CN110616235A - 一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本产品涉及一种利用维斯假丝酵母生物法合成生产长链十三碳二元酸的方法，包括以下步骤：种子培养阶段、发酵培养阶段与十三碳二元酸分离回收阶段，所述维斯假丝酵母的保藏号CCTCC M No.2019074。其中，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。本发明方法生产的正十三碳二元酸具有令人满意的结晶形态，更容易满足欧洲无尘化、低粉尘产品出口要求；而且特别适合作为高级润滑油、高级轿车喷涂材料的原料加工利用。

Description

一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法及产品与菌种。
背景技术
长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸，一般指直链二元酸。麝香酮是天然麝香中具有生理活性的主要有效成分之一，可以代替天然麝香配制成多种名贵的中成药，具有抗菌消炎、通经活血等疗效。用混合二元酸与乙二醇酯制成的麝香-M，为生产高级香料提供了新原料和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。以十三碳二元酸(DC13)为原料合成的麝香-T，可做定香剂。
我国的石油轻蜡中除了含有十二碳正构烷烃外，还含有将近25％的十三碳正构烷烃，开发利用十三碳正构烷烃，把它们转化为高附加值的尼龙1313，不仅本身具有重大的经济意义，而且也开发了一种新型的长碳链尼龙新品种，巩固了我国在长碳链尼龙新品种开发方面的优势，可进一步突破国外在这一领域的材料和技术垄断。尼龙1313与尼龙11和尼龙12相比，碳链更长，柔韧性更好，吸水率更低，加工性能更优。除在原有的长碳链尼龙应用领域使用外，在精密机械和电子电气零部件等领域也可使用。
此外，十三碳二元酸还是润滑油添加剂和耐寒性增塑剂等的重要原料；酯类润滑油基础油的分子结构容易控制，不同结构对润滑油基础油的相应指标影响比较明显。酯类润滑油分子量越大，闪点越高；支链越多，倾点越低；支链增加，粘度指数提高。因此从一元醇和长链十三碳二元酸合成优良润滑油基础油，例如以十三碳二元酸与与带支链的脂肪族一元醇直接酯化获得双酯型化合物，其凝点不高于20℃，闪点不低于210℃，通常40℃时运动粘度为10-100mm2/s，粘度指数不低于130，不同产品之间互溶性好，作为润滑油基础油能够满足绝大部分高温或低温条件下的使用要求。与普通的矿物油相比，酯类润滑油具有更加优良的黏温性和低温性，挥发率低，化学性能稳定，可降解，可再生，抗燃性好，被广泛用于航空发动机润滑油、高温链条油、压缩机油、高档汽车发动机油、精密仪表油、金属切割液等各个高端领域。
十三碳二元酸可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂；生产时需要防火、防爆和防毒装置，收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单，常温常压下就能生产，无污染、收率高，具备成本优势。然而，生物法合成十三碳二元酸的现有方法中，依然存在发酵水平不高，产品纯度达不到制备长链二元酸酯的要求，特别是二元酸产品中由于发酵菌株α，ω-氧化位点的不同，会产生一定含量的一元酸杂质，此外现有技术的发酵方法结果为：70小时后每天补加一定量nC13，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达235.8g/L，发酵到163小时结束，产酸量达265g/L，但上述方法操作步骤较为复杂，且并没有缩短整个发酵周期，占用生产设备时间较长，不能解决二元酸工业化难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法及产品与菌种，该方法是基于以下发现：通过在含烷烃(生产使用废弃石蜡油)废渣中以基因高通量筛选结合特定化学诱变方法，筛选出一株维斯假丝酵母(Candida viswanathiiws-1301，保藏号CCTCC M No.2019074，保藏日期为2019年1月23日，保藏地点为武汉大学，中国典型培养物保藏中心)，其一方面能保持现有高水平发酵生产DC13的能力或略有提高，又极大地缩短了发酵生产DC13的发酵时间，使得维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的工业化成为可能。该菌株发酵并使用本发明的精制方法获得产品十三碳二元酸，形态为具有较为紧密结晶体的结构，大大减少了粉末程度的同时，减少了产品包装尺寸，使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求的同时，更利于长途集装箱的运输并减少货柜装量。
维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)的培养特征如下：
原料包括碳源的混合物，包含一种或多种选自糖、纤维素、烷烃、脂肪酸、三酰甘油、石蜡等或它们的组合的碳源。氮可自无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，脲或谷氨酸)供应。除合适的碳源和氮源外，培养基还可含有适合微生物培养的适当矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素、金属离子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)和其他组分。或使用酵母复合培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖肉汤(YPD))或其他可商品化制备的(如酵母氮基料(DIFCO Laboratories,Detroit,Mich.)通用酵母培养基中培养维斯假丝酵母。在本发明的一个优选斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基。液体发酵培养基包括：碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L,钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。
发明所述的发酵转化正十三烷(nC13)生产十三碳二元酸(DC13)的方法是以热带假丝酵母维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)为发酵菌种，在以正十三烷(nC13)为基质的发酵培养基中同步发酵，生产α，ω-正十三碳二元酸。
发明所述的发酵转化正十三烷(nC13)生产十三碳二元酸(DC13)的方法的步骤为：
第一阶段为维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)的种子培养，即将维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)接入发酵培养基，28～29℃220转/分的旋转摇床上培养40～48小时，菌株生长OD值达到0.6～0.85时，作为发酵液的种子。应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到OD值达到0.6～0.85，作为发酵液的种子即可。
