CN110628678A - 一株耐重金属的贪铜菌及菌剂制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于新菌种筛选技术及环境微生物技术领域，具体涉及一种耐重金属的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC‑8。所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC‑8从豆科植物含羞草(Mimosa pudica)根部分离出来，能够耐重金属铜，提高受Cu2+污染的种子萌发率和促进受Cu2+污染的幼苗生长，能够有效去除环境中的铜离子,可作为Cu2+污染土壤修复制剂使用，具有广阔的应用前景。

Description

一株耐重金属的贪铜菌及菌剂制备方法和应用
技术领域
本发明属于新菌种筛选技术及环境微生物技术领域，具体涉及一株耐重金属的贪铜菌 (Cupriavdus sp.)HXC-8及其菌剂制备方法和应用。
背景技术
近年来，采矿、化工和生活对土壤的重金属污染日益严重。重金属在土壤中不能自行分解，残留时间长，危害大，且容易被农作物吸收进而影响人类身体健康。铜污染是常见的重金属污染，土壤中铜元素积累过多，被植物吸收后停留在根部，阻碍根系对其它成分特别是对铁元素的吸收，导致植物生长不良，过多的铜进入体内会出现恶心、呕吐、上腹疼痛、急性溶血和肾小管变形等中毒现象。生物修复，特别是微生物修复技术因具有原位修复、廉价和环境友好等优点，逐渐受到重视。
利用贪铜菌修复土壤重金属污染已成为目前的研究趋势，发明专利CN201510885689.5 《一株能转化重金属的贪铜菌属菌株及其应用》公开了贪铜菌属菌株在硝酸盐环境中对亚铁有较强的氧化能力并能对亚铁氧化成矿，其可用于土壤的改良；该菌株对砷也具有较强的还原作用，在无硝酸盐和亚铁离子的条件下，其对砷的还原作用更强，可用于修复砷污染土壤。
发明专利CN201810855138.8《一种贪铜菌及贪铜菌制剂和贪铜菌制剂在重金属污染土壤修复中的应用》公开了贪铜菌(Cupriavidus sp.)能耐受重金属离子、吸附重金属离子、增加土壤水相微环境的pH和产生具有氮磷缓控释肥作用的鸟粪石，将其用于重金属污染土壤修复，特别是镉污染土壤修复，不但可以通过吸附和沉积固定土壤中镉离子，减少土壤镉的生物有效性，而且可以提高土壤肥力，解决土壤酸化等技术问题。
但是，现有技术并没有公开用于修复土壤中Cu2+的贪铜菌。在生物技术领域，Cu2+的污染仍然是未解决的问题，本发明在含羞草中发现了一株新的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8能够耐重金属铜，提高受Cu2+污染的种子萌发率和促进受Cu2+污染的幼苗生长。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐重金属的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，所述的贪铜菌的分类命名是Cupriavdus sp.，于2019年4月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO:60632，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一种含有所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8的贪铜菌菌剂。
所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8能够耐重金属Cu2+。
所述的贪铜菌菌剂制备方法包括以下步骤：取对数期的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8 培养液，低温离心，去上清，加入无菌水，离心，去上清，将离心管壁上的混合菌种用无菌水冲洗下来，配置成贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌剂。
贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌剂在提高受Cu2+污染的种子萌发率中的应用。
优选的，所述的种子为含羞草种子。
贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌剂在促进受Cu2+污染幼苗生长中的应用。
优选的，所述的幼苗为含羞草幼苗。
贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌剂在制备Cu2+污染土壤修复制剂中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一株耐重金属的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为： GDMCC NO:60632，并制备了相应的贪铜菌菌剂，利用所述的贪铜菌菌剂转染含羞草种子，中低浓度Cu2+污染的种子接种贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，萌发率显著高于无接种贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，接菌能够有效减缓重金属铜的污染，提高含羞草种子萌发率。高浓度Cu2+污染的种子接种贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，接菌组和无接菌的种子萌发率均大幅增长，提高其抗逆性，具有促生作用。且在幼苗生长过程中，贪铜菌菌剂能有效减缓 Cu2+对幼苗生长的胁迫、促进物质积累和幼苗生长；贪铜菌菌剂显著解除铜污染，增大对铜污染的耐受性，促进含羞草幼苗生长和生物量积累。
附图说明
图1革兰氏染色图分析
长杆状为枯草芽孢杆菌G+，短杆状为贪铜菌G-
图2过氧化氢酶活性测定
图3刚果红实验
图4甲基红反应
图5淀粉水解反应
图6肉汁实验
图7 BTB反应
图8铜胁迫以及接种贪铜菌菌剂对含羞草种子萌发率的影响
图9铜胁迫以及接种贪铜菌菌剂对含羞草幼苗根长的影响
图10铜胁迫以及接种贪铜菌菌剂对含羞草幼苗茎长的影响
图11铜胁迫以及接种贪铜菌菌剂对含羞草幼苗生物量的影响
图12贪铜菌重金属最低抑菌浓度实验结果
图13铜离子去除率
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。 YMA培养基(1L)：甘露醇10g，酵母粉4g，K2HPO3 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.05g，RH微量元素液4ml，dH2O 996ml，琼脂15-16g。
Rh微量元素液(1L)：H3BO3 5.0g，Na2MoO4 5.0g，dH20 1000ml
实施例一、含羞草根瘤菌的分离、培养
采集整株的含羞草，将采集回来的含羞草用清水清洗，去掉土块和茎干，在根部选取个大、饱满、新鲜的根瘤，洗去杂质，用95％乙醇浸泡5min后，用0.1％的HgCl2表面灭菌5min，然后在无菌条件下，用无菌水冲洗10次。
在无菌操作的情况下，将最后一次冲洗根瘤流下来的无菌水摇匀，倒少量于YMA培养基中进行均匀涂布，在28℃下倒置培养3～5天。如无菌落出现，则证明贪铜菌接种前已经清洗干净了，否则应分析出现菌落的原因，并且验证接种贪铜菌的培养基出现的菌落是否为根瘤菌菌落。
根瘤菌特性：短杆状、革兰氏阴性菌，大小为粘性大、生长快，28℃下24-48h长成菌落，菌落呈正圆形、乳白色、半透明的鼻涕状***。
在无菌操作的情况下，将单个根瘤切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向YMA 培养基放置，每个培养皿中均匀放置四个切半的根瘤，在28℃下倒置培养3～5天。出现菌落后，挑取符合根瘤菌形态的、单个的菌落进行纯化培养，经过三次纯化培养，获得菌株，将其命名为HXC-8。
实施例二、菌株HXC-8的革兰氏染色鉴定
对纯化获得的菌株HXC-8进行革兰氏染色法鉴定，鉴定结果显示其呈红色短杆状，因此判定其为革兰氏阴性短杆菌。具体鉴定步骤如下：
(1)用接种环挑取圆形半透明的乳白色鼻涕状单个菌落中的少许菌，均匀涂布在滴无菌水的载玻片上；同时，挑取枯草芽孢杆菌少许，涂布在同一滴无菌水中，作为对照；将菌涂布均匀，自然干燥后，在酒精灯上过火2-3次以固定；
(2)滴加结晶紫染液染色1～2min，以细水流洗去染液，用滤纸吸去残水；
(3)用碘液媒染1min，水洗；
(4)用滤纸吸去残水，将玻片倾斜，在白色背景下用滴管流加95％的乙醇脱色20～30s，直至流出的乙醇无色，立即水洗；
(5)用番红染液染色1min，水洗；
(6)干燥后进行镜检，镜检结果显示，贪铜菌为短杆菌、革兰氏阴性菌(红色)，枯草芽孢杆菌为长杆状、革兰氏阳性菌(紫色)，如图1所示。
实施例三、菌株HXC-8的16S rDNA测序鉴定
1.基因组DNA提取
1)在酒精灯火焰旁取培养基上的菌株于研钵，液氮研磨。
