CN110656183A

CN110656183A - 用于犬的str基因座集及用途

Info

Publication number: CN110656183A
Application number: CN201810687031.7A
Authority: CN
Inventors: 李生斌; 梁雪; 伏东科; 李梦瑶; 王帅; 许骄
Original assignee: Shenzhen Huada Forensic Science And Technology Co Ltd; Shenzhen Huada Judicial Technology Collaborative Innovation Institute
Current assignee: Shenzhen Huada Forensic Science And Technology Co Ltd; Shenzhen Huada Judicial Technology Collaborative Innovation Institute
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-01-07

Abstract

本发明涉及遗传学测定领域，具体涉及一种用于犬的STR基因座集及用途。STR基因座集，选自以下基因座中的至少一种：D1S653、D1S317、D2S374、D3S174、D4S768、D7S109、D13S170、D16S585、D19S512、D20S531、D31S244、D34S45。本发明还提供了用来扩增所述STR基因座集的引物组，试剂盒、基因分型的方法、基因分型的***、用于犬个体识别和亲缘鉴定的方法和设备。利用这些STR基因座集可以实现对于犬的个体识别和亲缘鉴定，而且具有高个体识别能力。

Description

用于犬的STR基因座集及用途

技术领域

本发明涉及遗传学测定领域，具体涉及一种用于犬的STR基因座集及用途，尤其涉及一种STR基因座集、用来扩增所述STR基因座集的引物组，试剂盒、基因分型的方法、基因分型的***、用于犬个体识别和亲缘鉴定的方法和设备。

背景技术

微卫星(microsatellite)，又称短串联重复序列(short tandem repeats，STR)，是由2-6个碱基作为核心单位串联重复而成的DNA序列，因其在基因组中分布广泛、具有高度的遗传多态性、检测方法简单而被广泛应用于法医学领域，尤其在个体识别和亲权鉴定中发挥了重要的作用。

然后用于犬的个体识别和亲缘鉴定的STR位点还有待于进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种STR基因座集、用来扩增所述STR基因座集的引物对，试剂盒、基因分型的方法、基因分型的***、用于犬个体识别和亲缘鉴定的方法和设备。

本发明的发明人在研究过程中发现，针对犬个体识别的已有方法，存在各种弊端，主要包括如下几个方面：

第一，已有的针对犬的STR位点的位点数量较少，遗传信息含量有限，且部分基因座遗传多态性低不高，累计个体识别率较低，不同品种的犬之间存在较大差异，广泛性差，在实际应用中受到限制，有待于进一步改良和优化。

第二，一些利用犬的STR基因座荧光标记检测试剂盒进行遗传多态分析的过程中，必须经过DNA提取这一步骤，无形中延长了实验周期，整体成本较高。

因此本发明提供了一种痕量样本条件下准确率更高，速度更快，操作更简便的新型个体识别方法，能够突破现有犬个体识别方法的局限性，而且该方法在用于犬的个体识别过程中，在个体出生时就已经完全表现，并且终生不变，不受性别、年龄、疾病、环境等因素影响，准确率高且不受样本数量的限制。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种STR基因座集，所述STR基因座集选自下列至少之一：D1S653、D1S317、D2S374、D3S174、D4S768、D7S109、D13S170、D16S585、D19S512、D20S531、D31S244、D34S45。根据本发明的实施例，本发明提供了一种STR基因座集，其可以包括D1S653、D1S317、D2S374、D3S174、D4S768、D7S109、D13S170、D16S585、D19S512、D20S531、D31S244、D34S45基因座中的一种、两种或多种。例如，所述STR基因座集可以仅包括D1S653，也可以包括D1S653和D1S317，或者也可以包括D2S374、D3S174和D4S768等。利用本发明提供的STR基因座集，可以应用于犬的精准个体识别和精细化管理，能够对犬进行有效的个体识别，提高犬的个体识别能力，且痕量样本即可以实现，不受性别、年龄、疾病、环境等因素影响，准确率高且不受样本数量的限制。本发明提供的各基因座具有很高的多态性，可以有效地对个体进行识别和鉴定。