第二阶段为维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)的发酵产酸阶段，即将培养成的种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)11个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中。所述混合液24～29℃转化48～52小时，然后将生产的十三碳二元酸进行分离纯化。更优选地，所述混合液在pH 6.0～7.5下24～29℃下转化48～52小时，然后将生产的十三碳二元酸进行分离纯化。更优选地，从24小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
优选地，本发明还包括将发酵液中产物十三碳二元酸分离回收阶段：即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至pH10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC13钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC13钠盐和DC13，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC13白色结晶。
用本发明的维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)菌株和发酵方法，可在工业化发酵罐，从nC13发酵生产DC13时，发酵52小时，产酸量达136g/L以上，生产效率达到2.62g/L·h，转化率达到90％以上，DC13纯度达到99％以上，其中一元酸的含量小于0.01％。
此外，令人意外地，本发明的DC13生产产品具有令人满意的片层状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的DC13产品具有令人满意的结晶状形态并整体较为密实，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，提供了利用生物法合成生产长链十三碳二元酸的方法，包括以下步骤：
(1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301种子培养阶段；
(2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301发酵培养阶段；
(3)发酵液中产物十三碳二元酸分离回收阶段，其中，
所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301的保藏号CCTCC MNo.2019074。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301的种子培养阶段为：将维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301接种至发酵培养基中生产菌体。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl 0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述种子培养阶段为在摇瓶中培养或在种子发酵罐中培养。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301发酵培养阶段为将所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301种子培养阶段获得的种子液在发酵罐中进行产酸培养，所述发酵罐包括底部通气装置与搅拌装置，以及设置于发酵罐中部的烷烃输入装置，所述发酵罐中部包括自发酵罐顶部1/3处至下部1/3处的中间1/3处之间任意位置，可以设置一个或多个烷烃输入口，只要使得烷烃的流入速度保持在本发明实施例所需的特定速率即可；所述底部通气装置的通气量为1:0.5～1:0.7；所述搅拌装置的转速为100～150转/分钟。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)11个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中；所述混合液在pH值为5.5～9.0下、24～29℃转化48～52小时，并从发酵培养第24小时开始，每天补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
优选地，在本发明的一个实施例中，提供了上述方法获得的产品及上述方法使用的菌种维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301。
在本发明的一个实施例中，还包括将发酵液中产物十三碳二元酸分离回收阶段：即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至pH10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC13钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC13钠盐和DC13，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC13白色结晶。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
发酵合成长链二元酸的过程如下：
1、培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖25g/L，磷酸氢二钠6g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
③发酵培养基:葡萄糖40g/L，磷酸氢二钠8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
2、种子培养阶段
取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27℃，250r/min条件下振荡培养48小时，检测菌种OD为0.6～0.85之间。
3、发酵产酸阶段：
将种子液以20％的接种量接种于装5L发酵培养基的10L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十三烷，使发酵液中正十三烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养48h产酸79.1g/L，培养52h时产酸116g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.23g/h·L，转化率93.5％。
其中，DC13回收方法为有机溶剂回收法，发酵结束后，用6N的HCl调节PH至2-3，用120ml***抽提后，蒸去***，得到DC13白色结晶，用15ml中性乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC13纯度98.71％，其中一元酸含量0.016％。
实施例2：
发酵合成长链二元酸的过程如下：
1、培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖25g/L，磷酸氢二钠6g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
