CN110662833A - 间充质干细胞的制造方法、间充质干细胞的治疗效果标志物和治疗效果判断方法、以及包含间充质干细胞的细胞制剂 - Google Patents

间充质干细胞的制造方法、间充质干细胞的治疗效果标志物和治疗效果判断方法、以及包含间充质干细胞的细胞制剂 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于，提供包含治疗效果好的MSC的细胞制剂。提供一种活化的MSC的制造方法，包括使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体在含有哺乳动物胎儿附属物来源的活化剂的培养基中培养MSC的工序。此外，还提供选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的MSC治疗效果标志物、使用同一标志物的治疗效果判断方法、判断MSC对用于提高治疗效果的处理的适应性的方法、包含MSC的细胞制剂及其制造方法。

Description

间充质干细胞的制造方法、间充质干细胞的治疗效果标志物 和治疗效果判断方法、以及包含间充质干细胞的细胞制剂
技术领域
本发明涉及间充质干细胞的制造方法、用于评价间充质干细胞的治疗效果的标志物、判断间充质干细胞的治疗效果的方法、判断间充质干细胞对用于提高治疗效果的处理的适应性的方法和包含间充质干细胞的细胞制剂。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，以下也称为MSC)是具有多能性和自我复制能力的干细胞，不仅具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等属于间充质的细胞的能力，还具有超过胚层的、分化为神经细胞、肝细胞等的能力。此外，已知MSC还具有自身产生的体液因子带来的旁分泌效应和细胞黏附相互作用。人们认为，基于这些作用，MSC发挥目标组织、细胞的修复-再生能力和抗炎症等免疫调节能力，其结果是，显示出对于各种疾病的治疗效果。
MSC由于容易分离培养且增殖力旺盛，能够在短时间内确保可移植的细胞数；能够进行没有免疫排斥的自身移植；伦理问题也少；由于低免疫原性而无需预处理，同种移植是现实的等；因而作为理想的细胞移植疗法材料，正在进行针对多种疾病治疗的应用的研究。
本发明人等在使用MSC的细胞移植疗法确立过程中发现：患者例如糖尿病患者的MSC是异常MSC，具体而言，作为失去前述那样多样的能力或这些能力比正常MSC降低的结果，MSC失去疾病治疗效果或治疗效果比正常MSC降低；来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物能够使前述异常MSC活化而恢复治疗效果；并且能够实现使用该活化的MSC的自身移植治疗等，从而发明了含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的针对异常MSC的活化剂，申请了专利(专利文献1)。该活化剂尤其在针对处于必须治疗阶段的患者也能够实现MSC自身移植的方面，具有重要的意义。
专利文献1中记载的针对异常MSC的活化剂可以作为来自哺乳动物的胎儿附属物、例如人的脐带组织、胎盘组织的提取物进行制造。幸运的是，包括人在内的哺乳动物的胎儿附属物是比较容易获得、且可以期待一定的供应量的生物学试样。然而，对于能够对期望应用使用MSC细胞移植疗法的患者、例如世界性持续增加的大量糖尿病患者进行MSC自身移植而言，哺乳动物的胎儿附属物和从其中提取的活化剂的供应量很难说是足够的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2015/137419号小册子
发明内容
发明所要解决的课题
根据本发明人等的研究，明确了：活化剂不仅能够提高异常MSC的治疗效果、而且能够提高健康人的MSC治疗效果；另一方面，存在即使用活化剂处理，也几乎观察不到治疗效果提高的MSC等。如上所述，含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂是需要有效利用的珍贵物质，即使有结果，用于几乎观察不到治疗效果提高的MSC也是不优选的。进一步，即使用活化剂处理也观察不到治疗效果提高的MSC即使对患者给药，也不能期待其效果，因此希望在给药前确认其活性。
因此，本发明的目的在于，提供在使用含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂活化的MSC的制造中，更有效地使MSC活化的方法。本发明的目的还在于，提供评价MSC治疗效果的方法，提供判断从对象分离到的MSC是否具有对于利用活化剂的处理等意在提高治疗效果的处理的适应性的方法，并且提供含有治疗效果好的MSC的细胞制剂。
用于解决课题的方法
本发明人等发现，通过在具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体上使异常MSC活化，能够用更少量的活化剂制造治疗效果更好的活化的MSC，并且，通过在前述细胞培养载体上在活化剂的存在下培养，正常MSC也被活化。进一步，本发明人等对治疗效果好的MSC的基因表达图谱进行分析，还发现了特定的基因表达变化。下述各发明是基于这些见解完成的。
(1)一种活化的MSC的制造方法，包括用含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂处理MSC的活化工序，活化工序是使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体在含有前述活化剂的培养基中培养MSC的工序。
(2)根据(1)所述的制造方法，细胞培养载体在与细胞接触的面上具有由具有纳米～微米单位的平均纤维直径的纤维形成的开口部。
(3)根据(2)所述的制造方法，开口部的平均直径为500nm～1000μm。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的制造方法，细胞培养载体为含有由生物降解性聚合物构成的纳米纤维的细胞培养载体。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的制造方法，培养基中活化剂的浓度为使用不具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养MSC的活化工序中的培养基中活化剂浓度的1/10～1/100000。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的制造方法，培养基中活化剂的浓度按蛋白质换算为0.01μg/mL～500μg/mL。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的制造方法，活化工序中细胞的继代次数为2次以下。
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的制造方法，MSC为骨髓来源的MSC。
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的制造方法，MSC为从有疾病的对象分离的MSC。
(10)一种含有MSC的细胞制剂，CD47阳性细胞的比例为2％以下。
(11)根据(10)所述的细胞制剂，MSC为通过(1)至(9)中任一项所述的方法制造的活化的MSC。
(12)一种含有MSC的细胞制剂的制造方法，包括从MSC簇中浓缩CD47阴性MSC的工序。
(13)一种与MSC治疗效果正相关的用于评价MSC治疗效果的标志物，其选自由p16ink4a和p14ARF组成的组。
(14)一种与MSC治疗效果负相关的用于评价MSC治疗效果的标志物，其选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组。
(15)一种判断MSC治疗效果的方法，包括：测定待测MSC中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；将测得的表达量与对照MSC中表达量进行比较的比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比对照MSC少的情况下，判断为待测MSC治疗效果比对照MSC好的判断工序。
(16)根据(15)所述的方法，
测定工序进一步包括测定待测MSC中的(A)和/或(B)的表达量，其中，
(A)为选自由DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6和TERT组成的组的至少1个基因或蛋白质，
(B)为选自由p53和α-SMA组成的组的至少1个基因或蛋白质；
判断工序为下述工序：在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况，以及前述(A)的基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多的情况和/或前述(B)的基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况下，判断为待测MSC治疗效果比对照MSC好。
(17)一种判断MSC治疗效果的方法，代替(15)或(16)所述的方法的测定工序中CD47基因或蛋白质的表达量，测定MSC中CD47阳性细胞的比例；代替判断工序中CD47基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况，在MSC中CD47阳性细胞的比例在待测MSC中比在对照MSC中低的情况下，判断为待测MSC治疗效果比对照MSC好。
(18)根据(15)至(17)中任一项所述的方法，待测MSC为在包含含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂的培养基中培养的MSC。
(19)根据(15)至(18)中任一项所述的方法，待测MSC为使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养的MSC。
(20)根据(15)至(19)中任一项所述的方法，待测MSC为从欲接受MSC自身移植疗法的对象分离的MSC。
(21)根据(15)至(20)中任一项所述的方法，待测MSC为骨髓来源的MSC。
(22)一种判断MSC对用于提高MSC治疗效果的处理的适应性的方法，包括：测定经处理的MSC中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；将测得的表达量与未处理的MSC中表达量进行比较的比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况下，判断为该MSC适合该处理的判断工序。
(23)根据(22)所述的方法，
测定工序进一步包括测定经处理的MSC和未处理的MSC各自中的(A)和/或(B)的表达量，其中，
(A)为选自由DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6和TERT组成的组的至少1个基因或蛋白质，
(B)为选自由p53和α-SMA组成的组的至少1个基因或蛋白质；
判断工序是下述工序：在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况，以及前述(A)的基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或前述(B)的基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况下，判断为该MSC适合该处理。
(24)一种判断MSC对处理的适应性的方法，在(22)或(23)所述方法的测定工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量，测定MSC中CD47阳性细胞的比例；在判断工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况，在MSC中CD47阳性细胞的比例在经处理的MSC中比在未处理的MSC中低的情况下，判断为该MSC适合该处理。
(25)根据(22)至(24)中任一项所述的方法，处理为在包含含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂的培养基中培养MSC的处理。
(26)根据(22)至(25)中任一项所述的方法，处理为使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养MSC的处理。
(27)根据(22)至(26)中任一项所述的方法，MSC为从欲接受MSC自身移植疗法的对象分离的MSC。
(28)根据(22)至(27)中任一项所述的方法，MSC为骨髓来源的MSC。
发明的效果
根据本发明的MSC制造方法，能够用量比以往少得多的活化剂进行MSC的活化，能够节省珍贵的活化剂的消耗量。此外，能够通过该制造方法制造的本发明的细胞制剂具有好的治疗效果，能够减少治疗等所必需的细胞数。给药细胞数的减少带来细胞培养继代次数的减少，产生细胞制剂的制造所需时间的缩短和成本的降低的效果。进一步，根据本发明的治疗效果标志物和判断方法，能够在向对象给药前判断MSC的治疗效果。而且，根据本发明的判断适应性的方法，能够在制备治疗所必需量的MSC之前，判断MSC对活化处理等处理的适应性。
附图说明
图1为显示对在具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体(以下也称为三维培养载体)上在活化剂的存在下培养的变形性髋关节症患者MSC(以下称为OA-MSC)的基因表达图谱进行聚类分析的结果的图。
图2为表示将在现有类型的二维结构细胞培养载体(以下称为二维培养载体)上在活化剂的存在下培养的OA-MSC、和在三维培养载体上在活化剂的存在下培养的OA-MSC中标志物基因的相对表达量与在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的OA-MSC的该基因相比的图表。
