CN110616163A

CN110616163A - 能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌及其制备方法和应用

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Publication number: CN110616163A
Application number: CN201810636528.6A
Authority: CN
Inventors: 周宏伟; 陈怡然; 曾念宜
Original assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2038-06-20
Also published as: CN110616163B

Abstract

本发明涉及一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌及其制备方法和应用。一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌，保藏号为GDMCC NO:60361。经证实，上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌，能够以三甲胺为碳源，分解体内的三甲胺，明显降低血液中氧化三甲胺的浓度。该能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌可应用于制备治疗肾脏疾病的药物、治疗三甲胺尿症的药物及预防或治疗心血管疾病的药物中。

Description

能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌及其制备方法和应用。

背景技术

人体肠道内的三甲胺(TMA)主要是来源于含有胆碱或三甲胺结构的食物，如磷脂酰胆碱、甜菜碱、左旋肉碱等，在肠道微生物产生的三甲胺裂解酶的作用下，代谢为TMA，TMA在肠道中通过门脉循环进入肝脏，并于肝脏中在黄素加氧酶(FMOs)的作用下生成氧化三甲胺(TMAO)，然后经肾脏的***。

TMAO在健康人体内的血浆浓度维持在正常水平。在疾病状态下，TMAO在体内蓄积，其血清浓度显著升高。

另外，血管内过量TMAO将促使人体动脉粥样硬化，会引起心血管疾病，还可能导致患心脏病的风险上升。

此外，对于三甲胺代谢异常疾病，比如三甲胺尿症(或称为TMAU、TMA引起的***、或臭鱼综合征)，由于患者体内一类酶(黄素单加氧酶，FMOs)的基因缺损导致肝脏内的TMA不能被有效地转化为TMAO，目前主要是通过减少TMA的摄入量来解决。

然而，目前缺乏能够有效降低三甲胺的药物。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌及其制备方法和应用。

一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌，保藏号为GDMCC NO:60361。

一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌的制备方法，包括以下步骤：

将健康人的新鲜粪便稀释10³倍～10⁵倍，得稀释液；

采用平板划线法将所述稀释液接种到脑心浸出液琼脂培养基上，37℃厌氧培养5天～7天，得到多个单菌落；及

分别提取多个所述单菌落的DNA，并扩增、测定所述单菌落的16S rDNA序列，将测定结果与粪肠球菌的16S rDNA序列进行比对，经筛选得到所述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌。

上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌在降低三甲胺浓度中的应用。

上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌在制备降低三甲胺浓度的功能性食品中的应用。

上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌在制备预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。

一种降低三甲胺浓度的组合物，包括上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌。

一种降低血液中氧化三甲胺浓度的组合物，包括上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌。

一种预防或治疗心血管疾病的药物，包括上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌。

一种预防心血管疾病的功能性食品，包括上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌。

在其中一个实施例中，上述功能性食品为胶囊剂、片剂、露剂、散剂、口服液或颗粒剂。

经证实，上述能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌，能够使得体内的三甲胺降解，进而能够明显降低血液中氧化三甲胺的浓度。

附图说明

图1为实施例1的健康人的粪便稀释液中菌群的分布图；

图2为实施例1的健康人的粪便稀释液中的肠球菌(Enterococcus)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图3为实施例1的健康人的粪便稀释液中中的乳酸杆菌(Lactobacillus)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图4为实施例1的健康人的粪便稀释液中的Eggerthella在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图5为实施例1的健康人的粪便稀释液中的Facklamia在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图6为实施例1的健康人的粪便稀释液中的韦荣球菌(Veillonella)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图7为实施例1的健康人的粪便稀释液中的毗邻单胞菌(Plesiomonas)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图8为实施例1的健康人的粪便稀释液中的布劳特氏菌(Blautia)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图9为实施例1的健康人的粪便稀释液中的芽孢杆菌(Bacillus)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图10为实施例1的健康人的粪便稀释液中的嗜碱菌(Alkaliphilus)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图11为实施例1的健康人的粪便稀释液中的弯曲杆菌(Campylobacter)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图12为实施例1的健康人的粪便稀释液中的徘徊球菌(Vagococcus)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图13为实施例1的健康人的粪便稀释液中的弯曲短杆菌(Varibaculum)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图14为实施例1健康人的粪便稀释液中的噬氢菌(Hydrogenophaga)在三甲胺组和对照组的相对丰度对比图；

