CN110623860B - 有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物,是将质量体积浓度为1~10%、pH5~7的大鲵活性肽溶液与玻尿酸按质量比为1~8:1混合而成,所述大鲵活性肽分子量小于2000Da,所含赖氨酸与精氨酸的摩尔百分比分别为7.2%和9.7%,所述玻尿酸的分子量为42.5~145kDa。大鲵活性肽可以通过氢键与富含多个羟基的玻尿酸发生天然交联,利用玻尿酸与人体皮肤细胞的天然亲和性,可有效提高促进皮肤纤维原细胞增殖作用,在医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于护肤品技术领域,尤其是一种有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物。
背景技术
生物活性肽主要是利用酶对蛋白质进行酶解的产物,采用不同的酶及酶解方法对同一来源的蛋白质进行酶解,其酶解产物亦会因结构不同而具有不同生物活性。付静等研究了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme、Protamex及Alcalase等5种酶酶解大鲵肉5h的肽得率,发现Protamex酶解大鲵肉所获得的肽得率最高,为13.75%,该酶酶解大鲵肉的最佳条件为料液比1:35、温度60℃及酶解时间7h(付静,陈德经,曹米娜. 大鲵多肽制备工艺的研究[J]. 食品科技,2012, 37(2):66-68, 72)。刘欣等研究了用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶(1:3(g/g))酶解大鲵肉,发现最佳条件为料液比1:7、温度55℃、pH7.5及酶解时间5h,肽得率达36.18%(刘欣,曲朝霞,黄石溪,等. 饲养大鲵蛋白水解工艺研究[J]. 食品科技,2012,37(2):82-88)。王文莉等对利用Aspergillus sp.酸性蛋白酶酶解大鲵肉进行了详细的单因素和正交试验研究(王文莉, 张伟, 于新莹, 等. 大鲵肉酶解产物的制备及其抗氧化性的研究[J]. 河北渔业, 2012, (9):1-4)。可见同为大鲵肉,不同的酶及酶解方法所得大鲵肽的得率、结构、分子量及活性均有所不同。
中国发明专利号ZL201610314751.X公开了一种“大鲵活性肽及用途”,其大鲵活性肽是按照如下步骤制备:
a . 将大鲵肉匀浆,向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0 .01~0 .1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0 .1~1%的复合酶,酶解12~48 h;所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合;
b . 离心取上清,采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离,取透过超滤膜的液体;
c . 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱,按每管1ml收集层析产物,取第30~36管层析产物进行冷冻干燥;
d.将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液,8000 rpm、4℃条件下离心10 min,用0 .22 μm水膜过滤,得到上清液;
e . 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液,通过孔径0 .45 μm水膜抽滤,通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A,使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液,通过孔径0 .45 μm油膜抽滤,通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B;使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱,洗脱条件:流速为1ml/min,洗脱梯度分配:0~20min,流动相A100%;20 .5~40min,流动相A50%,流动相B50%;40 .5~60min,流动相B100%;将上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口,收集紫外检测波长280 nm的吸收峰;
f . 挥发收集物中的甲醇后,真空冷冻干燥,得到大鲵肽制品。
所制备的大鲵活性肽具有促进皮肤纤维原细胞增殖的作用。
玻尿酸因其具有较好的保水作用,已经成为重要的皮肤友好型的化妆品原料,被广泛添加于面膜、乳液、膏霜和化妆水中。同时,已研制出多种玻尿酸的组合物。中国发明专利号ZL201380080735.3公开了一种“通过胶原蛋白和玻尿酸的天然交联强化其橡胶性质物性的生体材料物质及其制造方法和使用方法”,是将胶原蛋白和玻尿酸混合,通过提供考虑到胶原蛋白和玻尿酸的分子结构特性的最佳混合比率以及非化学性或物理***联的天然交联条件,制造呈现出橡胶特性的全新物质,借此大幅度提升产品的品质和可靠性。中国发明专利ZL201410718100.8公开了一种“一种干细胞与玻尿酸的组合物与应用”,是将间充质干细胞与玻尿酸的组合物,以同时具备玻尿酸的快速起效和干细胞持续时间长的优点。
但是,迄今为止并没有将大鲵活性肽溶液与玻尿酸进行组合,以提高促进纤维原细胞增殖作用的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物。
本发明的技术解决方案是:一种有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物,其特征在于是将质量体积浓度为1~10%、pH5~7的大鲵活性肽溶液与玻尿酸按质量比为1~8:1混合而成,所述大鲵活性肽分子量小于2000Da,所含赖氨酸与精氨酸的摩尔百分比分别为7.2%和9.7%,所述玻尿酸的分子量为42.5~145kDa。
所述大鲵活性肽按如下步骤制备:
a. 将大鲵肉匀浆,向匀浆中加入1~4倍体积pH 4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.5~10%的复合酶,在超声频率15~25 kHz、温度30~60℃条件下,酶解1~12h;所述复合酶为海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶按活力单位比为4:3:2:1混合而成;
b. 将酶解液离心取上清,采用截留分子量为2000 Da的超滤膜分离器分离,取透过超滤膜的液体;
c. 将得到的液体按照1g:10mL比例加入大孔吸附树脂DA201中,调pH为5~8,以150r/min室温震荡6~12h后,加入体积浓度为60~95%的乙醇,再以150r/min室温震荡6~24h进行解析,得到解析液;
d. 将解析液进行透析,冷冻干燥,得到大鲵活性肽。
本发明是以大鲵肉为原料,通过海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.、胃蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解,酶解产物通过超滤膜分离器进行分离,再通过大孔吸附树脂DA201纯化后得到的大鲵活性肽,在体积浓度为1~10%、pH为5~7条件下与玻尿酸进行混合,得到一种大鲵活性肽与玻尿酸的组合物。大鲵活性肽分子量均小于2000Da,且具有较高含量的带有正电荷的赖氨酸与精氨酸残基,可以通过氢键与富含多个羟基的玻尿酸发生天然交联,利用玻尿酸与人体皮肤细胞的天然亲和性,可有效提高促进皮肤纤维原细胞增殖作用,在医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例组合物的电子显微镜照片。
图2是本发明实施例组合物的红外光谱图。
图3是本发明实施例的组合物200μg/mL与纤维原细胞共同培养36h的显微镜照片。
图4是本发明实施例纤维原细胞单独培养36h的显微镜照片。
具体实施方式
本发明的有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物,是将质量体积浓度为8%、pH6的大鲵活性肽溶液与玻尿酸按质量比为5:1混合而成,大鲵活性肽分子量小于2000Da,所含赖氨酸与精氨酸的摩尔百分比分别为7.2%和9.7%,玻尿酸的分子量为80kDa。所述质量体积浓度为8%、pH6的大鲵活性肽溶液是将大鲵活性肽加水配成质量体积8%(w/v)的大鲵活性肽溶液,用稀盐酸调整pH为6。
大鲵活性肽按如下步骤制备:
a. 将大鲵肉匀浆,向匀浆中加入2倍体积pH 4的0.05M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为5%的复合酶,在超声频率20kHz、温度50℃条件下,酶解8h;所述复合酶为3500u/mg海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.、6000u/mg胃蛋白酶、6000u/mg风味蛋白酶、6000u/mg木瓜蛋白酶按活力单位比为4:3:2:1混合而成; 海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.、胃蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶均为外购。
b. 将酶解液离心取上清,采用截留分子量为2000 Da的超滤膜分离器分离,取透过超滤膜的液体;
c. 将得到的液体按照1g:10mL比例加入处理好的大孔吸附树脂DA201中,调pH为6,以150r/min室温震荡8h后,加入体积浓度为85%的乙醇,再以150r/min室温震荡20h进行解析,得到解析液;
d. 将解析液进行透析,冷冻干燥,得到大鲵活性肽。
对所得大鲵活性肽按照现有技术的方法进行检测,其分子量小于2000 Da,所含赖氨酸与精氨酸的摩尔百分比分别为7.2%和9.7%。可对本发明实施例进行冷冻干燥后进行粉末化处理,制成粉剂、喷剂,应用于制备促进皮肤纤维原细胞增殖产品。
将本发明实施例组合物制成粉剂后的电子显微镜照片、红外光谱图分别如图1、图2所示,从图1可以看出实施例组合物表现出自然交联形成的结构。图2表明本发明实施例组合物红外光谱图与典型的玻尿酸红外光谱图相比,已经发生了很大的变化。
实验:
本发明实施例的组合物促进小鼠皮肤的纤维原细胞增殖作用
来自于Balb/c 小鼠皮肤的纤维原细胞制成悬浮液(5×103个细胞/孔)接种于96孔培养板中,其中部分孔中加入本发明实施例组合物(大鲵活性肽与玻尿酸的组合物)冻干粉溶液、大鲵活性肽冻干粉溶液、玻尿酸溶液,使最终浓度均分别为2、20、200 µg/ml。于37℃ 5% CO2培养箱中分别培养36 h后,每孔加入10 μl 四唑溶液(细胞计数试剂盒kit-8),混匀后,在培养箱中继续孵育2 h,测定其在450 nm处的吸光值。
本发明实施例组合物冻干粉溶液是将本发明实施例组合物制成冻干粉后再溶于无血清培养基中制成2µg/ml、20µg/ml、200 µg/ml不同浓度。
大鲵活性肽冻干粉溶液是将本发明大鲵活性肽冻干粉溶于无血清培养基中制成2µg/ml、20µg/ml、200 µg/ml不同浓度。
所用玻尿酸溶液是将玻尿酸溶于加入无血清培养基中,制成2µg/ml、20µg/ml、200µg/ml不同浓度。
结果如表1所示。结果表明小鼠皮肤的纤维原细胞随着本发明组合物、大鲵活性肽及玻尿酸溶液浓度增加而增加,但是本发明实施例组合物与同等浓度的大鲵活性肽或玻尿酸溶液相比,具有显著促进小鼠皮肤的纤维原细胞增殖作用(表1)。
表1
本发明实施例的组合物200μg/mL与纤维原细胞共同培养36h的显微镜照片如图3所示。本发明实施例纤维原细胞单独培养36h的显微镜照片如图4所示。通过对比,亦可以看出本发明实施例组合物具有显著促进小鼠皮肤的纤维原细胞增殖作用。
Claims (1)
1.一种有效促进纤维原细胞增殖的大鲵活性肽与玻尿酸组合物,其特征在于是将质量体积浓度为8%、pH6的大鲵活性肽溶液与玻尿酸按质量比为5:1混合而成,所述大鲵活性肽分子量小于2000Da,所含赖氨酸与精氨酸的摩尔百分比分别为7.2%和9.7%,玻尿酸的分子量为80kDa,所述赖氨酸与精氨酸残基通过氢键与富含多个羟基的玻尿酸发生天然交联,具有自然交联形成的结构;
所述大鲵活性肽按如下步骤制备:
a. 将大鲵肉匀浆,向匀浆中加入2倍体积pH 4的0.05M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为5%的复合酶,在超声频率20kHz、温度50℃条件下,酶解8h;所述复合酶为3500u/mg海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.、6000u/mg胃蛋白酶、6000u/mg风味蛋白酶、6000u/mg木瓜蛋白酶按活力单位比为4:3:2:1混合而成;
b. 将酶解液离心取上清,采用截留分子量为2000 Da的超滤膜分离器分离,取透过超滤膜的液体;
c. 将得到的液体按照1g:10mL比例加入处理好的大孔吸附树脂DA201中,调pH为6,以150r/min室温震荡8h后,加入体积浓度为85%的乙醇,再以150r/min室温震荡20h进行解析,得到解析液;
d. 将解析液进行透析,冷冻干燥,得到大鲵活性肽。
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