2)将研磨好的菌至1.5ml离心管中，标记菌株名称，加入0.6mL TE(pH 8.0)，用枪头吸打均匀，使菌体充分悬浮。
3)加入250μL 10％SDS，轻轻倒转混匀。
4)加入3μL蛋白酶K(20ng/μL)，轻轻混匀，37℃水浴1h。
5)加入150μL 5mol/L NaCl，轻轻混匀。
6)加入150μL 2％CTAB，轻轻混匀，65℃水浴20min。
7)12000rpm常温离心20min。
8)小心吸取上清至新的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30min， 12000rpm，4℃离心10min。
9)吸掉上清，在吸水纸上控干液体，加750μL 70％乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，12000rpm，4℃离心2min。
10)每管加入30μl纯化水溶解沉淀(水中加Rnase，终浓度10ng/μl)，用手轻弹管壁， 4℃溶解过夜。
2.DNA电泳检测
3.PCR扩增
16s引物序列：
Primer1(27f)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
Primer2(1492R)：TACGGYTACCTTGTTACGACTT
反应体系：
H2O 17.8μL；Buffer 3μL；dNTP 2μL；Primer1 3μL；Primer2 3μL；DNA模板1μL；酶0.2μL；总体积30μL。
反应条件：
1.95℃5min
2.95℃30sec；55℃30sec；72℃1min；35cycle
3.72℃10min
4.12℃forever 4.电泳PCR产物鉴定
5.上机测序，输出峰图。
6.结果
(1)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图片
电泳条件：3μL样品+1％琼脂糖凝胶，Marker条带组成：100bp，250bp，500bp，750bp， 1000bp，2000bp，3000bp，5000bp。750bp条带浓度为60ng/3μL，显示为加亮带，其余条带浓度均为30ng/3μL。电泳方向从下向上。
(2)基因序列
菌株HXC-8的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
(3)Blast结果
根据blast结果，所述菌株HXC-8与贪铜菌属(Cupriavdus sp.)HBU52001亲源关系最近，因此，判定菌株为属(Cupriavdus sp.)菌株，其全称为贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，将贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO:60632。
实施例四、贪铜菌HXC-8的生理生化特性
1.H2O2酶活性测定
如图2所示，将所述的贪铜菌HXC-8菌株接种于YMA固体培养基上，28℃培养3d，取1ml3％H2O2滴在菌苔上，每个处理三个重复；若在5min内出现气泡为阳性，反则为阴性。结果显示，加入H2O2快速产生较多气泡，表明贪铜菌HXC-8H2O2酶活性较高。
2.刚果红实验
刚果红实验用于检测细胞表面成分中是否含纤维素。刚果红能将纤维素染成红色复合物，故菌落变红，为阳性反应，显示细胞表面有纤维素；菌落颜色不变，则为阴性反应，细胞表面无或少纤维素。将所述的贪铜菌HXC-8接种于刚果红培养基上，28℃培养3d，每个处理三个重复。刚果红染色反应显示所述的贪铜菌HXC-8菌落颜色由白色变为红色，吸收了刚果红染料，表明细胞表面成分中纤维素的含量较多，如图3所示。
3.MR实验
MR实验可检测贪铜菌HXC-8是否产生有机酸。微生物在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基变成酸性，其pH下降至4.2或更低，使加入到培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2)或不变色(仍为黄色)。变为红色的现象称为甲基红实验阳性反应，如果仍为黄色，则为甲基红实验阴性反应。甲基红的变色范围为pH4.2(红色)至pH6.3(黄色)。具体方法：将贪铜菌HXC-8 接种于甲基红培养基上，28℃培养3d，每个处理3个重复。MR反应显示，贪铜菌HXC-8菌落仍为黄色，表明贪铜菌HXC-8在糖代谢过程中，丙酮酸没有进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，如图4所示。