根据本发明的实施例，所述STR基因座集可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述基因座进一步包括下列至少之一：DRAS2、SC24A2、ATP2B2、FH2010、CTNND2、DAMEL。各基因座具有很高的多态性，可以有效地对个体进行识别和鉴定。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种引物组，所述引物组适于特异性扩增含有本发明第一方面所述的STR基因座集中的至少之一的核酸序列。

根据本发明的实施例，以上引物组可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述引物组根据本发明第一方面所述的每一个基因座的核心序列两端250bp以内的保守序列设计而成。利用每一个基因座的核心序列两端250bp以内的保守序列设计引物对，实现对于每一个基因座的扩增，从而可以保证扩增的准确性。其中核心序列指的是每一个基因座所对应的重复单元所形成的短串联重复结构。根据本发明的一些实施例，所述核酸序列长度不超过600bp。

根据本发明的一些实施例，所述核酸序列位于基因组中。

根据本发明的实施例，所述引物组选自下列至少一对：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:36。在进行多重PCR反应的时候，引物序列的选择应该非常小心。因为引物的不恰当选择可能会产生不期望的结果，例如扩增缺乏、在预期的靶基因座之外的一个或多个位点扩增、形成引物二聚体、不同的基因座的引物间发生非期望的相互作用等等。本发明提供的引物对可以同时实现基因座的共扩增，能够同时实现各基因座的多重PCR扩增。

根据本发明的一些实施例，所述引物组中的至少一个引物上连接有可检测标记，所述可检测标记包括荧光标记。当不同的引物组上连接有不同的可检测标记时，通过检测相应的标记，来反映不同的STR基因座的情况。

根据本发明的一些实施例，所述引物组中包含有多种不同的可检测标记。当所述引物组中包含不止是一对引物时，即通过一个扩增体系，实现两个以上的STR位点的同时扩增，可以根据需要，将不同的引物标记上不同的荧光标记，然后根据荧光的不同，得到带有不同的荧光的DNA扩增产物；对于带有同种荧光的DNA扩增产物，可以结合DNA扩增产物的片段大小，区分得到具体对应是哪个STR基因座。例如，利用不同的荧光染料标记引物，使得扩增出来的产物可以分别检测为蓝色，绿色，黄色或者红色等，可以实现每一个STR基因座的快速检测。具体可以为采用FAM标记为蓝色，HEX标记为绿色，TMRA标记为黄色，ROX标记为红色。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括根据本发明第二方面所述的引物组。本发明提供的试剂盒能够实现STR基因座集的扩增，应用于犬的精准个体识别和精细化管理，能够对犬进行有效的个体识别，提高犬的个体识别能力。

根据本发明的实施例，以上试剂盒可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的一些实施例，所述试剂盒进一步包括等位基因分型标准物，所述等位基因分型标准物包括根据本发明第一方面所述的每一个基因座的纯合子DNA。将每一个基因座的纯合子DNA作为等位基因分型标准物，用来实现对于未知样本的STR基因座的分型。在本文中，所用到的术语“等位基因分型标准物(allelic ladder)”指的是一组长度与各STR基因座所对应等位基因形成的DNA。试剂盒中可以含有不同的等位基因分型标准物，以便应用所述试剂盒区分STR基因座上的不同的等位基因。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测基因座集的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于犬类个体识别和亲缘鉴定。根据本发明的实施例，所述基因座集为根据本发明第一方面所述的基因座集。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种基因分型的方法，包括：对待测样品内的基因座集中的至少一个基因座进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述基因座集为根据本发明第一方面所述的STR基因座集；对所述经扩增的等位基因进行分析，以确定在所述待测样品内的基因组座集中的至少一个基因座上存在的等位基因。

根据本发明的实施例，以上基因分型的方法可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的一些实施例，利用多重扩增反应对待测样品内的基因座集中的至少两个基因座进行共扩增，得到经扩增的等位基因。