图3为显示在三维培养载体上培养的OA-MSC和在二维培养载体上培养的OA-MSC的外观的电子显微镜观察照片。左上对应的是不加入活化剂而在三维培养载体上培养的OA-MSC(倍率600倍)，右上对应的是加入活化剂而在三维培养载体上培养的OA-MSC(倍率200倍)，左下对应的是不加入活化剂而在二维培养载体上培养的OA-MSC(倍率700倍)，右下对应的是加入活化剂而在二维培养载体上培养的OA-MSC(倍率500倍)。
图4为显示在三维培养载体上培养的OA-MSC和在二维培养载体上培养的OA-MSC的外观的高倍放大电子显微镜观察照片。左上对应的是不加入活化剂而在三维培养载体上培养的OA-MSC(倍率3500倍)，右上对应的是加入活化剂而在三维培养载体上培养的OA-MSC(倍率2500倍)，左下对应的是不加入活化剂而在二维培养载体上培养的OA-MSC(倍率7000倍)，右下对应的是加入活化剂而在二维培养载体上培养的OA-MSC(倍率8000倍)。
图5为显示将在比较例的细胞培养载体上或其他在三维培养载体上在活化剂的存在下培养的OA-MSC的基因表达图谱根据三维培养载体的图谱进行聚类分析的结果的图。
图6为显示在其他三维培养载体上加入活化剂而培养的OA-MSC的外观的电子显微镜观察照片(倍率3500倍)。
图7为表示将在二维培养载体上在活化剂的存在下培养的健康人MSC和在三维培养载体上在活化剂的存在下培养的健康人MSC中OCT4、SOX2和TSG-6基因的相对表达量与在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的健康人MSC的这些基因相比的图表。
图8为显示使用用活化剂处理的OA-MSC给药的皮肤缺损模型大鼠皮肤切除后第3天和第7天的残留缺损面积的图表。
图9为显示使用用活化剂处理的OA-MSC给药的皮肤缺损模型大鼠皮肤切除7天后的皮肤缺损部的照片。
图10为显示使用用活化剂处理的OA-MSC给药的皮肤缺损模型大鼠皮肤切除21天后的皮肤组织断裂应力测定结果的图表。
图11为显示使用用活化剂处理的OA-MSC给药的阿尔茨海默病模型小鼠的、莫里斯水迷宫中的学***台的时间，横轴表示的是距离学习测试开始的天数。
图12为显示使用用活化剂处理的OA-MSC给药的阿尔茨海默病模型小鼠的、莫里斯水迷宫中的记忆测试的结果的图表。纵轴的象限时间表示的是学***台的4个分隔区域内游泳的时间相对于总游泳时间的比例。
图13为显示移植了用活化剂处理的OA-MSC的、抗癌剂处理后的糖尿病性肾病大鼠的血清肌酐的演变的图表。
图14为显示移植了用活化剂处理的OA-MSC的、抗癌剂处理后的糖尿病性肾病大鼠到移植后11周的生存率的演变的图表。粗线表示各组的平均值，细线表示各组的95％CI(置信区间)。
图15为显示对OA-MSC(n＝10)的基因表达图谱进行聚类分析的结果的图。
图16为显示对OA-MSC(n＝10)的基因表达图谱进行聚类分析的结果的图。
图17为显示将用活化剂处理的OA-MSC中基因表达量与未处理的MSC的该基因相比，算出的OCT4、SOX2、NANOG、IDO和TSG6各自的相对表达量与p16ink4a的相对表达量的相关性的图。
图18为显示将用活化剂处理的OA-MSC中基因表达量与未处理的MSC的该基因相比，算出的p14ARF的相对表达量与p16ink4a的相对表达量的相关性的图。
图19为显示OA-MSC(BM-021、BM-022、BM-023)中OCT4、p16ink4a和RB基因的相对表达量的图表。图中，将用活化剂处理的OA-MSC表示为PE+或PE+MSC，将未处理的OA-MSC表示为PE-或PE-MSC(关于以下的图也是同样的)。
图20为显示在三维培养载体上用活化剂处理的OA-MSC(BM-010)中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量的图表。
图21为表示将在三维培养载体上用活化剂处理的类风湿性关节炎患者MSC(RA)、老年人MSC(Aged)、肝硬化患者MSC和年轻人MSC(Young)各自中CD47基因的相对表达量与在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的MSC的该基因相比的图表。
图22为显示未处理的年轻人MSC和老年人MSC各自中细胞表面的CD47表达量的直方图。
图23为显示在三维培养载体上用活化剂处理的年轻人MSC和老年人MSC各自中细胞表面的CD47表达量的直方图。
图24为显示OA-MSC(BM-008、BM-021、BM-005)中p16ink4a基因的相对表达量的图表。
图25为显示与OA-MSC(BM-008、BM-021、BM-005)共培养的RAW264.7细胞的吞噬能力的图表。
图26与为显示OA-MSC(BM-008、BM-021、BM-005)共培养的RAW264.7细胞中Fpr2(Formyl Peptide Receptor-2，甲酰肽受体)基因的相对表达量的图表。
图27为显示OA-MSC(BM-021)中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量的图表。
图28为显示使用用活化剂处理的或未处理的OA-MSC(BM-021)或PBS局部给药的多发性肌炎模型小鼠中总巨噬细胞(MΦ)、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞相对于除去死细胞之外的单核细胞的总数的比例的图表。
图29为显示使用用活化剂处理的或未处理的OA-MSC(BM-021)局部给药的多发性肌炎模型小鼠的后肢肌肉功能的图表。
图30为显示OA-MSC(BM-008)中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量的图表。
图31为显示使用用活化剂处理的或未处理的OA-MSC(BM-008)或PBS全身给药的多发性肌炎模型小鼠的肌肉功能的图表。
图32为使用用活化剂处理的或未处理的OA-MSC(BM-008)或PBS全身给药的多发性肌炎模型小鼠的肌肉组织HE染色图像。
图33为显示使用用活化剂处理的或未处理的OA-MSC(BM-008)或PBS全身给药的多发性肌炎模型小鼠的肌肉截面面积的图。
图34为显示在二维培养载体或三维培养载体上用活化剂处理的OA-MSC(BM-021)中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量的图表。
图35为表示将移植至抗癌剂处理后的糖尿病性肾病大鼠中的用活化剂处理的OA-MSC中OCT4、SOX2、NANOG、p16ink4a、p14ARF、IDO、α-SMA和TERT各个基因的相对表达量与在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的MSC的这些基因相比的图表。
图36为显示在三维培养载体上用活化剂处理的CDKN2A敲除OA-MSC的p16ink4a的表达的图像。
图37为显示使用在三维培养载体上用活化剂处理的CDKN2A敲除OA-MSC在小腿三头肌局部给药的多发性肌炎模型小鼠的肌肉组织层粘连蛋白染色图像(左)和肌肉截面面积的图(右)。
图38为显示使用过量表达CD47的OA-MSC给药的皮肤缺损模型小鼠从皮肤切除后第3天至第9天的创伤面积变化量的图表(左)和皮肤切除后第9天的皮肤缺损部的代表例的照片(右)。
图39为显示使用CD47阳性细胞率不同的2种OA-MSC给药的阿尔茨海默病模型小鼠的、莫里斯水迷宫中的学习测试的结果的图表。
图40为显示使用CD47阳性细胞率不同的2种OA-MSC给药的阿尔茨海默病模型小鼠的、莫里斯水迷宫中的记忆测试的结果的图表。
图41为表示将提取方法不同的在其他活化剂的存在下在二维培养载体或三维培养载体上培养的OA-MSC和在不存在活化剂下在三维培养载体上培养的OA-MSC中OCT4、SOX2和TSG-6基因的相对表达量与在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的健康人MSC的这些基因相比的图表。
图42为表示将提取方法不同的在其他活化剂的存在下在二维培养载体或三维培养载体上培养的OA-MSC和在不存在活化剂下在三维培养载体上培养的OA-MSC中p16ink4a基因的相对表达量与在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的健康人MSC的该基因相比的图表。
具体实施方式
活化的MSC的制造方法
本发明的第一方式涉及一种活化的MSC的制造方法，其包括用含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂处理MSC的活化工序，活化工序是使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体在含有前述活化剂的培养基中培养MSC的工序。
本发明中使用的MSC可以是从健康对象分离的MSC，也可以是从有疾病的对象分离的MSC。此外，本发明中使用的MSC还可以是由人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚胎性干细胞(ES细胞)、胚胎性肿瘤细胞(EC细胞)、胚胎性生殖干细胞(EG细胞)等多能性干细胞分化诱导而得的细胞。
本说明书中的用语“对象”、“从有疾病的对象分离的MSC”和“来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物”均解释为具有作为专利文献1的国际公开WO2015/137419号小册子和作为与之对应的美国申请的美国专利申请公开US2017/0071984号公报中记载的各用语相同的意思。通过参照，这些文献整体并入本说明书，将这些文献和本说明书中各用语的意思的概要示于下文。
“对象”的意思是具有MSC的任意动物，优选为哺乳动物的个体、例如人、黑猩猩等灵长类、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类、牛、山羊、绵羊、猪等偶蹄目、马等奇蹄目、兔、狗、猫等个体，进一步优选为人的个体。
如在专利文献1中也有记载，已知有某些疾病的对象和老化对象的MSC治疗效果比健康人的MSC差，即使对这些对象直接移植自身MSC，也不能期待好的治疗效果。另一方面，根据第一方式的制造方法，即使是这样的治疗效果差的MSC，也能够活化，提高治疗效果。具有治疗效果差的MSC的对象所患疾病是慢性疾病，其例子在专利文献1中是作为MSC异常的疾病记载的。
在考虑其后细胞移植疗法中的安全性的情况下，MSC优选从与使用细胞给药的个体同种或近缘种个体采集。例如，对人的个体进行细胞移植的情况下，优选使用从作为同种的人采集的细胞，更优选使用从接受给药的同一个人个体采集的细胞、即自身MSC。
本发明中使用的MSC可以通过一般的方法从对象的骨髓液、脂肪组织、胎儿附属组织、牙髓等试样采集。例如，使用骨髓液作为试样的情况下，可以通过密度梯度离心法、骨髓播种法等公知的方法分离MSC。本发明的一个优选实施方式中，MSC是骨髓来源的MSC。
“来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物”是，将在哺乳动物、优选为人胎儿娩出后作为后产物从母体娩出、或通过剖宫产从母体取出的胎儿附属物、优选脐带组织、胎盘组织或卵膜直接、或者切断或粉碎，在蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、细胞培养中通常使用的培养基等提取介质中浸泡等而制备的提取物。提取物特别优选不含作为供体的哺乳动物来源的具有增殖能力的细胞。具体的提取操作和条件可以遵照专利文献1中记载的操作和条件。
此外，“来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物”也可以在从胎儿附属物、典型地从胎盘提取生理活性物质时，对胎儿附属物实施本领域技术人员通常使用的处理、例如使用酸、酶的水解等处理来制备。该提取物的例子是，由美思满制药株式会社出售的人胎盘提取物“美思满”、由株式会社天本生物制剂出售的人胎盘提取物“LAENNEC”、其他市售胎盘制剂和被称为胎盘提取物的各种市售品。
本发明中的“含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂”是指含有前述提取物作为有效成分、用于增强MSC治疗效果的制剂，以下将其表述为“活化剂”。这里，“活化”的意思是，与未处理的情况相比，接受某种处理的MSC显示出更好的治疗效果。
第一方式的制造方法中，活化工序通过在体外、使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体、在含有前述活化剂的培养基中培养MSC来进行。具体地，通过使用三维培养载体作为支架，在活化剂的存在下培养MSC来进行。
优选的实施方式中，三维培养载体由具有纳米(nm)～微米(μm)单位的平均纤维直径的纤维构成。这里，“平均纤维直径”是指从细胞黏附面一侧、典型地从上方观察培养载体时，作为相对于纤维长度方向正交的方向上的长度测得的纤维直径的算术平均值。进一步优选的实施方式中，三维培养载体在与细胞接触的面上具有由具有纳米(nm)～微米(μm)单位的平均纤维直径的纤维形成的开口部。这里，“开口部”是指由上述纤维形成的、存在于载体与细胞的接触面上的凹陷。其中，除非特殊指明，否则本说明书中平均的意思均为数量平均。
在纤维彼此相接触的情况下，开口部的平均直径是指从上方观察培养载体时观察到的、以纤维为轮廓的图形的直径的平均值。图形的直径在图形为多边形的情况下对应于从各顶点出发的对角线的长度的算术平均值，在图形为圆形的情况下对应于其直径，在图形为椭圆形或与之类似的形状的情况下对应于其长径。
此外，在纤维彼此不接触的情况下，开口部的平均直径是指通过ASTM-F316中规定的方法得到的平均流量孔径，这例如可以使用孔径计(库尔特公司制等)通过平均流点法来测定。
构成三维培养载体的纤维的平均纤维直径可以在nm～μm单位的范围内，优选在10nm～500μm、更优选在10nm～300μm的范围内。特定的实施方式中，平均纤维直径例如可以在10nm～1μm、100nm～1μm、500nm～1μm、1μm～10μm、1μm～100μm、1μm～300μm、或1μm～500μm的范围内，优选在10nm～1μm、1μm～10μm或10μm～300μm中的任一范围内。本发明中，也可以使用一般被称为纳米纤维的纤维。