4.水解淀粉实验
水解淀粉实验可检测贪铜菌HXC-8中淀粉酶的活性。淀粉酶使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，遇碘液不变蓝色，并且在培养基上会形成透明圈。如果出现透明圈，则为阳性反应；无透明圈则为阴性反应。具体方法：将贪铜菌HXC-8接种于淀粉培养基上，28℃培养3d，每个处理三个重复，滴加适量碘液，观察结果。水解淀粉实验显示贪铜菌HXC-8菌落上出现白色透明圈，表明贪铜菌HXC-8含有淀粉酶且活性较高，如图5所示。
5.肉汁实验
检测所述的贪铜菌HXC-8在肉汁蛋白胨上的生长情况。将所述的贪铜菌HXC-8接种于肉汁蛋白胨生长培养基上，28℃培养3d，每个处理三个重复，观察结果。肉汁实验显示所述的贪铜菌HXC-8培养基很澄清，菌落很少几乎是无增殖，表明所述的贪铜菌HXC-8不适合在肉汁培养基上生长，如图6所示。
6.BTB实验
检测该菌是否产生酸性物质。BTB是一元有机弱酸，可表示为HIn，在酸性溶液里，分子HIn是其存在的主要形式，使溶液呈黄色；在碱性溶液里，离子In-是其存在的主要形式，故溶液呈蓝色。具体方法：将所述的贪铜菌HXC-8接种在含0.5％的溴麝香草酚蓝的YMA培养基上，置于28℃的恒温培养箱中培养3d，每个处理三个重复；观察结果。BTB实验显示，所述的贪铜菌HXC-8的培养基变为黄色，显示在生长过程中产生酸性物质(图7)。
综上可知，所述的贪铜菌HXC-8H2O2酶活性较高；刚果红染色反应阳性(细胞表面纤维素含量较多)；MR实验阴性，即代谢中其丙酮酸没有进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等；菌体中含有淀粉酶且活性较高；贪铜菌HXC-8不适合在肉汁培养基上生长；在生长过程中产生了一定的酸性物质。
实施例五、贪铜菌菌剂对受Cu2+污染的含羞草种子萌发和幼苗生长的促生作用
1.贪铜菌菌剂的制备
将贪铜菌HXC-8菌株在无菌条件下，接种于YMA液体培养基中，与未接种菌种的无菌 YMA液体培养基(空白对照)一起，置于175r/min、28℃条件下进行摇床培养，并在6h后，每隔2h测定一次其OD值(波长600)，每次测定三个重复值，取其平均值，绘制其吸光度变化曲线。
测得该贪铜菌HXC-8的生长对数期为16-22h。将贪铜菌HXC-8对数期的培养液取100ml，于10000r/min、4℃条件下进行低温超速离心3min，去上清，加入少量无菌水，再次在10000r/min、4℃下离心8min，去上清，将离心管壁上的混合菌种用无菌水冲洗下来，配置成100ml的贪铜菌菌剂。
2.含羞草种子的采集与染菌过程
于秋季采集饱满、成熟、大小相近的野生含羞草种子，用95％的酒精浸泡7min用0.1％HgCl2溶液消毒5min，再在用0.1％HgCl2溶液浸泡5min；在无菌条件下用无菌水冲洗5次，用经过灭菌的吸水纸吸干残水，破除休眠(在含羞草种子外种皮近种脐处剪(或扎)一个小口)。
将含羞草种子置于贪铜菌的菌剂中浸泡6h，空白对照组在无菌水中浸泡6h，浸泡过程中，菌悬液以刚好没过种子为宜，浸种后自然阴干1h，备用。
3.重金属铜溶液浓度的分组
配置浓度分别为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、800mg/L的CuCl2溶液，并与植物营养液按1:1的比例充分混匀，得到最终浓度为0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L的重金属Cu2+的混合培养液，以模拟受重金属Cu2+污染的土壤。设置4个重复，每个重复30粒含羞草种子。
4.含羞草种子的播种
用吸水纸和培养皿制成的含羞草种子及幼苗培养环境，用Cu2+混合培养液浸湿并刚好没过滤纸，模拟重金属污染土壤环境，来培养含羞草种子，每两天更换一次吸水纸与培养液。将培养皿置于RXZ型(多段编程)智能人工气候箱中进行培养，培养条件为光照10h/d，温度28℃、相对湿度50％、通气良好。
5.含羞草种子萌发和幼苗生长状况的测定
(1)萌发率每隔24h观察并记录含羞草种子的萌发情况，直至无种子继续萌发为止(萌发标准：胚芽突破种皮)。发芽率＝发芽数/种子数
(2)幼苗生长待含羞草种子基本萌发后持续培养7d以上后，将幼苗的根、茎分离，用量尺测量幼苗的根长、茎长(不计子叶长度)，用电子天平称量幼苗的根鲜重和茎鲜重(包括子叶)，得出幼苗生物量，计算平均值，得出含羞草幼苗的生长指标(根长、茎长、生物量)。
(3)耐受性指数耐受性指数常被用于综合测评植物对重金属处理的反应。