根据本发明的一些实施例，对所述待测样品内的DNA上的基因座集中的至少一个基因座进行扩增。

根据本发明的一些实施例，所述待测样品来自于犬。

根据本发明的一些实施例，所述待测样品来自于血液、***、***细胞、毛发、唾液、尿、骨、口腔样品、含有胎盘细胞的羊膜水、含有胎儿细胞的羊膜水中的一种或多种。

根据本发明的一些实施例，在进行所述分析之前，还包括对所述经扩增的等位基因进行分离。

根据本发明的一些实施例，通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离。

根据本发明的一些实施例，使用引物组特异性扩增含有根据本发明第一方面任一实施例所述的STR基因座集中的至少之一的核酸序列，所述引物组为根据本发明第二方面任一实施例所述的引物组。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种基因分型的***，所述***包括：扩增单元，所述扩增单元用于对待测样品内的基因座集中的至少一个基因座进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述基因座集为本发明第一方面任一实施例所述的STR基因座集；等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述等位基因确定单元用于对所述经扩增的等位基因进行分析，以确定在所述待测样品内的基因组座集中的至少一个基因座上存在的等位基因。

根据本发明的实施例，以上基因分型的***，可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的一些实施例，所述扩增单元利用多重扩增反应对所述待测样品内的基因座集中的至少两个基因座进行共扩增，得到经扩增的等位基因。

根据本发明的一些实施例，所述扩增单元用于对所述待测样品内的DNA上的基因座集中的至少一个基因座进行扩增。

根据本发明的一些实施例，所述待测样品来自于犬。

根据本发明的一些实施例，所述***还包括分离单元，所述分离单元分别与所述扩增单元和所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述经扩增的等位基因进行分离。

根据本发明的一些实施例，所述分离单元通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离。

根据本发明的一些实施例，所述扩增单元使用引物组特异性扩增含有根据本发明第一方面任一实施例所述的STR基因座集中的至少之一的核酸序列，所述引物组为根据本发明第二方面任一实施例所述的引物组。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种STR基因座集在犬个体识别和亲缘鉴定领域中的用途。根据本发明的实施例，所述STR基因座集为本发明第一方面任一实施例所述的STR基因座集。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种用于犬个体识别和亲缘鉴定的方法，包括：基于STR基因座集，获得待测样本中所述DNA的基因分型结果，所述STR基因座集包括本发明第一方面所述的STR基因座集；根据所述基因分型结果，对所述犬待测个体进行个体识别和亲缘鉴定。利用本发明的STR基因座集，可以直接利用犬的血液样本，而不经过核酸提取步骤，直接将采样载体加入PCR-STR反应体系中进行复合PCR扩增。从而实现犬的个体识别和亲缘鉴定。

根据本发明的一些实施例，所述基因分型结果根据本发明第五方面任一实施例所述的方法获得。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于犬个体识别和亲缘鉴定的设备，包括：基因分型***，所述基因分型***基于SRT基因座集，获得待测样本中所述DNA的基因分型结果，所述STR基因座集包括本发明第一方面所述的STR基因座集；分析***，所述分析***与所述基因分型***相连，所述分析***根据所述基因分型结果，对所述犬待测个体进行个体识别和亲缘鉴定。

根据本发明的实施例，所述基因分型***为根据本发明第六方面任一实施例所述的***。

本发明所取得的有益效果为：本发明从DNA层面对犬只个体进行个体识别及亲缘鉴定，提供了一组包含19个基因座在内的遗传标记***，该套遗传标记***在个体出生时就已经完全表现且终生不变，不受性别、年龄、疾病、环境等因素影响，能够为犬提供一个永久的身份及亲缘鉴定的科学依据，为涉犬案件侦破提供更全面的技术支持。而且可以取代核酸提取步骤，利用犬的血液样本，直接将血液样本加入PCR-STR反应体系中进行复合PCR扩增，在对犬进行基因分型的过程中，操作流程更少，实验周期更短，成本更低等优势。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施例提供的基因分型***的示意图。

图2是根据本发明的一个实施例提供的基因分型***的示意图。

图3是根据本发明的一个实施例提供的用于犬个体识别和亲缘鉴定的设备。

图4是根据本发明的一个实施例提供的技术路线的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为了实现对于犬个体的科学和精确识别，本发明提出了一种对未知犬生物检材进行个体识别的方法，并提供了一套完整的信息分析流程，获得了一套包含18个STR基因座在内的遗传标记***，应用于犬精准个体识别和精细化管理。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种STR基因座集，所述STR基因座集选自下列至少之一：D1S653、D1S317、D2S374、D3S174、D4S768、D7S109、D13S170、D16S585、D19S512、D20S531、D31S244、D34S45。进一步地，所述STR基因座集包括下列至少之一：DRAS2、SC24A2、ATP2B2、FH2010、CTNND2、DAMEL。

