扩增，序列如SEQ ID NO.1所示，将所测 16SrDNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，该菌株与Lysinibacillus fusiformis有较近亲缘关系，属于纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的变种或亚种。菌体形态特征：革兰氏阴性，无荚膜，呈杆状，部分菌体顶端生有圆形芽孢，菌体大小约为1.0-1.5×0.5-0.8μm。菌落形态特征：在NA培养基上菌落圆形、表面光滑、不透明，颜色乳白色，直径约1.5-2mm；菌体杆状。菌株的生理生化特征如表2所示。
表2菌株的生理生化特征
Figure BDA0002278427620000041
Figure BDA0002278427620000051
结合形态特征、生理生化性质及16S rDNA基因序列分析，鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)CA1。
实施例2
1)菌剂制备
将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1的活化菌株接种于种子扩大培养基(淀粉6～ 20g/L、K2HPO3 4～12g/L、硫酸铵2～5.5g/L、酵母膏0.5～5g/L、蔗糖4～10g/L、 MgSO4 2～5g/L、CaCO3 2～5g/L、SiO2 2～10g/L、FeCl3 0.02～1g/L，pH 7.2～ 7.4)中，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养18～24h，制得种子液；
将制得的种子液接种于发酵培养基(蔗糖2～5g/L、K2HPO3 2～5g/L、酵母膏1.2～5g/L、硫酸铵0.2～5g/L、大豆蛋白胨1.5～5g/L、MgSO4 0.4～5g/L， pH7.2～7.4)中，接种量5～10％(体积百分比)，在28～32℃、控制发酵罐的搅拌转速为150～200r/min的条件下培养48～72h，控制通气量1:0.5-2vvm，即得发酵液。纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在发酵液中的有效菌数在1.0×109cfu/mL～2.0 ×109cfu/mL。
固态促生菌剂的制备方法为：将上述发酵液与载体混匀，制备成固态促生菌剂，载体为玉米秸秆粉，发酵液：载体含量之比为1.5～2:3，玉米秸秆粉中含有可溶性碳、氮源等营养物质可被菌种分解，载菌效果好，活菌量高，原料的生产和采集环保无公害，制备的菌剂产品使用方便，载体基质施入菌袋或土壤中后可降解，不会对食用菌生长环境产生负面影响。
2)纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1在促进食用菌生长中的应用
采用的袖珍菇来自于济宁市常生源菌业有限公司，并在食用菌基地日光温室中培养，进行产量对比试验。基地中温度适宜、水分含量适中，适合于正常的袖珍菇生长。
采用23cm×36cm的聚乙烯袋栽培袖珍菇。拌料时应将各种料混匀，每袋装料2kg，然后在袋的一头加套环再用塑料膜封口，高压灭菌2h，灭菌后待料温自然降至常温时，在菌袋开口后向菌袋施入该促生菌菌液(发酵液)，施入量为每千克培养料5mL。设4个浓度梯度，分别施入细菌数为每克培养料104、105、 106、107cfu(分别为A、B、C、D)，每个处理的总施入量相同，对照组(CK) 施入相同量的无菌水，每个处理6个重复。然后向其中接袖珍菇栽培种，接种量为每袋培养料重量的5％。发菌期在智能温控的菇房中进行，菌丝生长温度为 23～26℃，湿度65～70％，注意避光；子实体生长温度12～20℃，出菇阶段空气相对湿度85～95％。接种完毕后，将菌袋稀疏立式码放，以利通风，采用落地墙式出菇。要常通风换气，保持空气新鲜，增加散射光照。发菌期间应每隔7～10 天检查一次，发现有杂菌者应立即捡出，以防蔓延。按常规栽培方法进行出菇管理，记录各处理组中菌丝生长速度，子实体性状，采收时菌盖长度，出菇产量，具体见表3，表4所示。
所用的培养料成分为：杂木屑55％、甘蔗渣40％、黄豆粉2％、石膏2％、过磷酸钙1％。
表3纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1对袖珍菇菌丝生长的影响
项目 A B C D CK
菌丝萌发 +++ +++ +++ +++ +++
菌丝生长状态 ++ ++ +++ +++ ++
菌丝生长量/cm 0.460 0.495 0.562 0.595 0.457
长满菌丝袋天数/d 28 27 26 26 29
注：“+”越多表示菌丝生长越好。
表4纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1对袖珍菇子实体生长及产量的影响
项目 A B C D CK
出菇整齐度 +++ +++ ++++ ++++ +++
子实体商品外观 +++ +++ ++++ ++++ +++
菌盖平均宽度/cm 3.42 3.58 4.35 4.18 3.30
出菇平均产量(g/袋) 435.5 450.2 455.6 475.2 430.8
注：“+”越多表示子实体生长越好。
结果显示，将该细菌的发酵液添加到袖珍菇的培养料中，菌丝日生长量、菌盖长度、出菇产量均有明显提高，能够有效缩短袖珍菇的生产周期。
需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 曲阜师范大学
<120> 一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1及其在促进袖珍菇生长中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> Lysinibacillus fusiformis
<400> 1
gccgtggcgg cgtgctatac atgcagtcga gcgaacagaa aaggagcttg ctcctttgac 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctacc ctatagtttg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc gaataatctc ttttgcttca tggtgaaaga ctgaaagacg 180
gtttcggctg tcgctatagg atgggcccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg gcgaaagcct 360
gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgtaaggg 420
aagaacaagt acagtagtaa ctggctgtac cttgacggta ccttattaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtcctttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccaagtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat ttggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcccgttgac cactgtagag atatagtttc cccttcgggg gcaacggtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccatcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggacg atacaaacgg ttgccaactc gcgagaggga gctaatccga 1260
taaagtcgtt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc cggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttgg agccagccgc 1440
cgaaggttgg attgggtttt 1460

Claims (6)

1.一株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，其分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）CA1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏编号CCTCC No:M 2019636，保藏地址：中国武汉大学。
2.权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1在促进袖珍菇生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1以发酵液的方式加入袖珍菇的培养料中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养料干燥状态下按照重量比例由以下原料组成：杂木屑55%、甘蔗渣40%、黄豆粉2%、石膏2%、过磷酸钙1%。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养料中纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1的活菌数为1×104～107 cfu/g。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液由以下步骤制成：
1）将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CA1菌株接种于NA培养基中，28 ℃培养3～4 d，得到活化的菌株；
2）将步骤1）活化的菌株接种于NA液体培养基中，在28 ℃、180 r/min的条件下培养48h，制得细菌发酵液。
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