耐性指数＝重金属处理组的植物性状/无重金属处理的植物性状
当耐性指数大于0.5时，表明该植物对重金属具有较强的耐性，生长较好，耐性指数越高，其耐性就越强；当耐性指数小于0.5时，则说明该重金属对这种植物的毒害作用明显，植株在该浓度下的重金属难以或者不能生长。
6.实验结果
(1)贪铜菌菌剂有效提高受Cu2+污染的种子萌发率。
如图8所示，Cu2+浓度0-200mg·L-1时，接菌对萌发率影响不明显；在Cu2+浓度为250mg·L-1和300mg·L-1时，接种贪铜菌的种子萌发率显著高于无接种贪铜菌。具体指数：种子未受Cu2+污染时，萌发率为96-100％；Cu2+污染为250mg·L-1和300mg·L-1时，没有接种菌剂的种子的萌发率分别降低至52.5％(SD±11)和51.6％(SD±7.6)；种子转染该贪铜菌菌剂后，萌发率分别提高至84.2％(SD±11)和84.0％(SD±14)，提高了1.60倍和1.63倍；种子萌发对Cu2+污染的耐受性指数由接菌前的0.62(250mg·L-1)和0.51(300mg·L-1)分别提高至0.88和0.87。因此，接菌能够有效减缓重金属铜污染对种子的影响，提高含羞草种子萌发率。在Cu2+为400mg·L-1时，接菌组和无接菌的种子萌发率均大幅增长，可能是含羞草在此浓度出现对重金属铜产生抗逆性，具有促生作用。
(2)贪铜菌菌剂有效促进含羞草幼苗的生长
如图9所示，没有接种菌剂的幼苗在未受铜污染时根长为11mm，随Cu2+污染浓度的增大，根长减小至3.5mm(250mg·L-1Cu2+污染)。转染贪铜菌菌剂能促进根的生长，但作用较小，在100mg·L-1、150mg·L-1、250mg·L-1铜污染下，贪铜菌菌剂分别使根增长了1.23、1.19、 1.31倍。
然而，贪铜菌菌剂能够增大茎生长对Cu2+的耐受性，有效促进幼苗生长。如图10所示，没有接种菌剂的幼苗在未受Cu2+污染时，茎长为7.9mm，当Cu2+污染增大至200mg·L-1时，茎长降至4.3mm；Cu2+污染浓度增大至250-300mg·L-1时，茎停止生长(0mm)；当转染贪铜菌菌剂后，茎长度显著增大至1.45mm(250mg·L-1)、2.84mm(300mg·L-1)、8.0mm(400mg·L-1)。染菌剂的幼苗茎生长对Cu2+出现耐受性，耐受性指数由0.56增长到1.03(150mg·L-1)，由0增长至0.17和0.33(250-300mg·L-1)，由0.36增长至0.94(400mg·L-1)。显示该贪铜菌能有效减缓Cu2+污染对幼苗生长的胁迫，增强含羞草在铜浓度为150-400mg·L-1时对铜的耐受性，促进植物生长。
(3)贪铜菌菌剂有效促进含羞草幼苗生物量的增加
如图11所示，没有接种菌剂的幼苗在未受Cu2+污染时，生物量为18.5mg，Cu2+浓度为 250mg·L-1、300mg·L-1、400mg·L-1时，幼苗生物量下降至1.48mg、2.15mg、5.22mg；经转染贪铜菌后，幼苗生物量分别增大至4.36mg、6.16mg、16.32mg，即染菌能使含羞草幼苗生物量增大约3倍，减缓Cu2+胁迫，利于幼苗生长中物质积累量，促进含羞草幼苗生长。经转染贪铜菌菌剂后，幼苗生物量累积对Cu2+的耐受性指数由0.34增大至0.95(150mg·L-1)、由0.08增大至0.23(250mg·L-1)、由0.11增大至0.32(300mg·L-1)、由0.28增大至0.87(400mg·L-1)。表明幼苗生长过程中，贪铜菌菌剂能有效减缓Cu2+对幼苗生长的胁迫、促进物质积累和幼苗生长。
实施例六、贪铜菌对重金属Cu2+的吸附和去除作用
1供试菌种
贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8
2研究方法
(1)激活贪铜菌：
首先将贪铜菌菌株在固体YMA培养基上划线进行接种，然后在温度条件为28℃的培养箱里培养3d至菌苔丰满。
(2)制备贪铜菌菌悬液：
在培养丰满的菌苔里用接种环挑选一环菌落于80mL YMA的液体培养基中(250mL锥形瓶)，并用摇床(转速为120r/min，温度为28℃)充分振荡15h，得到菌悬液。
(3)对重金属Cu2+的最高耐受浓度测定
配置重金属Cu2+浓度为(mmol/L)：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6的YMA固体培养基，备用。
取1mL步骤(2)制备获得的菌悬液分别滴加到含有上述重金属浓度的YMA固体培养基中涂布培养，每4h观察一次菌落生长情况。以此验证最大MIC值。
(4)重金属离子去除率的测定