与细胞黏附的面上具有开口部的三维培养载体中，开口部的平均直径可以为500nm～1000μm，可以优选在700nm～600μm、更优选在900nm～400μm的范围内。特定的实施方式中，开口部的平均直径例如可以在500nm～100μm、5μm～100μm、10μm～100μm、20μm～100μm、100μm～200μm、100μm～400μm、或100μm～600μm的范围内，优选在500nm～100μm或100μm～400μm的范围内。
特定的实施方式中，三维培养载体具有60％以上、优选具有70％以上、更优选具有75％以上、特别优选具有80％以上的空隙率。
其他实施方式中，三维培养载体的开口部的平均面积为0.1～100μm2，优选为0.2～60μm2，更优选为0.5～30μm2。开口部为孔的情况下，开口部面积对应于孔面积。
三维培养载体具有纤维三维堆积的、即纤维在三维方向上堆积的结构，纤维的配置可以是规则的，也可以是不规则的，此外纤维彼此可以是结合的，也可以不结合。
三维培养载体可以在细胞黏附面具有由纤维构成的三维结构，也可以具有不与细胞黏附的部分、典型地在由纤维构成的三维结构下面作为基础的部件。基础部件只要能够支撑前述三维结构，则什么样的结构体均可，例如可以为无纺布、编物、织物、多孔质支架材料等。
三维培养载体中的细胞黏附面可以是其主要部分具有由纤维构成的三维结构的部分，具体地，从细胞黏附面一侧、典型地从上方观察培养载体时，具有由纤维构成的三维结构的部分可以占培养载体面积的50％以上。因此，在三维培养载体细胞黏附面的一部分，可以在黏附面中该部分的面积低于50％的范围内、优选在低于40％的范围内、进一步优选在低于30％的范围包含不是“由纤维构成的三维结构”的部分、例如不具有三维结构的平坦的膜状部分等。
作为形成纤维的材料没有特别限制，可以列举聚氟乙烯、聚苯乙烯等聚合物化合物、二氧化硅等无机化合物、生物降解性聚合物等。作为生物降解性聚合物，可以为具有生物相容性、能够在期望的时间内在培养载体上维持三维结构的物质，例如，合成高分子材料中可列举聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚二噁烷酮、其他乳酸-乙醇酸共聚物等上述共聚物，无机材料中可列举β-磷酸三钙、碳酸钙等，天然高分子材料中可列举胶原、明胶、海藻酸、透明质酸、琼脂糖、壳聚糖、纤维蛋白、丝心蛋白、几丁质、纤维素、蚕丝等。
三维培养载体的形状没有限制，只要在培养时细胞能够与由纤维构成的三维结构接触即可。三维培养载体可以是设置在细胞培养容器内而使用的***物形状，或者也可以是由纤维构成的三维结构在细胞培养容器的内面、例如孔的底面等一体成型的形状。
作为本发明中能够利用的三维培养载体的例子，可以列举Vessel株式会社的VECELL(注册商标)(聚四氟乙烯，平均纤维直径：＜1μm，平均孔面积：1～20μm2，开口部的平均直径：20～100μm，空隙率：80～90％)、日本宝翎株式会社的Cellbed(注册商标)(高纯度二氧化硅纤维，平均纤维直径：1μm，平均流量孔径：7～8μm，空隙率：＞95％)、3D Biotek的3D Insert-PS系列(聚苯乙烯纤维，平均纤维直径：PS-200为～150μm、PS-400为～300μm，开口部的平均直径：PS-200为200μm、PS-400为400μm)、国际公开WO2014/196549号小册子中记载的细胞培养基材、国际公开WO2016/068266号小册子和作为与之对应的美国申请的美国专利申请公开US2017/319747号公报中记载的细胞培养基材(生物降解性聚合物，平均纤维直径50nm～5μm)、Liu L、Kamei K等Biomaterials 124(2017)47-54中记载的细胞培养基材(聚乙醇酸，平均纤维直径：345±91nm，平均孔面积：0.68±0.02μm2，由平均孔面积算出的开口部的平均直径：0.93μm((0.68μm2/π)1/2)×2)、NEOVEIL和NEOVEIL NANO(郡是株式会社)等出售的组织增强材料等。通过参照，上述各文献整体并入本说明书。
三维培养载体上的MSC培养进行24小时～144小时，优选进行24小时～96小时，更优选进行48～96小时。活化工序中的培养温度和气体浓度可以在MSC培养中通常使用的温度和气体浓度的范围内，温度例如为25℃～37℃，优选为30℃～37℃，更优选为37℃，氧浓度例如为2％～30％，优选为2％～20％。活化处理可以在实现充分活化前进行多次。
活化工序中的培养基中活化剂的浓度按蛋白质换算的最终浓度为0.01μg/mL～500μg/mL即可，优选为0.02μg/mL～300μg/mL、0.03μg/mL～200μg/mL，更优选为0.04μg/mL～100μg/mL，在特定的实施方式中可以为0.05μg/mL～10μg/mL。正如对专利文献1中例示的活化剂的更优选浓度0.1mg/mL(100μg/mL)～5mg/mL(5000μg/mL)与上述特定的实施方式中活化剂的浓度进行比较表明的那样，通过使用三维培养载体，能够使活化剂的浓度减少至以往的1/10～1/100000。活化剂的浓度范围的下限例如为使用以往的二维培养载体时所用浓度的1/100000、1/50000、1/20000、1/10000、1/5000或1/2000，活化剂的浓度范围的上限例如为使用以往的二维培养载体时所用浓度的1/10、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500或1/1000。
培养基可以使用MSC培养中通常使用的培养基、例如α-MEM、DMEM等。只要不妨碍活化，这些培养基可以含有MSC增殖所必需的各种成分、例如血清成分等。
如后续实施例所示，与在不具有由纤维构成的三维结构的培养载体、例如Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养平板(Thermo Fisher Science公司)等由聚苯乙烯等构成的二维培养载体上在活化剂的存在下培养的MSC与相比，在三维培养载体上在活化剂的存在下培养的MSC具有更好的治疗效果。如果是治疗效果更好的MSC，则即使是更少的细胞数也可以期待效果，因而本发明中活化工序的MSC继代次数可以比使用不具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养MSC的活化工序中的继代次数少。活化工序中MSC的继代次数优选为2次以下，也可以为1次，进一步也可以为0次。此外，通过第一方式的制造方法制造的活化的MSC优选继代数为3、即P3以下，可以为P2，进一步可以为P1。
MSC是否活化的判断可以按照专利文献1中记载的方法和基准来进行。例如，在反映疾病模型动物、疾病模型动物来源细胞等的疾病的评价系中，在三维培养载体上在活化剂的存在下培养的MSC(以下也称为“3D活化处理MSC”)的治疗效果比在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的MSC(以下也称为“比较对象MSC”)好的情况下，判断该3D活化处理MSC是活化的。
此外，也可以通过使用细胞和细胞内细胞器的形态、细胞增殖能力、分化能力、以及作为具有治疗效果的MSC的标志物公知的增殖因子、分化相关因子和细胞因子-趋化因子等各种因子的蛋白质表达量、基因表达量、细胞外分泌量等评价指标来对活化进行判断。
例如，3D活化处理MSC的细胞增殖能力或分化能力比比较对象MSC高的情况下，也可以判断该3D活化处理MSC的治疗效果好、即是活化的。
进一步，干细胞性相关因子(例如DNMT1、Nanog、SOX2和OCT4等)、免疫调节-抗炎症功能相关因子(例如IDO、TSG6和IL-6等)或端粒酶活性相关因子(例如TERT等)的基因或蛋白质表达量在3D活化处理MSC中比在比较对象MSC中多的情况下，或细胞老化相关因子(例如P53等)或细胞骨架相关因子(例如α-SMA等)的基因或蛋白质表达量在3D活化处理MSC中比在比较对象MSC中少的情况下，也可以判断该3D活化处理MSC的治疗效果好、即是活化的。
进一步，3D活化处理后观察到MSC细胞厚度的增加、突起数的增加、网络结构形成的促进、分泌囊泡形成的促进等的情况下，也可以判断该3D活化处理MSC的治疗效果好、即是活化的。
而且，如下文所述，以本发明人等新发现的与MSC治疗效果正相关性高的p16ink4a和p14ARF、以及同样由本发明人等新发现的与MSC治疗效果负相关性高的CDK4、CDK6、RB和CD47的基因或蛋白质表达为指标，也可以判断3D活化处理MSC的治疗效果是否比比较对象MSC的治疗效果好、即3D活化处理MSC是否活化。
活化的MSC可以维持在未分化状态，或者也可以分化为期望的细胞。MSC的未分化状态的维持可以使用适合维持未分化状态的培养基、例如HyClone AdvanceSTEMMesenchymal Stem Cell Expansion Kit(赛默飞世尔科技)、MesenCult(商标)MSC BasalMedium(STEMCELL Technology(干细胞技术))、Stromal Cellutions(商标)Media(DVBiologics)、MSC专用培养基试剂盒(MSCGM BulletKit，龙沙)等培养MSC来进行。此外，MSC的分化可以通过在加入了具有向期望的细胞分化诱导作用的因子的分化诱导培养基中培养等一般已知的方法来进行。例如，在向成骨细胞分化中，使用骨形成的蛋白(BoneMorphogenetic Proteins，BMP)4、BMP2等作为分化诱导因子；在向脂肪细胞分化中，使用***、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素等作为分化诱导因子。
此外，MSC在活化、增殖培养、分化诱导培养等处理的前后，可以通过冷冻保存等一般的方法来保存。例如，可以在通过培养使活化的MSC增殖后，以具有一定细胞数的方式分装保存，解冻给药所需量而使用。
MSC治疗效果标志物和MSC治疗效果的判断方法
本发明的另一方式涉及与MSC治疗效果正相关的用于评价MSC治疗效果的标志物，其选自由p16ink4a和p14ARF组成的组。此外，本发明的进一步的另一方式涉及与MSC治疗效果负相关的用于评价MSC治疗效果的标志物，其选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组。
p16ink4a是具有锚蛋白重复序列的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子。已知p16ink4a是一种癌抑制因子，此外，还已知是在细胞由于达到***寿命、暴露于致癌压力等而产生DNA损伤时表达量上升的老化相关基因(E.Hara等，Mol.Cell.Biol.，1996，第16卷，第859-867页；B.G.Childs等，Nature Medicine，2015，第21卷，第1424-1435页)。
p16ink4a与作为细胞周期蛋白依赖性激酶的CDK4和CDK6、作为细胞周期调节因子的RB(视网膜母细胞瘤蛋白质，编码RB的基因也称为Rb)一起形成被称为p16ink4a-RB通路的信号传导通路。该通路中，p16ink4a与CDK4/6特异性结合，阻碍其作用。CDK4/6的阻碍使得活性型脱磷酸化RB增加，使细胞周期的进行停止。以下，也将这些因子统称为p16ink4a-RB通路因子。
人p16ink4a基因和翻译成蛋白质的mRNA的碱基序列以登录号NM_000077和NM_001195132登录于数据库GenBank/NCBI，蛋白质的氨基酸序列以登录号NP_000068登录于数据库GenPept(NCBI Protein Database)。
人CDK4和CDK6的基因和翻译成蛋白质的mRNA的碱基序列以登录号NM_000075和NM_001259登录于数据库GenBank/NCBI，蛋白质的氨基酸序列以登录号NP_000066和NP_001138778(或NP_001250)登录于数据库GenPept(NCBI Protein Database)。
人RB的基因和翻译成蛋白的mRNA的碱基序列以登录号NM_000321登录于数据库GenBank/NCBI，蛋白质的氨基酸序列以登录号NP_000312登录于数据库GenPept(NCBIProtein Database)。
p14ARF是p16ink4a的剪切突变体，两者由CDKN2A基因编码。p14ARF是p53稳定化蛋白质，具有通过与MDM2结合来抑制p53分解的功能，已知p16ink4a同样地为一种癌抑制因子。
人p14ARF基因和翻译成蛋白的mRNA的碱基序列以登录号NM_058195登录于数据库GenBank/NCBI，蛋白质的氨基酸序列以登录号NP_478102登录于数据库GenPept(NCBIProtein Database)。
CD47(也称为整联蛋白相关蛋白质(IAP))是属于免疫球蛋白超家族的跨膜型蛋白质。已知，正常细胞的细胞膜上表达的CD47与巨噬细胞细胞膜上的信号调节蛋白质α(SIRPα)结合，以此来抑制巨噬细胞的吞噬作用。认为，为了避免巨噬细胞的吞噬，优选细胞移植疗法中使用的细胞表达CD47。此外，据报道，CD47使MSC的归巢和组织修复效果增强(Int JClin Exp Pathol.2015，8(9)：10555-10564)，推测具有提高MSC的疾病治疗效果的功能。
人CD47基因和翻译成蛋白的mRNA的碱基序列以登录号NM_001777和NM_198793登录于数据库GenBank/NCBI，蛋白质的氨基酸序列以登录号NP_001768登录于数据库GenPept(NCBI Protein Database)。
出人意料的是，对活化的MSC的基因表达图谱进行分析的结果，发现了通过活化处理p16ink4a-RB通路因子的表达变化，具体地为p16ink4a的基因表达量的增加、以及作为p16ink4a下游因子的CDK4、CDK6和RB的基因表达量的减少等。此外，p14ARF的基因表达量与p16ink4a同样显示出增加，另一方面，CD47基因的表达量显示出减少。进一步，还通过实验确认，在即使活化处理也确认不到治疗效果上升的MSC中，不发生上述那样的p16ink4a-RB通路因子、p14ARF和CD47的表达变化。