其中，每个STR基因座的基本信息如下表1所示：

表1. 18个STR基因座的基本信息

注【1】基因座名称命名规则如下：

a.位于基因区的STR位点采用基因名称作为位点名称，包括DRAS2、SC24A2、ATP2B2、CTNND2；

b.已有文献/专利报道的STR位点保持其原有名称不变，包括FH 2010；

c.新发现的STR位点按照“D+染色体号+S+起始碱基前3位数字”规则命名，包括D1S653、D1S317、D2S374、D3S174、D4S768、D7S109、D13S170等。

利用包含本发明18个STR基因座中的一种、两种或者多种组成的STR基因座集，能够对犬进行有效的个体识别。本发明中的STR基因座集也可以称为STR遗传标记***。

下面对本发明中出现的某些术语进行解释和说明，以便能够更好的理解本发明。需要说明的是，这些解释和说明，仅用来帮助对于本发明的理解，而不应看做是对于本发明的限制。

在本文中，正如本领域通常的理解，“DNA”指的是以其各种形式存在的脱氧核糖核酸，诸如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA以及染色体DNA。“核酸”是指任何形式的DNA或RNA(核糖核酸)。

在本文中，基因座或者位点指的是基因在染色体上所占的位置，在分子水平上，基因座是指有遗传效应的DNA序列。一个基因座可以是一个基因，一个基因的一部分，或具有某种调控作用的DNA序列。染色体中，编码在相同基因座上的DNA被称为等位基因。

在本文中，所用到的术语“STR基因座”或“STR位点”或“多个STR基因座”或者“STR基因座集”中的STR基因座或者STR位点是指由在某一个染色体处或者给定的靶核酸处，由两个或多个核苷酸重复形成的核苷酸序列。其中“多个STR基因座”或者“STR基因座集”包括两个以上的STR基因座组成的组合物。在本文中，所用到的术语“STR等位基因”或”等位基因”指的是个体基因组中发现的STR基因座的存在形式。针对某一个STR基因座，其可以是杂合的，意味着两个等位基因(分别来自于两个生物学亲本)的长度不同且碱基对组成不同，或者可以是纯合的，意味着两个等位基因长度相同(碱基对组成通常相同但并不总是相同)。某些情况下，对于给定的STR基因座，个体可能具有三个或更多个等位基因。偶尔，由于一个或多个突变，给定STR基因座的个体的等位基因可能不同于它的父母。

在对待测个体或者待测样本体内的基因座进行分析时，可以从待测个体或者待测样本的组织样品中制备得到DNA，所述组织样品例如可以是血液、***、***细胞、毛发、唾液、尿、骨、口腔样品、含有胎盘细胞或胎儿细胞的羊膜水、绒膜绒毛、和/或任意这些的混合物或其他组织的一种或更多种。

在本文中，“引物组”包含至少一对引物，所述引物适于特异性扩增所述STR基因座集中的至少一个STR基因座的核酸序列。因此，在某些情况下，引物组也可以表述为引物对。引物组中可以仅包含一对引物，用来特异性扩增一个STR基因座；也可以包含两对以上的引物，可以用来特异性扩增两个以上的STR基因座。

本发明还提供了一种试剂盒。所述试剂盒可以用来对待测样本或者待测个体的STR基因座进行扩增或者检测。在本发明的一些具体实施方式中，所述试剂盒包括容器，所述容器中具有用来扩增一个或者更多个基因座的特异性引物对。所述试剂盒还可任选地包含使用说明书。所述试剂盒还可以包含其它任选的试剂盒成分，例如包括以下中的一种或者两种或者多种：用于扩增的足量的酶、促进扩增的缓冲液、促进酶活性的盐溶液、在扩增期间用于链延伸的核苷酸(dNTP)、用于制备用于电泳的扩增材料的上样溶液、作为模板对照的基因组DNA、保证材料如预期的模式在分离介质中迁移的大小标记物、以及教导用户以及减少使用中的误差的方案和手册。本发明的试剂盒包括任何其他形式的例如用于手工应用的测试试剂盒或使用自动化检测仪或分析仪的测试试剂盒等，这些均包含在本发明所述的试剂盒的范围之内。其中，盐和缓冲液例如，可以包括氯化镁以及Tris-HCl和KCl。缓冲液中可以含有添加剂，如表面活性剂、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG)，以及本领域技术人员熟知的其他添加剂。核苷酸通常是脱氧核糖核苷三磷酸，例如脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，也以适当的量加至反应室用于靶核酸扩增。

