CN110655586B - 一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110655586B CN110655586B CN201910821408.8A CN201910821408A CN110655586B CN 110655586 B CN110655586 B CN 110655586B CN 201910821408 A CN201910821408 A CN 201910821408A CN 110655586 B CN110655586 B CN 110655586B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sugar polymer
- sugar
- hop
- polymer
- hlp4
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 117
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims abstract description 30
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims abstract description 14
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims abstract description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 14
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims abstract description 12
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 claims abstract description 11
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 35
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 14
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 7
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 241000628997 Flos Species 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 39
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 abstract description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 4
- 241000218228 Humulus Species 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 13
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 8
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000004192 high performance gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 5
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003262 anti-osteoporosis Effects 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 4
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 3
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 3
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 3
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 150000008209 arabinosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229920000550 glycopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 229940078581 Bone resorption inhibitor Drugs 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010027304 Menopausal symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241000218231 Moraceae Species 0.000 description 1
- 208000007443 Neurasthenia Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 240000008474 Pimenta dioica Species 0.000 description 1
- 235000006990 Pimenta dioica Nutrition 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019790 abdominal distention Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 239000002617 bone density conservation agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N galp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001052 heteronuclear multiple bond coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004799 sedative–hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种啤酒花均一糖聚合物,包括HLP1‑1,HLP1‑2,HLP4‑2、HLP4‑3的至少一种,其中,HLP1‑1是由木糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖组成的糖聚合物,其结构式如式(I)所示;HLP1‑2是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖、鼠李糖组成的糖聚合物,其结构式如式(Ⅱ)所示;HLP4‑2是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖、鼠李糖组成的糖聚合物,其结构式如式(Ⅲ)所示;HLP4‑3是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖、鼠李糖组成的糖聚合物,结构式如式(Ⅳ)所示;上述四个均一糖聚合物在抗骨质疏松方面的都具有较好的活性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,更具体地,涉及一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量减少、骨微结构破坏和骨密度降低为特征,导 致骨质脆性增加和易发生骨折的全身性骨代谢疾病。由于人口老龄化现象日趋严重,骨质疏 松症病例数快速增长。妇女绝经后***水平急剧下降,导致骨转换率升高,易诱发骨质疏 松,成为该病最大的受害人群,骨质疏松症已成为当今社会必须面对的严重的公共健康问题。 目前,临床上常用的骨质疏松症防治药物可分为骨吸收抑制剂、骨矿化剂和骨形成促进剂, 但这些药物在长期使用过程中多具有一定的副作用,因此高效、低毒的新型抗骨质疏松症药 物的研发势在必行。天然药物在治疗骨质疏松症方面具有历史悠久、毒副作用小、价格低等 优势,受到人们的广泛关注。
啤酒花(Humulus lupulus L.)又称忽布、蛇麻花、香蛇麻、啤瓦古丽(维吾尔语),是桑科 葎草属多年生攀援草本植物,常以其雌花入药,是新疆药食兼用的特色资源植物,也是啤酒 工业的重要原料之一。其味苦,微凉,无毒,具有健胃消食、镇静利尿之功,临床上可用于 治疗消化不良、腹胀、肺结核、膀胱炎、神经衰弱、失眠等。近年来研究发现啤酒花含有树 脂类、挥发油、多酚、糖聚合物等多种化学成分,具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、镇静催眠、***样作用等药理活性。有研究表明,啤酒花水提取液具有***样作用,可抑制去卵巢大鼠的肥胖,增加去卵巢大鼠子宫重量,对其体内***水平有一定调节作用,可用于改善女性围绝经期症状,替代***用于激素相关性疾病的治疗。
目前,国内外对啤酒花的研究大多集中在其酿酒特性,对其生物活性及活性物质的研究 主要集中在啤酒花小分子物质的提取、分离鉴定和粗提物的药理活性上。啤酒花糖聚合物作 为啤酒花的主要活性成分之一,已被报道具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种药 理活性,但对其结构以及在防治骨质疏松症方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种啤酒花均一糖聚合物。
本发明要解决的另一技术问题在于提供上述啤酒花均一糖聚合物的制备方法。
本发明还一要解决的技术问题在于提供上述啤酒花均一糖聚合物在制备防治骨质疏松药 物或功能食品中的应用。
本发明所采取的技术方案是:
提供一种啤酒花均一糖聚合物,包括HLP1-1,HLP1-2,HLP4-2、HLP4-3的至少一种,其中,HLP1-1是由木糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖组成的糖聚合物,其 结构式如式(I)所示:
其中m,n的范围分别为1~30;
HLP1-2是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖、鼠李糖组成的糖聚合物,其结构式 如式(Ⅱ)所示:
其中m,n的范围分别为1~30;
HLP4-2是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖、鼠李糖组成的糖聚合物,其结构式 如式(Ⅲ)所示:
其中x,y,z,m,n的范围分别为1~30;
HLP4-3是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖、鼠李糖组成的糖聚合物,结构式如 式(Ⅳ)所示:
其中m的范围为1~30。
提供上述啤酒花均一糖聚合物的制备方法,包括以下步骤:
S1.浸泡:将干燥的啤酒花雌花加水浸泡,得混合液A;
S2.水提:将混合液A加热提取,过滤,得提取液B和残渣C;
S3.醇沉:将提取液B减压浓缩后,加入乙醇使乙醇体积浓度为10~60%,静置,收集沉 淀和上清液,得粗糖聚合物HL1和上清液;
