CN110643525B - 一种生产1,3-丙二醇用的酪酸梭菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种生产1,3-丙二醇用的酪酸梭菌菌株及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产1,3‑丙二醇用的酪酸梭菌菌株及其筛选方法和应用。所述菌株在中国典型培养物保藏中心CCTCC的保藏号为：No.M 2019459，命名为Clostridium butyricum AYM014。所述酪酸梭菌菌株是将一株物理化学复合诱变的突变株C.butyricum QXYZ514为出发菌株经诱变处理后得到的。该菌株的选育方法如下：菌悬液的制备与等离子体诱变；诱变菌株的定向筛选；诱变菌株的产量鉴定。本发明选育得到的酪酸梭菌菌株具有较高的1,3‑丙二醇耐受性，且可获得的1,3‑丙二醇产量达到40.8 g/L，约比原始株提高42.4%。本发明涉及的诱变设备简单、操作简易、运行成本低廉，为生物法生产1,3‑丙二醇提供了高效菌株，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种生产1,3-丙二醇用的酪酸梭菌菌株及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产1,3-丙二醇用的酪酸梭菌菌株及其筛选方法和应用。
背景技术
1,3-丙二醇（1,3-propenadiol，1,3-PD）是一种无色粘性有机化合物，其结构简式为CH2OH-CH2-CH2OH，是一种不易燃，低毒的液体。1,3-PD具有独特的双功能基团，可参与多种缩聚反应，合成聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）等聚酯，应用广泛；可用于食品工业和医药产业中相关化合物的生产，同时，作为化妆品中的添加物，可作为润肤剂与保湿剂。因此，开发经济高效的1,3-PD的生产方式对于各项工业发展都有重要的意义。目前，合成1,3-PD的常规方法是通过丙烯醛的水合，以及环氧乙烷的加氢甲酰化，这些化学合成方法无论从经济角度还是生态角度来看，都具有成本高和环境不友好等的缺点。由DuPont公司开发的甘油到1,3-PD的酶促转化开创了1,3-PD合成的新纪元，可天然生产1,3-PD的菌种有，肺炎克雷伯氏菌、酪酸梭菌、短乳杆菌和弗氏柠檬酸杆菌等，但是，采用这些天然菌株发酵过程存在某些缺陷，使微生物发酵法生产1,3-PD无法达到工业化生产的要求。
以甘油为底物的生物转化，是1,3-PD生成的唯一途径，制约这一发酵方法的主要因素有：生产菌种对底物甘油的低耐受性，代谢途径中有毒副产物的累积以及部分菌株在转化过程中对于辅酶B12的依赖性。其中，菌体本身对甘油底物的低耐受性直接制约了1,3-PD产量的提高，因此，需要通过优化天然菌株发酵条件或开发新型菌株进行发酵的方法对天然生产菌进行改造，以期提高生物法生产1,3-PD的产量。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种酪酸梭菌及其筛选方法与应用，所述的酪酸梭菌在生产1,3-丙二醇过程中对底物甘油具有较高的耐受性，不需要添加辅酶B12，可以提高1,3-丙二醇的产量。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一种酪酸梭菌，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2019459，分类命名为Clostridium butyricum AYM014，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心；保藏日期：2019年6月17日。
本发明所述菌株Clostridium butyricum AYM014的形态学特征为奶白色菌落，菌落呈现不规整圆形且较大，显微形态排列整齐，成膨大梭状。
本发明以Clostridium butyricum QXYZ514为出发菌株，经诱变处理后筛选得到的。
本发明还提供了保藏编号为CCTCC No. M 2019459的酪酸梭菌的筛选方法，包括以下步骤：
（1）以Clostridium butyricum QXYZ514为出发菌株，对其进行活化，将活化后的菌液稀释到CFU为106后放入ARTP诱变仪中进行诱变，诱变结束后的菌液涂布在含有一定浓度的甘油RCM琼脂平板培养基上筛选培养，重复进行诱变与筛选培养，诱变条件相同，筛选培养时培养基中甘油浓度逐渐提高，得到初筛突变菌株；
（2）将步骤（1）得到的初筛突变菌株的单菌落分别进行基础培养后，接种在96孔板上进行复筛，以生物量为指标，复筛生物量前五的突变菌株；