利用本发明提供的STR基因座集可以实现亲子鉴定。在进行亲子鉴定时，可将待测样本的STR基因座的扩增结果或DNA概况与取自假定匹配源的已知样品的STR基因座的扩增结果或DNA概况进行比较，或者也可以与衍生自该假定匹配源的样品的STR基因座的扩增结果或DNA概况进行比较。

利用本发明提供的STR基因座，还可以用来丰富犬的基因库。根据本发明的实施例，本发明在对犬类进行个体识别和亲缘鉴定时，所用到的参考基因组是canFam3基因组。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种基因分型***，如图1所示，所述***包括扩增单元和等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连。所述扩增单元用于对待测样品内的基因座集中的至少一个基因座进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述基因座集为根据本发明第一方面所述的STR基因座集；所述等位基因确定单元用于对所述经扩增的等位基因进行分析，以确定在所述待测样品内的基因组座集中的至少一个基因座上存在的等位基因。

根据本发明的实施例，所述基因分型***还可以进一步包括分离单元，如图2所示，所述分离单元分别与所述扩增单元以及所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述经扩增的等位基因进行分离。例如，可以通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于犬类个体识别和亲缘鉴定的设备，如图3所示，包括：基因分型***以及分析***，所述分析***与所述基因分型***相连。所述基因分型***基于SRT基因座集，获得待测样本中所述DNA的基因分型结果，所述STR基因座集包括本发明第一方面所述的STR基因座集；所述分析***根据所述基因分型结果，对所述犬待测个体进行个体识别和亲缘鉴定。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在本实施例中，本发明通过生物信息分析，筛选出一组能够对未知来源的犬只个体进行有效个体识别的18个高辨性STR位点，其中的17个位点位于常染色体，1个位点位于性染色体(DAMEL)。这18个位点是通过对70只犬的全基因组重测序数据中分析得到，并在另外188只无关样本中得到验证。基于上述位点可以对未知来源的犬只个体进行个体识别和亲缘鉴定。

具体分析流程如下：

1)数据获取：

从DoGSD数据库(http://dogsd.big.ac.cn)中获取70只犬的全基因组重测序数据(illuminant HiSeq 2000)用于位点筛选，这70只犬个体之间均无生物学关联。

2)数据预处理：

使用BWA(v0.6.2-r126)将原始数据比对到最新版本犬参考基因组canFam3.fa，然后使用Picard(v1.87)去除由PCR产生的重复序列，再使用GATK(v2.5-2)进行碱基校正。

3)序列比对

使用lobSTR(v4.0.6)将bam文件比对到犬参考基因组，并使用Samtools(v1.3.1)进行排序和索引。

4)基因分型：

运行Allelotype程序，提取犬全基因组中的全部STR位点，共计334,642个候选STR位点。

5)位点筛选：

为了从上述334,642个候选位点中筛选出最优的STR位点，以便应用于犬的个体识别和亲缘鉴定，根据程序计算出的每个位点的个体识别率(PD)、随机匹配率(PM)、多态性信息含量(PIC)、杂合度(HE)等重要筛选条件，并经过GENEPOP程序对频率分布进行了Hardy-Weinberg平衡检验和连锁不平衡检验，初步筛选取50个STR作为试剂盒的候选位点。

6)引物设计、合成、筛选：

通过对这些STR位点进行研究发现，有些位点没有合适的扩增引物，有些位点和其他位点一同扩增进行基因分型时，所获得产物之间会发生交叉等等。通过设计并合成PCR扩增引物，根据引物的工作浓度进行溶解后，按照比例配置PCR扩增体系，以犬DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，经筛选得到44对电泳条带清晰、特异性良好的引物。

