CN110658286B - 利用rp-hplc法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用反相高效液相色谱(RP‑HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4‑羟基苯乳酸含量的方法,包括以下步骤:步骤a:配置流动相;步骤b:配制不同稀释倍数的苯乳酸和4‑羟基苯乳酸标准溶液,采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4‑羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析,制作标准曲线,绘制苯乳酸含量‑峰面积标准曲线和4‑羟基苯乳酸含量‑峰面积标准曲线,得出标准曲线回归方程;步骤c:将含有苯乳酸和4‑羟基苯乳酸的样品溶液适度稀释,8000~10000r/min离心2~4min,离心后经过0.22μm微滤,采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析,根据峰面积,按照步骤b的标准曲线回归方程,利用内标法计算出苯乳酸和4‑羟基苯乳酸的含量。
Description
技术领域
本发明属于高效液相色谱分析技术领域,涉及食品和发酵液中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的快速检测,具体涉及一种利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法。
背景技术
苯乳酸和4-羟基苯乳酸是近年来微生物源生物防腐剂研究的热点之一,可以有效抑制革兰氏阴性、阳性细菌和真菌的生长,不仅用于控制食源性致病菌和腐败菌的生长,而且在调节肠道菌群方面有巨大的潜力;同时它们溶解性好,对酸碱和温度的稳定性高,故在食品行业和健康保健等领域的应用前景被人们广泛看好。
目前,苯乳酸和4-羟基苯乳酸的检测主要有薄层层析法和高效液相检测法,相关报道均以单个物质的测定较多。高效液相色谱法测定苯乳酸代表性的方法是以0.05%的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05%的三氟乙酸/水(B)的混合液为流动相,梯度洗脱程序为:0~20min由10%A线性变化至100%,20~23min保持100%A,23~25min100%A线性变化至10%;流速1mL/min,检测波长210nm,柱温30℃。4-羟基苯乳酸的检测的方法为:0.05%三氟乙酸/水(A) 和0.05% 三氟乙酸/甲醇溶液(B)为流动相;梯度洗脱程序为:0~20min 为10%~100% B,20~23min保持 100% B;流速: 1mL/min;检测波长: 210nm;柱温: 30℃。这两种方法中均要求梯度洗脱,对仪器配制要求高,流动相比例发生变化时,基线易发生漂移,对结果产生影响。同时流动相中三氟乙酸酸性强,对柱子的损伤大,柱子寿命严重缩短。
发明内容
针对目前苯乳酸和4-羟基苯乳酸检测时对仪器要求高、柱子损伤大、不能同时检测中两种物质等问题,本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法,本发明的方法对柱子损伤小、准确度高,稳定性好,操作简单,节约成本,缩短生产过程中的检测时间,且检测结果准确可靠。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下:
利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法,包括以下步骤:
步骤a:配置流动相,过滤,脱气,调节仪器,平衡色谱柱;
步骤b:配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液,采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析,利用依利特离线数据处理软件进行数据处理,确定出峰时间,采用外标法,以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,制作标准曲线,绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线,得出标准曲线回归方程;
步骤c:将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品溶液适度稀释,8000~10000r/min离心2~4min,离心后经过0.22μm微滤,采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析,根据峰面积,按照步骤b的标准曲线回归方程,利用外标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量。
其中,步骤b中,所述色谱柱为 C18 (4.6×250mm,5μm)色谱柱,色谱条件包括:
流动相:流动相A为质量分数0.1%甲酸/水溶液,流动相B为乙腈,且所述流动相A和B的体积比为80:20;
流动相流速:0.5mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱温:20~30℃;
进样量:10μL。
本发明流动相的选择,利用质量分数0.1%的甲酸/水溶液来改善分离物质的吸附性能,C18色谱柱是亲水性色谱柱,亲水性强的先被分离出来,乙腈洗脱能力强,可使低波长下有吸收的杂质被检测,由于不使用梯度洗脱,检测结果稳定,基线不会发生漂移。两者结合使检测结果更准确,且保留能力强,对苯乳酸和4-羟基苯乳酸两个水溶性的物质分离效果好,出峰时间合适。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1、本发明流动相和流速不发生变化,压力稳定,2个水溶性物质同时被检出,操作简单,结果准确可靠,能够大规模检测样品中苯乳酸和4-羟基本速算的含量。
2、本发明利用质量分数0.1%甲酸/水溶液和乙腈为流动相,相较三氟乙酸为流动相时对柱子的损伤小。
3、本发明利用反相高效液相色谱法快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量,准确度高,稳定性好,操作简单,且检测结果准确可靠,检测样品和杂质之间分离较好,有利于食品样品和乳酸菌发酵液中的苯乳酸和4-羟基苯乳酸的定量检测。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的苯乳酸标准溶液的液相色谱图(0.8mg/mL);
