CN110643667B - ***c1,2位的生物脱氢方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种***C1,2位的生物脱氢方法。本发明以***为底物，以简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将大豆油100‑200ml/L和吐温‑80 0.1‑2g/L加入转化体系中，于29‑31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到脱氢***。本发明在采用普通直接转化法的基础上，通过加入大豆油和吐温‑80，可以大幅度提高转化率，转化率可达到99％以上；同时产物的降解率可降低至，反应专一性强，转化时间相对较快，产品质量高；并且无需无菌环境，常规室外操作即可，操作简单，适合工业化大批量生产。

Description

***C1,2位的生物脱氢方法
技术领域
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种***C1,2位的生物脱氢方法。
背景技术
甾体化合物C1,2位脱氢有化学法和生物法两种，传统的化学法采用二氧化砷脱氢，工艺简单，收率可观，但产物中含有一定量的砷，不能达到有关标准的规定，而生物法具有特异性强、反应快速以及高产率等特点，所以近年来生物法已经在逐渐取代化学法。
***C1,2位脱氢的反应过程如图1所示。***进行C1,2位脱氢，目前生物法中有4种反应体系：普通直接转化、双液相转化、原生质体转化以及破碎细胞转化。普通直接转化是通过直接将菌液加入发酵培养基进行转化，菌液不需要经过任何处理，但是需要无菌操作，增加了操作的难度。双液相转化技术早期主要应用在生物分子和细胞的分离纯化，近年来才逐渐应用于生物转化，该技术中关键的因素就是成相介质的选取，但选择对细胞有较好相容性的有机溶剂较为困难。原生质体转化能克服细胞膜通透性影响胞内酶催化微生物转化的困难，但是操作复杂繁琐，不利于大批量生产。超声破碎转化通过增加底物溶解性、强化传质、增加酶与底物的有效接触来提高微生物对甾体化合物的转化率，但是超声破碎对于工业生产来说难度较大。在这4种体系中，转化率最高的是普通直接转化，但也只有59.5％，导致成本居高不下。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种快速的、高纯度的、单一性强的简单诺卡氏菌微生物转化17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮制备17α甲基-17β羟基雄甾-1,4-二烯-3-酮的方法，能够解决目前***脱氢方法中操作复杂、转化率低和降解率高的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种***C1,2位的生物脱氢方法，所述方法为：以17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮为底物，以简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将大豆油1％-16％(v/v)和吐温-800.05％-0.2％(w/v)加入转化体系中，于29-31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到17α甲基-17β羟基雄甾-1,4-二烯-3-酮。
进一步地，所述底物的添加量按质量体积百分数(w/v)计为0.5％-10％。
进一步地，所述简单诺卡氏菌菌液的制备方法为：
(1)斜面培养：所述斜面培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉0.01-2％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌菌种；
(2)一级种子培养：所述一级种子培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌斜面菌种，振荡培养，得到一级种子液；
(3)二级种子培养：所述二级种子培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.25％、17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮0.05％和泡敌0.02％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，将所述一级种子液接种至所述二级种子培养基中，振荡培养，得到简单诺卡氏菌菌液。
进一步地，所述简单诺卡氏菌菌液中OD600值为0.5-2.0。
进一步地，所述斜面培养的条件为：于25-40℃下，培养1-5d。
进一步地，所述一级种子培养的条件为：于25-40℃下振荡培养，转速50-200rpm，培养时间10-72h。
进一步地，所述二级种子培养的条件为：于25-40℃下振荡培养，转速50-200rpm，培养时间10-72h。
进一步地，所述转化反应在10L发酵罐内进行时，条件为：空气流量0.05-0.6m3/h，罐压0.01-0.1MPa。
进一步地，所述分离纯化方法具体为：将转化液升温到80℃并搅拌，保温静置分层，上层油相分出，冷却至常温，加3L甲醇，搅拌静置分层，上层甲醇减压浓缩，下层油层再继续萃取2次，上层甲醇层合并减压浓缩，浓缩温度50-70℃，浓缩至糊状，加水带干其中的甲醇，冷却至室温，抽滤，得类白色固体，固体70℃烘干；烘干后，加入石油醚，升温60℃回流打浆，冷却至30℃以下，抽滤，滤饼用石油醚淋洗，抽干后烘干。