（3）将步骤（2）中得到的突变菌株分别接种于含有浓度为60 mM的甘油RCM液体培养基中培养后获得发酵种子液，发酵种子液接种于发酵培养基中进行厌氧培养收集发酵液，检测发酵液中1,3-丙二醇的含量，从而筛选出1,3-丙二醇产量最高的突变株。
优选的，步骤（1）中所述的活化为出发菌株在RCM琼脂平板培养基中进行划线后放入厌氧罐中厌氧培养，挑取单菌落接种到煮沸后冷却到40~55℃的RCM液体培养基，趁热覆盖石蜡，培养一段时间后得到活化的菌液。
优选的，步骤（1）中所述的筛选培养条件为37℃厌氧培养12h。
优选的，步骤（1）中所述诱变条件为处理距离2 mm，射频功率输入为100~120 W，氦气流速为10 L/min，处理时间为180~200 s。
优选的，步骤（1）中所述甘油的浓度为100~120 g/L。
优选的，步骤（3）中所述的发酵培养基的成分为（每升含）：甘油100~120 g/L，酵母粉1~2 g/L，K2HPO4×3H2O 1g，KH2PO4 0.5 g，(NH4)2SO4 2 g，MgSO4×7H2O 0.2 g，CaCl2×2H2O 0.02 g，微量元素溶液1.0 mL，铁溶液1.0 mL。
其中，所述微量元素溶液的成分为（每升含）：ZnCl2 70 mg，MnCl2×4H2O 100mg，H3BO3 60 mg，CoCl2×6H2O 200 mg，CuCl2×2H2O 20 mg，NiCl2×6H2O 25 mg，Na2MoO4×2H2O35 mg，37 %HCl (v/v) 0.9 mL；所述铁溶液组成（每升含）：FeSO4×7H2O 5 g，37%HCl 4 mL。
优选的，步骤（3）中所述的接种量为8%，所述厌氧培养为37℃厌氧培养20~30 h。
本发明制备的酪酸梭菌突变株Clostridium butyricumAYM014以甘油为底物的1,3-PD产量达到41.3 g/L。
本发明还提供了保藏编号为CCTCC No. M 2019459的酪酸梭菌在生产1,3-丙二醇的应用。
此外，本发明还提供了一种1,3-丙二醇的生产方法，将保藏编号为CCTCC No. M2019459的酪酸梭菌接种于含有终浓度为60 mM的甘油的RCM液体培养基中培养获得发酵种子液，然后将发酵种子液转入发酵培养基进行发酵。
生物保藏说明
生物材料Clostridium butyricum QXYZ514，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2019460，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心；保藏日期：2019年6月17日。
生物材料Clostridium butyricum AYM014，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2019459，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心；保藏日期：2019年6月17日。
与现有技术相比较，本发明的有益效果有：
本发明所述保藏编号为CCTCC No. M 2019459的酪酸梭菌以Clostridiumbutyricum QXYZ514为出发菌株，经过ARTP反复诱变提高对甘油的耐受性，复筛后经过分批发酵后得到1,3-丙二醇最高产菌株Clostridium butyricum AYM014，其生产的1,3-PD产量达到41.3 g/L，较出发菌株1,3-PD产量有明显提高，且转化过程中不需要添加辅酶B12，极大地降低了生产成本，对1,3-PD的天然生产菌株改造和1,3-PD的生物法工业化生产具有理论与实践参考意义。本发明采用的ARTP诱变方法与传统诱变方法相比，能够有效造成DNA的多种变性，突变比例高，突变基因可以稳定传给子代，具有运行成本不高、操作轻便、无有毒有害物质产生等优点。
附图说明
图1是实施例5中出发菌株Clostridium butyricum QXYZ514不同ARTP诱变时间的致死率曲线图。
具体实施方式
本发明公开了一种酪酸梭菌及其应用，所述的酪酸梭菌在生产1,3-丙二醇过程中对底物甘油具有较高的耐受性，不需要添加辅酶B12，可以提高1,3-丙二醇的产量。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明所述Clostridium butyricum AYM014的初筛
