CN110632062B - 一种有机磷农药的可视化比色检测方法 - Google Patents
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Abstract
有机磷农药(Organophosphorus pesticide,OPs)因其高效、广泛的作用效果而备受青睐,常用作农业杀虫剂及除草剂。然而,OPs残留会对人体造成一系列严重的健康问题,如头晕,呕吐,腹泻,肌肉震颤,甚至死亡,因此迫切需要设计开发用于OPs的即时定量检测方法。在此,我们针对有机磷农药构建了一种可视化比色检测技术:本发明中选取***磷作为有机磷农药代表性模式分子,采用硫代乙酰胆碱碘化物(ATCI)作为乙酰胆碱酯酶(AchE)催化底物,ATCI会被催化分解为巯基胆碱,其末端还原性巯基能够抑制I2诱导的金纳米棒刻蚀;当OPs存在时,乙酰胆碱酯酶的活性被抑制,无还原性巯基产生,I‑可被KIO3氧化生成I2,最后由后者触发金纳米棒的刻蚀反应,导致OPs浓度依赖性的金纳米棒纵向吸收峰位蓝移及金纳米棒溶液颜色变化。该新方法对有机磷农药检测的良好性能及实际应用能力得到了验证,具有明显的创新性和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和分析检测领域,涉及基于乙酰胆碱酯酶活性调控介导的金纳米棒刻蚀可视化比色传感器的构建及有机磷农药检测分析新方法。
背景技术
有机磷农药因其高效、广泛的作用效果而备受青睐,常用作农业杀虫剂及除草剂。目前,因为有机磷农药在传统农业实践及现代工业中的滥用导致空气、水体、土壤及农产品、食品中农药残留增加。同时,有机磷残留会对人类健康产生一系列严重的影响,因此针对有机磷残留水平的检测十分迫切,设计开发用于有机磷的即时定量检测手段至关重要。目前,有机磷的定量检测仍主要依赖于传统方法,如高效液相色谱、气相色谱和荧光方法等,这些传统方法在有机磷的定量分析中提供了精确的数据结果,但是,由于传统方法在检测操作中的固定性、复杂性及专业性的需求,大大限制阻碍了其现场应用能力。因此,迫切需要开发便捷、简易的灵敏有机磷定量检测方法。
近几十年,可视化比色方法用于环境有害物质的检测受到越来越多的关注,因为此方法具有便捷性、可靠性及应用范围广泛的特性,大大满足了即时检测的需求。可视化比色方法是基于Beer-Lambert定律而衍生出的一种方法,通过简单的紫外-可见光光谱仪器测定相关生色团的吸光度就可以推知待测物质的准确浓度;而只需要通过肉眼对颜色的分别,也可以实现对目标物的半定量。在许多的文献报道中,金纳米材料是可视化比色传感中最常用的材料之一,因为其具有以下几个重要特征:1.超高的消光系数;2.独特的等离子体共振特性;3.敏感的颗粒间距离依赖性颜色变化;4.多样的尺寸/形状变化依赖性的颜色改变,色彩变化范围更广泛,更易被裸眼识别,为可视化比色检测提供了新的识别方法。
本发明受到农药检测的重要性及金材料尺寸依赖性可视化比色的简便性等特性的启发,构建了一种基于金纳米棒的可视化比色方法用于有机磷农药的检测。采用金纳米棒的尺寸改变的可视化比色方法来检测水中的有机磷农药,利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用,影响后续催化产物,从而对金纳米棒产生纵向刻蚀改变其尺寸,即可产生裸眼轻松分辨的不同颜色,达到对有机磷农药的便捷且低成本的可视化比色检测目的。
发明内容
本发明的目的在于克服传统有机磷农药检测方法耗时久、专业操作技术限制的缺点,结合金纳米棒的合成与性能优势,构建一种可视化比色传感器,将其发展为一种有机磷农药的可视化检测新方法。本方法用于有机磷农药的检测,具有简单方便、成本低廉、特异性好等优点,具有良好的社会价值和应用前景。
为实现上述目的,本发明的技术方案是:
先将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶混匀孵育,随后向有机磷农药-酶混合液中加入ATCI,混匀孵育。在甘氨酸-盐酸缓冲溶液中加入金纳米棒,缓慢加入KIO3溶液,温和混匀,使IO3 -充分分散在体系中;再向上述溶液中加入有机磷农药-酶-ATCI混合液混匀,IO3 -与I-反应生成I2,对金纳米棒产生纵向刻蚀;采用紫外-可见光光谱仪收集金纳米棒的吸收峰光谱图,根据金纳米棒的颜色变化及吸收峰的相对位置改变量,实现有机磷农药的定性与定量检测。
所述甘氨酸-盐酸缓冲溶液pH为2.2;
所述金纳米棒为本实验室合成;
所述有机磷农药(***磷)从阿拉丁试剂(上海)有限公司购买;
所述乙酰胆碱酯酶从源叶生物科技(上海)有限公司购买,与有机磷农药溶液4:5体积比混合孵育;
所述ATCI浓度为1-1.5 mM;IO3 -浓度为10-20 mM;乙酰胆碱酯酶浓度为0.01-0.04mg/mL。
本发明所述可视化比色传感方法的反应过程优选:
(1)取***磷溶液10 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中,再加入8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液,混合均匀;
(2)静置25分钟;
(3)向(1)中所述混合液体中加入8 μL ATCI溶液;
(4)摇晃混匀后,37 ℃放置孵育60分钟。
本发明所述的一种有机磷农药的可视化比色过程优选:
(1)在以上述方法反应之后,将混合液加入到金纳米棒的甘氨酸-盐酸缓冲液中,
其中含有20 μL KIO3溶液;
(2)50 ℃水浴静置反应15分钟;