7)荧光标记引物：

采用荧光染料标记引物，其中蓝色用FAM、绿色用HEX、黄色用TMRA、红色用ROX，以犬DNA为模板进行单点PCR扩增，3730毛细管电泳检测扩增产物，进一步筛选出18对无杂峰的引物可用于复合扩增。

所述引物如表2所示，所述引物用来扩增表1中所述的STR基因座，其中用于扩增D20S531，FH2010，D2S374，D34S45，D1S653，DAMEL的STR基因座的引物上标记有FAM蓝色荧光，用于扩增D19S512，D31S244的STR基因座的引物上标记有HEX绿色荧光，用于扩增D7S109，ATP2B2，DRAS2，D4S768，CTD2的STR基因座的引物上标记有TMRA黄色荧光，D16S585，SC24A1，D13S170，D1S317，D3S174引物上标记有ROX红色荧光。

表2 18个STR位点的引物

经过实验验证，利用以上引物，能够实现每一个STR基因座的扩增。更重要的是，将这些引物混合形成混合物，能够在一个扩增体系中同时实现对于所有STR基因座的扩增。每条引物退火温度均在60℃左右，彼此之间不会产生引物二聚体，也不会发生非特异性扩增，也没有其他的相互作用或者交叉反应。

其中17个基因座的个体识别能力(discrimination power，PD)、随机匹配概率(probablity of matching，PM)、多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)、杂合度(expeeted hcterozygosity，HE)均由Modified-Powerstates软件计算得到。采用乘积原理计算17个STR基因座的累积随机匹配概率(CPM)和累积个体识别能力(CPD)。17个常染色体STR位点的群体遗传学参数见表3。

表3 17个常染色体STR位点的群体遗传学参数(n＝70)

其中，PIC用来评价一个多态性基因座使用价值的一个量化概念，即在某一个群体内科利用该基因座进行遗传分析的概率。PD(Power of Discrimination)也简写为DP，是指在同一群体中随机抽取两名个体，其基因型不同的概率，即利用某一遗传标记可以识别无关个体的能力。随机匹配概率(probability of matching，PM)即为在同一群体随机抽取两名个体，基因型由一致的概率。杂合度(heterozygosity，HE)是指某群体某一遗传标记所有基因型中杂合子所占到的比例。即为杂合子数与个体总数的比值，杂合度用来反映群体内遗传变异的水平。通常在行业内，一般如下法医学参数达到下列阈值要求的STR位点即可作为法医学鉴定依据，包括：HE>＝0.6,PD>＝0.6,PIC>＝0.5,CPD>＝0.99999。从表2可以看出，本发明的17个STR基因座中的每一个基因座的杂合度(HE)在0.64-0.83之间，个体识别能力(PD)为0.70-0.91，多态信息含量为0.64-0.82，随机匹配概率均在0.09-0.3之间，累积个体识别能力(CPD)达0.9999999999999238，远超出行业标准，利用本发明提供的STR基因座集可以实现犬的个体识别和亲缘鉴定。

8)复合扩增体系建立与优化：

将验证完毕的荧光标记引物进行混合，配制成Primer Mix，以犬DNA为模板进行复合扩增，3730毛细管电泳检测荧光扩增产物，GeneMapper软件分型。调整复合扩增体系的循环参数、Mg²⁺浓度、复合扩增反应体积以及荧光标记引物浓度等，使扩增产物达到平衡、特异性的要求，建立稳定、均衡的复合扩增体系。

9)等位基因ladder建立及分型标准化：

以犬DNA作为模板，复合扩增后上机检测扩增片段大小，选取各基因座的纯合子个体，并将其PCR产物分别与载体进行连接反应，将重组后的质粒转化感受态细胞，筛选阳性菌株，提取质粒，以重组质粒DNA为模板，PCR扩增各基因座的等位基因，产物胶回收纯化后，混合各等位基因ladder，3730毛细管电泳检测，并建立准确的panels，bins文件以及Matrix文件，实现复合扩增体系的分型标准化。