将Clostridium butyricum QXYZ514进行活化，活化具体步骤为：保存在-80℃的Clostridium butyricum QXYZ514菌株在RCM琼脂平板培养基中进行划线，将RCM琼脂平板放入2.5 L厌氧罐中进行厌氧培养，然后挑取单菌落接种到煮沸后冷却到40~55℃的RCM液体培养基，趁热覆盖石蜡，所述的接种量为2%，培养条件为37~40℃培养10~14 h后得到活化的菌液。RCM琼脂平板培养基的组分为：酵母提取物3 g/L，牛肉浸膏10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，可溶性淀粉1 g/L，NaCl 5 g/L，三水合乙酸钠3 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.15g/L，琼脂15 g/L。RCM液体培养基组分同上述RCM琼脂平板培养基，区别为不添加琼脂。
将活化的菌液稀释到CFU约为106后滴加到ARTP诱变仪配制的不锈钢载片上，将载片放入常压室温等离子体诱变仪（ARTP-IIS，无锡源清天木生物科技有限公司），设定参数为：处理距离为2 mm，射频功率输入为100~120 W，氦气流速为10 L/min，处理时间为180~200 s，进行等离子体照射诱变处理，诱变之后的菌液在RCM液体培养基中反复洗脱重悬；取100 μL诱变后菌液涂布在含有甘油的RCM琼脂平板培养基上筛选培养，初始甘油浓度为100g/L，37℃下厌氧培养12h后，收集菌体；采用与上述步骤相同的方法进行ARTP的二次诱变，区别为诱变后的菌液筛选培养时RCM琼脂平板培养基中甘油的浓度为110 g/L；采用与上述步骤相同的方法进行ARTP的第三次诱变，区别为诱变后的菌液筛选培养时RCM琼脂平板培养基中甘油的浓度为110 g/L。
经过三次反复诱变后获得29株初筛突变菌株，命名为AYM001~029，记录菌落的形态特征；分别挑取初筛突变菌株的单菌落在RCM液体培养基中基础培养获得液体培养物，接种在添加有RCM液体培养基的96孔板中进行复筛，接种量为培养基体积的2%；因菌株生物量与1,3-PD产量具有正相关性，因此以生物量为指标，筛选相同培养时间内生物量排在前五的突变菌株进行后续生产1,3-丙二醇的分批发酵。生物量以波长600 nm下光密度值（OD600）乘以系数0.34转化为菌体干重（Cell Dry Weight, CDW），前五的突变菌株分别为AYM003、AYM007、AYM013、AYM014、AYM022。前五的突变菌株CDW值如下表1所示，以生物量最高的AYM014株为基准，计算相对生物量。
表1.五株突变菌株的生物量
突变株 CDW 相对生物量
AYM003 2.62±0.21 94.2%
AYM007 2.70±0.16 97.1%
AYM013 2.55±0.09 91.7%
AYM014 2.78±0.22 100.0%
AYM022 2.62±0.11 94.2%
实施例2：突变菌株的1,3-PD发酵
将实施例1中得到的五株突变菌株分别接种于含有终浓度为60 mM的甘油RCM液体培养基中37℃培养24 h获得发酵种子液，甘油的添加是为了诱导甘油代谢相关酶的表达。然后以8%的接种量分别接种于发酵培养基中进行分批发酵，发酵场所为500 mL三角瓶，发酵体积为400 mL；发酵条件为37℃厌氧培养20~30 h，收集发酵液。发酵培养基中的成分为（每升含）：甘油 100~120 g，酵母粉 1~2 g，K2HPO4×3H2O 1 g，KH2PO4 0.5 g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4×7H2O 0.2 g，CaCl2×2H2O 0.02 g，微量元素溶液1.0 mL，铁溶液1.0 mL。
其中，微量元素溶液的成分为（每升含）：ZnCl2 70 mg，MnCl2×4H2O 100mg，H3BO360 mg，CoCl2×6H2O 200 mg，CuCl2×2H2O 20 mg，NiCl2×6H2O 25 mg，Na2MoO4×2H2O 35mg，37 %HCl (v/v) 0.9 mL；铁溶液组成（每升含）：FeSO4×7H2O 5 g，37%HCl 4 mL。
采用高效液相色谱的方法测定发酵液中1,3-丙二醇产量，筛选出1,3-PD产量最高的酪酸梭菌突变株。五株突变株的1,3-PD终产量如表2所示，以1,3-PD产量最高的AYM014株为基准，计算相对产量。
表2.五株突变株的1,3-PD终产量
突变株 1,3-PD产量（g/L） 相对产量
AYM003 40.2±0.99 97.3%
AYM007 40.2±1.07 97.3%
AYM013 38.7±0.57 93.7%
AYM014 41.3±0.84 100.0%
AYM022 39.5±1.21 95.6%