而且，本发明人等确认，在活化的MSC中，作为干细胞性相关因子的OCT4、SOX2和Nanog、作为免疫调节-抗炎症功能相关因子的IDO和TSG-6等与MSC治疗效果相关的基因的表达量增加，确认到p16ink4a的基因表达与这些基因的表达有非常高的正相关性。p16ink4a的基因表达还与p14ARF的基因表达正相关。
此外确认到，与上述的与治疗效果相关的基因同样地，p16ink4a和p14ARF在治疗效果好的MSC中表达量增加，此外还确认到CD47在治疗效果好的MSC中表达量减少。进一步还通过实验确认到，缺失p16ink4a和p14ARF的MSC、强制表达CD47的MSC的治疗效果均降低。
基于这些结果，p16ink4a和p14ARF可以作为与MSC的疾病治疗效果正相关的用于评价MSC治疗效果的标志物使用，此外，p16ink4a的下游因子CDK4、CDK6和RB、以及CD47可以作为与MSC的疾病治疗效果负相关的用于评价MSC治疗效果的标志物使用。此外，可以利用这些标志物评价MSC的治疗效果。
本发明的又另一方式涉及一种判断MSC的治疗效果的方法，其包括：测定待测MSC中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；对测得的表达量与对照MSC中表达量进行比较的比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况下，判断为待测MSC治疗效果比对照MSC好的判断工序。
上述方式的治疗效果判断方法包括测定待测MSC中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47(以下也称为治疗效果标志物)组成的组的至少1个、优选2个、3个或全部基因或蛋白质的表达量的测定工序。
待测MSC只要是希望判断治疗效果的MSC即可。待测MSC的例子是预定在细胞移植疗法中使用的MSC。预定在自身移植疗法中使用的情况下，待测MSC是从欲接受自身移植疗法的对象分离的、优选为骨髓来源的MSC。通过在移植前判断这些MSC的治疗效果，能够避免对患者进行不必要的细胞移植，能够提高细胞移植疗法的成功率。特定的实施方式中，待测MSC可以是实施了用于提高治疗效果的处理的MSC，该MSC的例子为在含有活化剂的培养基中培养的即经活化处理的MSC、使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养的MSC。
MSC中治疗效果标志物的基因或蛋白质表达量测定可以采用能够测定碱基序列或氨基酸序列已知的基因或蛋白质的表达量的、本领域技术人员公知的各种方法来进行。
标志物蛋白质的表达量测定可以使用其特异性抗体，通过直接竞争法、间接竞争法、三明治法等ELISA法、RIA法、原位杂交、免疫印迹分析、蛋白质印迹分析和组织阵列分析等公知的方法来进行。这种情况下，特异抗体不受来源动物物种的限制，并且可以为多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种，还可以是包括免疫球蛋白全长的抗体或者Fab片段或F(ab’)2片段等部分片段等。特异抗体可以用荧光物质(例如FITC、罗丹明、鬼笔环肽等)、金等的胶体粒子、Luminex(注册商标，Luminex公司)等荧光微珠、重金属(例如金、铂等)、色素蛋白质(例如藻红蛋白、藻蓝蛋白等)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S、125I、131I等)、酶(例如过氧化酶、碱性磷酸酶等)、生物素、链霉亲和素、其他标记化合物标记。
标志物基因的表达量测定可以通过使用包含基于其碱基序列设计的适当的碱基序列的引物核酸的PCR法、特别是实时PCR法和能够进行核酸的绝对定量的数字PCR法、使用包含能够在严格条件下与其mRNA碱基序列杂交的碱基序列的探针核酸的杂交法、使用固定有包含能够与其mRNA的碱基序列杂交的碱基序列的探针核酸的芯片的微阵列法、RNA测序法、以及其他能够对该标志物基因的表达进行检测的公知方法来进行。根据所使用的方法，引物核酸或探针核酸可以用荧光物质、放射性同位素、酶、生物素、链霉亲和素、其他标记化合物标记。
上述方式的治疗效果判断方法还包括对测得的表达量与对照MSC中表达量进行比较的比较工序。这里，对照MSC是作为治疗效果判断基准的MSC。例如，待测MSC是预定在细胞移植疗法中使用的MSC的情况下，作为对照MSC，可以使用具有细胞移植疗法中能够使用的最低水平治疗效果的MSC。对照MSC中治疗效果标志物的基因或蛋白质表达量可以与待测MSC同时测得，也可以预先准备。
上述方式的治疗效果判断方法进一步包括如下判断工序：在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况下，判断为待测MSC治疗效果比对照MSC好。
判断工序中，在测定工序中测得的治疗效果标志物为p16ink4a或p14ARF的情况下，p16ink4a或p14ARF的基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多时，可以判断待测MSC的治疗效果比对照MSC好。此外，在测定工序中测得的治疗效果标志物为CDK4、CDK6、RB或CD47的情况下，在这些基因或蛋白质表达量在待测MSC中比在对照MSC中少时，可以判断待测MSC的治疗效果比对照MSC好。
使用多个治疗效果标志物判断MSC治疗效果的情况下，也可以使用聚类分析。具体地，将待测MSC中测得的各治疗效果标志物的相对表达数据与治疗效果好的正对照MSC、即具有足以用于细胞移植疗法水平的治疗效果的MSC和治疗效果差的阴性对照MSC、即只具有不足以用于细胞移植疗法水平的治疗效果的MSC中各治疗效果标志物的相对表达数据一起用于聚类分析，待测MSC与正对照MSC属于同一簇的情况下，可以判断为治疗效果好，与阴性对照MSC属于同一簇的情况下，可以判断为治疗效果差。
聚类分析可以利用R version 3.0.1(Various R programming tools forplotting data；gplots等统计软件采用适当的聚类方法、例如沃德法、小组平均法等分层方法来进行。
此外，本发明人等还确认到，治疗效果好的MSC中，除了上述治疗效果标志物以外，作为干细胞性指标的DNMT1、Nanog、SOX2和OCT4基因、被认为是端粒酶活性相关基因的TERT基因等的表达水平也比未处理MSC中高，进一步，被认为是细胞老化相关基因的p53和被认为是细胞骨架相关基因的α-SMA的表达量比未处理MSC中的表达水平低。因此，测定工序中除了测定上述治疗效果标志物的基因或蛋白质表达量以外，还测定(A)和/或(B)的表达量，其中，(A)为选自由DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6和TERT组成的组的至少1个、优选2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部基因或蛋白质，(B)为选自由p53和α-SMA组成的组的至少1个、优选全部基因或蛋白质，在判断工序中将其结果与上述治疗效果标志物的基因或蛋白质表达量的变化组合，具体地，
在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况，以及前述(A)的基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中多的情况和/或前述(B)的基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况下，也可以判断该MSC的治疗效果好。
进一步，本发明还包括下述方法：在上述方式的治疗效果判断方法的测定工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量，测定MSC中CD47阳性细胞的比例；在判断工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量在待测MSC中比在对照MSC中少的情况，在MSC中CD47阳性细胞的比例在待测MSC中比在对照MSC中低的情况下，判断为待测MSC的治疗效果比对照MSC好。
MSC中CD47阳性细胞的比例可以通过将MSC用针对CD47的标记化抗体标记，以同型对照等为阴性对照，通过流式细胞法等进行分析来确定。
MSC对用于提高治疗效果的处理的适应性判断方法
本发明的进一步的方式涉及一种判断MSC对用于提高MSC治疗效果的处理的适应性的方法，包括：测定经处理的MSC中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；对测得的表达量与未处理的MSC中表达量进行比较的比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况下，判断该MSC适合该处理的判断工序。
此外，本发明的进一步的方式涉及一种判断MSC对用于提高MSC治疗效果的处理的适应性的方法，包括：测定经处理的MSC中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；将测得的表达量与未处理的MSC中表达量进行比较的比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少或同等的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多或同等的情况下，判断该MSC不适合该处理的排除判断工序。
上述方式的适应性判断方法中，“经处理的MSC”是指接受了用于提高MSC治疗效果的某种处理的MSC。此外，“未处理的MSC”是指未接受该处理的MSC或接受了作为该处理的对照的理的MSC。作为这样的处理及其对照处理的例子，可列举在活化剂存在下的培养/不存在活化剂下的培养、在三维培养载体上的培养/二维培养载体上的培养、低氧浓度下或低营养下的培养/通常氧浓度下或通常营养下的培养、微重力环境或超重力环境的培养/正常重力环境的培养、bFGF、TNF-α、IL-6、TGF-β或PDGF等增殖因子、细胞因子-趋化因子等存在下的培养/这些因子不存在下的培养、通过基因导入进行的转化处理/未处理等。
如上所述，p16ink4a和p14ARF与MSC治疗效果正相关，CDK4、CDK6、RB和CD47与MSC治疗效果负相关，因而通过对进行了用于提高MSC治疗效果的处理的MSC和未处理的MSC中它们的表达量进行比较，可以判断该MSC对该处理是否有应答性或者对该处理是否有适应性。
上述方式的适应性判断方法中的测定工序和比较工序是在前述治疗效果判断方法的对应工序中说明的那样。此外，未处理的MSC中治疗效果标志物的基因或蛋白质表达量可以是与经处理的MSC同时测得的，也可以是预先准备好的。
经处理的MSC中选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况下，预测该MSC是治疗效果由于该处理而提高的MSC，是适合该处理的MSC，换句话说，可以判断该MSC对该处理有适应性。上述方式的适应性判断方法还可以表述为判断用于提高MSC治疗效果的处理导致的MSC治疗效果的上升的方法，其包括：前述测定工序和比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况下，判断该MSC治疗效果由于该处理而上升的工序。
另一方面，在经处理的MSC中选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少或同等的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多或同等的情况下，可以预测，该MSC是即使进行了用于提高治疗效果的处理，治疗效果提高的可能性也很低的MSC，可以判断该MSC对该处理的适应性低或没有适应性。上述方式的适应性判断方法还可以表述为判断用于提高MSC治疗效果的处理导致的MSC治疗效果提高不存在的方法，其包括：前述测定工序和比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少或同等的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多或同等的情况下，判断该MSC治疗效果不会由于该处理而提高的工序。
上述方式的适应性判断方法中，与前述治疗效果判断方法同样，可以在使用多个治疗效果标志物判断适应性时利用聚类分析，可以与干细胞性相关因子、免疫调节-抗炎症功能相关因子和端粒酶活性相关因子组合判断，并且可以使用MSC中CD47阳性细胞的比例代替CD47基因或蛋白质的表达量，其详细情况如在前述治疗效果判断方法中说明的那样。
另外，也可以代替上述方式的适应性判断方法中用于提高MSC治疗效果的处理，进行不清楚是否能提高MSC治疗效果的处理，在该MSC中选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的MSC中比在未处理的MSC中少的情况下，判断该处理适合提高MSC治疗效果。本发明也提供这样的判断方法。
对于根据上述治疗效果判断方法和适应性判断方法判断出治疗效果好、对用于提高治疗效果的处理的适应性高或治疗效果上升的MSC，可以进一步推进对利用该处理的移植用MSC的制造或其研究。另一方面，对于判断出治疗效果差、适应性低或没有适应性、或治疗效果没有提高的MSC，不进行利用该处理的移植用MSC的制造，可以减少MSC和处理所必需的活化剂等试剂的消耗。
细胞制剂
本发明的另一方式涉及一种CD47阳性细胞的比例为2％以下的、含有MSC的细胞制剂。
如上所述，确认CD47是与MSC治疗效果负相关的治疗效果标志物。本发明人等发现，通过第一方式的制造方法，能够制造CD47阳性细胞的比例极低的MSC。该MSC可以期待极高的治疗效果，因而含有其的细胞制剂可以作为用于使用MSC的细胞移植疗法有效的疾病的治疗和/或预防的药物来使用。
