CN110616185A - 一种多细胞肿瘤球及其高通量制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多细胞肿瘤球的高通量制备方法，包括如下步骤：S1、将肿瘤细胞的细胞悬液与基底膜基质快速混合均匀，将所得细胞悬液接入低贴附孔板中；S2、之后离心，离心后放入培养箱中培养，培养过程不换液，形成与基底膜基质结合的多细胞肿瘤球。本技术方案采用的添加物质是基底膜基质Matrigel，能促进多细胞肿瘤球的形成和生长，从而促进所形成的多细胞肿瘤球的三维结构；同时采用低贴附孔板，使肿瘤细胞自发聚集成球；并结合对孔板离心后培养，培养过程不换液的步骤设计，利用离心人为增加细胞聚集，使得后续形成的细胞球更加紧密、更具有三维立体结构。从而，使制备的肿瘤球达到直径大小均匀、粒径分布集中的状态。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多细胞肿瘤球及其高通量制备方法。
背景技术
传统的二维培养，细胞呈平面生长，缺乏各种细胞因子的相互作用，无法构建出一个立体的微环境，与体内细胞状态差距巨大。多细胞肿瘤球是紧密的细胞聚集体，与体内实体瘤、无血管的肿瘤结节或毛细血管附近的肿瘤组织结构相似，可以在时间和空间上模拟肿瘤组织的特定细胞群。多细胞肿瘤球是研究肿瘤形成机理和肿瘤耐药研究的理想体外模型。
目前常用的几种多细胞肿瘤球的制备方法有：悬滴法、液体覆盖法、胶原和水凝胶支架法、微载体悬浮法、旋转培养法等。
悬滴法：将细胞悬液滴在倒置的玻璃覆盖物表面上，通过重力形成单个簇，每个液滴大约15-30μL，包含大约300–3000个细胞，每个液滴的微重力环境使细胞集中，在自由液-气界面形成单个球体(L.P.Ferreira,V.M.Gaspar.Design of spherically structured3D in vitro tumor models-Advances and prospects.Acta Biomaterialia.2018,75(15):11-34.)。但是其缺陷在于：悬滴法由于培养液体积少(5-20μL)，蒸发的存在使得细胞培养的微环境很难长时间维持，并且后续肿瘤球体的分离和纯化也存在一定困难，重复性比较差。需要经常更换介质，非常耗时耗力。
液体覆盖法：在非贴附孔板里培养细胞球，防止粘附到培养物板表面。细胞类型、接种密度、培养基组成、静态或搅拌生长等培养参数决定了细胞的聚集效率和球形大小及形状的均匀性。这种方法生成的细胞球通常具有较宽的尺寸分布(Chatzinikolaidou,M.Cell spheroids:The new frontiers in in vitro models for cancer drugvalidation.Drug Discovery Today,2016,21(9):1553–1560.)。但是液体覆盖法的缺陷在于：操作相对简单，但是影响因素较多，不容易控制细胞球的生长状态，可能会导致不可重复。培养过程为静态，长期培养时代谢物可能对细胞迁移及活性产生影响。
支架法：多孔三维支架为细胞自组装提供了物理支持。支架分为天然材料和合成材料。细胞吸附、迁移到在固体材料内，形成微组织。支架法的选择很大程度上取决于材料的可用性，生物降解性和生物相容性等特性是考虑的主要因素(Chung,T.W.,Moon,S.K.,Lee,Y.C.,Kim,J.G.et al.,Preparation of alginate/galactosylated chitosanscaffold for hepatocyte attachment.Biomaterials2002,23,2827–2834.)。但是支架法的缺陷在于：胶原和水凝胶支架法稳定性较差，并且支架可能会改变肿瘤细胞的微环境，影响后续的分析。
旋转培养法：在特定的反应器中，通过连续搅拌防止细胞黏附在材料表面而聚集成球。调节细胞接种密度、培养基组成、旋转速度和培养时间，可以控制球的平均直径。在培养容器中有很强的剪切力，可能会影响细胞的生长状态(Breslin,S.,&O’Driscoll,L.Three-dimensional cell culture:The missing link in drug discovery.DrugDiscovery Today,2013,18(5-6):240–249.)。但是旋转培养法的缺陷在于：不适用于对剪切力敏感或低黏附性的细胞，持续搅拌不利于直观地观察细胞的聚集，并且设备构造较为复杂，实现起来比较繁琐，限制了其广泛应用(Ruei-Zhen Lin,Hwan-You Chang.Recentadvances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedicalresearch.Biotechnology Journal,2008,3,1172–1184.)。
因此，本领域技术人员迫切需要开发一种制备成本低，操作简便、快速，重复性高的多细胞肿瘤球的高通量制备方法，利用该方法获得粒径均一的多细胞肿瘤球，且适于大规模生产。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明旨在提供一种制备成本低，操作简便、快速，重复性高的多细胞肿瘤球的高通量制备方法，利用该方法获得粒径均一的多细胞肿瘤球。
本发明提供的技术方案如下：
一种多细胞肿瘤球的高通量制备方法，包括如下步骤：
S1、将肿瘤细胞的细胞悬液与基底膜基质快速混合均匀，将所得细胞悬液接入低贴附孔板中；
S2、之后离心，离心后放入培养箱中培养，培养过程不换液，形成与基底膜基质结合的多细胞肿瘤球。