具体地，所述方法为：将简单诺卡氏菌经斜面培养、一级种子培养和二级种子培养制备成菌液，以菌液体积为6L计，在转化体系中加入17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮120g、大豆油960ml和吐温-80 6g；转化体系于30℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到17α甲基-17β羟基雄甾-1,4-二烯-3-酮。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在采用普通直接转化法的基础上，通过加入大豆油和吐温-80，可以大幅度提高转化率，转化率可达到99％以上；同时产物的降解率低，反应专一性强，转化时间相对较快，产品质量高；并且无需无菌环境，常规室外操作即可，操作简单，适合工业化大批量生产。
附图说明
图1为***C1,2位脱氢的反应过程。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的物质均可自常规途径购买得到。17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮以下简称***，17α甲基-17β羟基雄甾-1,4-二烯-3-酮以下简称脱氢***。
实施例1简单诺卡氏菌种子培养
菌种：简单诺卡氏菌
斜面培养基：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％、琼脂粉0.01-2％；pH为7.0-7.2，培养条件：25-40℃，培养时间1-5d。
一级种子培养基：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％；pH为7.0-7.2，培养条件：500ml摇瓶装100ml培养基，振荡培养，转速50-200rpm，25-40℃，培养时间10-72h。
二级种子培养基：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.25％、17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮0.05％和泡敌0.02％；pH为7.0-7.2，培养条件：500ml摇瓶装100ml培养基，接种一级种子液，振荡培养，转速50-200rpm，25-40℃，培养时间10-72h。
培养得到的简单诺卡氏菌菌液中OD600值为0.5-2.0。
实施例2摇瓶转化
按照实施例1的方法进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养16h，向培养好的100ml二级种子中加入2g***，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量52.75％，***归一含量47.11％。
实施例3摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养10h，向培养好的100ml二级种子中加入2g粉碎至200目的***，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量53.15％，***归一含量46.50％。
实施例4摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养24h，向培养好的100ml二级种子中加入2g的***、16ml大豆油，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量80.41％,***归一含量18.97％。
实施例5摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养36h，向培养好的100ml二级种子中加入2g的***、0.1g吐温-80，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量75.13％,***归一含量24.35％。
实施例6摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养48h，向培养好的100ml二级种子中加入2g的***，16ml大豆油，0.1g吐温-80，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量96.15％,***归一含量3.48％。
实施例7摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养10h，向培养好的100ml二级种子中加入0.5g的***，10ml大豆油，0.15g吐温-80，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量95.96％,***归一含量3.60％。
实施例8摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养72h，向培养好的100ml二级种子中加入5g的***，16ml大豆油，0.05g吐温-80，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量96.07％,***归一含量3.54％。
实施例9摇瓶转化
按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养24h，向培养好的100ml二级种子中加入10g的***，1ml大豆油，0.2g吐温-80，转化120h，转化条件：200rpm，30±1℃。转化结束，样品送液相，脱氢***归一含量96.44％,***归一含量3.10％。
实施例10发酵罐转化和分离纯化
按照实施例1配方培养一级种子600ml。
按照实施例1二级种子配方配制培养基，在10L发酵罐中进行种子培养，计料体积6L，配制好后加入10L发酵罐中，121℃，灭菌30min，冷却至30℃，接种，接种后体积6L。种子培养条件：30±1℃，转速150-200rpm，空气流量0.2m3/h，罐压0.05MPa，培养时间16h。培养结束，加入***底物120g，吐温-80 6g，大豆油960ml，转化120h，转化条件：30±1℃，转速200rpm,空气流量0.05-0.6m3/h，罐压0.01-0.1MPa。