S4.碱提:将步骤S2中残渣C浸泡于NaOH溶液中,静置,收集上清液,得上清液D, 加入HCl溶液中和,减压浓缩,离心收集上清液,得上清液F,加入乙醇使乙醇体积浓度为 50~90%,静置,收集沉淀,得碱提粗糖聚合物HL4;
S5.纯化:将粗糖聚合物HL1、HL4分别进行纯化,得啤酒花均一糖聚合物HLP1-1、HLP1-2、HLP4-2、HLP4-3。
进一步地,步骤S5中所述将粗糖聚合物HL1、HL4分别进行纯化的方法为:对粗糖聚合物HL1、HL4分别进行除蛋白,透析,冻干;将冻干后的HL1、HL4分别进行离子交换柱 层析,梯度洗脱,分别收集糖部分,减压浓缩,透析,冻干;然后分别用水复溶,离心,取 上清液进行分子筛凝胶柱层析,用水进行洗脱,收集糖部分,减压浓缩,冻干后得啤酒花均 一糖聚合物HLP1-1,HLP1-2,HLP4-2、HLP4-3。
进一步地,步骤S5中所述将粗糖聚合物HL1、HL4分别进行纯化的具体操作为:对粗糖聚合物HL1进行除蛋白,透析,冻干;将冻干后的HL1、进行离子交换柱层析,用NaCl 进行梯度洗脱,使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线分别收集糖部分,减压浓缩, 透析,冻干;然后,分别用水复溶,离心,取上清液进行分子筛凝胶柱层析,用水进行洗脱, 使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线收集糖部分,减压浓缩,冻干后得啤酒花均一糖聚合物HLP1-1,HLP1-2;对粗糖聚合物HL4进行除蛋白,透析,冻干;将冻干后的HL4 进行离子交换柱层析,用NaCl进行梯度洗脱,使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲 线分别收集糖部分,减压浓缩,透析,冻干;然后,分别用水复溶,离心,取上清液进行分 子筛凝胶柱层析,用水进行洗脱,使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线收集糖部分, 减压浓缩,冻干后得啤酒花均一糖聚合物HLP4-2、HLP4-3。
优选地,步骤S2中所述水提的具体操作为在混合液A中加入3~15倍体积的60~100℃ 热水进行提取,提取时间1~10h,过滤,得提取液B和残渣C。
更优选地,在混合液A中加入10倍体积90℃的热水。
优选地,步骤S3中加入乙醇使乙醇体积浓度为50%。
优选地,步骤S3、S4中所述减压浓缩的反应条件为40~70℃;步骤S3、S4中所述静置 的时间为10~24h。
更优选地,步骤S3中加入乙醇使乙醇体积浓度为50%,步骤S3、S4中所述减压浓缩的 反应条件为60℃。
优选地,步骤S4中加入乙醇使乙醇体积浓度为75%。
优选地,步骤S4中所述NaOH溶液的浓度为0.1~1M,所述NaOH溶液的用量为残渣 C重量的5~20倍;所述HCl溶液的浓度为0.1~1M,中和至溶液pH为6~8。
更优选地,步骤S4中所述NaOH溶液为残渣C的15倍体积量的0.3M NaOH溶液。
提供上述啤酒花均一糖聚合物在制备防治骨质疏松药物或功能食品中的应用。
本发明的有益效果是:
1.与传统水煮法提取糖聚合物相比,本发明采用水提醇沉法和碱提醇沉法的结合,乙醇 浓度由低到高进行分级醇沉,对啤酒花糖聚合物进行初步分离,同时高浓度乙醇能将极性大、 水溶性好的糖聚合物与极性小、水溶性差的糖聚合物分离,使后期的分离纯化难度大大降低。 且本制备工艺简单,操作方便,可以大规模生产。
2.本发明中通过离子交换层析和分子筛凝胶柱层析方法对啤酒花粗糖聚合物进行分离纯 化,效果显著,首次制备出四个啤酒花均一糖聚合物。
3.本发明对制备出的四个均一糖聚合物进行了结构鉴定,对其理化性质,分子量、单糖 组成等进行了***的分析,并成功得出了四个均一糖聚合物的特征结构,为探究其药理活性 和作用机制提供结构依据。值得注意的是:这四个糖聚物与以往啤酒花糖聚物的区别在于结 构中有木糖和/或葡萄糖醛酸,这可能是其发挥抗骨质疏松活性的重要结构特征。
4.本发明提供了四个均一糖聚合物在抗骨质疏松方面的活性研究,四个均一糖聚合物可 以单独或组合使用,使啤酒花糖聚合物可以尽快转化为药物或功能食品,造福于社会。
5.本发明提取方法在比较温和的条件下进行,完好的保存了糖聚合物的组分,所得糖聚 合物结构明确,质量可控。
附图说明
图1HLP1-1的相关图谱。A:HPGPC色谱图,B:红外图谱图,C:13C NMR图谱。D: 1H NMR图谱,E:HSQC图谱,F:HSQC图谱。
图2HLP1-2的相关图谱。A:HPGPC色谱图,B:红外图谱图,C:13C NMR图谱。D: 1H NMR图谱,E:HSQC图谱,F:HSQC图谱。
图3HLP4-2的的相关图谱。A:HPGPC色谱图,B:红外图谱图,C:13C NMR图谱。 D:1HNMR图谱,E:HSQC图谱,F:HSQC图谱。
图4HLP4-3的相关图谱。A:HPGPC色谱图,B:红外图谱图,C:13C NMR图谱。D: 1H NMR图谱,E:HSQC图谱,F:HSQC图谱。
图5HLP1-1对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。A:对MC3T3-E1细胞增殖的影响, B:对MC3T3-E1细胞分化的影响。
图6HLP1-1对MC3T3-E1细胞矿化的影响。A:细胞显微图,B:统计结果。
图7HLP1-2对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。A:对MC3T3-E1细胞增殖的影响, B:对MC3T3-E1细胞分化的影响。
图8HLP1-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响。A:细胞显微图,B:统计结果。