①铜胁迫下贪铜菌菌悬液的制备：将菌悬液分别加入到100mL含重金属的液体培养基中 (重金属浓度为：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mmol/L)，摇床培养(转速为120r/min，温度为28℃)，培养24h。
②铜标准母液的制备(100μg/ml)：准确称取0.390g五水硫酸铜，用1％硝酸定容于1000ml 容量瓶，混匀。即配成100ug/ml的母液。
铜标准储备液的制备：根据仪器的可测范围(0-2.5μg/mL)，将母液用1％硝酸分别稀释250 倍、200倍、125倍、100倍、50倍、40倍，即分别得到0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的铜标准储备液，并分别取出7mL的标准储备液于离心管。(离心管使用之前先用10％的硝酸浸泡12―24小时，用清水冲洗，再用去离子水润洗备用)。
③样液的稀释：将培养24h(稳定期)不同浓度的重金属(铜)菌培养液取出，以0.45μm 的微滤膜过滤。由于火焰原子吸收光谱仪测定铜的范围是0-2.5μg/mL，菌液中Cu2+浓度是0-0.6mmol/L，故将菌液缩小16倍，制成样液。
④铜含量的测定：将标准溶液放入火焰原子吸收光谱仪进行测定铜的含量及绘制出标准曲线。将配置好的样液在火焰原子吸收光谱仪测定OD值。
根据测定得到的标准曲线获得标准曲线公式为：y＝0.0121x+0.0019，根据标准曲线公式及测出的吸光度，计算出24h后Cu2+浓度，并利用以下公式计算出HXC-8对Cu2+的去除率：
3结果
由实验可知，Cu2+浓度为0.2mmol/L时，贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌株生长较好，20h后菌落量达到90％以上。Cu2+浓度为0.4和0.6mmol/L时，培养20-24h，该菌生长缓慢，菌落量仅为10％；培养28-32h，菌落逐渐增多，菌落量为15％；40h时菌落数量增多，为50％。当Cu2+浓度为0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L时，贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8 菌株不生长。因而，贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌株对Cu2+的最高耐受浓度为0.6mmol/ L(图12)。
由计算结果可知，贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8菌株在Cu2+浓度为0.1-0.6mmol/L范围内，随着Cu2+浓度的增大，去除率逐渐降低，且最大去除率可达到97.94％(图13)。现有技术公开去除率大于30％为有效去除率。因而，贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8能够有效去除环境中的铜离子，最大去除率为97.94％。
综上所述，本发明所请求保护的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8制备的菌剂能够耐受一定浓度的铜污染，能够显著解除铜污染，解除部分对受铜污染的含羞草种子，促进种子萌发，使萌发率提高；促进含羞草幼苗生长和生物量积累。同时，本发明所请求保护的贪铜菌 (Cupriavdus sp.)HXC-8菌株能够有效去除环境中的铜离子。
序列表
<110> 韩山师范学院
<120> 一株耐重金属的贪铜菌及菌剂制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> 贪铜菌(cupriavdus sp.)
<400> 1
ggttggcggc tgcttaacat gcagtcggac ggcagcgcgg gcttcggcct ggcggcgagt 60
ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt gtcctggagt gggggatagc ccggcgaaag 120
ccggattaat accgcatacg ctctgaggag gaaagcgggg gatcttcgga cctcgcgctc 180
aaggggcggc cgatggcaga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat 240