本技术方案采用的添加物质是基底膜基质Matrigel，来自于EHS小鼠肉瘤，含有层粘连蛋白，胶原蛋白等生长因子。与肿瘤细胞的生物相容性良好，能促进多细胞肿瘤球的形成和生长，从而促进所形成的多细胞肿瘤球的三维结构；采用低贴附孔板，使肿瘤细胞自发聚集成球；并结合对孔板离心后培养，培养过程不换液的步骤设计，利用离心人为增加细胞聚集，使得后续形成的细胞球更加紧密、更具有三维立体结构。从而，使制备的肿瘤球达到直径大小均匀、粒径分布集中的状态。
优选的，所述肿瘤细胞采用单个细胞组分或多个细胞组分。
本技术方案利用前述技术方案中各技术特征的配合，加入多细胞组分使其可形成多细胞组分的肿瘤球，实体瘤是由肿瘤细胞与多种基质细胞构成的，多组分细胞的共培养能更好地模拟实体瘤的空间结构，与肿瘤耐药性也息息相关，从而进一步满足了临床和试验研究的功能需求。
优选的，所述肿瘤细胞的细胞密度为1000个/mL～50000个/mL；
所述基底膜基质的体积分数为1～5％。
本技术方案通过选择一定密度的细胞与一定浓度的基底膜基质混合，便于提高细胞的聚集程度，并且提高肿瘤球的圆度和重复性。
进一步的，所述的肿瘤细胞密度为5000个/mL～10000个/mL；
所述基底膜基质的体积分数为2.5％。
本技术方案通过进一步优化肿瘤细胞密度与基底膜基质的混合比例，结合上述的技术方案，选择接种浓度为5000个/mL～10000个/mL时，有利于控制肿瘤球的平台期直径达到大约400～500微米的范围左右，符合文献报道的具有分层结构的肿瘤球要求，便于形成分层结构，使形成的肿瘤球具有实体肿瘤的异质性。
优选的，所述细胞悬液接入低贴附孔板的接种量为150～250μL。
优选的，所述细胞悬液与基底膜基质快速混合后的细胞悬液快速接入U型圆底低贴附96孔板中。
本技术方案中特殊性的选择U型圆底低贴附96孔板，使多细胞肿瘤球在其中不会贴壁生长，并且利于细胞聚集成球生长。尤其，在该96孔板中，每个孔只形成一个球，易于观察肿瘤细胞球的生长，并且高度可重复，利于肿瘤发生发展过程分子生物学研究。
优选的，离心机中控制在1000×g下离心5～20分钟。
本技术方案中通过合理的控制离心条件，促使在低贴附孔板中的细胞聚集成球，尤其是在U型圆底低贴附96孔板中，进一步促进每个孔只形成一个球，便于开展相关的试验研究。
优选的，离心后放入培养箱中的培养周期约为5～8天。
本技术方案中培养达到5～8天即达到肿瘤球的生长平台期。
优选的，所述培养箱中培养条件为37℃，5％CO2；
所述培养箱中采用的培养基为加入10vol％FBS的DMEM(Dulbecco's modifiedeagle medium)培养基，或者加10vol％FBS(Fetal bovine serum)的RPMI1640(RoswellPark Memorial Institute)培养基，或者驯化的无血清培养基。
进一步的，所述DMEM培养基的牌号为11995-065，Gibco；10％FBS的牌号为10099-141，Gibco。
利用上述的高通量制备方法制备得到的多细胞肿瘤球，所述多细胞肿瘤球的直径大小在200～550μm。
本技术方案中可进一步通过对接入的细胞悬液的细胞密度和培养时间的控制，最后达到平台期时的肿瘤球直径可达到400～500微米的范围左右。
与现有技术相比，本发明能够带来以下有益效果：
(1)本发明选用基底膜基质Matrigel作为添加物质，基底膜基质来自于EHS小鼠肉瘤，含有层粘连蛋白，胶原蛋白等生长因子，与肿瘤细胞的生物相容性良好，能促进多细胞肿瘤球的形成和生长，能促进所形成的多细胞肿瘤球的三维结构；将基底膜基质与肿瘤细胞混合均匀后接入低贴附型孔板，多细胞肿瘤球在其中不会贴壁生长，并且利于细胞自发聚集成球生长；同时，在培养前利用离心增加细胞聚集，使得后续形成的细胞球更加紧密、更具有三维立体结构；从而，孔板离心的操作保证了所形成的肿瘤球的圆度和重复性，并且培养过程不换液，既简化了操作步骤，也保留了培养基中细胞分泌的生长因子，对细胞球的生长有促进作用。从而，使制备的肿瘤球达到直径大小均匀、粒径分布集中的状态，形成的多细胞肿瘤球的直径大小在200～600μm。
(2)本发明在U型圆底低贴附型96孔板中，每个孔只形成一个球，易于观察肿瘤细胞球的生长，并且高度可重复，从而，本发明培养过程中细胞球的生长状态可以进行直观的观察，方便且简单，利于肿瘤发生发展过程分子生物学研究。
(3)本发明制备得到的肿瘤细胞球大小均匀，可用于进行后续生物学相关重复试验。
(4)本发明通过基底膜基质Matrigel的添加及统一的低贴附型孔板离心操作，可以保证所得的多细胞肿瘤球的圆度和重复性。
(5)本发明多细胞肿瘤球的制备方法操作简单，可重复性强，不仅适用于单组分肿瘤细胞的成球培养，同时适用于多种肿瘤细胞系也即多个组分细胞混合成球培养；更优的，可以控制肿瘤球直径在大约400～500微米，形成分层结构，使之具有实体肿瘤的重要特征，有利于进一步模拟实体肿瘤异质性和空间三维结构。同时，本发明提供的重复性高、能够大规模生产的高通量制备技术可以为后续肿瘤发生发展的分子生物学研究和临床药物筛选提供基础。
附图说明
图1a为实施例1制备的多细胞肿瘤球培养过程中的荧光显微镜图；图1b为实施例1中的肿瘤球在培养过程中的粒径分布图；图1c为实施例1中的肿瘤球的圆度数据图。