细胞制剂可以使用通过第一方式的制造方法制造的MSC来制造。细胞制剂所含的MSC具有CD47阳性细胞的比例为2％以下的特征。如后续实施例所示，即使在被认为治疗效果好的从年轻人采集的MSC中，CD47阳性细胞的比例也超过了2％，从这一点来看，这样CD47阳性细胞的比例极低的MSC可以期待具有以往所没有的好的治疗效果。
细胞制剂所含的MSC中CD47阳性细胞的比例为2％以下，优选为1.5％以下。MSC中CD47阳性细胞的比例可以通过在前述治疗效果判断方法中曾提及的方法来确认。
细胞制剂也可以通过由从对象分离的MSC等MSC簇中浓缩CD47阴性的MSC来制造。因此，本发明还提供一种含有MSC的细胞制剂的制造方法，包括从MSC簇中浓缩CD47阴性的MSC的工序。
CD47阴性MSC的浓缩可以利用不具有特定细胞表面标志物的细胞的浓缩中使用的公知技术、例如CD47的负向选择来进行。CD47的负向选择中，MSC簇被供给至结合有CD47特异抗体的珠子、使用了CD47特异抗体的流式细胞仪，回收不与抗体结合的MSC。
细胞制剂含有有效量的MSC。“有效量”的意思是对于治疗和/或预防疾病有效的量。该有效量根据疾病的种类、症状的严重程度、给药途径、患者的其他医学要因适当调节。优选的实施方式中，MSC的有效量在全身给药的情况下是每1kg给药个体体重为104细胞～109细胞，优选为105细胞～108细胞，在局部给药的情况下是每1kg给药个体体重为102细胞～109细胞，优选为104细胞～106细胞。如上所述，与在不具有由纤维构成的三维结构的培养载体上、典型地在二维培养载体上使用活化剂活化的MSC与相比，通过本发明第一方式涉及的制造方法制造的MSC具有更好的治疗效果，因而细胞制剂中MSC的有效量可以为使用不具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体制造的活化的MSC有效量的1/20～1/2的量、优选为1/10～1/4的量。该有效量的细胞制剂可以1次或分多次进行给药。
此外，已知MSC的培养物中含有MSC产生的各种体液因子，仍然具有疾病治疗效果。因此，培养上述方式的细胞制剂所含的MSC而得到的培养物还可以作为用于疾病的治疗和/或预防的药物使用。培养物优选为培养上清，可以通过在MSC的培养中通常使用的培养基、例如α-MEM、DMEM等中在活化剂的存在下培养MSC或培养活化后的MSC来获得。含有MSC培养物的药物中培养物的有效量是每1kg给药的个体体重为0.01mg～100mg，优选为0.02mg～50mg，更优选为0.05mg～20mg，可以将其1次或分多次进行给药。
上述细胞制剂和含有培养物的药物(以下统称为本发明的药物)通常以注射剂等非口服制剂的形态使用。作为非口服制剂中能够使用的载体，可列举例如生理盐水、含有葡萄糖、D-山梨糖醇等的等渗液等水性载体。此外，本发明的药物也可以是含有医学上允许的缓冲剂、稳定剂、保存剂、其他成分的药物组合物。
本发明的药物的给药方法没有特别限制，为非口服制剂的情况下，可以列举例如血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、肠道内给药、皮下给药、被膜下给药等局部给药(被膜的意思是被覆各种器官的膜组织)。一个优选实施方式中，本发明的药物通过静脉内给药而对生物体给药。此外，本发明的药物可以根据治疗和/或预防的疾病与其他药物组合使用。
细胞制剂也可以通过以黏附在三维培养载体上的形态粘贴于生物体内发生疾病的部位、存在发生可能的部位或构成疾病的原因的部位或它们附近而对生物体局部给药。本实施方式中，形成三维培养载体的纤维的材料优选为生物相容性材料，特别优选为生物降解性聚合物。
本发明的药物可以因为使用MSC的细胞移植疗法有效的疾病、例如糖尿病及其并发症、脑血管疾病、脑变性疾病、脱髓鞘性疾病、功能性发作性疾病、痴呆性疾病、末梢神经疾病、心血管疾病、自身免疫疾病、肝/胆道/胰疾病、胃/十二指肠疾病、小肠/大肠疾病、甲状腺疾病、血液/造血器疾病、肺病、急性肾功能障碍和慢性肾病、眼疾病、皮肤疾病、肌肉/骨疾病、外伤和GVHD(移植物抗宿主病)的治疗和/或预防而使用。作为这些疾病，具体地，可以列举：I型糖尿病和II型糖尿病以及它们的并发症、例如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜症、糖尿病性神经障碍、糖尿病性坏疽等；中风(脑梗塞和脑出血)等脑血管疾病、帕金森病、亨廷顿病、大脑基底节变性症、多***萎缩症、脊髓小脑变性症、肌肉萎缩性侧索硬化症等脑变性疾病；多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、视神经脊髓炎等脱髓鞘性疾病；癫痫、脑性麻痹等功能性发作性疾病；血管性认知症、阿尔茨海默病、路易小体型认知症、前头侧头型认知症、糖尿病性认知症等痴呆性疾病；格林巴利综合征、末梢神经障碍、面神经麻痹、三叉神经痛、排尿困难、***障碍、自主神经失调症等末梢神经疾病；心肌梗塞、狭心症、梗塞性动脉硬化症、心肌症等心血管疾病；类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、干燥综合征、多发性肌炎、皮肌炎、硬皮病、混合性***病、类风湿性多肌痛症、嗜酸性细胞增多症、***、结节病、Still病、脊椎关节炎、川崎病等自身免疫疾病；急、慢性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、急、慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎等肝-胆道-胰腺疾病；急性、慢性胃炎、胃、十二指肠溃疡等胃-十二指肠疾病；克罗恩病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、过敏性肠综合征等小肠-大肠疾病；格雷夫斯病、急性、慢性甲状腺炎等甲状腺疾病；自身免疫性溶血性贫血、真性红细胞增多症、特发性血小板减少性紫癜病等血液-造血器官疾病；慢性梗塞性肺病、间质性肺炎、肺纤维症、尘肺、支气管喘息、嗜酸性粒细胞性肺炎、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)等肺病；伴随体液量减少、缺血的急性肾功能障碍、ANCA相关肾炎、显微镜下多血管炎、多血管炎性肉芽肿病、嗜酸性粒细胞性多血管炎性肉芽肿病、恶性高血压、冷球蛋白血症、感染后肾小球肾炎、IgA肾病、急性间质性肾炎、药物性肾功能障碍、骨髓瘤肾、痛风肾、横纹肌溶解症、急性肾小管坏死等急性肾功能障碍；膜性肾病、膜性增殖性肾小球肾炎、微小变化型肾病综合征、局灶性肾小球硬化症、狼疮性肾炎、淀粉样变性、肾硬化症、紫癜性肾炎、IgG4相关肾病、干燥综合征、硬皮病肾、慢性间质性肾炎、多发性肾囊肿等慢性肾病；黄斑变性症、视神经炎、葡萄膜炎等眼病；特应性皮肤炎、水泡性疾病、Stevens-Johnson综合征等皮肤疾病；重症肌无力症、肌营养不良、变形性髋关节症、股骨头坏死、骨质疏松、腕管综合征等肌肉-骨骼疾病；脊髓损伤、脑挫伤等外伤；褥疮等创伤、口腔内溃疡、GVHD(移植物抗宿主病)、吻合口瘘、器官的损伤。本发明的药物适合的疾病优选为糖尿病性肾病、急性肾功能障碍、慢性肾病、糖尿病性视网膜症、糖尿病性神经障碍、糖尿病性坏疽、阿尔茨海默病、糖尿病性认知症、类风湿性关节炎、多发性肌炎和创伤。
本说明书中使用的治疗和/或预防包括以疾病或症状的治愈、暂时缓解、预防等为目的的医学上允许的全部类型的治疗性和/或预防性介入。即，疾病或症状的治疗和/或预防包括各种目的的医学上允许的介入，包括使疾病或症状的进行延迟或停止、病变的退化或消失、发病的预防或复发的防止等。
本发明也包括用有效量的本发明的药物对有必要的对象给药，还包括治疗和/或预防使用MSC的细胞移植疗法有效的疾病的方法作为另一方式。本方式中各用语的意思如上所述。
通过以下的实施例进一步详细地对本发明进行说明，但本发明不限定于这些例子。
实施例
实施例1 制备在三维培养载体上活化处理的MSC
1)活化剂的制备
根据专利文献1的记载，从人胎盘组织制备活化剂。简单地说，将切碎的人胎盘组织按相对于50g湿重量为100mL的比例放入无血清培养基(α-MEM)，4℃振荡72小时。通过离心分离回收上清，得到作为胎盘组织提取物的活化剂。
2)活化处理
将在变形性髋关节病患者的人工关节置换术时采集的骨髓来源的MSC(OA-MSC)在不含活化剂的MSC培养培养基(含有15％FBS、1％青霉素、1％链霉素和100mg/dL葡萄糖的DMEM)中进行培养。回收细胞，分别在作为三维培养载体的Preset VECELL 6well(注册商标)(Vessel株式会社)上播种8×104细胞/孔、在Cellbed 24 well(注册商标)(天本宝翎株式会社)上播种2×104细胞/孔、在3D-insert PS-200 12well和3D-insert PS-400 12well(3DBiotek公司)上播种3.8×104细胞/孔，使用MSC培养培养基在37℃培养72小时。去掉培养基后，将含有按蛋白质换算为10μg/mL、1μg/mL或0.1μg/mL的上述活化剂或不含活化剂的MSC培养培养基分别在Preset VECELL 6well上加入2mL、在Cellbed 24well上加入0.6mL、在3D-insert PS-200 12well和3D-insert PS-400 12well上加入1mL，37℃进行4天培养。进行1～3次该培养后，回收细胞，制备继代数为1～3次的OA-MSC。
此外，在作为平板状的二维细胞培养载体的Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板(Thermo Fisher Science公司)上播种6×104细胞/孔，在100μg/mL的活化剂的存在下或不存在下进行培养。进一步重复1次该培养，从而制备继代数为2次的对照OA-MSC。
实施例2 在三维培养载体上活化处理的OA-MSC的基因表达分析和形态观察
1)基因表达分析
使用Tri Reagent(Molecular Research Center，Inc)从实施例1的2)中制备的各OA-MSC提取总RNA。通过逆转录反应合成克隆DNA，对于OCT4、Nanog、SOX2、DNMT1、TERT、IL-6、IDO、TSG-6、p21、p53、α-SMA和18sRNA，使用包含表1所示碱基序列的引物组实施实时PCR。
表中的(F)意思是正向引物，(R)意思是反向引物。
[表1]
基因 碱基序列 序列编号
OCT4(F) GACAGGGGAGGGGAGGAG 1
OCT4(R) CTTCCCTCCAACCAGTTGCCC 2
NANOG(F) TGGACACTGGCTGAATCCTTC 3
NANOG(R) CGTTGATTAGGCTCCAACCAT 4
SOX2(F) GGGAAATGGGAGGGGTGCAA 5
SOX2(R) TTGCGTGAGTGTGGATGGGA 6
DNMT1(F) CGTAAAGAAGAATTATCCGAGG 7
DNMT1(R) GTTTTCTAGACGTCCATTCAC 8
TERT(F) CGGAAGAGTGTCTGGAGC 9
TERT(R) GGATGAAGCGGAGTCTGGA 10
IL-6(F) GATGAGTACAAAAGTCCTGATCCA 11
IL-6(R) CTGCAGCCACTGGTTCTGT 12
IDO(F) GCATTTTTCAGTGTTCTTCGCATA 13
IDO(R) TCATACACCAGACCGTCTGATAGC 14
TSG-6(F) CCCATTGTGAAGCCAGGGCCCAACTG 15
TSG-6(R) GGAAGCTCATCTCCACAGTATCTTCCC 16
P16INK4a(F) AGCATGGAGCCTTCGGCTGA 17
P16INK4a(R) CCATCATCATGACCTGGATCG 18
RB(F) GCTAGCCTATCTCCGGCTAAA 19
RB(R) CTGGAAAAGGGTCCAGATGA 20
P21(F) GAGACTCTCAGGGTCGAAAA 21
P21(R) TTAGGGCTTCCTCTTGGAGA 22
TP53(F) TGACTGTACCACCATCCACTA 23
TP53(R) AAACACGCACCTCAAAGC 24
alpha-SMA(F) GCAGCCCAGCCAAGCACTGT 25
alpha-SMA(R) TGGGAGCATCGTCCCCAGCA 26
RNA18S(F) ATCGGGGATTGCAATTATTC 27
RNA18S(R) CTCACTAAACCATCCAATCG 28
以18sRNA为持家基因，基于在二维培养载体上在100μg/mL活化剂的存在下培养的对照OA-MSC算出ΔΔCT值，对基因表达图谱进行分析，聚类。将在Preset VECELL上在0.1μg/mL活化剂的存在下培养的OA-MSC(VECELL_0.1)、在Cellbed上在0.1、1或10μg/mL活化剂的存在下培养的OA-MSC(分别CellBed_0.1、CellBed_1、CellBed_10)、在3D-insert PS-200上在0.1μg/mL活化剂的存在下培养的OA-MSC(3D.insert200_0.1)、在3D-insert PS-400上在10μg/mL活化剂的存在下培养的OA-MSC(3D.insert400_10)、以及在二维培养载体上在100μg/mL活化剂的存在下培养的对照OA-MSC(2D_100)的结果示于图1。此外，将2D_100和VECELL_0.1的OCT4、SOX2和TERT相对于在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的OA-MSC(2D_0)的相对基因表达量示于图2。
与2D_100和2D_0相比，确认到在三维培养载体上活化处理的OA-MSC中，被认为是干细胞性相关基因的DNMT1、Nanog、SOX2和OCT4、被认为是免疫调节-抗炎症功能相关基因的IDO、TSG6和IL-6、被认为是端粒酶活性相关基因的TERT的表达量增加，被认为是细胞老化相关基因的P53、被认为是细胞骨架相关基因的α-SMA的表达量减少。该结果表明，作为具有治疗效果的MSC的标志物已知的基因族群的表达趋势是，与在二维培养载体上活化处理的MSC相比，在三维培养载体上活化处理的MSC中表达更强。