图2是本发明实施例1提供的4-羟基苯乳酸标准溶液的液相色谱图(400ug/mL);
图3是本发明实施例提供的含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸混标的液相色谱图(1为4-羟基苯乳酸,2为苯乳酸);
图4 是本发明实施例1提供的含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液的液相色谱图(1为4-羟基苯乳酸,2为苯乳酸)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步说明。
以下实施例中采用的高效液相色谱仪为依利特P230ll,色谱柱为POSITISIL C18(3) (4.6×250mm,5μm)色谱柱色谱柱。其中,色谱条件为:
流动相:流动相A为质量分数0.1%甲酸/水溶液,流动相B为乙腈,且所述流动相A和B的体积比为80:20;
流动相流速:0.5mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱温:20~30℃;
进样量:10μL。
实施例1
利用反相高效液相色谱法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法,具体步骤为:
步骤a、配置流动相,过滤,脱气,调节仪器,平衡色谱柱;
步骤b、采用Aldrich纯度大于98%色谱纯苯乳酸标准品配制苯乳酸标准溶液,依次稀释得到浓度为0.2 mg/mL、0.4mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的标准溶液,采用高效液相色谱仪对苯乳酸标准溶液进行高效液相分析,每个浓度的标准溶液分别进样三次,利用依利特离线数据处理软件进行数据处理,色谱图如图1所示,图中保留时间为30.5800min处为苯乳酸的峰,其余为杂质峰,峰面积如表1所示,并采用外标法绘制苯乳酸含量-峰面积的标准曲线,得出标准曲线回归方程:y=33969x+2525.4,R2 =0.9976;
步骤c、采用Aldrich的纯度大于97%的色谱纯4-羟基苯乳酸标准品配制4-羟基苯乳酸标准溶液,依次稀释得到浓度为0.15 mg/mL、0.20mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL、0.35 mg/mL和 0.40 mg/mL的标准溶液,采用高效液相色谱仪对4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相分析,每个浓度的标准溶液分别进样三次,利用依利特离线数据处理软件进行数据处理,色谱图如图2所示,图中保留时间为10.0475min处为4-羟基苯乳酸的峰,其余为杂质峰,峰面积如表2所示,并采用外标法绘制苯乳酸含量-峰面积的标准曲线,得出标准曲线回归方程:y=30623x+384.2,R 2=0.9986;
步骤d、将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品进行前处理,8000r/min离心4min,0.22μm微滤,利用高效液相色谱仪分析,采用与上述标准溶液完全相同的色谱条件,记录峰面积,利用大连依利特离线数据处理软件计算峰面积,代入标准曲线,得到样品中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量。从图3可以看出,保留时间9.7983min为4-羟基苯乳酸的峰,保留时间30.7658min为苯乳酸的峰,其余的为杂峰,2个主峰的出峰时间适宜,且与杂峰分离度良好。
表1 苯乳酸标准溶液浓度与峰面积数值记录表
表2 4-羟基苯乳酸标准溶液浓度与峰面积数值记录表
实施例2
为验证上述实施例1的可行性和准确性,进行回收率试验,取已知含 0.25 ug/mL的 4-羟基苯乳酸浓度的发酵液样品 5 份,分别添加 4-羟基苯乳酸标准品溶液试验,进行样品处理和色谱分离检测,测定加样回收率。测定结果显示表3所示。
表3 4-羟基苯乳酸加样回收率实验数据
实施例3
为验证上述实施例1的可行性和准确性,进行回收率试验,取已知含 0.42 mg/mL的苯乳酸浓度的发酵液样品 5 份,分别添加苯乳酸标准品溶液试验,进行样品处理和色谱分离检测,测定加样回收率。测定结果显示表4所示。
表4 苯乳酸加样回收率实验数据
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤a:配制流动相,过滤,脱气,调节仪器,平衡色谱柱;
步骤b:配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液,采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析,利用离线数据处理软件进行数据处理,确定出峰时间,采用外标法,以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,制作标准曲线,绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线,得出标准曲线回归方程;
步骤c:将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品溶液适度稀释,8000~10000r/min离心2~4min,离心后经过0.22μm微滤,采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析,根据峰面积,按照步骤b的标准曲线回归方程,利用外标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量;
步骤b中,所述色谱柱为规格为4.6×250mm,5μm的C18色谱柱,色谱条件如下:
流动相:流动相A为质量分数0.1%甲酸/水溶液,流动相B为乙腈,且所述流动相A和B的体积比为80:20;
流动相流速:0.5mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱温:20~30℃;进样量:10μL。
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