10)案例验证：

与深圳趣致宠物医院合作，在相关负责人知情同意的情况下采集188只不同品种犬的血液样本进行案例验证，并注明其品种、性别、年龄、体重、毛色、采样日期等；按照上述实验步骤，获得每个验证样本在18个位点的等位基因型，热图显示出所有验证集中两两样本之间的差异等位基因型数目，结果表明在188个验证样本中存在188种等位基因型组合，即没有任何两个样本的分型数据完全一致。

实施例2

实施例2提供了一种利用本发明提供的STR基因座集为每只犬建立一套个体专属的犬DNA档案的方法，包括如下步骤：

(1)样本采集：将抽血部位(耳尖)的被毛剃去直至耳缘静脉清晰可见，用碘酒-酒精进行局部皮肤消毒，将针头迅速穿刺入静脉采集1-2滴血液于专业采血滤纸上，待血卡上的血痕自然阴干；采用手持式打孔器从干血卡中央部位获取4个0.5mm的血痕滤纸片，放于96孔板或0.2mL PCR管中。

利用实施例1中给出的引物进行PCR扩增。

(2)PCR扩增：采用10μl反应体系，按照PCR热循环程序(详见下表)对本发明中18个STR位点进行直接PCR扩增反应(简称为“直扩”)；

PCR反应体系如下表所示：

表4 PCR反应体系

PCR热循环程序如下表所示：

表5 PCR热循环程序

(3)电泳检测：采用ABI-3730XL型遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳检测，包括自动灌胶、上样、电泳分离和检测；采用专业法医鉴定软件GeneMapper ID v4.0对分型结果进行判读，记录本发明中18个STR位点的等位基因。

(4)出具报告：根据18个STR位点的基因分型结果，为每只犬建立一套个体专属的“犬DNA档案”，用于个体识别和亲缘鉴定。

按照如上方法，对多个待测犬类样本的18个基因座扩增，并进行分型测定。结果，对于被测试的犬类的样本来说，每个样本的分型结果图谱清晰完整，而且没有任何两个样本的分型数据完全一致，表明基于本发明的18个基因座，完全可以实现对于犬类的基因分型。以所得到的分型结果作为每只犬建立DNA档案报告，用作犬个体的识别，以此来建立犬类的DNA档案库。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市华大司法技术协同创新研究院，深圳华大法医科技有限公司

<120> 用于犬的STR基因组座集及用途

<130> PIDC3182030

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatccaggac ataggctgct accaa 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagtctggct tctttcactt gtgt 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctcaggaac tgtgggacaa tatcaag 27

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggcgattgg taagtctctc agtca 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agccaagata tgaaagcacc gtgtcc 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccacctcca ggcagtttat tctct 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acatggttct tgtccccagt agctc 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcaggaaa tggcacaggt aaggaa 26

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cacattttcc caggcagtag gaac 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtaagttac agggatgtag gtacaac 27

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttagcaaatt taactccacc agattctc 28

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttctcagcca aaactcatca tggta 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aattggctga ggagatggag ctg 23

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctctgaccc tttagatatt ttggat 26

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctgaacccaa gactgaaagt agcct 25

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccaaaagggc tgactgaaga gatcaca 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tctctttccc ttctgccttc aacca 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cactgccaca acaaaaccta actga 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tatccaggac ataggctgct accaa 25

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gagtctggct tctttcactt gtgt 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgcgtactgt ctctcaagtt ctct 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacctgacac agtagaagtt catc 24

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atccactcac ccaccaatcc atc 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gctttcctgg ctgacaaact ccc 23

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgctatggaa gtagagggag acaagg 26

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaagggcaag gaattgcttt ca 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccagaatgga acagttgagc at 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gattttccag cctgtgcctt 20

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctagaatttg atttttaagg aaaggtgcca t 31

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aacagccatt agagggaaaa tgatttgat 29

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

accaggttgc atgatacact agaca 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

actgatgagt ttcatgctgg acgat 25

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcccctcagc tgggttttaa actg 24

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tcgtagtcgc tcatggatag caagacct 28

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tgttgattgt ttgcctgcct 20

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gttatttctt caagcttgtg aaattg 26

Claims

1.一种STR基因座集，其特征在于，选自下列至少之一：

D1S653、D1S317、D2S374、D3S174、D4S768、D7S109、D13S170、D16S585、D19S512、D20S531、D31S244、D34S45；

任选地，进一步包括下列至少之一：

DRAS2、SC24A2、ATP2B2、FH2010、CTNND2、DAMEL。

2.一种引物组，其特征在于，所述引物组适于特异性扩增含有权利要求1所述STR基因座集中的至少之一的核酸序列；

任选地，所述引物组根据权利要求1中所述的基因座集的至少之一的核心序列两端250bp以内的保守序列设计而成；

任选地，所述核酸序列位于基因组中；

任选地，所述引物组选自下列至少一对：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:36。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的至少一个引物上连接有可检测标记，所述可检测标记包括荧光标记。

任选地，所述引物组中包括多种不同的可检测标记。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的引物组；

任选地，进一步包括等位基因分型标准物，所述等位基因分型标准物包括权利要求1所述的每一个基因座的纯合子DNA。

5.检测权利要求1所述的基因座集的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于犬类个体识别和亲缘鉴定。

6.一种基因分型的方法，其特征在于，包括：

对待测样品内的基因座集中的至少一个基因座进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述基因座集为权利要求1所述的STR基因座集；

对所述经扩增的等位基因进行分析，以确定在所述待测样品内的基因座集中的至少一个基因座上存在的等位基因；

任选地，利用多重扩增反应对所述待测样品内的基因座集中的至少两个基因座进行共扩增，得到经扩增的等位基因；

任选地，对所述待测样品内的DNA上的基因座集中的至少一个基因座进行扩增；

任选地，所述待测样品来自于犬；

任选地，所述待测样品来自于血液、***、***细胞、毛发、唾液、尿、骨、口腔样品、含有胎盘细胞的羊膜水、含有胎儿细胞的羊膜水中的一种或多种；

任选地，在进行所述分析之前，还包括对所述经扩增的等位基因进行分离；

任选地，通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离；

任选地，使用引物组特异性扩增含有权利要求1所述STR基因座集中的至少之一的核酸序列，所述引物组为权利要求2或3所述的引物组。

7.一种基因分型***，其特征在于，所述***包括：

扩增单元，所述扩增单元用于对待测样品内的基因座集中的至少一个基因座进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述基因座集为权利要求1所述的STR基因座集；

等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述等位基因确定单元用于对所述经扩增的等位基因进行分析，以确定在所述待测样品内的基因组座集中的至少一个基因座上存在的等位基因；

任选地，所述扩增单元利用多重扩增反应对所述待测样品内的基因座集中的至少两个基因座进行共扩增，得到经扩增的等位基因；

任选地，所述扩增单元用于对所述待测样品内的DNA上的基因座集中的至少一个基因座进行扩增；

任选地，所述待测样品来自于犬；

任选地，所述***还包括分离单元，所述分离单元分别与所述扩增单元和所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述经扩增的等位基因进行分离；

任选地，所述分离单元通过毛细管凝胶电泳对所述经扩增的等位基因进行分离；

任选地，所述扩增单元使用引物组特异性扩增含有权利要求1所述STR基因座集中的至少之一的核酸序列，所述引物组为权利要求2或3所述的引物组。

8.权利要求1所述的STR基因座集在犬个体识别和亲缘鉴定领域中的用途。

9.一种用于犬个体识别和亲缘鉴定的方法，其特征在于，

基于STR基因座集，获得待测样本中所述DNA的基因分型结果，所述STR基因座集包括权利要求1所述的STR基因座集；

根据所述基因分型结果，对所述犬待测个体进行个体识别和亲缘鉴定；

任选地，所述基因分型结果根据权利要求6所述的方法获得。

10.一种用于犬个体识别和亲缘鉴定的设备，其特征在于，包括：

基因分型***，所述基因分型***基于SRT基因座集，获得待测样本中所述DNA的基因分型结果，所述STR基因座集包括权利要求1所述的STR基因座集；

分析***，所述分析***与所述基因分型***相连，所述分析***根据所述基因分型结果，对所述犬待测个体进行个体识别和亲缘鉴定；

任选地，所述基因分型***为权利要求7所述的***。