图2a、2b、2c分别为实施例2制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图3a、3b、3c分别为实施例3制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图4a、4b、4c分别为实施例4制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图5a、5b、5c分别为实施例5制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图6a、6b、6c分别为实施例6制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图7a、7b、7c分别为实施例7制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图8a、8b、8c分别为实施例8制备的多细胞肿瘤球的荧光显微镜图、粒径分布图、圆度数据图。
图9为试验例中证明生物学相关重复性的细胞活率与加药时间的关系图。
图10为对比例1中制备的多细胞肿瘤球培养过程中的荧光显微镜图。
图11为对比例2中制备的多细胞肿瘤球培养过程中的荧光显微镜图。
图12为对比例3中制备的多细胞肿瘤球培养过程中的荧光显微镜图。
图13为对比例4中制备的多细胞肿瘤球培养过程中的荧光显微镜图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本申请中所涉及的肿瘤细胞为：
HCT116：人结肠癌细胞；
Hela：人***细胞；
PBMC：Peripheralbloodmononuclear cell，外周血单个核细胞；
UCF：Umbilical cord fibroblast，人脐带成纤维细胞；
以上肿瘤细胞中：HCT116，Hela细胞购自中国科学院上海细胞库；UCF细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)；PBMC细胞购自广州雷德生物。
另外基底膜基质Matrigel：是从富含胞外基质蛋白的EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肿瘤中提取出的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。采用牌号为Corning,NY，356237的BDMatrigel TM基底膜基质。由于Matrigel在高于10℃时会凝固，下述实施例中将Matrigel在冰盒上融化；并且细胞悬液与Matrigel要求快速混合，快速接入相应器材如低贴附孔板中。
实施例1
提供了一种单个细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别将5000个/mL、10000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液与体积分数为2.5％的基底膜基质Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板(购自美国康宁公司)中每孔接入200μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用加入10vol％FBS的DMEM培养基、将细胞放于37℃，5vol％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成与基底膜基质结合的多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图1a所示，在培养的第5～8天，肿瘤球进入生长的平台期；如图1b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL细胞所形成的肿瘤球直径大小对应分别约为250～500μm、350～550μm，在平台期肿瘤球直径大小达到500μm左右；并且从图1b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图1c所示，所形成肿瘤球圆度都大于90％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例2
提供了一种单个细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别将5000个/mL、10000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液与体积分数为2.5％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入200μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用加入10vol％FBS的RPMI1640培养基、将细胞放于37℃，5vol％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图2a所示，在培养的第5～8天，肿瘤球进入生长的平台期；如图2b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL细胞所形成的肿瘤球直径大小对应分别约为280～450μm和380～550μm，在平台期肿瘤球直径大小达到400μm、500μm左右；并且从图2b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图2c所示，所形成的肿瘤球圆度都大于90％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例3