图15为实施例1的粪便样品1的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图16为实施例1的粪便样品2的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图17为实施例1的粪便样品3的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图18为实施例1的粪便样品4的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图19为实施例1的粪便样品5的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图20为实施例1的粪便样品6的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图21为实施例1的粪便样品7的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图22为实施例1的粪便样品8的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图23为实施例1的粪便样品9的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图24为实施例1的粪便样品10的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图25为实施例1的粪便样品11的三甲胺组和对照组中肠球菌属的OTUs总量对比图；

图26为实施例6的各种培养液中2，3，5－三苯基氯化四氮唑显色结果图；

图27为实施例8的动物实验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌于2018年4月23日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCCNO:60361，分类命名：Enterococcus faecalis TMAO-D。该粪肠球菌来源于人粪便。

该粪肠球菌能够以三甲胺为碳源，分解三甲胺，能够明显降低血液中氧化三甲胺的浓度。

微生物属于仅用结构和/或组成特征不能清楚表征的产品，并且用制备方法之外的其他特征不能充分表征。根据审查指南第二部分第十章第4.3节的规定，该类产品的权利要求，允许采用制备方法来表征。

一实施方式的能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌的制备方法，该方法包括以下步骤S110～S120。

S110、初筛健康人新鲜粪便中，得能够降低三甲胺浓度菌属。

具体地，将多个健康人的新鲜粪便稀释液分别接种到多个三甲胺的脑心浸出液肉汤(BHI肉汤)培养基和多个未添加三甲胺的脑心浸出液(BHI肉汤)培养基中，厌氧培养，得多个培养物，然后分别提取多个培养物的DNA，选用16S rDNAV4通用引物进行扩增，扩增产物测序。然后采用BIPES分析流程对测序数据进行分析，得到能够降低三甲胺浓度菌属。

需要说明的是，健康人的新鲜粪便是指自述没有消化道疾病的人排除的粪便(在4℃保存时间少于24h)。

进一步地，粪便稀释液由健康人的新鲜粪稀释10³倍～10⁵倍而得。

进一步地，将粪便稀释液接种到多个三甲胺的脑心浸出液肉汤(BHI肉汤)培养基和多个未添加三甲胺的脑心浸出液(BHI肉汤)培养基时，粪便稀释液与液体培养基的体积比是1：20～28。优选为1：23～26，进一步优选为1：25。

进一步地，厌氧培养的条件为：37℃厌氧培养5天～7天。

进一步优选为37℃厌氧培养7天。

进一步地，提取培养物的DNA的方法可以按照本领域熟知的提取方法，比如采用商品化的试剂盒提取。

进一步地，16S rDNAV4通用上游引物如SEQ.ID.NO.1所示。16S rDNA V4通用下游引物如SEQ.ID.NO.2所示。

进一步地，选用16S rDNA V4通用引物对多个培养物的DNA进行扩增，扩增体系为20μL，得到多个扩增产物。其中，包括DNA模板2μL，SYBR Green PCR Master Mix 10μL，ddH2O 7.2μL，10μM的上、下游引物各0.4μL。扩增反应条件如下：(1)预变性94℃，2分钟。(2)变性94℃，30秒；退火52℃，30秒；延伸72℃，30秒；30个循环。(3)后延伸72℃，5分钟。

进一步地，采用BIPES分析流程对测序数据进行分析，包括健康人粪便稀释液在添加三甲胺和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养产物的菌群、肠球菌分布差异分析，根据结果初步推测Enterococcus(肠球菌属)可能为能够降低三甲胺浓度的菌属。

具体地，健康人粪便稀释液在添加三甲胺和不添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养产物的菌群分布差异分析，包括各个菌属间的对比分析及单个菌属水平的对比分析。

更进一步地，将多个健康人的粪便稀释液在添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养产物的测序结果整合形成三甲胺培养组的数据，将多个健康人的粪便稀释液在未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养产物的测序结果整合形成对照组的数据，并对三甲胺培养组的数据及对照组的数据进行各个菌属间的对比分析及单个菌属水平的对比分析。

OTUs(operational taxonomic units)在微生物的免培养分析中经常用到，一般情况下，如果序列之间，比如不同的16S rDNA序列的相似性高于97％就可以把它定义为一个OTU，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌(微生物)种。通过OTU分析，就可以知道样品中的微生物(种水平)的丰度。

需要说明的是，若已经知晓健康人新鲜粪便中能够降低三甲胺浓度的菌属时，此步骤可以省略。

S120、筛选能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌。

具体地，筛选能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌包括S121～S125的操作。

S121、将健康人的新鲜粪便稀释10³倍～10⁵倍，得稀释液。

进一步地，优选地，将健康人的新鲜粪便稀释10⁵倍，得稀释液。

S123、采用平板划线法将稀释液接种到脑心浸出液琼脂培养基上，37℃厌氧培养5天～7天，得到多个单菌落。单菌落是指单个细菌形成的菌落，单菌落上的细菌性质是一样的，DNA、所处细胞期都一样，便于科学研究，一个单菌落一般就是一个圆点。

S125、分别提取多个单菌落的DNA，并分别扩增、测定多个单菌落的16S rDNA序列，将测定结果与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16S rDNA序列进行比对，与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16S rDNA序列相似度大于97％的菌，就鉴定为粪肠球菌。

一实施方式的上述粪肠球菌在降低三甲胺浓度中的应用。

一实施方式的上述粪肠球菌在降低血液中氧化三甲胺浓度中的应用。

一实施方式的上述粪肠球菌在制备降低三甲胺浓度的功能性食品中的应用。

一实施方式的上述粪肠球菌在制备预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。

经证实，上述粪肠球菌能够降低三甲胺的浓度。因此，上述粪肠球菌能够应用于降低三甲胺的浓度中，比如，应用于制备治疗肾脏疾病的药物、制备治疗肾脏疾病的药物、制备治疗三甲胺尿症的药物及制备预防或治疗心血管疾病的药物。当然，也可以将上述粪肠球菌应用于功能性食品的制备中。

一实施方式的降低三甲胺浓度的组合物，包括上述粪肠球菌。

在其中一个实施例中，上述降低三甲胺浓度的组合物为片剂、水剂乳剂、粉剂或膏剂。

在其中一个实施例中，上述降低三甲胺浓度的组合物，还包括益生菌。

进一步地，益生菌选自酪酸梭菌、乳杆菌及双歧杆菌中的至少一种。

上述粪肠球菌与益生菌配合，能够能产生健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用。

当然，在其他实施方式中，上述降低三甲胺浓度的组合物，不限于包括益生菌，还可以包括其他有益健康的组分。

一实施方式的降低血液中氧化三甲胺浓度的组合物，包括上述粪肠球菌。

一实施方式的预防心血管疾病的药物，包括上述粪肠球菌。

一实施方式的治疗心血管疾病的药物，包括上述粪肠球菌。

一实施方式的预防心血管疾病的功能性食品，包括上述粪肠球菌。

正常的人体血清中TMAO的含量维持在较低的水平，当TMAO的血清浓度显著升高，血管内过量TMAO将促使人体动脉粥样硬化，并导致患心脏病的风险上升。

因此，包括上述粪肠球菌的预防或治疗心血管疾病的药物能够降低TMA的浓度，从而降低血液中TMAO，能够降低患心血管疾病的风险或治疗心血管疾病。

以下为具体实施例部分。

以下实施例中，如未特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例中所用的材料：健康人的新鲜粪便来自珠江医院检验科，细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒购自深圳易瑞生物技术有限公司，Sprague Dawley大鼠购于南方医科大学实验动物中心，高脂饲料购于广东省医学实验动物中心，脑心浸出液肉汤培养基购于青岛海博培养基有限公司，三甲胺购于北京百灵威科技有限公司。

实施例1

(1)随机选取11位健康人的新鲜粪便，并各取1g配置成10⁵稀释液，并记作粪便样品1～粪便样品11，分别将稀释液按照粪便稀释液与液体培养基的体积比1：25接种到添加4g/L三甲胺的脑心浸出液肉汤(BHI肉汤)培养基和未添加三甲胺的BHI肉汤培养基中。

(2)将接种后的多个上述两种培养基放置于厌氧箱(10％H₂，5％CO₂，85％N₂)中37℃厌氧培养7天，得到多个培养产物。

(3)使用深圳易瑞生物技术有限公司的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒提取多个培养产物的DNA，具体操作方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

(4)选用16S rDNA V4通用引物，分别扩增多个培养产物的16S rDNA V4片段，得多个扩增产物。其中，16S rDNA V4通用上游引物如SEQ.ID.NO.1所示。16S rDNA V4通用下游引物如SEQ.ID.NO.2所示，16S rDNA V4通用引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR每个DNA样品对应相应的barcode上下游引物信息。每个扩增体系为20μL，其中，包括DNA模板2μL，SYBR Green PCR Master Mix 10μL，dd H2O 7.2μL，10μM的上、下游引物各0.4μL。扩增反应条件如下：(1)预变性94℃，2分钟。(2)变性94℃，30秒；退火52℃，30秒；延伸72℃，30秒；30个循环。(3)后延伸72℃，5分钟。

(5)将多个扩增产物测序，并对测序结果采用BIPES分析流程分析11个健康人粪便稀释液在添加三甲胺和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养物的菌群及肠球菌分布差异。

其中，健康人粪便稀释液在添加三甲胺和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基的培养产物在菌属间的分布差异分析具体地为：分析11份健康人的粪便稀释液在添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养产物的测序结果，分析结果如图1所示。

由图1可知，肠球菌在三甲胺培养组平均相对丰度更高，说明三甲胺富集肠球菌。

其中，对健康人粪便稀释液在添加三甲胺和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基的培养产物在细菌属水平的相对丰度差异分析具体为：分别将11个样品在添加三甲胺和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中的培养样品的测序结果进行对比分析。图2～图14为对照组(脑心浸出液肉汤培养基中未添加三甲胺)与三甲胺培养组(脑心浸出液肉汤培养基中添加三甲胺)中肠球菌(Enterococcus)、噬氢菌(Hydrogenophaga)、徘徊球菌属(Vagococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、弯曲短杆菌(Varibaculum)、布劳特氏菌(Blautia)、嗜碱菌(Alkaliphilus)、毗邻单胞菌(Plesiomonas)、Facklamia、乳酸杆菌(Lactobacillus)、Eggerthella、弯曲杆菌(Campylobacter)及韦荣球菌(Veillonella)的结果对比图。

由图2～图14可知，肠球菌(Enterococcus)、噬氢菌(Hydrogenophaga)、徘徊球菌属(Vagococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、弯曲短杆菌(Varibaculum)、布劳特氏菌(Blautia)、嗜碱菌(Alkaliphilus)、毗邻单胞菌(Plesiomonas)、Facklamia、乳酸杆菌(Lactobacillus)、Eggerthella、弯曲杆菌(Campylobacter)及韦荣球菌(Veillonella)的对照组与三甲胺培养组在相对丰度上均存在显著差异，三甲胺培养组的相对丰度高于对照组。

其中，分析肠球菌在三甲胺组和对照组的培养样品中的相对丰度的方法具体为：分别分析11个粪便样品在添加三甲胺和未添加三甲胺的脑心浸出液肉汤培养基中厌氧培养以后的培养产物的测序结果，并分析对比肠球菌的相对丰度。分析结果如图15～图25所示。

由图15～图25可知，新鲜粪便稀释液中肠球菌的OTUs总量在对照组(脑心浸出液肉汤培养基中未添加三甲胺)和三甲胺培养组(脑心浸出液肉汤培养基中添加三甲胺)的OTUs总量明显差别。11个样品中，有9个样品的三甲胺培养组的OTUs总量高于对照组，且具有明显差异。

实施例2

(1)随机另外选取2位健康人的粪便各取1g配置成10⁵稀释液，然后分别取100微升接种在XX mL的BHI琼脂培养基上，并置于厌氧箱(10％H₂，5％CO₂，85％N₂)中37℃厌氧培养7天，得到待筛选培养物。

(2)将待筛选培养物采用平板划线法纯化，直到BHI琼脂培养基上只生长一种形态的单菌落。

(3)分别挑取多个单菌落以提取其DNA，并分别扩增、测定多个单菌落的16S rDNA序列，将测定结果与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16S rDNA序列进行比对，测定结果与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16S rDNA序列相同的即为粪肠球菌，筛选得到1株粪肠球菌。该粪肠球菌于2018年4月23日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC NO:60361，分类命名：Enterococcus faecalis TMAO-D。

实施例3

实施例3的步骤大致与实施例2的步骤相同，其不同在于，在步骤(3)中，测定多个单菌落的16S rDNA序列后与酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)的16S rDNA序列进行比对，筛选得到1株酪黄肠球菌。

实施例4

实施例4的步骤大致与实施例2的步骤相同，其不同在于，在步骤(3)中，测定多个单菌落的16S rDNA序列后与坚强肠球菌(Enterococcus durans)的16S rDNA序列进行比对，筛选得到1株坚强肠球菌。

实施例5

实施例5的步骤大致与实施例2的步骤相同，其不同在于，在步骤(3)中，测定多个单菌落的16S rDNA序列后与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的16S rDNA序列进行比对，筛选得到1株屎肠球菌。

实施例6

(1)在96孔培养板中，按照如图26所示的分布，加入检测培养液(每升检测培养液包括1g K₂HPO₄、2.6g KH₂PO₄、1.4g MgSO₄·7H₂O、0.2g NH₄Cl、0.25g KCl、1g NaCl、4g三甲胺及1g TTC)，阳性对照培养液(每升阳性对照培养液包括1g K₂HPO₄、2.6g KH₂PO₄、1.4gMgSO₄·7H₂O、0.2g NH₄Cl、0.25g KCl、1g NaCl、4g葡萄糖及1g TTC)和阴性对照培养液(每升阴性对照培养液包括1g K₂HPO₄、2.6g KH₂PO₄、1.4g MgSO₄·7H₂O、0.2g NH₄Cl、0.25gKCl、1g NaCl及1g TTC)，每个孔加入的量为200μL。

(2)然后取实施例2筛得的粪肠球菌、实施3筛得的酪黄肠球菌、实施4筛得的坚强肠球菌、实施5筛得的屎肠球菌按照图26的分布分别接种到上述96孔培养板上，其中，接种时菌液的OD600为0.9，菌液与每孔培养液比例是1：50。

(3)在37℃厌氧培养48小时后，96孔板培养液发生颜色改变。结果如图26所示。图26中：PC指阳性对照，NC指阴性对照，TM指检测培养液，Ef1、Ef2及Ef3指实施例2得到的粪肠球菌的平行试验组，即Ef1、Ef2及Ef3均为实施例2所得的粪肠球菌，E4指实施例3得到的酪黄肠球菌，E5指实施例4得到的坚强肠球菌，E6指实施例5得到的屎肠球菌。由于培养液中添加了代谢指示剂2，3，5－三苯基氯化四氮唑(TTC)，TTC的氧化态是无色的，如果有活菌存在，TTC在细菌脱氢酶的作用下，可被氢还原成不溶性的红色三苯甲月替，使培养液从无色变成红色(因图为黑白照片，颜色深处实际颜色为红色)。

根据图26的结果可知，粪肠球菌在检测培养液和阳性对照中有代谢活性，说明实施例2得到的粪肠球菌可以将三甲胺作为能源，分解三甲胺。

实施例7

取实施例2的粪肠球菌、实施3的酪黄肠球菌、实施4的坚强肠球菌、实施5的屎肠球菌分别接种到多个以400μg/mL三甲胺作为唯一碳源的无机盐溶液，菌液浓度和接种量与实施例6相同。然后，37℃厌氧培养24小时后采用苦味酸比色法检测各培养液中三甲胺浓度。检测结果如表1所示，其中，Enterococcus faecalis1、Enterococcus faecalis2及Enterococcus faecalis3均是实施例2所得的粪肠球菌。

表1

由表1可知，含有粪肠球菌的培养液中三甲胺浓度(平均209.03μg/mL)明显低于含有酪黄肠球菌、坚强肠球菌和屎肠球菌的培养液(平均311.4μg/mL)。进一步说明实施例2所得的粪肠球菌可以降解三甲胺。

实施例8

将南方医科大学实验动物中心购买的13只体重相近的12周龄的雌性SpragueDawley大鼠随机分为实验组(7只)和对照组(6只)。取实施例2得的粪肠球菌菌液(OD600＝0.9)，然后通过灌胃对实验组大鼠进行干预，每天灌胃一次，每次灌胃1.5毫升。对照组大鼠每天灌胃等量PBS。所有大鼠每天都灌胃53mg/kg氯化胆碱。所有大鼠都自由进食高脂饲料(高脂饲料购买于广东省医学实验动物中心)。在实验第1天和第14天分别使用眼静脉采血方法收集所有大鼠血浆(经过禁食12小时)。然后将所有血浆样品在4℃以3000g的速度离心20分钟，收集血清。采用液相质谱法检测TMAO浓度。TMAO浓度的浓度如图27所示。

由图27可知，经过14天的干预，实验组大鼠血浆TMAO水平明显更低，说明粪肠球菌能够在体内降解TMA。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 南方医科大学珠江医院

<120> 能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgtgccagc mgccgcggta a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggactach vgggtwtcta at 22

Claims

1.一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌，其特征在于，保藏号为GDMCC NO:60361。

2.一种能够降低三甲胺浓度的粪肠球菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将健康人的新鲜粪便稀释10³倍～10⁵倍，得稀释液；

3.如权利要求1所述的粪肠球菌或如权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌在降低三甲胺浓度中的应用。

4.如权利要求1所述的粪肠球菌或如权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌在制备降低三甲胺浓度的功能性食品中的应用。

5.如权利要求1所述的粪肠球菌或如权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌在制备预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。

6.一种降低三甲胺浓度的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌。

7.一种降低血液中氧化三甲胺浓度的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌。

8.一种预防心血管疾病的功能性食品，特征在于，包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌。

9.如权利要求8所述的预防心血管疾病的功能性食品，特征在于，所述功能性食品为胶囊剂、片剂、露剂、散剂、口服液或颗粒剂。

10.一种预防或治疗心血管疾病的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的制备方法制得的粪肠球菌。