由表2可知，最优突变株Clostridium butyricum AYM014，发酵24 h后的1,3-PD终产量达到41.3 g/L。将突变株Clostridium butyricum AYM014芽孢在RCM液体培养基上37℃恒温培养1 d看到清晰的奶白色菌落，菌落呈现不规整圆形且较大，显微形态排列整齐，成膨大梭状；继续培养1 d可获得芽孢，卵圆形，次端生。突变株Clostridium butyricumAYM014生长速度较快，对甘油底物的耐受性较高，遗传稳定性好，以甘油为唯一底物获得的1,3-PD产量也较高。最优突变株Clostridium butyricum AYM014于2019年6月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2019459，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心。
实施例3：出发菌株的1,3-PD发酵
将本发明所述的出发菌株按照与实施例2相同的生产方法进行1,3-PD的发酵，发酵环境、接种量均相同，采用高效液相色谱法测定发酵液中1,3-PD终产量为28.7 g/L，可见，突变株Clostridium butyricum AYM014与出发菌株Clostridium butyricum QXYZ514相比，1,3-PD产量提高了43.9%。
实施例4：出发菌株的甘油耐受性测定
将Clostridium butyricum QXYZ514进行活化，活化步骤与实施例1中所述相同。将活化后的菌落置于含有不同甘油浓度（60、70、80、90、100、110、120 g/L）的RCM液体培养基中，以不含甘油的RCM液体培养基为对照，37℃下厌氧温育24 h，测定各组培养物在600nm下的吸光度，测得Clostridium butyricum QXYZ514对甘油的耐受性为80 g/L，该浓度下，细菌存活率为85~90%。
实施例5：出发菌株的ARTP诱变时间选择
将Clostridium butyricum QXYZ514进行活化，活化步骤与实施例1中所述相同。将活化后的菌落培养至指数期，菌液稀释到CFU为106后滴加到诱变仪配制的不锈钢载片上，然后将载片放入ARTP诱变仪，设定参数如下：处理距离为2 mm，射频功率输入为100 W，氦气流速为10 L/min，处理时间分别设定为0、60、90、120、150、180、210、240 s，计算不同时间下的致死率，制作致死曲线；图1是出发菌株Clostridium butyricum QXYZ514 ARTP诱变不同时间的致死曲线图；如图1所示，菌株的致死率随ARTP诱变时间的增加而升高，当时间从120 s增加到160 s时致死率呈指数形式增加，持续到180 s时致死率达到90％左右，而将菌株处理240 s后发现致死率为100％。通常认为致死率达到90％左右时，是恰当的处理条件，选择ARTP诱变时间为180~200 s，最佳ARTP诱变时间确定为180 s。
本发明的实施方案不仅仅限于说明书和实施方式中所列的运用，本领域研究人员可结合实际实施案例进行具体的修改。因此，在不背离权利要求及等同范围内所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (3)

1.一种酪酸梭菌的菌株，其特征在于，所述菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No. M 2019459，分类命名为Clostridium butyricum AYM014。
2.根据权利要求1所述的酪酸梭菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
3.一种1,3-丙二醇的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CCTCC No. M 2019459的酪酸梭菌接种于含有终浓度为60 mM的甘油的RCM液体培养基中培养获得发酵种子液，发酵种子液接种于发酵培养基中进行厌氧培养，收集1,3-丙二醇。
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Production of 1,3-propanediol by Clostridium butyricum growing on biodiesel-derived crude glycerol through a non-sterilized fermentation process;Afroditi Chatzifragkou 等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20110412;第91卷;第101-112页 *
丁酸梭菌高产1,3-丙二醇菌株选育及培养基优化研究;李凤梅 等;《青岛农业大学学报(自然科学版)》;20071231;第24卷(第03期);第193-195页 *
产1,3-丙二醇菌株丁酸梭菌的诱变育种;李凤梅 等;《生物技术》;20050220;第15卷(第01期);第34-35页 *

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