图9HLP4-2对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。A:对MC3T3-E1细胞增殖的影响, B:对MC3T3-E1细胞分化的影响。
图10HLP4-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响。A:细胞显微图,B:统计结果。
图11HLP4-3对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。A:对MC3T3-E1细胞增殖的影响,B:对MC3T3-E1细胞分化的影响。
图12HLP4-3对MC3T3-E1细胞矿化的影响。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但本发明并不限于这些具体 实施方式。实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1粗糖聚合物HL1、HL4的制备方法
按照以下步骤制备粗糖聚合物HL1、HL4:
1)浸泡:将27kg干燥的啤酒花雌花以料液比1:10(w/v)加入去离子水浸泡12h。
2)水提:将充分浸泡的啤酒花雌花用5~15倍体积的60~100℃热水提取,优选10倍 体积90℃的热水,共提取3次,每次提取3h,过滤,收集提取液,残渣晾干。
3)分级醇沉:提取液于60~100℃减压浓缩后,加入乙醇使乙醇体积浓度为10~60%, 优选60℃减压浓缩,加入乙醇使乙醇体积浓度为50%,室温静置24h后,离心,收集沉淀, 为粗糖聚合物HL1和上清液,上清液还可以用于不同体积浓度的分级醇沉。
4)碱提:将水提后残渣浸没于5~20倍体积量的0.1~1M NaOH溶液中,优选15倍体积量的0.3M NaOH溶液,室温下静提1~4h,共提取2次,合并上清液并用0.1~1M HCl 进行中和,使其pH为6~8,离心(5000r/min,10min),取上清液,40~70℃减压浓缩, 然后加入乙醇使乙醇体积浓度为50~90%,优选60℃减压浓缩,加入乙醇使乙醇体积浓度为 75%,静置24h后离心,收集沉淀,为碱提粗糖聚合物HL4。
5)纯化:利用Sevag法分别对各组分粗糖聚合物HL1和HL4进行除蛋白,除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干,即得粗糖聚合物HL1、HL4。
实施例2啤酒花糖聚合物HLP1-1的制备方法
啤酒花糖聚合物HLP1-1是由实施例1所得啤酒花糖聚合物HL1二次纯化所得,具体步 骤如下:
1)离子交换柱层析:取200mg初步纯化后的糖聚合物HL1,溶于10mL的去离子水中,上样于DEAE-Cellulose 52柱,在不同盐浓度的洗脱液条件下出现三个峰,其中峰一为0.05M NaCl洗脱部分,峰二为0.1M NaCl洗脱部分,峰三为0.15M NaCl洗脱部分(洗脱过程中使 用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线分别收集糖部分),分别将所得洗脱液减压浓缩、 透析(截留分子量为100Da)、冻干后,得到三个糖聚合物(峰一糖聚合物、峰二糖聚合物 和峰三糖聚合物)。
2)分子筛凝胶层析:将20mg上述冻干后的峰一糖聚合物样品,用水进行溶解,离心(11000r/min,5min),取上清液,上Sephadex G75柱,用水进行洗脱,洗脱过程中使用苯 酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线收集主峰,浓缩,冻干后得啤酒花糖聚合物HLP1-1。
纯度及分子量检测:将上述获得的糖聚合物HLP1-1配成5mg/mL的水溶液,HPGPC法测得保留时间,根据标准曲线计算得分子量。
结果如附图1所示,经离子交换和分子筛凝胶分离纯化后得到的组分HLP1-1呈单一对 称峰,说明HLP1-1为均一糖聚合物,其分子量为49.13kDa。
对酒花糖聚合物HLP1-1进行结构分析:
(1)单糖组成分析
由完全酸水解产物采用PMP-柱前衍生高效液相色谱法测得图谱可知,啤酒花糖聚合物 HLP1-1由木糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖组成。
(2)红外光谱检测
HLP1-1的红外光谱检测结果如附图1(B)所示,从中可以看出,HLP1-1含有糖的特征 吸收峰:在3390cm-1为糖中O-H伸缩振动的特征吸收峰;2930cm-1为糖中C-H伸缩振动的特征吸收峰;1610cm-1和1412cm-1为糖中COO-非对称和对称伸缩振动;1044cm-1为吡喃糖 中C-O的弯曲振动;617cm-1处的峰也表明HLP1-1中存在吡喃糖环。
(3)甲基化分析
样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后用GC-MS分析,结果表明HLP1-1中含有 →4)-D-Glcp-(1→,→6)-D-Manp-(1→,→3)-L-Rhap-(1→,D-Glcp-(1→,L-Araf-(1→, →4,6)-D-Galp-(1→,D-Galp-(1→,→3,6)-D-Glcp-(1→,→2,3,4,)-D-Xylp-(1→,→6)-D-Glcp-(1→, →3)-D-Galp-(1→,→4)-D-Galp-(1→等12种糖残基。
(4)糖聚合物的核磁共振分析
将均一糖聚合物HLP1-1样品置于核磁管中,用D2O溶解后测谱,所得结果如附图1(C、 D、E、F)所示。
根据附图1(C、D、E、F)的核磁图谱可知各个碳和氢的归属,如下表1所示。
表1 HLP1-1核磁共振信号归属