(3)通过紫外-可见光光谱仪或裸眼进行吸收峰谱信号或色彩信号采集,实现定量或半定量分析。
与现有技术相比,本发明的优势在于:该方法具有专一性高、操作简便、条件温和、经济实用等优点;特别是操作简便,可以克服由于传统仪器的复杂前处理导致检测时间过长,同时,也可使用裸眼实现有机磷农药的半定量检测;实现了实际水样中有机磷农药的可视化检测。因此,该发明方法具有原始创新性、良好的社会价值和应用前景。
附图说明
图1为实施例1中可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的可行性验证;
图2为实施例2中透射电子显微镜(TEM)表征有机磷农药调控金纳米棒刻蚀;
图3为实施例3中可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的实验条件优化;
图4为实施例4中可视化比色检测方法针对不同浓度有机磷农药的检测能力研究;
图5为实施例5中可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的选择性研究;
图6为实施例6中可视化比色检测方法应用于实际水样的分析;
图7为实施例1中可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的检测原理图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和过程,旨在易于理解本发明的技术方案特征,对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案,均落在本发明权利保护范围之内。
实施例1可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的可行性验证
配制构建可视化比色传感器所需的溶液:将合成好的金纳米棒储备溶液置于室温待用,配制250 μg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液,配制100 mM的ATCI溶液,配制0.41 mM的KIO3溶液,配制甘氨酸-盐酸缓冲液( pH 2.2),放置4 ℃冰箱内待用。
通过单一变量法,***地考察了各反应成分对光谱信号的影响。
(1)取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2 ) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;
(2)加入250 μL的金纳米棒储备溶液;
(3)加入8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250 μg/mL)、20 μL的KIO3溶液(0.41 mM)及8μL的ATCI溶液(100 mM),温和混匀,50 ℃水浴放置15min;
(4)最后加入8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250 μg/mL)、10 μL有机磷农药溶液(2 μg/mL)、20 μL的KIO3溶液(0.41 mM)及8 μL的ATCI溶液(100 mM),温和混匀,50 ℃水浴放置15 min。
测试并分别记录上述各步骤在400 nm-800 nm范围内的的紫外-可见光光谱。
结果分析:从图1的紫外谱图中可以看出,同时加入ATCI和KIO3时,具有明显的峰谱改变及颜色变化,说明二者发生氧化还原反应生成I2对金纳米棒产生了刻蚀,实现了吸收峰的蓝移及颜色的转变;当在该比色体系中引入乙酰胆碱酯酶时,吸收峰不会发生改变,颜色仍保持棕色,说明乙酰胆碱酯酶分解ATCI使得其与KIO3的反应不会发生,从而不会刻蚀金纳米棒;当继续加入有机磷农药时,吸收峰又发生明显蓝移同时伴随颜色向红色的转变,说明有机磷农药对乙酰胆碱酯酶产生抑制,乙酰胆碱酯酶无法分解ATCI,从而发生氧化还原反应生成I2,对金纳米棒产生刻蚀效果。
实施例2 透射电子显微镜(TEM)表征有机磷农药调控金纳米棒刻蚀
使用不同浓度的有机磷农药溶液,直观的分析考察不同浓度有机磷农药对金纳米棒的影响。
(1)取8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250 μg/mL)和10 μL有机磷农药溶液加入到容积为0.5 mL的EP管中,混匀,室温孵育25 min;
(2)向(1)中混合溶液中加入8 μL的ATCI溶液(100 mM),温和混匀,37 ℃水浴孵育60 min;
(3)取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2 ) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;
(4)加入250 μL的金纳米棒储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.41 mM),温和混匀;
(5)将(2)中混合液加入(4)温和混匀,50 ℃水浴放置15 min,测试并记录400 nm-800 nm范围内的紫外-可见光光谱图。
结果分析:从图2中的透射电子显微镜照片更加直观地显示有机磷农药浓度对金纳米棒的刻蚀影响。随着有机磷农药的浓度增加,乙酰胆碱酯酶活性减弱,ATCI中I-与KIO3发生反应,从而刻蚀金纳米棒使其长度逐渐变短,说明达到有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制效果。
