CN110658195B - 一种移频无标记超分辨显微芯片及其成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种移频无标记超分辨显微芯片及其成像方法，该超分辨显微芯片包括两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明光波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域位于功能表面的光栅圈的中心。成像方法具体为：首先用普通显微镜照明样品，用光学相机采集样品的低频空间信息；然后将光斑打到不同光栅上面，采集样品的不同方向不同频率的高频空间信息；将低频、高频空间信息进行频移，然后在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。
Description
技术领域
本发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种移频无标记超分辨显微芯片及其成像方法。
背景技术
传统光学***受到阿贝衍射极限的限制，为了突破光学***的衍射极限，人们发明了一系列的荧光标记和非荧光标记方法。其中移频技术可以突破传统成像与探测器件的带宽限制，在视场大、速度快上具有显著优势。移频无标记超分辨显微术无需荧光标记，可以实现对非生物样品的超分辨成像，具有广泛的应用前景。
移频无标记超分辨显微方法利用高有效折射率的倏逝场将样品的高频空间信息转移到显微镜能接收到的低频部分，再通过频谱拼接算法将高低频频谱拼接，最终恢复出突破光学衍射极限的高分辨率图像。
目前已有的移频无标记超分辨显微技术有纳米线环状照明超分辨显微技术和有机发光薄膜超分辨显微技术，但是这些方法在实用化方面还存在着一定的难度。纳米线环状照明方法不利于进行集成化生产，而发光薄膜超分辨显微术由于有机发光薄膜遇到液体容易被破坏，不易清洗，且发光效率随着使用时间变长而降低，其实用性受到限制。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种移频无标记超分辨显微芯片及其成像方法，基于块状高折射波导材料，通过在波导表面制备光栅结构，利用光栅的衍射效应将自由空间光耦合进波导材料，利用全反射提供的高有效折射率倏逝场对样品进行移频照明，从而恢复出样品的超分辨显微图。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种移频无标记超分辨显微芯片，包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明光波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域位于功能表面的光栅圈的中心；一组同对光栅之间的间距满足：
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是该对光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角。
进一步地，如果照明光是可见光，可选衬底材料包括SiN、SiO2、Al2O3、TiO2或者Polymer等。成像分辨率取决于材料折射率以及选用照明波长，衬底材料和照明波长具体根据成像分辨率需求、成本、加工条件等选用。
进一步地，采用微纳加工方法制备光栅，包括EBL、FIB、光刻或纳米压印等。
一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学***结构，该光学***结构包括：耦合到芯片中产生倏逝场的平行光光源、支撑芯片的样品台、收集样品散射光的显微物镜、光学接收***和镜架等机械固定装置。其中平行光光源位于芯片的功能表面的外侧，照射到光栅表面，用于在衬底光波导中激发所需的倏逝场。显微物镜位于芯片的成像平面的外侧，用于收集成像信号。光学接收***包括了透镜、光学相机和计算机，用于记录成像信号。
进一步地，光源后可以增加光束扫描装置，将光斑准确反射到光栅上，提高成像速度。激光扫描装置可以是振镜或者空间光调制器。
进一步地，光源部分可以是激光或者LED光。
进一步地，可以在平行光光源后加缩束扩束装置，产生适合光栅大小的入射光斑。
一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学***结构的成像方法，该方法包括：
步骤一：普通显微镜照明样品，用光学相机采集样品的低频空间信息；
步骤二：将光斑打到不同光栅上面；光场经过光栅发生一级衍射，以一定的角度θm耦合到衬底光波导中；
其中λ是使用的光波长，n是材料的折射率，Pm是光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角。
光场在成像平面发生全反射，产生的倏逝场照明中心成像区域的样品并通过光学接收***采集样品的不同方向不同频率的高频空间信息；
步骤三：将步骤一和步骤二采集到的低频、高频空间信息进行频移，第m圈光栅产生的倏逝场频移量为：
Km＝K0*n*sinθm
其中
是入射光在真空中的波矢。然后在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。
本发明的有益效果：本发明直接在整块的光波导材料上面采用集成光学加工方法制备光栅结构，特点是可以实现集成化大规模生产，有利于降低芯片的成本；其次是器件功能结构所在的平面与样品放置的平面能够有效分离，可以在不破坏器件功能结构的情况下清洗成像区域，有利于芯片的重复利用。
附图说明
图1是芯片的截面及激发光的示意图；
图2是光学***结构的示意图；
图3是光栅的平面分布图；
图4是重构频谱示意图；
图5是仿真的移频超分辨的结果示意图。
图中：201.光源；202.光束的缩束扩束***；203.光束角度调节***；204.反射镜；205.样品台；206.芯片；207.显微物镜；208.透镜；209.光学相机；210.用于图像的存储、重构和显示的计算机。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例和附图来详细说明本发明。
如图1所示，本发明提供的一种移频无标记超分辨显微芯片，包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明光波段是透明的，如果照明光是可见光，可选衬底材料包括SiN、SiO2、Al2O3、TiO2或者Polymer等，成像分辨率取决于材料折射率以及选用照明波长，衬底材料和照明波长具体根据成像分辨率需求、成本和加工条件等选用。衬底材料其中一个表面是功能表面，采用EBL、FIB、光刻或纳米压印等微纳加工方法在上面刻m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域位于功能表面的光栅圈的中心；一组同对光栅之间的间距满足：
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是该圈光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角。