经上述完全酸水解、红外光谱检测、甲基化-GC/MS分析及核磁分析,结果显示HLP1-1 是一种由木糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖组成的杂糖聚合物,且→4)-α-D-Glcp-(1→,→6)-α-D-Manp-(1→,→3)-α-L-Rhap-(1→,β-D-Glcp-(1→,α-L-Araf-(1→, →4,6)-2-OAc-β-D-Galp-(1→,β-D-Galp-(1→,→3,6)-β-D-Glcp-(1→,→2,3,4,)-α-D-Xylp-(1→, →6)-α-D-Glcp-(1→,→3)-α-D-Galp-(1→,→4)-α-D-Galp-(1→以4.9:5.0:8.7:5.1:25.9:9.2:3.6: 14.6:5.0:4.3:2.7:11.0比例组成,不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得 出,由以上分析得出HLP1-1的结构式如式(I)所示:
其中m,n的范围分别为1~30。
实施例3啤酒花糖聚合物HLP1-2的制备方法
HLP1-2的制备方法同实施例2中HLP1-1的制备方法,除了步骤2)中进行分子筛凝胶 层析时选用的是步骤1)中的峰二糖聚合物样品,其他均同实施例2。
结果如附图2(A)所示,经离子交换和分子筛凝胶分离纯化后得到的组分HLP1-2呈单 一对称峰,说明HLP1-2为均一糖聚合物,其分子量为73.25kDa。
HLP1-2核磁图谱如附图2(B)所示。
啤酒花糖聚合物HLP1-2:是由木糖、葡萄糖醛酸、***糖、半乳糖和鼠李糖组成的杂糖聚 合物。甲基化和核磁分析结果表明其→4)-β-D-GlcAp-(1→,→4)-α-L-Rhap-(1→, →5)-α-L-Araf-(1→,α-L-Araf-(1→,→3,6)-β-D-Galp-(1→,α-D-Galp-(1→,→3,4,6)-β-D-Galp-(1→, β-D-Xylp-(1→,→6)-α-D-Galp-(1→,→4)-β-D-Galp-(1→以4.6:6.5:13.6:31.6:7.8:3.9:7.0:14.5: 4.2:6.3比例组成。不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出,由以上分 析得出HLP1-2的结构式如式(Ⅱ)所示:
其中m,n的范围分别为1~30。
HLP1-2的核磁图谱如附图2(C、D、E、F)所示。
实施例4啤酒花糖聚合物HLP4-2的制备方法
啤酒花糖聚合物HLP4-2是由实施例1所得啤酒花糖聚合物HL4二次纯化所得,具体步 骤如下:
1)离子交换柱层析:取200mg初步纯化后的糖聚合物HL4,溶于10mL的去离子水中,上样于DEAE-Cellulose 52柱,不同盐浓度的洗脱液条件下出现四个峰,其中峰一为0MNaCl 洗脱部分,峰二为0.05M NaCl洗脱部分,峰三为0.1M NaCl洗脱部分,峰四为0.15MNaCl 洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线分别收集糖部分),分 别将所得洗脱液减压浓缩、透析(截留分子量为100Da)、冻干后,得到四个糖聚合物(峰 一糖聚合物、峰二糖聚合物,峰三糖聚合物和峰四糖聚合物)。
2)分子筛凝胶层析:将20mg上述冻干后的峰二糖聚合物样品,用水进行溶解,离心(11000r/min,5min),取上清液,上Sephadex G75柱,用水进行洗脱,洗脱过程中使用苯 酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线收集主峰,浓缩,冻干后得啤酒花糖聚合物HLP4-2。
纯度及分子量检测:将上述获得的糖聚合物HLP4-2配成5mg/mL的水溶液,HPGPC法测得保留时间,根据标准曲线计算得分子量。
结果如附图3(A)所示,经离子交换和分子筛凝胶分离纯化后得到的组分HLP4-2呈单 一对称峰,说明HLP4-2为均一糖聚合物,其分子量为17.11kDa。
HLP4-2核磁图谱如附图3(C、D、E、F)所示。
啤酒花糖聚合物HLP4-2:单糖组成分析结果表明HLP4-2是由木糖、葡萄糖醛酸、阿拉 伯糖、半乳糖和鼠李糖组成的杂糖聚合物。甲基化和核磁分析结果表明其α-L-Araf-(1→, →3)-α-L-Araf-(1→,→2,3,5)-α-L-Araf-(1→,→3,5)-α-L-Araf-(1→,→4)-β-D-Xylp-(1→, β-D-Galp-(1→,2,3,6)-α-D-Galp-(1→,→6)-α-D-Galp-(1→,→3)-α-D-Galp-(1→,α-L-Rhap-(1→, →4)-β-D-GlcAp-(1→以13.2:3.7:6.0:3.5:35.8:5.5:8.0:6.7:3.8:10.1:3.7比例组成。不同糖残 基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出,由以上分析得出HLP4-2的结构如式(Ⅲ) 所示:
其中x,y,z,m,n的范围分别为1~30。
实施例5啤酒花糖聚合物HLP4-3的提取方法
HLP4-3的制备方法同实施例4中HLP4-2的制备方法,除了步骤2)中进行分子筛凝胶 层析时选用的是步骤1)中的峰三糖聚合物样品,其他均同实施例4。
结果如附图4(A)所示,经离子交换和分子筛凝胶分离纯化后得到的组分HLP4-3呈单 一对称峰,说明HLP4-3为均一糖聚合物,其分子量为35.23kDa。
HLP4-3的核磁图谱如附图4(C、D、E、F)所示。
啤酒花糖聚合物HLP4-3:单糖组成分析结果表明HLP4-3是由木糖、葡萄糖醛酸、阿拉 伯糖、半乳糖和鼠李糖组成的杂糖聚合物。甲基化和核磁分析结果表明其→5)-α-L-Araf-(1→, →2,3,5)-α-L-Araf-(1→,α-L-Araf-(1→,→3)-α-L-Araf-(1→,→2,4)-α-L-Rhap-(1→, →3)-α-L-Rhap-(1→,β-D-GlcAp-(1→,β-D-Galp-(1→,→3,6)-β-D-Galp-(1→,→3)-α-D-Galp-(1→, →3,4)-α-D-Galp-(1→,→6)-α-D-Galp-(1→,β-D-Xylp-(1→以19.6:3.5:11.6:7.7:3.8:2.8:5.0: 8.6:9.2:3.5:4.1:15.6:5.0比例组成。不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析 得出,由以上分析得出HLP4-3的结构式如式(Ⅳ)所示:
其中m的范围为1~30。
实施例6啤酒花糖聚合物的抗骨质疏松作用研究
1实验方法
1.1糖聚合物对MC3T3-E1细胞增殖的影响
以新鲜的完全培养基将MC3T3-E1细胞悬液稀释至2.5×104cells/mL,以每孔200μL种于 96孔板内培养24h。用完全培养基将糖聚合物HLP1-1、HLP1-2,HLP4-2和HLP4-3分别稀 释至6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL。在MC3T3-E1细胞贴壁24h后,更换 成含有样品的完全培养基(200μL/well),每个浓度设置6个复孔。同时设置给予完全培养基的正常组(Normal),完全培养基+***(0.1μM)的阳性对照组。
糖聚合物对MC3T3-E1细胞分别作用48h或72h后,将培养基吸出,每孔加入含10%CCK-8的新鲜培养基200μL,于37℃培养箱中孵育60min,同时检测450nm及630nm(空 白)波长处的OD值。细胞增殖率的公式:(ODSample-ODNormal)/ODNormal×100%。公式中使用 的OD值为两个波长下OD值的差值。
1.2糖聚合物对MC3T3-E1细胞分化的影响
依据CCK-8检测结果,HLP1-1、HLP1-2和HLP4-3选择6.25μg/mL、12.5μg/mL和25 μg/mL三个浓度进行下一步实验,糖聚合物HLP4-2选择12.5μg/mL、25μg/mL和50μg/mL 三个浓度。
用成骨诱导培养基将糖聚合物HLP1-1、HLP1-2、HLP4-2和HLP4-3分别稀释至所需浓 度。以新鲜的完全培养基将细胞悬液稀释至6×104cells/mL,以每孔500μL接种于24孔板内。 72h后,更换成含有样品的诱导培养基(500μL/well),每个浓度设置4个复孔。设置给予完全 培养基的正常组(Normal),给予成骨诱导培养基的对照组(Control),成骨诱导培养基+雌 二醇(0.1μM)的阳性对照组。
样品作用于MC3T3-E1细胞6d、8d、10d或12d后,弃去培养基,每孔加300μL的 PBS缓冲液清洗细胞,弃去PBS,每孔加入100μL的RIPA裂解液,4℃作用30min,收集 裂解液于4℃下以12,000×g离心20min,收集蛋白上清,于-20℃保存待用。
参照BCA Protein Assay试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。检测562nm波长下的OD 值,根据标准曲线计算各组蛋白的浓度。
采用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒,根据说明书进行实验。在96培养孔板中加入1μL 上述蛋白上清液、49μL检测缓冲液和50μL的显色底物,置于37℃培养箱中孵育(具体时间视孔内颜色变化而定),向各孔加入100μL的反应终止液,检测405nm波长下的OD值。 由ALP标准曲线计算出各组蛋白上清中相当于β-nitrophenol的摩尔浓度;ALP活性(U/L)=蛋白实际摩尔浓度×1000×100/60。
1.3糖聚合物对MC3T3-E1细胞矿化的影响
用成骨诱导培养基将糖聚合物HLP1-1、HLP1-2、HLP4-2和HLP4-3分别稀释至所需浓 度。以新鲜的完全培养基将细胞悬液稀释至6×104cells/mL,以每孔1mL种于12孔板内培养 72h。更换成含有样品的成骨诱导培养基(500μL/well),每个浓度设置4个复孔。设置给予完 全培养基的正常组(Normal),给予成骨诱导培养基的对照组(Control),成骨诱导培养基+ ***(0.1μM)的阳性对照组。给药诱导约18天后(具体视钙结节出现的时间而定),进 行茜素红染色,显微镜下观察并拍照。每孔加入400μL 10%的十六烷基吡啶溶液,以溶解染 色后的钙结节。室温下避光作用1h,将各孔溶液转移至96孔板(100μL/well),设3个复孔, 检测562nm波长处的OD值。计算各组的矿化率,矿化率=(ODSample-ODNormal)/ODNormal×100%。
2实验结果
2.1糖聚合物HLP1-1对MC3T3-E1细胞增殖、分化、矿化的影响
HLP1-1对MC3T3-E1细胞增殖的影响见附图5,如图所示,随着HLP1-1浓度的增加,细胞的增殖率先升高后降低。6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL和50μg/mL组显著促进MC3T3-E1细胞的增殖,且12.5μg/mL组增殖率最高,与阳性对照组(E2)作用相当。
碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞早期分化的标志。如附图6所示,与Normal组相比,Control 组MC3T3-E1细胞的ALP活性显著增强(P<0.01),说明成骨诱导的细胞模型造模成功。给 药10d后,随着HLP1-1浓度的增加,MC3T3-E1细胞的ALP活性先升高后下降,且与Control 组相比,12.5μg/mL的HLP1-1显著促进ALP活性,与阳性对照组(E2)作用相当。
茜素红与基质中钙离子形成红色沉淀,即钙结节,可用于评价成骨细胞的矿化作用。如 附图6所示,培养18d后,Control组MC3T3-E1细胞矿化率明显高于Normal组,表明成功 诱导MC3T3-E1细胞矿化。与Control组比较,E2组和6.25μg/mL的HLP1-1组形成大量钙结节。可见HLP1-1对MC3T3-E1细胞矿化有促进作用。