③发酵培养基:葡萄糖35g/L，磷酸氢二钠8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温1.5g/L。
2、种子培养阶段
取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27℃，250r/min条件下振荡培养48小时，将培养液以20％的接种量接种于装5L发酵培养基的10L发酵罐中，初始pH 6.0，温度27℃，通气量1∶0.6，发酵罐转速120转/分，检测获得的种子液菌种OD为0.6～0.85之间。
3、发酵产酸阶段：
将获得的种子液以20％的接种量接种于装35L发酵培养基的50L发酵罐中，初始pH7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，发酵24小时以后，通过连续或间歇的方式补加正十三烷，使发酵液中正十三烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养48h产酸88.6g/L，培养52h时产酸115g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.21g/h·L，转化率91.5％。。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC13，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC13产品。DC13纯度达到99.65％，其中一元酸的含量0.005％。
实施例3：
发酵合成长链二元酸的过程如下：
1、培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖25g/L，磷酸氢二钠6g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温0.5g/L。
③发酵培养基:葡萄糖35g/L，磷酸氢二钠8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 1g/L，吐温1.5g/L。
2、种子培养阶段
取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1301)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27℃，250r/min条件下振荡培养48小时，将培养液以20％的接种量接种于装3L发酵培养基的5L发酵罐中，初始pH 6.0，温度27℃，通气量1∶0.6，发酵罐转速120转/分，检测获得的种子液菌种OD为0.6～0.85之间。
将5L发酵罐中的3L种子液接种到装有1.5m3发酵液的2m3发酵罐中，初始pH 6.0，温度27℃，通气量1∶0.6，发酵罐转速120转/分，检测获得的种子液菌种OD为0.6～0.85之间。
3、发酵产酸阶段：
将获得的种子液以20％的接种量接种于装189L发酵培养基的300L发酵罐中，初始pH 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，发酵24小时以后，通过连续或间歇的方式补加正十三烷，使发酵液中正十三烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养48h产酸93.4g/L，培养52h时产酸118.5g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.28g/h·L。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC13，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC13产品。DC13纯度达到99.32％，其中一元酸的含量0.007％。
对比例1
按照专利ZL201710601371.9实施例2所述菌种与方法进行发酵发酵139小时，产酸量达235.8g/L，发酵到163小时结束，产酸量达265g/L.
与本发明相比，对比例1公开的技术方案虽然产酸量高，但平均产酸速率为1.63g/h·L，且发酵周期长达7天，不利于生产周期的压缩。此外通过比较发现本发明的实施例2，实施例3的获得产品晶体更大，产品体积更小。而对比例1获得产品虽然为晶体状，但是相同质量产品本发明实施例2，实施例3的产品包装体积仅为对比例1的50％左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用生物法合成生产长链十三碳二元酸的方法，包括以下步骤：
(1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301种子培养阶段；
(2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301发酵培养阶段；
(3)发酵液中产物十三碳二元酸分离回收阶段，其中，
所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301的保藏号CCTCC M No.2019074。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candida viswanathiiws-1301的种子培养阶段为：将维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301接种至发酵培养基中生产菌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl 0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养阶段为在摇瓶中培养或在种子发酵罐中培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candida viswanathiiws-1301发酵培养阶段为将所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301种子培养阶段获得的种子液在发酵罐中进行产酸培养，所述发酵罐包括底部通气装置与搅拌装置，以及设置于发酵罐中部的烷烃输入装置。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candida viswanathiiws-1301种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)11个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中；所述混合液在pH值为5.5～9.0下、24～29℃转化48～52小时，并从发酵培养第24小时开始，每天补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法获得的产品。
10.根据权利要求1～8任意一项所述的菌种维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1301。
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