2)形态观察
接下来，将在Preset VECELL上在0.1μg/mL活化剂的存在下或不存在下培养的OA-MSC(MSC(3D·活化剂+)和MSC(3D·活化剂-))、以及在二维培养载体上在100μg/mL活化剂的存在下或不存在下培养的OA-MSC(MSC(2D·活化剂+)和MSC(2D·活化剂-))用含有2.5％戊二醛和2％多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液在4℃固定1小时，其后用含有1％锇的0.1M磷酸缓冲液在4℃固定1小时。其后，脱水、干燥，进行金属包被，用扫描电子显微镜观察。
在二维培养载体上培养的情况下，由于活化剂的添加，MSC的突起数增加，细胞的厚度增大(图3下部)，此外，更多地形成了推测是外泌体的囊泡(图4下部)。如果不添加活化剂在三维培养载体上培养，则MSC显示出与活化剂存在下的二维培养同等以上的形态变化(图3左上和右下、图4左上和右下)。进一步，在活化剂存在下在三维培养载体上的培养使MSC的突起数飞跃性增加，形成网络结构(图3右上)，此外还使囊泡形成增加(图4右上)。需要说明的是，图4右上的MSC(3D·活化剂+)中，大量形成的囊泡被放出的痕迹表现为大量空洞。
3)在其他培养载体上活化处理的OA-MSC的基因表达分析和形态观察
作为比较例的培养载体，使用细胞培养基材A(平均纤维直径0.1～0.5μm，空隙率70％以下，平均孔面积0.2μm2，24孔)，在活化剂浓度1μg/mL或0.1μg/mL下，与实施例1的2)的Cellbed 24孔的情况同样地进行OA-MSC的活化处理。基材A是其一部分具有由纤维构成的三维结构、且不具有三维结构的平坦膜状部分约占细胞黏附面50％的基材。
此外，作为其他三维培养载体，使用细胞培养基材B进行OA-MSC的活化处理。细胞培养基材B是按照国际公开WO2016/068266号小册子和Liu L、Kamei K等，Biomaterials124(2017)47-54所述的方法制造的、在由聚乙醇酸构成的基础部件上含有由聚乙醇酸构成的纳米纤维的三维培养载体。
在不含活化剂的MSC培养培养基(含有15％FBS、1％青霉素、1％链霉素和100mg/dL葡萄糖的DMEM)中培养OA-MSC。回收细胞，在二维培养载体(Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板，Thermo Fisher Science公司)上放入2.5cm×2.5cm的细胞培养基材B，播种8×104细胞的MSC，加入2mL含有1μg/mL活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行72小时培养，从而制备继代数为1次的经活化处理的MSC片。通过该方法制备的MSC片大概含有8,500细胞/cm2的MSC。
从基材A和B回收MSC，通过实时PCR测定各基因的表达量，与先前的实时PCR结果合并，聚类。将结果示于图5。在基材A上活化处理的OA-MSC显示出与2D_100类似的基因表达图谱，确认到基材A上的活化处理仅带来与二维培养载体上的活化处理同等程度的效果。此外，在基材B上活化处理的OA-MSC显示出其他三维培养载体类似的基因表达图谱，推测活化处理的效果与其他三维培养载体是同样的。
此外，将在基材B上活化处理的OA-MSC的扫描电子显微镜的观察图像示于图6。与上述在Preset VECELL上进行活化处理的OA-MSC同样地，观察到大量囊泡。
实施例3 在三维培养载体上活化处理的健康人来源MSC的基因表达分析
将从除了前十字韧带断裂以外未进行检查的22岁女性采集的骨髓来源的MSC(健康人来源MSC)在不含活化剂的MSC培养培养基中进行培养。回收细胞，在Preset VECELL6well(注册商标)(Vessel株式会社)上播种8×104细胞/孔，使用MSC培养培养基在37℃培养72小时。将培养基除去，加入2mL含有1μg/mL活化剂的MSC培养培养基进行培养，从而制备继代数为1次的经活化处理的健康人来源MSC(3D·活化剂+)。
此外，在二维培养载体(Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板，Thermo Fisher Science公司)上播种6×104细胞/孔的健康人来源MSC，在100μg/mL活化剂的存在下或不存在下进行培养。进一步重复1次该培养，从而制备继代数为2次的经活化处理的或未活化处理的健康人来源MSC(2D·活化剂+、2D·活化剂-)。
与实施例2的1)同样地通过实时PCR测定上述3种MSC中各基因的表达量。将经活化处理的MSC(2D·活化剂+和3D·活化剂+)的OCT4、SOX2和TSG-6相对于未活化处理的MSC(2D·活化剂-)的相对基因表达量示于图7。任一基因的表达量均按2D·活化剂-、2D·活化剂+、3D·活化剂+的顺序提高，特别是OCT4和TSG-6的表达量在3D·活化剂+中显示显著高的值。这提示三维培养载体上的活化处理不仅能够使有疾病的患者来源的MSC活化，而且也能够使健康人来源的MSC活化，提高其治疗效果。
实施例4 在三维培养载体上活化处理的MSC治疗效果(皮肤缺损)
通过在10周龄Lewis大鼠的背部设置两处将3cm×3cm的皮肤切除的部位，制作皮肤缺损模型大鼠。皮肤切除1天后，使用实施例1的2)中制备的MSC(2D·活化剂-)(5×105细胞/只)、MSC(2D·活化剂+)(5×105细胞/只)、MSC(3D·活化剂+)(1×105细胞/只)或PBS(vehicle，空白)对大鼠进行静脉内给药，饲养21天。
皮肤切除3天后和7天后，测定皮肤缺损部的残留缺损面积，从而评价创伤治愈的程度。将其结果示于图8。此外，将对7天后的皮肤缺损部进行拍照得到的照片示于图9。确认到与用MSC(2D·活化剂+)给药的大鼠与相比，用MSC(3D·活化剂+)给药的大鼠中，尽管给药的细胞数为1/5，但创伤治愈快。
此外，皮肤切除21天后，将皮肤缺损部周围2cm×2cm的皮肤从大鼠切下，使用精密万能试验机(AG-1)(株式会社岛津制作所)测定皮肤的断裂应力。将其结果示于图10。确认到与使用MSC(2D·活化剂+)给药的大鼠的皮肤组织相比，使用MSC(3D·活化剂+)给药的大鼠的皮肤组织虽然给药的细胞数为1/5，但获得了更高的断裂应力。
以实施例1中的活化中所使用的活化剂浓度为基础，算出能够以使用由1个人胎盘制造的活化剂活化的MSC来进行治疗等的人患者数，推测使用不具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体的活化中大约为10人，而使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体的活化中大约为10,000人。
此外，关于实施例4中确认的使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体活化的MSC的高治疗效果，考虑到给药细胞数为使用不具有由纤维构成的三维结构的二维培养载体活化的MSC的给药细胞数的1/5，能够大幅减少治疗和/或预防所必需的细胞数。这带来了给药时间的缩短和副作用的减少等患者治疗负担的减轻等优点。进一步，还能够减少用于确保所必需的细胞数的继代培养的继代次数，带来细胞制造时间的缩短和成本降低等优点。
实施例5 在三维培养载体上活化的MSC治疗效果(认知功能)
在Preset VECELL 6well(注册商标)(Vessel株式会社)上播种8×104细胞/孔的OA-MSC，使用MSC培养培养基在37℃培养72小时。将培养基除去，按2mL/孔加入含有0.1μg/mL活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行4天培养后，回收细胞，制备继代数为1次的经活化处理的OA-MSC(3D·活化剂+)。此外，在二维培养载体(Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板，Thermo Fisher Science公司)上播种6×104细胞/孔的OA-MSC，按1.3mL/孔加入不含活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行4天培养，制备继代数为1次的未处理MSC(2D·活化剂-)。
在17月龄雄性APP/PS1小鼠(查尔斯河)中，用上文中制备的MSC(2D·活化剂-)(2.5×104细胞/只)或MSC(3D·活化剂+)(2.5×104细胞/只)进行髓腔内给药，饲养28天。髓腔内给药21天后，在6天内进行莫里斯水迷宫试验。在莫里斯水迷宫试验中，从灌满水(25℃±1℃)的圆形水池(直径1.2m)的一端放入小鼠，测定能够到达设于水面之下、小鼠的脚能够接地的平台(直径10cm)的时间。平台的位置设为一定的，改变小鼠的放入位置，1天4次，进行5天，评价学***台测试)。在Hiddenplatform tests结束的第二天，将平台从水池除去，测定在先前的隐藏平台测试中有平台的4个分隔区域内游泳的时间相对于总游泳时间(60秒)的比例，评价小鼠的记忆能力(probe test，搜索实验)。
将莫里斯水迷宫中的学习测试的结果示于图11，将记忆测试的结果示于图12。与使用MSC(2D·活化剂-)给药的小鼠相比，使用MSC(3D·活化剂+)给药的小鼠的学习能力和记忆能力高，确认到MSC(3D·活化剂+)好的治疗效果。
实施例6 在三维培养载体上活化的MSC治疗效果(糖尿病性肾病)
在糖尿病性肾病发病的14月龄雄性OLETF大鼠(星野试验动物)中，按5mgRituximab(中外制药)/只、1天1次、尾静脉给药4天。距离Rituximab初次给药10～14天后，在使用Rituximab给药的大鼠的肾脏中，移植在实施例2的3)中使用基材B制备的MSC片(3D活化剂+MSC组，n＝6)。以仅使用Rituximab给药作为空白(空白组，n＝7)。在异氟烷吸入麻醉下，从侧卧位大鼠最下面的肋骨下切开皮肤，切开肌肉层，将一个肾脏拉出体外。小心地将杰氏筋膜、脂肪层和纤维被膜以不损伤肾上腺的方式切开，从肾表面剥下，拉到肾门部。以包裹整个肾脏的方式粘贴1枚2.5cm×2.5cm的MSC片和1枚切成1/3的同样的MSC片。在另一肾脏上也同样地粘贴MSC片。MSC片移植当天、移植后3周和6周时，从大鼠采集血液，使用酶法(SRL)测定血清肌酐。
将移植后11周生存的动物(空白组，3D活化剂+MSC组均为n＝2)的血清肌酐的演变示于图13。空白组中确认到血清肌酐的经时性上升，而3D活化剂+MSC组中未确认到血清肌酐值的上升。此外，将表示生存至移植后11周的生存率的Kaplan-Meier曲线示于图14。与空白组相比，3D活化剂+MSC组显示出高的生存率。
本试验中使用的大鼠是除了糖尿病性肾病以外还通过抗癌剂处理进一步诱导急性肾功能障碍从而使程度一致的严重慢性肾病发病的模型动物，表现出相当于肾病4期(肾衰竭期)的非常严重的末期肾功能障碍。确认到在三维培养载体上活化的MSC片对于这样的严重的疾病也表现出治疗效果。
实施例7 经活化处理的OA-MSC中治疗效果标志物基因的表达分析
1)MSC的活化处理
将在变形性髋关节病患者(n＝13)的人工关节置换术时采集的骨髓来源的MSC(OA-MSC)在不含活化剂的MSC培养培养基(含有15％FBS、1％青霉素、1％链霉素和100mg/dL葡萄糖的DMEM)中培养。回收细胞，在Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板(Thermo Fisher Science公司)上播种6×104细胞/孔，按1.3mL/孔加入含有活化剂或不含活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行4天培养。进一步重复1次该培养，从而制备继代数为2次的经活化处理的OA-MSC和未处理的OA-MSC。
此外，将除了前十字韧带断裂以外未观察到诊断所见的22岁女性采集的骨髓来源的MSC(健康人MSC)与上述OA-MSC同样地培养、进行活化处理，从而制备经活化处理的健康人MSC和未处理的健康人MSC。
2)基因表达分析
与实施例2的1)同样地通过实时PCR测定上述1)中制备的各OA-MSC中各基因(OCT4、Nanog、SOX2、DNMT1、TERT、IL-6、IDO、TSG-6、p16ink4a、RB、p21、p53、α-SMA、18sRNA)的表达量。
以18sRNA为持家基因，基于未处理OA-MSC算出经活化处理的OA-MSC中各基因表达的ΔΔCT值，对基因表达图谱进行分析，聚类。将关于10个病例的OA-MSC的分析结果示于图15。
进一步，使用同一病例的OA-MSC，使用包含表2所示碱基序列的引物，通过实时PCR测定p14ARF和CD47的基因表达量，与先前测定的基因表达量的结果合并聚类。将结果示于图16。
[表2]
基因 碱基序列 序列编号
P14ARF(F) TACTGAGGAGCCAGCGTCTA 29
P14ARF(R) TGCACGGGTCGGGTGAGAGT 30
CD47(F) AGAAGGTGAAACGATCATCGAGC 31
CD47(R) CTCATCCATACCACCGGATCT 32
这些结果表明，各个分离源患者的MSC的基因表达图谱是不同的，各个分离了MSC的患者对于活化处理的反应性是不同的。
此外，出人意料的是，被认为是MSC治疗效果的负向标志物的p16ink4a和p14ARF与已知是MSC治疗效果的正向标志物的DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6和TERT是属于同一簇的。将9个病例的OA-MSC中，OCT4、SOX2、Nanog、IDO和TSG6基因的相对表达量与p16ink4a基因的相对表达量的相关性示于图17，将p14ARF的相对表达量与p16ink4a基因的相对表达量的相关性示于图18。OCT4、SOX2、Nanog、IDO和TSG6与p16ink4a、以及p14ARF与p16ink4a确认到高相关性。
进一步，作为p16ink4a下游因子的CDK4、CDK6和RB、以及被认为希望在细胞疗法使用的细胞中表达的CD47的基因表达表现出与p16ink4a相反的趋势。将通过实时PCR测得的3个病例的OA-MSC(BM-021、BM-022、BM-023)中OCT4、p16ink4a和RB基因的相对表达量示于图19。任一MSC中，通过活化处理，OCT4和p16ink4a的表达均得到促进，而RB的表达降低。