一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学***结构，该光学***结构包括：耦合到芯片中产生倏逝场的平行光光源201、支撑芯片的样品台205、收集样品散射光的显微物镜207、光学接收***和镜架等机械固定装置。其中平行光光源可以是激光或者LED光，位于芯片的功能表面的外侧，照射到光栅表面，用于在衬底光波导中激发所需的倏逝场。可以在平行光光源后加缩束扩束装置202，产生适合光栅大小的入射光斑。并且光源后可以增加光束扫描装置203，将光斑准确反射到光栅上，提高成像速度。激光扫描装置可以是振镜或者空间光调制器。显微物镜位于芯片的成像平面的外侧，用于收集成像信号。光学接收***包括了透镜208、光学相机209和计算机210，用于记录、存储和处理成像信号。
一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学***结构的成像方法，该方法包括：
步骤一：普通显微镜照明样品，用光学相机采集样品的低频空间信息；
步骤二：将光斑打到不同光栅上面；光场经过光栅发生一级衍射，以一定的角度θm耦合到衬底光波导中；
其中λ是使用的光波长，n是材料的折射率，Pm是光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角。
光场在成像平面发生全反射，产生的倏逝场照明中心成像区域的样品并通过光学接收***采集样品的不同方向不同频率的高频空间信息；
步骤三：将步骤一和步骤二采集到的低频、高频空间信息进行频移，第m圈光栅产生的倏逝场频移量为：
Km＝K0*n*sinθm
其中
是入射光在真空中的波矢。然后在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。
实施例
图1图3分别是波导芯片截面和平面的光栅分布示意图。芯片的功能表面有m圈成对分布的光栅，每圈的光栅周期一致，为Pm，成对光栅的间距Dm。上表面是成像平面，放置有需要成像的样品。上表面的成像区域位于下表面的光栅圈的中心。
假设一束平行光照明到芯片其中一组光栅，则产生的一级衍射光在光波导内的传输角度是：
λ是使用的光波长，n是材料的折射率，P是光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角。若平行光垂直照明，
则衍射角公式θ简化为：
该一级衍射光在成像区域发生全反射，所能提供的倏逝场的波矢是：K＝K0*n*sinθ，其中K0是入射光在真空中的波矢，可以表述为
一组同对光栅之间的间距是：Dm＝2*T*tanθ，其中T是波导的厚度。
其重构的频谱空间如图3所示，频谱空间相比普通显微镜的频谱空间扩大，分辨率得到了提高。
以SiN材料为例，在532nm的激光照明下，其折射率为2.06。
第一圈光栅的周期P1＝500nm,θ1＝32°，倏逝波的有效折射率为1.06；
第二圈光栅的周期P2＝300nm，θ2＝62°，倏逝波的有效折射率为1.77；
第三圈光栅的周期P3＝270nm，θ3＝80°，倏逝波的有效折射率为1.97；
分别用平行光垂直照射每圈不同方向的光栅，来自光栅的一级衍射光将以θm的角度射到上表面成像区域，样品散射的光将被光学***接收到并被存储记录。再拍摄普通显微镜垂直照明下的样品信息。将这些不同空间频谱范围的物体的信息采集后，在频域空间进行迭代拼接得到扩大后的频谱，如图4，最后进行反傅里叶变换得到突破衍射极限的样品图像。如图5所示，图5(a)是原本的样品分布，其中双白线具有180nm的间距，图5(b)是宽场显微镜拍摄的图，其中纳米结构的细节信息是无法分辨的，图5(c)是采用我们的方法重构的结果，可以发现180nm的结构信息被有效分辨出来。相比普通显微镜其分辨率可以提高1.5倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内。
Claims (8)
1.一种移频无标记超分辨显微芯片，其特征在于，包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明光波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域位于功能表面的光栅圈的中心；第m圈光栅圈的直径为：
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是第m圈光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角。
2.根据权利要求1所述的一种移频无标记超分辨显微芯片，其特征在于，如果照明光是可见光，可选衬底材料包括SiN、SiO2、Al2O3、TiO2或者Polymer；成像分辨率取决于材料折射率以及照明波长，衬底材料和照明波长具体根据对成像分辨率的需求、成本、加工条件选用。
3.根据权利要求1所述的一种移频无标记超分辨显微芯片，其特征在于，采用微纳加工方法制备光栅，包括EBL、FIB、光刻或纳米压印。
4.一种利用如权利要求1所述的超分辨显微芯片进行成像的光学***结构，其特征在于，该光学***结构包括：耦合到芯片中产生倏逝场的平行光光源、支撑芯片的样品台、收集样品散射光的显微物镜、光学接收***和镜架机械固定装置；其中平行光光源位于芯片的功能表面的外侧，照射到光栅表面，用于在衬底光波导中激发所需的倏逝场；显微物镜位于芯片的成像平面的外侧，用于收集成像信号；光学接收***包括了透镜、光学相机和计算机，用于记录成像信号。
5.根据权利要求4所述的光学***结构，其特征在于，所述平行光光源后增加光束扫描装置，将光斑准确反射到光栅上，提高成像速度；所述光束扫描装置是振镜。
6.根据权利要求4所述的光学***结构，其特征在于，光源部分是激光或者LED光。
7.根据权利要求4所述的光学***结构，其特征在于，在所述平行光光源后加缩束扩束装置，产生适合光栅大小的入射光斑。
8.一种利用如权利要求4所述的光学***结构的成像方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一：普通显微镜照明样品，用光学相机采集样品的低频空间信息；
步骤二：将光斑打到不同光栅上面；光场经过光栅发生一级衍射，以一定的角度θm耦合到衬底光波导中；
其中λ是使用的光波长，n是材料的折射率，Pm是第m圈光栅的周期,
是入射光与波导法线的夹角；
光场在成像平面发生全反射，产生的倏逝场照射放置于中心成像区域的样品并通过光学接收***采集样品的不同方向不同频率的高频空间信息；
步骤三：将步骤一和步骤二采集到的低频、高频空间信息进行频移，然后在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像；第m圈光栅产生的倏逝场频移量为：
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| GR01 | Patent grant | ||
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