实施例3 可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的实验条件优化
通过单一变量法,分别考察确定了各反应因素对紫外光谱信号的影响。
(1)ATCI浓度优化:取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2 ) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;随后加入250 μL的金纳米棒储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.14 mM),温和混匀;最后加入不同体积的ATCI溶液(100 mM),温和混匀,50 ℃水浴放置15分钟;直接测量并记录各组溶液在400 nm-800 nm范围内的吸收峰位置值,得到不同浓度的ATCI对可视化比色传感器的形成及紫外光谱的影响,重复三次试验,取平均值。
(2)乙酰胆碱酯酶浓度优化:取不同浓度乙酰胆碱酯酶溶液(8 μL)与8 μL的ATCI溶液(100 mM)混匀,37 ℃孵育1 h;取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2 ) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;随后加入250 μL的金纳米棒储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.41 mM),温和混匀;最后将上述不同浓度酶-ATCI混合液加入,温和混匀,50 ℃放置15分钟;直接测量并记录各组溶液在400 nm-800 nm范围内的吸收峰位置值,得到不同浓度的乙酰胆碱酯酶对可视化比色传感器的形成及紫外光谱的影响,重复三次试验,取平均值。
(3)乙酰胆碱酯酶催化分解ATCI时长优化:分别取8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250μg/mL)与8 μL的ATCI溶液(100 mM)混匀,在37 ℃水浴中孵育不同时间;取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;随后加入250 μL的金纳米棒储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.41 mM),温和混匀;最后将不同孵育时间的混合液加入,温和混匀,50 ℃放置15分钟;直接测量并记录各组溶液在400 nm-800 nm范围内的吸收峰位置值,得到不同酶促时间对可视化比色传感器的形成及紫外光谱的影响,重复三次试验,取平均值。
(4)有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶活性时长优化:分别取8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250 μg/mL)与10 μL的有机磷农药溶液(2 μg/mL)混匀,在室温放置不同时间;向上述溶液中加入8 μL的ATCI溶液(100 mM)混匀,在37 ℃水浴中孵育1 h;取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;随后加入250 μL的AuNRs储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.41 mM),温和混匀;最后将上述有机磷农药-酶-ATCI混合液加入,温和混匀,50 ℃放置15分钟;直接测量并记录各组溶液在400 nm-800 nm范围内的吸收峰位置值,得到不同酶抑制时间对可视化比色传感器的形成及紫外光谱的影响,重复三次试验,取平均值。
结果分析:从图3可以看出,在多组不同浓度的ATCI中,1-1.5 mM为刻蚀反应的平台值,刻蚀效果明显。体系乙酰胆碱酯酶浓度在0.01-0.04 mg/ml时,达到刻蚀的理想效果。乙酰胆碱酯酶对ATCI的分解在40-60 min时达到最大,用于后续研究。有机磷农药的抑制时间在20-30 min时达到最佳的刻蚀效果。上述实验条件研究用于后续实验。
实施例4 可视化比色检测方法针对不同浓度有机磷农药的检测能力研究
分别取8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250 μg/mL)与10 μL不同浓度的有机磷农药溶液混匀,在室温放置25 min;向上述溶液中加入8 μL的ATCI溶液(100 mM)混匀,在37 ℃水浴中孵育1 h;取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;接着加入250 μL的金纳米棒储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.41 mM),温和混匀;将上述有机磷农药-酶-ATCI混合液加入,温和混匀,50 ℃放置15分钟;直接测量并记录各组溶液在400nm-800 nm范围内的吸收峰位置值,得到不同浓度有机磷农药对刻蚀的影响情况。
结果分析:从图4A的紫外—可见光光谱图中可以看出,随着有机磷农药浓度的增大,金纳米棒的吸收峰位置不断蓝移,这表明金纳米棒的吸收峰位置蓝移量跟有机磷农药浓度呈正相关。从图4B可以得出,该可视化比色传感器对有机磷农药检测在12-117 nM浓度范围具有较好的线性关系。
实施例5 可视化比色检测方法用于有机磷农药检测的选择性研究