转化结束，取样送液相，脱氢***98.38％，***0.86％。
本发明所述的分离纯化方法为常规方法，例如包括但不限于以下方法：
将转化液升温到80℃，搅拌30min，保温静置4h，分层，上层油相分出，冷却至常温，加3L甲醇，搅拌30min，静置1h，分层，上层甲醇减压浓缩。下层油层再继续萃取2次，上层甲醇层合并减压浓缩。浓缩温度50-70℃，浓缩至糊状，加入少量水，带干其中的甲醇，冷却至室温，抽滤，得类白色固体，固体70℃烘干。烘干后，加入240ml石油醚，升温60℃回流打浆2h，冷却至30℃以下，抽滤，滤饼用少量石油醚淋洗，抽干，入烘箱70℃烘干。收白色晶体104.1g，样品送液相检测，其中脱氢***99.21％，***0.66％。
综上所述，本发明的生物脱氢方法能大幅度提高转化率，转化率可达到99％以上；同时产物的降解率低，反应专一性强，转化时间相对较快，产品质量高；并且无需无菌环境，常规室外操作即可，操作简单，适合工业化大批量生产。

Claims (10)

1.一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述方法为：以17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮为底物，以经斜面培养、一级种子培养和二级种子培养制备的简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将体积百分数为1％-16％的大豆油和质量体积百分数为0.05％-0.2％的吐温-80加入转化体系中，于29-31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到17α甲基-17β羟基雄甾-1,4-二烯-3-酮。
2.根据权利要求1所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述底物的添加量按质量体积百分数计为0.5％-10％。
3.根据权利要求1所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述简单诺卡氏菌菌液的制备方法为：
(1)斜面培养：所述斜面培养基包括按质量体积百分数计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉0.01-2％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌菌种；
(2)一级种子培养：所述一级种子培养基包括按质量体积百分数计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌斜面菌种，振荡培养，得到一级种子液；
(3)二级种子培养：所述二级种子培养基包括按质量体积百分数计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.25％、17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮0.05％和泡敌0.02％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，将所述一级种子液接种至所述二级种子培养基中，振荡培养，得到简单诺卡氏菌菌液。
4.根据权利要求3所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述简单诺卡氏菌菌液中OD600值为0.5-2.0。
5.根据权利要求3所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述斜面培养的条件为：于25-40℃下，培养1-5d。
6.根据权利要求3所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述一级种子培养的条件为：于25-40℃下振荡培养，转速50-200rpm，培养时间10-72h。
7.根据权利要求3所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述二级种子培养的条件为：于25-40℃下振荡培养，转速50-200rpm，培养时间10-72h。
8.根据权利要求1所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述转化反应在10L发酵罐内进行时，条件为：空气流量0.05-0.6m3/h，罐压0.01-0.1MPa。
9.根据权利要求1所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述分离纯化方法具体为：将转化液升温到80℃并搅拌，保温静置分层，上层油相分出，冷却至常温，加3L甲醇，搅拌静置分层，上层甲醇减压浓缩，下层油层再继续萃取2次，上层甲醇层合并减压浓缩，浓缩温度50-70℃，浓缩至糊状，加水带干其中的甲醇，冷却至室温，抽滤，得类白色固体，固体70℃烘干；烘干后加入石油醚，升温60℃回流打浆，冷却至30℃以下，抽滤，滤饼用石油醚淋洗，抽干后烘干。
10.根据权利要求1所述的一种***C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述生物脱氢方法具体为：将简单诺卡氏菌经斜面培养、一级种子培养和二级种子培养制备成菌液，以菌液体积为6L计，在转化体系中加入17α甲基-17β羟基雄甾-4-烯-3-酮120g、大豆油960ml和吐温-80 6g；转化体系于30℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到17α甲基-17β羟基雄甾-1,4-二烯-3-酮。
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