对于该3个病例的OA-MSC的总RNA，使用Affymetrix Clariom(注册商标)S Array进行微阵列分析。数据使用Affymetrix Transcriptome Analysis Console(TAC)Software进行分析。任一MSC中，通过活化处理，CDK6的表达量均减少了约2.04倍(数据在图中未显示)。
活化处理导致的上述因子的表达变化趋势在健康人MSC中也得到了确认，例如，SOX2和p16ink4a的基因表达量由于活化处理而增加至2倍多(数据在图中未显示)。综上所述，提示p16ink4a具有与上述已知因子同样地用作MSC治疗效果的正向标志物的可能性，此外，CDK4、CDK6和RB具有用作治疗效果的负向标志物的可能性。
实施例8 在三维培养载体上活化处理的OA-MSC中治疗效果标志物基因的表达分 析
1)OCT4、SOX2和p16ink4a
使用OA-MSC，对三维培养载体上的活化处理导致的基因表达的变化进行分析。在Preset VECELL 6well(注册商标)(Vessel株式会社)上播种8×104细胞/孔的OA-MSC，使用MSC培养培养基37℃培养72小时。将培养基除去，按2mL/孔加入含有0.1μg/mL的活化剂或不含活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行4天培养后，回收细胞，制备继代数为1次的经活化处理的OA-MSC和未处理的OA-MSC。通过实时PCR测得这些OA-MSC中各因子的表达量。
将1个病例的OA-MSC(BM-010)中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量示于图20。确认到与实施例7的二维培养载体上的活化处理同样地，各因子的表达量也由于三维培养载体上的活化处理而增加。
2)CD47
使用从类风湿性关节炎患者、72岁男性、肝硬化患者和38岁男性采集的骨髓来源的MSC(分别为RA、老年人、肝硬化、年轻人)，用2种活化剂浓度(1μg/mL、0.1μg/mL)，与上述1)同样操作，进行三维培养载体上的活化处理，制备继代数为1次的经活化处理的MSC。此外，在二维培养载体(Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板、ThermoFisher Science公司)上将同一MSC按6×104细胞/孔的量播种，按1.3mL/孔加入不含活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行4天培养，制备继代数为1次的未处理MSC。
通过实时PCR测得这些MSC中CD47的基因表达量。将在三维培养载体上活化处理的MSC中CD47相对于未处理MSC的相对基因表达量示于图21。任一MSC中通过活化处理CD47的基因表达量均减少，该趋势在类风湿性关节炎患者、72岁男性、肝硬化患者的MSC中更显著。考虑到有疾病的对象和老年人的MSC一般治疗效果差，提示CD47具有用作治疗效果的负向标志物的可能性。
实施例9 细胞表面标志物CD47的表达分析
使用从38岁男性和72岁男性采集的骨髓来源的MSC(分别为年轻人MSC、老年人MSC)，用活化剂浓度0.1μg/mL，与实施例8的2)同样地操作，制备继代数为1次的经活化处理的MSC和未处理的MSC。为了对这些MSC进行死细胞染色，与Zombie Violet(商标)Dye(Biolegend)进行反应，其后，用FITC anti-human CD47抗体(Biolegend)标记，用FACSCanto(商标)II(BD Biosciences)进行流式细胞分析。阴性对照使用同型对照(isotype control)或仅与二抗反应的MSC。数据分析用FACSDiva(商标)(BD Biosciences)和Kaluza V1.5a(贝克曼库尔特)进行。
将未处理MSC的结果示于图22。将信号强度比阴性对照中检测到的信号强度强的MSC判断为CD47阳性、比阴性对照中检测到的信号强度弱的MSC判断为CD47阴性。年轻人MSC中CD47阳性细胞率、即该MSC簇中CD47阳性MSC的比例为低至2.34％的值，而老年人MSC中CD47阳性细胞率显示出高达90.10％的值。
将经活化处理的MSC的结果示于图23。年轻人MSC、老年人MSC中，通过活化处理，CD47阳性细胞率均降低，特别是老年人MSC中，显示出显著降低。考虑到老年人MSC一般疾病治疗效果差，提示CD47具有用作治疗效果的负向标志物的可能性。
实施例10 p16ink4a高表达MSC的功能评价(对巨噬细胞的作用)
对于实施例7的1)中进行活化处理的OA-MSC中表达变化的程度不同的3个病例的OA-MSC(BM-008、BM-021、BM-005)进行功能评价。将这些OA-MSC中p16ink4a基因的相对表达量示于图24。p16ink4a表达量在BM-008中由于活化处理增加了约1.4倍、在BM-021中增加了约1.6倍，而在BM-005中减少了0.2倍左右。
将经活化处理的上述3种OA-MSC和与之对应的未处理OA-MSC、合计6种MSC用于与小鼠巨噬细胞样细胞株RAW264.7的共培养。在Cell culture insert(Falcon(注册商标))的***的膜部分按2x104细胞播种用PKH红色素染色的MSC，在塑料平板部分播种2x105细胞的用PKH绿色素染色的RAW264.7细胞，用DMEM培养基在37℃进行24小时接触共培养。
共培养结束后，用胰蛋白酶将MSC从***部的膜剥下，移植至存在RAW264.7细胞的塑料平板部分，进行24小时接触共培养。接触共培养后，用4％多聚甲醛固定，进行流式细胞分析。
将根据流式细胞分析显示PKH红和PKH绿双阳性的细胞在除死细胞之外的单核细胞的总数中所占比例示于图25。双阳性细胞被认为是对应于吞噬了MSC来源的死细胞碎片的巨噬细胞的细胞，因而该细胞数的增加意味着巨噬细胞吞噬能力的促进。双阳性细胞的比例在BM-008和BM-021中由于活化处理而增加，而在BM-005中是减少的。
此外，回收共培养后的RAW264.7细胞，用Tri Reagent(Molecular ResearchCenter，Inc)提取总RNA。通过逆转录反应合成克隆DNA，使用以下的引物组，通过实时PCR测得作为M1巨噬细胞的标志物的Fpr2(甲酰肽受体-2)的表达量。
Fpr(F)：5’-TCTACCATCTCCAGAGTTCTGTGG-3’(序列编号33)
Fpr(R)：5’-TTACATCTACCACAATGTGAACTA-3’(序列编号34)
将与OA-MSC(BM-008、BM-021、BM-005)共培养的RAW264.7细胞中Fpr的相对表达量示于图26。Fpr表达量在BM-008和BM-021中由于活化处理而增加，而在BM-005中未确认到变化。
近年来，确认以往被称为慢性炎症性疾病的疾病以外的各种疾病也与慢性炎症相关。作为慢性炎症相关疾病，除了慢性炎症性疾病以外，还可以列举过敏性疾病、自身免疫性疾病、癌症、动脉硬化性疾病(缺血性心脏病、中风等)、神经变性疾病(阿尔茨海默病)、代谢综合征-生活习惯病(肥胖、糖尿病、脂质异常症、慢性肾病、非酒精性脂肪性肝炎等)、排尿困难等，进一步已知老化也与慢性炎症相关。
在急性炎症中，炎症初期M1巨噬细胞增加，吞噬已完成职能的老化细胞、有损伤的细胞等各种细胞。人们认为，利用M1巨噬细胞的吞噬进行清理后，组织中出现M2巨噬细胞，受细胞因子等的刺激，促进来自周边细胞的胶原等的产生，引导组织修复。另一方面，认为M2巨噬细胞在慢性炎症中持续处于优势性状态，成纤维细胞等各种细胞不会通过吞噬被除去，而是持续存在，因此不发生组织修复，炎症持续，助长了组织的纤维化(J.G.Tidbal等，NatureMedicine，2015，第21卷，第665-666页；X.M.Meng等，Nature Reviews Nephrology，2014，第10卷，第493-503页；A.Pellicoro等，Nature Reviews Immunology，2014，第14卷，第181-194页)。推测在慢性炎症相关疾病的处理中，诱导M1巨噬细胞的优势性状态是重要的，因此，M1巨噬细胞的增加可用作这些慢性炎症相关疾病中治疗效果的指标。
根据实施例10的试验确认到，p16ink4a表达量由于活化处理而增加的MSC提高共培养的巨噬细胞的吞噬能力，诱导向MI型的转变，而p16ink4a表达量由于活化处理而减少的MSC不显示对巨噬细胞的这样的作用。M1巨噬细胞的增加可用作慢性炎症相关疾病治疗效果的指标，因而认为，p16ink4a表达量由于活化处理而增加的MSC由活化处理带来的治疗效果好，即被活化；另一方面，p16ink4a表达量由于活化处理而减少的MSC由活化处理带来的治疗效果不好，即未活化。
实施例11 p16ink4a高表达MSC的功能评价(多发性肌炎)
1)局部给药
使用p16ink4a表达量由于活化处理而增加的OA-MSC(BM-021)，进行对作为慢性炎症相关疾病的多发性肌炎的治疗效果的确认。将BM-021中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量示于图27。任一因子表达量均由于活化处理而增加。
在8周龄Balb/c小鼠的***附近，使用从其他Balb/c小鼠的骨架肌肉制备的肌球蛋白部分(1mg/只)和完全弗氏佐剂(Chondrex公司，200μg/只)的乳液给药，同时，使用百日咳毒素(List Biological Laboratories公司，500ng/只)腹腔内给药，进行免疫。初次免疫1周后和2周后，使用上述乳液在小鼠***附近给药，进行加强免疫，从而制作多发性肌炎模型小鼠。初次免疫4周后，将小鼠分为3组(n＝9)，使用实施例7中制备的经活化处理的MSC(1x105细胞/只的BM-021)、未处理的MSC(1x105细胞/只的BM-021)或PBS(vehicle，空白)在后肢小腿三头肌局部给药。
MSC给药2天后，采集小腿三头肌，胶原酶处理后，用RBC Lysis缓冲液将红血球除去，制成单细胞悬浊液。其后，用死细胞标志物(Zonbi Dye)、PE-Cy7-CD11b抗体、APC-F4/80抗体、FITC-Ly6C抗体进行抗原抗体反应，进行流式细胞分析。将其结果示于图28。与用未处理的MSC给药的小鼠(PE-)相比，用经活化处理的MSC给药的小鼠(PE+)中，总巨噬细胞和M1巨噬细胞的比例显著增加。
MSC给药7天后和13天后，如下实施后肢肌肉功能评价。保持小鼠的颈部和尾部，将后肢置于直径1mm的金属制的线上，目测确定小鼠用两后肢抓住金属制的线后，将小鼠从线拉开，直至小鼠无法抓住金属线。将无法抓住的时刻的牵引力(克)记录为后肢肌肉力。牵引力用电子天平测量，其分解能为0.01g(A&D公司)。对各小鼠实施3次测量，使用其中值作为代表值。将结果示于图29。与PE-小鼠相比，PE+小鼠的后肢肌肉功能更高。
2)全身给药
接下来，使用p16ink4a表达量由于活化处理而增加的OA-MSC(BM-008)，进行对多发性肌炎的治疗效果的确认。将BM-008中OCT4、SOX2和p16ink4a基因的相对表达量示于图30。与BM-021同样，任一因子表达量均由于活化处理而增加。
与上述1)同样地制作多发性肌炎模型小鼠，初次免疫4周后，使用实施例7中制备的经活化处理的MSC(1x106细胞/只的BM-008)、未处理的MSC(1x106细胞/只的BM-008)或PBS(vehicle，空白)静脉内给药。MSC给药0天、7天和14天后，如下实施利用倒筛试验(invertedscreen test)进行的肌肉功能评价。将小鼠置于直径1mm、网眼5mm的金属网上，使金属网翻转，测量用前、后肢倒吊的时间。将小鼠的体重(克)与倒吊时间(秒)的积作为肌肉功能数据。与使用未处理MSC给药的小鼠(PE-MSC)相比，使用经活化处理的MSC给药的小鼠(PE+MSC)的肌肉功能更强(图31)。
将MSC给药14天后采集的小鼠肌肉组织的HE染色图像的一例示于图32。与PE-MSC小鼠相比，PE+MSC小鼠中，炎症细胞对肌肉组织的浸润少。此外，对于MSC给药14天后采集的小鼠肌肉组织(各组n＝3)，对肌肉截面面积进行分析。肌肉截面面积是，制成8μm的冷冻切片，一抗使用兔抗层粘连蛋白抗体(Abcam公司)、二抗使用抗兔Cy3标记抗体进行染色，用共焦点显微镜(Nikon公司)获得图像数据。层粘连蛋白检测的是肌肉基底膜，因此由层粘连蛋白包围的封闭区域是肌肉截面面积。封闭区域的面积使用ImageJ由图像数据算出。与使用未处理MSC给药的小鼠(MSC PE-)相比，使用经活化处理的MSC给药的小鼠(MSC PE+)中，肌肉截面面积更大(图33)。
如以上的1)、2)所示，确认到，与未处理的MSC相比，p16ink4a表达量由于活化处理而增加的MSC使总巨噬细胞和M1巨噬细胞的比例增加，此外促进由于炎症受损的组织的修复。这表明，MSC中p16ink4a基因的表达促进是与MSC的活化、即治疗效果的上升有相关性的事件。
实施例12 p16ink4a高表达MSC的功能评价(皮肤缺损)
对于在实施例4中对大鼠给药的3种MSC，通过实时PCR测得OCT4、SOX2和p16ink4a的基因表达量。将相对于在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的MSC(PE-(2D))的相对表达量示于图34。通过活化处理，各因子的表达量增加，特别是在使用了三维培养载体时显著增加。由实施例4中确认的创伤治愈效果的趋势确认到，与未处理的MSC相比，p16ink4a的表达量增加的MSC更快地带来创伤治愈，特别是p16ink4a的表达量显著增加的MSC，即使细胞数少也具有极高的创伤治愈能力。
实施例13 p16ink4a高表达MSC的功能评价(糖尿病性肾病)
对于实施例6中对大鼠给药的MSC，通过实时PCR测定OCT4、SOX2、Nanog、p16ink4a、p14ARF、IDO、α-SMA和TERT的表达量。将相对于在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的MSC的相对表达量示于图35。由于三维培养载体上的活化处理，OCT4、SOX2、Nanog、p16ink4a、p14ARF、IDO和TERT的表达量增加，α-SMA的表达量减少。由实施例6中确认的肾病治疗效果确认到，p16ink4a和p14ARF的表达量增加的MSC具有好的肾病治疗效果。
实施例14 p16ink4缺损MSC的功能分析(多发性肌炎)
1)p16ink4a敲除MSC的制备
对于从OA-MSC采集的骨髓来源MSC，使用p14ARF/p16CRISPR/Cas9KOplasmids(Santa Cruz Biotechnology)，进行编码p16ink4a和p14ARF的CDKN2A基因的敲除。将整合了用于CDKN2A基因敲除的目标gRNA的CRISPR/Cas9敲除质粒或作为对照的、整合了杂乱的(scramble)gRNA来代替目标gRNA的杂乱的质粒转染至MSC。与实施例8的2)同样地将这些MSC用于活化处理后，与作为一抗的抗p16ink4a抗体(anti-p16INK4A human，Proteintech)反应，用作为二抗的Alxa 647 Anti-rabbit IgG(Jackson)标记，进行免疫染色。
将MSC的荧光观察图像示于图36。只有在导入了敲除质粒的MSC(敲除MSC)中未观察到p16ink4a的荧光，因而确认该MSC是p16ink4a敲除的。
2)多发性肌炎模型小鼠中的MSC治疗效果
与实施例11的1)同样操作，使用上述1)的活化处理后的敲除MSC、杂乱的MSC或PBS在多发性肌炎模型小鼠的小腿三头肌局部给药，评价治疗效果。将MSC给药11天后采集的小鼠肌肉组织的层粘连蛋白染色图像的一例和肌肉截面面积的分析结果示于图37。与使用PBS给药的小鼠(空白)相比，使用杂乱的MSC给药的小鼠(SC)的肌肉截面面积增加，使用敲除MSC给药的小鼠(CDKN2A KO)中未确认到肌肉截面面积的增加。以这种方式敲除了p16ink4a的MSC确认到治疗效果的降低，表明p16ink4a是治疗效果的正向标志物。
实施例15 CD47高表达MSC的功能评价(皮肤缺损)
1)CD47高表达MSC的制备
对于从38岁男性采集的骨髓来源MSC，使用CD47 CRISPR activation plasmid(Santa Cruz Biotechnology)，转染用于活化CD47的整合了目标gRNA的质粒，制成过量表达CD47的MSC。
2)皮肤缺损模型小鼠中的MSC治疗效果
在35周龄Balb/c小鼠的背部设置两处将1.5cm×1.5cm的皮肤切除的部位，从而制作皮肤缺损模型大鼠。皮肤切除1天后，使用上述1)中制备的MSC(2.5×104细胞/只)、未进行质粒转染的对照MSC(2.5×104细胞/只)或PBS(空白)对小鼠静脉内给药，饲养9天。
将从皮肤切除后第3天至第9天的创伤面积变化量和对第9天的皮肤缺损部拍摄的照片示于图38。确认到与使用对照MSC给药的小鼠(Control)相比，使用CD47过量表达MSC给药的小鼠(CD47activate)的创伤面积变化量小、即创伤治愈慢，表明CD47是治疗效果的负向标志物。
实施例16 CD47表达量不同的MSC的功能评价(认知功能)
1)CD47表达量不同的MSC的制备
使用从OA-MSC采集的骨髓来源的MSC，以活化剂浓度0.0001mg/mL，与实施例8的2)同样地操作，进行三维培养载体上的活化处理，制备继代数为1次的经活化处理的MSC。此外，在二维培养载体(Corning(注册商标)Costar(注册商标)细胞培养6孔板、ThermoFisher Science公司)上将同一MSC按6×104细胞/孔的量播种，按1.3mL/孔加入不含活化剂的MSC培养培养基，在37℃进行4天培养，制备继代数为1次的未处理MSC。与实施例9同样地操作，测定这些MSC中的CD47阳性细胞率，结果，经活化处理的MSC中为＜20％，未处理MSC中为＞90％。
2)阿尔茨海默病模型小鼠中的MSC治疗效果
与实施例5同样操作，使用上述1)的2种MSC对APP/PS1小鼠进行髓腔内给药，评价治疗效果。将莫里斯水迷宫中的学习测试的结果示于图39，将记忆测试的结果示于图40。与使用CD47阳性细胞率低的MSC给药的小鼠相比，使用CD47阳性细胞率高的MSC给药的小鼠学习能力和记忆能力差，表明CD47是治疗效果的负向标志物。
实施例17 使用提取方法不同的活化剂的MSC的活化处理
用蒸发器对市售的人胎盘提取物(“美思满”，美思满制药株式会社)进行浓缩，制备活化剂，使用其与实施例8的2)同样地进行Preset VECELL和二维培养载体上的OA-MSC的活化处理。通过实时PCR测定这些OA-MSC中各基因的表达量。将各MSC中OCT4、SOX2、TERT和p16ink4a相对于在二维培养载体上在不存在活化剂下培养的MSC(2D·无活化剂)的相对基因表达量示于图41和图42。与实施例1的1)中制备的活化剂同样地，由人胎盘提取物制备的活化剂在三维培养载体上显示出更强的活化效果。
Figure ISB0000184204880000021
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Claims (28)

1.一种活化的间充质干细胞的制造方法，包括用含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂对间充质干细胞进行处理的活化工序，活化工序是使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体在所述含有活化剂的培养基中培养间充质干细胞的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，细胞培养载体在与细胞接触的面上具有由具有纳米～微米单位的平均纤维直径的纤维形成的开口部。
3.根据权利要求2所述的制造方法，开口部的平均直径为500nm～1000μm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制造方法，细胞培养载体为含有由生物降解性聚合物构成的纳米纤维的细胞培养载体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制造方法，培养基中活化剂的浓度是使用不具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养间充质干细胞的活化工序中的培养基中活化剂浓度的1/10～1/100000。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法，培养基中活化剂的浓度按蛋白质换算为0.01μg/mL～500μg/mL。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制造方法，活化工序中细胞的继代次数为2次以下。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制造方法，间充质干细胞为从有疾病的对象分离的间充质干细胞。
10.一种包含间充质干细胞的细胞制剂，CD47阳性细胞的比例为2％以下。
11.根据权利要求10所述的细胞制剂，间充质干细胞为通过权利要求1至9中任一项所述的方法制造的活化的间充质干细胞。
12.一种包含间充质干细胞的细胞制剂的制造方法，包括从间充质干细胞簇中浓缩CD47阴性间充质干细胞的工序。
13.一种与间充质干细胞的治疗效果正相关的用于评价间充质干细胞的治疗效果的标志物，其选自由p16ink4a和p14ARF组成的组。
14.一种与间充质干细胞的治疗效果负相关的用于评价间充质干细胞的治疗效果的标志物，其选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组。
15.一种判断间充质干细胞的治疗效果的方法，包括：测定待测间充质干细胞中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；将测得的表达量与对照间充质干细胞中的表达量进行比较的比较工序；以及在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中少的情况下，判断为待测间充质干细胞的治疗效果比对照间充质干细胞好的判断工序。
16.根据权利要求15所述的方法，
测定工序进一步包括测定待测间充质干细胞中的(A)和/或(B)的表达量，其中，
(A)为选自由DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6和TERT组成的组的至少1个基因或蛋白质，
(B)为选自由p53和α-SMA组成的组的至少1个基因或蛋白质，
判断工序为下述工序：在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中少的情况，以及所述(A)的基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中多的情况和/或所述(B)的基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中少的情况下，判断为待测间充质干细胞的治疗效果比对照间充质干细胞好。
17.一种判断间充质干细胞的治疗效果的方法，在权利要求15或16所述的方法的测定工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量，测定间充质干细胞中CD47阳性细胞的比例；在判断工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中少的情况，在间充质干细胞中CD47阳性细胞的比例在待测间充质干细胞中比在对照间充质干细胞中低的情况下，判断为待测间充质干细胞的治疗效果比对照间充质干细胞好。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，待测间充质干细胞为在包含含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂的培养基中培养的间充质干细胞。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，待测间充质干细胞为使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养的间充质干细胞。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，待测间充质干细胞为从欲接受间充质干细胞自身移植疗法的对象分离的间充质干细胞。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，待测间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞。
22.一种判断间充质干细胞对用于提高间充质干细胞治疗效果的处理的适应性的方法，包括：
测定经处理的间充质干细胞中选自由p16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量的测定工序；
将测得的表达量与未处理的间充质干细胞中的表达量进行比较的比较工序；以及
在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中少的情况下，判断为该间充质干细胞适合该处理的判断工序。
23.根据权利要求22所述的方法，
测定工序进一步包括测定经处理的间充质干细胞和未处理的间充质干细胞各自中的(A)和/或(B)的表达量，其中，
(A)为选自由DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6和TERT组成的组的至少1个基因或蛋白质，
(B)为选自由p53和α-SMA组成的组的至少1个基因或蛋白质；
判断工序为下述工序：在选自由p16ink4a和p14ARF组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中多的情况和/或选自由CDK4、CDK6、RB和CD47组成的组的至少1个基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中少的情况，以及所述(A)的基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中多的情况和/或所述(B)的基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中少的情况下，判断为该间充质干细胞适合该处理。
24.一种判断间充质干细胞对处理的适应性的方法，在权利要求22或23所述的方法的测定工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量，测定间充质干细胞中CD47阳性细胞的比例；在判断工序中，代替CD47基因或蛋白质的表达量在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中少的情况，在间充质干细胞中CD47阳性细胞的比例在经处理的间充质干细胞中比在未处理的间充质干细胞中低的情况下，判断为该间充质干细胞适合该处理。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，处理为在包含含有来自哺乳动物的胎儿附属物的提取物作为有效成分的活化剂的培养基中培养间充质干细胞的处理。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，处理为使用具有由纤维构成的三维结构的细胞培养载体培养间充质干细胞的处理。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，间充质干细胞为从欲接受间充质干细胞自身移植疗法的对象分离的间充质干细胞。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞。
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