本实施例提供了一种两细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别制备5000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液和PBMC细胞悬液、10000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液和PBMC细胞悬液，其中，两种细胞悬液按照1:1的细胞数比例充分混合；再与体积分数为2.5％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入200μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用驯化的无血清培养基、将细胞放于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图3a所示，在培养的第5天左右，肿瘤球进入生长的平台期。如图3b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL两组分细胞所形成的肿瘤球直径大小分别约250～350μm、350～450μm；并且从图3b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图3c所示，所形成肿瘤球圆度都大于85％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例4
本实施例提供了一种两细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别制备5000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液和PBMC细胞悬液、10000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液和PBMC细胞悬液，其中，两种细胞悬液按照1:1的细胞数比例充分混合；再与体积分数为1％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入150μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用加入10vol％FBS的RPMI1640培养基、将细胞放于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图4a所示，在培养的第5-8天，肿瘤球进入生长的平台期；如图4b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL两组分细胞所形成的肿瘤球直径大小分别约为200～300μm和300～380μm；并且从图4b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图4c所示，所形成肿瘤球圆度都大于90％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例5
本实施例提供了一种两细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别制备5000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液和UCF细胞悬液、10000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液和UCF细胞悬液，其中，两种细胞悬液按照1：1的细胞数比例充分混合；再与体积分数为2％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入200μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用驯化的无血清培养基、将细胞放于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图5a所示，在培养的第5天左右，肿瘤球进入生长的平台期；如图5b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL两组分细胞所形成的肿瘤球直径大小分别约在300～400μm、400～500μm范围内，在平台期肿瘤球直径大小达到400μm左右；并且从图5b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图5c所示，所形成肿瘤球圆度都大于90％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例6
本实施例提供了一种两细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别制备5000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液和UCF细胞悬液、10000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液和UCF细胞悬液，其中，两种细胞悬液按照1:1的细胞数比例充分混合；再与体积分数为2.5％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入200μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用加入10vol％FBS的DMEM培养基、将细胞放于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图6a所示，在培养的第5～6天左右，肿瘤球进入生长的平台期；如图6b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL两组分细胞所形成的肿瘤球直径大小分别约为250～350μm、300～400μm；并且从图6b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图6c所示，所形成肿瘤球圆度都大于85％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例7
本实施例提供了一种三细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别制备5000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液、UCF细胞悬液和PBMC细胞悬液，10000个/mL细胞密度的HCT116细胞悬液、UCF细胞悬液和PBMC细胞悬液，其中，三种细胞悬液按照1:1:1的细胞数比例充分混合；再与体积分数为3％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入250μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用加入10vol％FBS的RPMI1640培养基、将细胞放于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图7a所示，在培养的第5～6天左右，肿瘤球进入生长的平台期；如图7b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL三组分细胞所形成的肿瘤球直径大小分别约为250～350μm、350～450μm；并且从图7b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图7c所示，所形成肿瘤球圆度都大于90％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
实施例8
本实施例提供了一种三细胞组分肿瘤球的高通量制备方法，其包括以下步骤：
S1、分别制备5000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液、UCF细胞悬液和PBMC细胞悬液，10000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液、UCF细胞悬液和PBMC细胞悬液，其中，三种细胞悬液按照1:1:1的细胞数比例充分混合；再与体积分数为2.5％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入200μL；
S2、之后将96孔板放于离心机中1000×g离心10分钟，离心后选用驯化的无血清培养基、将细胞放于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养过程不换液，细胞逐渐生长，增殖，最终形成多细胞肿瘤球。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。如图8a所示，在培养的第5～6天左右，肿瘤球进入生长的平台期；如图8b所示，接种密度为5000个/mL、10000个/mL三组分细胞所形成的肿瘤球直径大小分别约为250～350μm、350～450μm；并且从图8b的误差线看出，每组数据的误差线都很小，证明利用本发明方法制备肿瘤球的重复性较好；如图8c所示，所形成肿瘤球圆度都大于90％，在平台期肿瘤球的圆度可达到99％。
表明，上述实施例通过优化接种浓度、结合本领域内创新性的孔板离心步骤，并且培养过程不换液，促进细胞聚集程度的增加，并使得制备的肿瘤球达到直径大小均匀、粒径分布集中的状态；进一步的结合对接入的细胞悬液的细胞密度和培养时间的控制，在上述实施例中，最后达到平台期时的肿瘤球直径可达到大约400～500微米左右。对于本领域来说，肿瘤球直径在大约400～500微米左右的时候，是容易形成分层结构的(在很多文献中都有记载，如LEONI A.KUNZ-SCHUGHART,1JAMES P.FREYER,2FERDINAND HOFSTAEDTER,1andREINHARD EBNER3.The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening:TheMulticellular Spheroid Model.Journal of Biomolecular Screening 9(4)；2004)，若超过500微米的范围将导致形成缺氧核心(Ruei-Zhen Lin1 and Hwan-You Chang1, 2.Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture forbiomedical research.Biotechnol.J.2008,3,1172–1184.)；而这个分层结构又是实体肿瘤的重要特征，因此本实施例制备的肿瘤球不仅粒径均一，圆度很高，且具有实体肿瘤的特征，非常适用于进行临床试验及生物学研究。
试验例：生物学相关重复性的证明例
将制备的盐酸阿霉素试剂加入到通过上述实施例1～8中的任一含有培养好的多细胞肿瘤球(细胞接种密度为10000个/mL)的市售96孔板(购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司)中，盐酸阿霉素终浓度为1μg/mL，隔一段时间取样(每次取三个孔)，台盼蓝染色检测细胞活率，得出的细胞活率与加药时间的关系图如图9所示。
表明，本发明方法制备得到的肿瘤球在存活率试验的整个过程重复性较好，可通过误差线看出。
对比例1
本对比例与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：
步骤S1中采用普通规格的市售96孔板，购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。
结果如图10所示，显示：制备所得的细胞球有贴壁生长的现象，在培养过程中发生了异常生长。且呈悬浮状态的正常细胞球圆度不高，大约在60％。
对比例2
本对比例与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：
步骤S1中，细胞悬液与基底膜基质快速混合均匀后，直接快速接种到培养基(选用加入10vol％FBS的DMEM培养基)中，在37℃、5vol％CO2下培养；
步骤S2中，在培养的第3～5天、溶液变黄时，将含肿瘤球的培养基转移至“U型”圆底低贴附96孔板中，然后放于离心机中1000×g离心10分钟；然后去除旧培养基，加入新培养基；待到培养5～8天后，最终形成多细胞肿瘤球。
结果如图11所示，显示：接种密度为5000个/mL、10000个/mL细胞形成的肿瘤球平均直径大约分别在100～150μm、150～200μm；并且圆度较低，大约在70％。
表明，本发明先离心后培养的方式效果更优，通过离心可进一步增加细胞聚集度，使得后续形成的细胞球更加紧密、粒径更大、且三维立体结构更立体。
对比例3
本对比例与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于：
步骤S1中HCT116细胞悬液与甲基纤维素(MC)介质快速混合均匀；
结果如图12所示，显示：接种密度为5000个/mL、10000个/mL细胞形成的肿瘤球平均直径大约分别在100～120μm、120～180μm，圆度大约在80％。
表明，本发明以基底膜基质与细胞悬液混合，能促进多细胞肿瘤球的形成和生长，从而进一步促使多细胞肿瘤球三维结构的形成。
对比例4
本对比例与实施例2的步骤基本相同，不同之处在于：
步骤S1中分别将1000个/mL、15000个/mL细胞密度的Hela细胞悬液与体积分数为2.5％的Matrigel快速混合均匀，将所得细胞悬液于“U型”圆底低贴附96孔板中每孔接入200μL。
细胞培养过程中不换液，在接种后的24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h取出孔板，于荧光显微镜下拍照，观察多细胞肿瘤球的生长情况。在培养的第5～8天，肿瘤球进入生长的平台期；如图13所示，接种密度为1000个/mL、15000个/mL细胞所形成的肿瘤球直径大小对应分别约为100～150μm和550～700μm；圆度达到90％以上。
本例与实施例2对比，可看出，当接种密度超出5000～10000个/mL的范围时，将不利于形成直径大约在400～500微米左右的肿瘤球，难以形成分层结构模拟实体肿瘤的特征。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多细胞肿瘤球的高通量制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将肿瘤细胞的细胞悬液与基底膜基质快速混合均匀，将所得细胞悬液接入低贴附孔板中；
S2、之后离心，离心后放入培养箱中培养，培养过程不换液，形成与基底膜基质结合的多细胞肿瘤球。
2.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
所述肿瘤细胞采用单个细胞组分或多个细胞组分。
3.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
所述的肿瘤细胞密度为1000个/mL～50000个/mL；
所述基底膜基质的体积分数为1～5％。
4.根据权利要求3所述的高通量制备方法，其特征在于：
所述的肿瘤细胞密度为5000个/mL至10000个/mL；
所述基底膜基质的体积分数为2.5％
5.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
所述细胞悬液接入低贴附孔板的接种量为150～250μL。
6.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
所述细胞悬液与基底膜基质快速混合后的细胞悬液快速接入U型圆底低贴附96孔板中。
7.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
离心机中控制在1000×g下离心5～20分钟。
8.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
离心后放入培养箱中的培养周期约为5～10天。
9.根据权利要求1所述的高通量制备方法，其特征在于：
所述培养箱中培养条件为37℃，5％CO2；
所述培养箱中采用的培养基为加入10vol％FBS的DMEM培养基，或者加10vol％FBS的RPMI1640培养基，或者驯化的无血清培养基。
10.一种多细胞肿瘤球，利用如权利要求1～9任一项所述的高通量制备方法制备得到，其特征在于：所述多细胞肿瘤球的直径大小在200～550μm。
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