ctgtagctgg tctgagagga cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300
acgggaggca gcagtgggga attttggaca atgggggcaa ccctgatcca gcaatgccgc 360
gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cacttttgtc cggaaagaaa acttcgccgc 420
caataccggt ggaggatgac ggtaccggaa gaataagcac cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca 540
ggcggttcgc taagaccgat gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg cattggtgac 600
tggcgggcta gagtatggca gaggggggta gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag 660
agatgtggag gaataccgat ggcgaaggca gccccctggg ccaatactga cgctcatgca 720
cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc 780
aactagttgt cgggtcttca ttgacttggt aacgtagcta acgcgtgaag ttgaccgcct 840
ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg 900
gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgtacgga 960
accttgccga gaggtgaggg tgcccgaaag ggagccgtaa cacaggtgct gcatggctgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtccct 1080
agttgctacg caagagcact ctagggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaag tcctcatggc ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggaa 1200
cagagggttg ccaagccgcg aggtggagcc aatcccagaa aaccgatcgt agtccggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggtttta 1380
ccagaagtgg ctagtctaac cgcaaggagg acggtcacca cggtagatcg tgc 1433

Claims (7)

1.一株耐重金属的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8，其特征在于，所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO:60632。
2.一种贪铜菌菌剂，其特征在于，所述的贪铜菌菌剂含有如权利要求1所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8。
3.一种如权利要求2所述的贪铜菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：取对数期的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8培养液，低温离心，去上清，加入无菌水，离心，去上清，将离心管壁上的混合菌种用无菌水冲洗下来，配置成贪铜菌菌剂。
4.如权利要求2所述的贪铜菌菌剂在提高受Cu2+污染种子的萌发率中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的种子为豆科植物含羞草种子。
6.如权利要求2所述的贪铜菌菌剂在促进受Cu2+污染幼苗生长中的应用。
7.如权利要求1所述的贪铜菌(Cupriavdus sp.)HXC-8在制备Cu2+污染土壤修复制剂中的应用。
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