同理,对糖聚合物HLP1-2(如附图7、8),HLP4-2(如附图9、10)和HLP4-3(如附 图11、12)进行上述同样的分析。
结果表明,糖聚合物HLP1-2可以促进MC3T3-E1细胞的增殖,并以12.5μg/mL最佳。HLP1-2在6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml浓度下能显著促进MC3T3-E1细胞的分化,且 促进成骨分化的时间比阳性药持续时间长。与Control组相比,HLP1-2显著促进MC3T3-E1 细胞的矿化,12.5μg/mL的HLP1-2对矿化的促进效果与E2相当,25μg/mL的HLP1-2对矿 化的促进效果明显高于E2。
实验表明,给药48h后,糖聚合物HLP4-2的6.25μg/ml,12.5μg/mL,25μg/mL和50μg/mL 组对MC3T3-E1细胞增殖有显著的促进作用,且以25μg/mL时最佳。给药8d后,与Control组相比,25μg/mL和50μg/mL的HLP4-2显著提高ALP活性。诱导21d后,与Control组相 比,12.5μg/mL,25μg/mL和50μg/mL的HLP4-2组均显著促进MC3T3-E1细胞矿化,其中 50μg/mL组和E2的促进效果相当。
实验表明,给药48h后,糖聚合物HLP4-3的12.5μg/mL和25μg/mL组对MC3T3-E1 细胞增殖有显著的促进作用,且以12.5μg/mL时最佳。给药10d后,与Control组相比,12.5 μg/mL和25μg/mL的HLP4-3显著提高ALP活性,且12.5μg/mL组的促进作用与E2相当, 25μg/mL组对ALP的促进作用显著优于阳性药。诱导15d后,与Control组相比,6.25μg/mL, 12.5μg/mL和25μg/mL的HLP4-3组均显著促进MC3T3-E1细胞矿化,其中6.25μg/mL组和 E2的促进效果相当。4种糖聚合物组合使用也能起到相应的促进作用。
综上所述,4种啤酒花糖聚合物均可以促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖,分化和 矿化,其中,HLP1-2,HLP4-2和HLP4-3对MC3T3-E1细胞的促进效果与阳性药相当或优于阳性药,证明其具有良好的体外促成骨活性。后续需对啤酒花糖聚合物的抗骨质疏松机制进 行研究,而均一糖聚合物的结构鉴定将为探究啤酒花糖聚合物抗骨质疏松的机制提供有力依 据。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。 对于本领域的普通技术人员来说,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、代替、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的应用,所述啤酒花均一糖聚合物的制备方法包括以下步骤:
S1. 浸泡:将干燥的啤酒花雌花加水浸泡,得混合液A;
S2. 水提:将混合液A加热提取,过滤,得残渣C;
S3. 碱提:将步骤S2中残渣C浸泡于NaOH溶液中,静置,收集上清液,得上清液D,加入HCl溶液中和,减压浓缩,离心收集上清液,得上清液F,加入乙醇使乙醇体积浓度为50~90%,静置,收集沉淀,得碱提粗糖聚合物HL4;
S4. 纯化:将粗糖聚合物HL4进行纯化,得啤酒花均一糖聚合物HLP4-3;
其中,步骤S4中所述将粗糖聚合物HL4进行纯化的方法为:对粗糖聚合物HL4进行除蛋白,透析,冻干;将冻干后的HL4进行离子交换柱层析,梯度洗脱,收集糖部分,减压浓缩,透析,冻干;然后用水复溶,离心,取上清液进行分子筛凝胶柱层析,用水进行洗脱,收集糖部分,减压浓缩,冻干后得啤酒花均一糖聚合物HLP4-3。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤S4中所述将粗糖聚合物HL4进行纯化的具体操作为:对粗糖聚合物HL4进行除蛋白,透析,冻干;将冻干后的HL4进行离子交换柱层析,用0M、0.05M、0.1M、0.15M NaCl进行梯度洗脱,使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线收集0.1M NaCl洗脱的糖部分,减压浓缩,透析,冻干;然后,用水复溶,离心,取上清液进行分子筛凝胶柱层析,用水进行洗脱,使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线,根据洗脱曲线收集糖部分,减压浓缩,冻干后得啤酒花均一糖聚合物HLP4-3。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤S2中所述水提的具体操作为在混合液A中加入3~15倍体积的60~100℃热水进行提取,提取时间1~10 h,过滤,得残渣C。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤S3中所述减压浓缩的反应条件为40~70℃;步骤S3中所述静置的时间为10~24 h。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤S3中加入乙醇使乙醇体积浓度为75%。
7.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤S3中所述NaOH溶液的浓度为0.1~1M,所述NaOH溶液的用量为残渣C重量的5~20倍;所述HCl溶液的浓度为0.1~1 M,中和至溶液pH为6~8。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910821408.8A CN110655586B (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910821408.8A CN110655586B (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110655586A CN110655586A (zh) | 2020-01-07 |