分别取8 μL的乙酰胆碱酯酶溶液(250 μg/mL)与10 μL不同的离子或小分子物质溶液混匀,在室温放置25 min;向上述溶液中加入8 μL的ATCI溶液(100 mM)混匀,在37 ℃水浴中孵育1 h;取甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2) 250 μL加入到容积为0.5 mL的EP管中;接着加入250 μL的金纳米棒储备溶液及20 μL的KIO3溶液(0.41 mM),温和混匀;将上述有机磷农药-酶-ATCI混合液加入,温和混匀,50 ℃放置15分钟;直接测量并记录各组溶液在400nm-800 nm范围内的吸收峰位置值,得到不同物质对乙酰胆碱酯酶的抑制影响。
结果分析:从图5可以看出,从左到右分别代表离子样品Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,SO4 2-,Cl-,NO3 -,小分子样品氨基***(ATZ),腈菌唑,恶醚唑,戊唑醇,己唑醇,谷氨酸(Glu)。只有有机磷农药的加入才会引起可视化比色传感器的紫外光谱信号的显著改变,其它对照物质不存在干扰。说明该可视化比色传感器对有机磷农药检测具有很好的选择性。
实施例6 可视化比色检测方法应用于实际水样的分析
实际水样取自河水(湘江水),用不同浓度的有机磷农药进行人为污染,制备成被污染的试剂水样。按照实施例4所涉及步骤制备可视化比色传感器,加入不同浓度有机磷农药污染的水样,检测金纳米棒吸收峰波长值,重复三次,取平均值,计算回收率。
结果分析:从图6的回收率实验结果可以得出,针对各水样检测的回收率分布在94%-105 %,并且具有较小的偏差,说明该可视化比色传感器可用于试剂水样中有机磷农药的快速检测分析。
Claims (1)
1.一种有机磷农药的可视化检测方法,其特征是,以乙酰胆碱酯酶作为作用物质,利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用,将ATCI作为媒介,当存在有机磷农药时,由于乙酰胆碱酯酶活性被抑制,其不能催化分解ATCI产生还原性巯基胆碱,则ATCI中的I-与KIO3反应产生I2,随后加入金纳米棒,I2对金纳米棒快速刻蚀,使得金纳米棒的纵向吸收峰蓝移及溶液颜色逐渐由棕色变向红色,实现有机磷农药的可视化多色比色检测;
具体步骤如下:先将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶按体积比5:4混匀孵育,室温放置25min,随后向有机磷农药和酶的混合液中加入ATCI,37℃水浴中混匀孵育1h得到混合溶液一;在pH为2.2的甘氨酸-盐酸缓冲溶液中加入金纳米棒溶液,再缓慢加入KIO3溶液,温和混匀,使IO3 -充分分散在体系中,得到混合溶液二;将混合溶液一加入混合溶液二中混匀,50℃水浴放置15min,I-与IO3 -反应生成I2,金纳米棒被纵向刻蚀;采用紫外-可见光光谱仪收集400nm-800nm金纳米棒吸收峰谱,根据吸收峰的相对位置改变量对有机磷农药实现定量检测,根据金纳米棒溶液的颜色变化实现对有机磷农药的可视化检测,随着有机磷农药浓度的增大,金纳米棒的吸收峰位置不断蓝移,金纳米棒的吸收峰位置蓝移量跟有机磷农药浓度呈正相关,可视化检测对有机磷农药检测在12-117 nM浓度范围具有线性关系;
所述有机磷农药为***磷,所述ATCI浓度为1-1.5 mM;IO3 -浓度为10-20 mM;乙酰胆碱酯酶浓度为0.01-0.04 mg/mL,乙酰胆碱酯酶对ATCI的分解在40-60 min时达到最大,有机磷农药的抑制时间在20-30 min时达到最佳的刻蚀效果。
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CN102221529A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-10-19 | 吉林大学 | 金纳米粒子比色法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法 |
CN105424688A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-03-23 | 哈尔滨商业大学 | 一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法 |
CN107084979A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-08-22 | 河南工业大学 | 一种基于金纳米棒刻蚀构建比色传感器定量检测有机磷农药的方法 |
CN107064134A (zh) * | 2017-06-14 | 2017-08-18 | 大连理工大学 | 一种用于有机磷农药裸眼可视化半定量检测的分析方法 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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Publication number | Publication date |
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CN110632062A (zh) | 2019-12-31 |
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