CN110655586B true CN110655586B (zh) | 2021-10-15 |
Family
ID=69036610
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910821408.8A Active CN110655586B (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110655586B (zh) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102558379A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-11 | 新疆大学 | 一种啤酒花多糖的提取和脱蛋白方法 |
CN109453232A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-03-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 啤酒花中树脂类成分提取物及其制备方法与应用 |
-
2019
- 2019-09-02 CN CN201910821408.8A patent/CN110655586B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110655586A (zh) | 2020-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sun et al. | Physicochemical properties and immunological activities of polysaccharides from both crude and wine-processed Polygonatum sibiricum | |
Li et al. | Isolation, structural characterization and bioactivities of polysaccharides from Laminaria japonica: A review | |
Wu et al. | Characterization of bioactive polysaccharides from Cordyceps militaris produced in China using saccharide mapping | |
CN111410698B (zh) | 骆驼刺糖聚合物及其制备方法和应用 | |
Sun et al. | Purification, characterization and immunomodulatory activity of a polysaccharide from Celosia cristata | |
CN111961141A (zh) | 一种刺五加均一多糖及其制备方法及应用 | |
CN107854507B (zh) | 一种从艾叶中提取黄酮类成分的方法 | |
Xue et al. | Isolation, structural properties, and bioactivities of polysaccharides from Althaea officinalis Linn.: A review | |
CN110343185B (zh) | 一种酒制黄精多糖及其在脾虚免疫功能调节方面的用途 | |
CN112920287B (zh) | 具有免疫调节功效的阳春砂多糖及其制备方法和应用 | |
KR20050025967A (ko) | 에치나세아 앙구스티홀리아의 폴리삭카라이드 | |
CN111635442B (zh) | 从药用植物地梢瓜中制备三种单体化合物的方法及其体外抗氧化作用 | |
CN110655586B (zh) | 一种啤酒花糖聚合物及其制备方法与应用 | |
CN108456258B (zh) | 一种铁皮石斛硒多糖制备方法 | |
CN113717296B (zh) | 一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备抗结肠癌药物中的应用 | |
KR0168485B1 (ko) | 산성다당체를 다량 함유하는 홍삼엑기스 제조방법 | |
CN112794925B (zh) | 一种阳春砂多糖及其制备方法和应用 | |
JP2602295B2 (ja) | 多糖類,その単離法および該多糖類を含む薬剤組成物 | |
CN114249846A (zh) | 一种酸性莼菜多糖及其分离纯化方法和应用 | |
CN117247472B (zh) | 一种褐藻多糖及其制备方法与应用 | |
CN109762075B (zh) | 一种雪菊糖聚合物及其制备方法和应用 | |
CN114437244B (zh) | 一种具有抗肺癌a549细胞增殖功能的枸杞多糖提取物 | |
TWI542355B (zh) | 靈芝多醣體用於促進胰島素敏感性之用途及其製備方法 | |
CN113603808B (zh) | 改性褐藻胶及制备方法与其在制备促进胃肠蠕动药物中的应用 | |
CN115141288B (zh) | 知母活性多糖、知母粗多糖及制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |