CN110612129A

CN110612129A - 自体骨移植物替代物

Info

Publication number: CN110612129A
Application number: CN201880030038.XA
Authority: CN
Inventors: 斯洛博丹·沃克切维奇; 科布尔·T.·萨姆帕; 路瓦卡·格尔古雷维奇; 查尔斯·科恩; 赫尔曼·欧珀曼
Original assignee: Executive Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Executive Biopharmaceutical Co Ltd; Perform Biologics Inc
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: US20200237959A1; CA3075869A1; SI3697459T1; EP3697459B1; AU2018351687A1; ES2935170T3; WO2019076484A1; US10960109B2; FI3697459T3; HRP20230020T1; DK3697459T3; EP3697459A1; CN110612129B; KR20200075850A; PL3697459T3; JP2020537590A; JP2023120322A

Abstract

本发明涉及用于诱导新骨形成，促进骨生长和治疗骨缺损的自体骨移植物替代物组合物(ABGS)，制备该自体骨移植物替代物组合物的方法以及制备植入物的自体骨移植物替代物组合物的套件。在具体的方面，本发明涉及用于治疗骨缺损，诱导新骨形成和促进骨折愈合，脊柱融合的骨生长的可注射的/可挤压的/可植入的自体骨移植物替代物组合物，以修复整形外科和口腔上颌面牙科手术的骨重建步骤中的骨缺损。

Description

自体骨移植物替代物

技术领域

本发明涉及组合物，该组合物的制备方法以及用于制备植入的组合物的套件，所述组合物能够模仿“活体自体移植物”，用于治疗骨缺损，诱导新骨形成以及促进骨生长。在具体方面，本发明涉及可注射的/可挤压的/可植入的自体骨移植物替代物组合物(下文简称为ABGS)，用于在整形外科和口腔上颌面牙科手术的骨重建操作中治疗骨缺损，诱导新骨形成并且促进骨折愈合、脊柱融合的骨生长以修复骨缺损。

背景技术

骨移植物用于设计为促进新骨的生长的多种手术操作中以修复骨缺损，提高特定位点的骨生长，促进相邻骨的融合，从而恢复、提高骨骼结构的稳定性并且降低患病个体所承受的背痛和腿疼。在许多情况下，手术操作联合使用骨移植物和多种工具中的任一种，例如，椎弓根螺钉和杆，从而在新骨生长的同时固定植入的骨移植物并且提高稳定性以校正缺陷。

脊柱融合是主要用于缓解椎骨节段(椎骨-盘-椎骨)受损或发炎的个体的背痛和腿疼的起源的手术操作。在脊柱融合过程中，两个或多个相邻的椎骨节段被融合以限制节段之间的移动和压缩，从而结束或基本缓和疼痛以及进一步结束或基本缓和由于受损的相邻节段的移动或压缩而引起的退化。因此，脊柱融合手术的期望的结果是由稳定、连续且承重的节段骨来代替纤维软骨-软骨片分隔的两个椎骨的原始排布方式，这进而缓解了疼痛并进一步减缓了节段退化(例如，腰椎前路椎体间融合术，ALIF)。

除了缓解疼痛并进一步稳定脊柱以避免压缩之外，也可通过使用自体移植物或失活的同种异体移植物节段或富含患者骨髓的失活的同种异体移植物颗粒或含有患者骨髓的同种异体移植物的脱矿骨基质将任何节段两侧的横突以异位位点形成功能性的新骨而融合(例如，腰椎后外侧融合术，PLF)。手术者使用诸如融合器、螺丝钉和杆之类的金属工具以帮助融合前侧(椎骨主体)和后侧(椎体横突)腰椎节段，从而对其可动性加以固定(关节固定术)以减弱对穿越两椎体之间的脊髓神经的压迫。为了提高融合速度，所述工具辅助有骨移植物以刺激椎体间(腰椎前路椎体间融合术，ALIF)或椎体横突异位位点(腰椎后外侧融合术，PLF)上的骨生成或在这两者(腰椎后外侧腰椎椎体间融合术，PLIF)上的骨生成。参见，例如，Mobbs,R.J.等人，Lumbar interbody fusion:techniques,indications andcomparison of interbody fusion options including PLIF,TLIF,MI-TLIF,OLIF/ATP,LLIF and ALIF.J Spine Surg 1:2-18(2015)。可使用脊柱融合术治疗多种疾病，包括但不限于：退行性椎间盘疾病(DDD)，脊椎前移，椎管狭窄，脊柱侧弯，感染，骨折，脊髓性肌肉萎缩症和各种不同的肿瘤。

脊柱融合术需要借助于促进新骨生长的材料以融合邻近椎骨。十几年来，标准脊柱融合术需要在患者体内产生另一切口以从患者的臀部髂骨获取自体骨碎片(自体移植物)。所获取的骨碎片被植入患病的椎骨之间的区域并通过合适的工具(例如，椎弓根钉和杆)将其固定。使用获自患者的自体移植物的这种脊柱融合术也被称为髂骨骨移植(下文称为ICBG)。使用ICBG的优势在于所获取的骨碎片具有活的骨髓细胞以及与患者身体免疫相容的细胞外基质并且包含功能性骨髓成分，所述功能性骨髓成分包括红细胞、白细胞以及巨核细胞。然而，使用ICBG需要患者忍受另一切口。用于获取作为自体移植物的骨的另一切口会有延长手术过程的考虑并且因此患者处于麻醉状态的时间也变长，这产生了另一手术后疼痛位点(参见，例如，Kim等人,Spine J.9:886-92；2009)，并且因为在患者身体上产生了另一切口，所以这增加了感染风险。而且，可收获的IGBG的量非常有限。

为了降低对患者产生这些额外的风险，多种备用可植入组合物已被开发并且在手术过程中测试替代自体移植物的效果。这些备用的组合物可包括同种异体移植物(例如，来自骨库的尸体骨)，脱矿的骨基质(DBM)，各种不同的陶瓷(基于钙的复合物)，合成的聚合物，骨形态形成蛋白(BMP)及其与动物衍生的胶原蛋白骨架结合的类似物，以及它们的组合。参见，例如，Gupta S,M.V.,Gupta MC(2017)Biology of spine fusion andapplication of osteobiologics in spine surgery.In:Vukicevic S,Sampath.KT.(ed)Bone Morphogenetic Proteins:Systems Biology Regulators.Springer InternationalPublishing。然而，对于研发用于脊柱融合术的自体移植物的替代品所作出的努力在为了取得管理局批准的过程中遇到了其自身特有的挑战。

2002年获批的骨移植物/LT-CAGE腰椎锥形融合器(MedtronicSofamorDanek,Memphis,Tennessee,USA)作为ICBG的替代物，通过使用前路方式治疗骨骼成熟的患者体内从L2至S1中单一水平(椎体-椎间盘-椎体，ALIF)的DDD。骨移植物成分由施加于可吸收的源自牛跟腱的胶原蛋白海绵载体的人骨形态形成蛋白2(rhBMP-2)构成，所述可吸收的源自牛跟腱的胶原蛋白海绵载体用于填充脊柱前凸螺纹(LT)融合器部件。每个腰椎椎间融合器包含12mg rhBMP-2(总量)，6mg rhBMP-2浸泡的胶原蛋白片分别填充在待***椎间盘空隙的2个LT融合器中。参见，详情，INFUSE Bone Graft productinformation:Lumbar.(2002)Medtronic SofamorDanek USA,Inc.www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf/P000058c.pdf.Accessed February 2010。在已批准的手术操作中，将腰椎椎间融合器植入于患病的椎骨水平的两个侧面以促进节段的每个侧面上的稳定融合。所述腰椎椎间融合器在各种不同的未经临床试验认可的腰椎后外侧融合术中促进脊柱融合的能力也是多种研究的目的。参见，例如，Cahill等人,JAMA302:58-66(2009)；Carragee,等人,Spine J 11:471-491(2011)。然而，未经临床试验认可的使用产生了不理想的安全问题，导致进行国会听证和FDA监管。

骨移植物替代产品(Medtronic)起初被设计并测试作为使用腰椎后外侧融合术(PLF)进行脊柱融合的ICBG的替代物。该ICBG替代物产品在多孔合成平板(porous synthetic Slab)中递送40mg rhBMP-2，所述多孔合成平板由浸满有羟基磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)复合物的陶瓷颗粒的牛跟腱衍生的胶原蛋白海绵构成。虽然骨移植物替代物产品在治疗DDD方面提供适度的脊柱融合，但是美国食品药品管理局(FDA)拒绝批准该产品，因为很多患者仍持续经历了下背部疼痛和腿疼并且担心与相对高剂量的rhBMP-2相关的可能的癌症风险以及在远离植入物位点的不想要的异位骨形成，这种异位骨形成归因于腰椎椎间融合器中使用的较大量的BMP-2。参见，例如，Executive Summary for P050036Medtronic’s AMPLIFY^TM rhBMP-2Matrix Orthopedicand Rehabilitation Devices Advisory Panel(2010)Food and Drug Administration。

植入物(Olympus/Stryker)是用于进行骨再生的可植入设备。该设备包含分散在牛骨衍生的I型胶原蛋白中的重组人BMP-7(rhBMP-7)。由于相对于自体移植物新骨的形成未能产生统计学差异，FDA批准了植入物仅用于人道主义器械豁免(humanitarian device exemption，HDE)，作为无法使用自体移植物并可选的治疗方法失败的顽抗性长期骨不连缺陷中自体移植物的替代物。参见，例如，Stryker Biotech OP-1product information(2009)www.stryker.com/stellent/groups/public/ documents/web_prod/126737.pdf.于2010年2月获取。

OP-1是一种组合了rhBMP-7，牛骨胶原蛋白和软粘胶添加剂(羧甲基-纤维素)的组合物。在腰椎后外侧融合术(PLF)的临床研究中评估了OP-1设备，但是与自体移植物相比并未取得统计学差异。因此，已经批准了OP-1用于脊柱融合术中的HDE使用。参见，例如，Stryker Biotech OP-1product information(2009)www.stryker.com/stellent/groups/public/documents/web_prod/127024.pdf.于2010年2月获取。

除了在脊柱融合术中使用自体移植物之外，自体移植物还可治疗多种其他整形外科适应症和牙科适应症。这些适应症包括各种不同的缺陷和骨折，例如，骨干、远端桡骨骨折、胫骨不连骨折、高位胫骨截骨术，骨质疏松骨折(椎骨压缩骨折，非经典股骨骨折)，骨囊肿中的缺陷以及骨肿瘤中的缺陷并且还包括各种不同的口腔、牙周、上颌面缺陷和异常现象。此外，自体移植物也用于治疗与诸如低磷酸酯酶症(组织非特异性碱性磷酸酶基因突变)、I型神经纤维瘤病(神经纤维瘤蛋白基因突变)、成骨不全症(I型胶原蛋白基因突变)之类的罕见肌肉骨骼失调相关的假关节病和假性骨折。基于这些病症中骨损失的严重性，可安全地从患者体内获得的自体移植物的量可能不足或可能缺乏骨质量以提供期望的治疗效果(在缺乏抵抗力的吸烟者、糖尿病患者、类固醇使用者和骨质疏松患者体内)。在这类情况下，特别需要安全的并且能够诱导仅限于缺陷位点处的有效骨形成的生物骨移植物的替代物。具体请参见，Vukicevic S,Sampath TK,editors.Bone Morphogenetic Proteins:from Laboratory to Clinical Practice.Basel:BirkhauserVerlag,2002；Vukicevic S,Sampath,KT,editor.Bone Morphogenetic Proteins:Systems BiologyRegulators.Springer International Publishing；2017。

迄今为止，患者仅限于使用几种产品作为可能的替代物以进行用于脊柱融合和其他整形外科手术的自体移植手术。简言之，本领域仍然需要改进的组合物，其可促进成功修复骨缺陷以及进行脊柱融合所需的新骨生长的水平和质量，而患者无需经历额外的风险、疼痛以及与自体移植手术相关的限制。

发明内容

本发明通过提供自体骨移植物替代物组合物(ABGS)解决了背景技术部分所举例说明的问题，所述自体骨移植物替代物组合物可用作ICBG的模拟物，用于在有治疗需求的个体体内的位点促进新骨生长。在具体方面，本发明涉及可注射的/可挤压的/可植入的自体骨移植物替代物组合物(ABGS)，用于治疗骨缺损，诱导新骨形成并且促进骨折愈合，脊柱融合的骨生长以修复整形外科手术和口腔上颌面牙齿手术的骨重建过程中的骨缺损。

在一种实施方式中，本发明提供自体骨移植物替代物组合物(ABGS)，其是一种用于促进新骨生长的自体移植物的替代物，包含：

1)自体血液(AB)，

2)成骨骨形态形成蛋白(BMP)，以及

3)凝血剂，选自离子溶液或纳米颗粒和Ca++微球偶联物中的药理学上可接受的钙盐；以及

4)耐压缩基质(CRM)，

其中，所述自体血液形成包含成骨骨形态形成蛋白，钙盐和耐压缩基质(下文称为CRM)的凝结物凝胶。

成骨骨形态形成蛋白选自：BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-6,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。非常合适的成骨骨形态形成蛋白是BMP-6或BMP-7，优选地为BMP-6。

所述自体血液(下文简称为AB)还可包含富含自体或同种异体血小板的血浆(下文简称为PRP)或者自体血液(AB)可被富含血小板的血浆(PRP)替代。

所述耐压缩基质(CRM)选自：骨同种异体移植物，磷酸钙-碳酸钙复合物，生物可吸收的聚合物或共聚物，硫酸钙，生物可吸收的水凝胶以及它们的组合。

在本发明的另一实施方式中，用于治疗骨缺损，诱导新骨形成并促进骨生长的自体骨移植物替代物组合物包含：

1)自体血液；

2)成骨骨形态形成蛋白，其选自：BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合，以及

3)凝血剂，选自离子溶液或纳米颗粒和Ca++微球偶联物中的药理学上可接受的钙盐；

其中，所述自体血液形成包含成骨骨形态形成蛋白和钙盐的凝结物凝胶。

合适的成骨骨形态形成蛋白是BMP-6或BMP-7，优选地为BMP-6。

所述自体血液(AB)还包含富含自体或同种异体血小板的血浆(PRP)或者自体血液(AB)被富含自体血小板的血浆(PRP)替代。

在本发明的另一实施方式中，用于诱导新骨形成并且促进骨生长的植入物的自体骨移植物替代物组合物包含：

1)自体血液；

3)耐压缩基质(CRM)；

其中，所述自体血液形成包含成骨骨形态形成蛋白和CRM的凝结物凝胶。

合适的成骨骨形态形成蛋白是BMP-6。除了成骨骨形态形成蛋白BMP-6之外，可使用选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白。

优选地，所述耐压缩基质(CRM)选自：骨同种异体移植物和/或磷酸钙-碳酸钙复合物。

在另一实施方式中，本发明提供制备植入用于诱导新骨形成的自体骨移植物替代物组合物的套件。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含含有骨祖细胞的外源提供的患者骨髓抽取物群。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含来自患者骨髓的外源提供的体外扩增的间充质干细胞(骨祖细胞)群。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含来自患者脂肪组织的外源提供的体外扩增的间充质干细胞(骨祖细胞)群。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含来自患者骨膜层(骨膜)的外源提供的体外扩增的间充质干细胞(骨祖细胞)群。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含由患者的邻近局部骨、合适的骨骼肌和/或筋膜制备的外源提供的切碎组织碎片。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含外源提供的体外扩增的间充质干细胞(骨祖细胞)群，所述间充质干细胞群源自患者免疫匹配的个体的同种异体骨髓或脂肪组织或骨膜。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含外源提供的体外扩增的间充质干细胞(骨祖细胞)群，所述间充质干细胞源自同种异体脐带。

在另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含同种异体或外源提供的富含患者血小板的血浆(PRP)，其是纤维蛋白网和生长因子(例如，PDGF,IGF,VEGF和TGF-β)的来源。

在另一实施方式中，作为耐压缩基质(CRM)的本文所述的自体骨移植物替代物组合物选自：骨同种异体移植物(例如，由皮质骨或小梁骨或这两者制备的骨同种异体移植物)，磷酸钙-碳酸钙复合物(下文简称为陶瓷)，热敏生物可吸收聚合物或共聚物(例如，丙交酯或乙交酯的聚合物和共聚物以及它们的组合)，硫酸钙，生物可吸收水凝胶以及它们的组合。所述磷酸钙-碳酸钙复合物选自：羟磷灰石(HA)，磷酸三钙(TCP)和TCP/HA的偶联物。

在又一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可包含同种异体脱矿骨基质。

在本发明的另一实施方式中，本文所述的自体骨移植物替代物组合物可还包含如下骨移植物替代物，所述骨移植物替代物可还包含反相热敏感生物可吸收聚合物。所述反相热敏感生物可吸收聚合物可在假定了包含AB，BMP和CRM的组合物的流变学的自体血液(AB)中混合，这样，所述反相热敏感生物可吸收聚合物可在室温下以液相进行注射并且在温度提高至体温(37℃)时，所述反相热敏感生物可吸收聚合物在递送位点/植入位点形成生物相容性凝胶。因此，所述组合物提供含有自体血液中的BMP，CRM和反相热敏感生物可吸收聚合物的无创可注射组合物。该制剂可通过例如注射以无创方式进行给药，由此克服了与目前市售的固体骨移植物替代物相关的限制。可注射的ABGS在异位骨形成的标准大鼠模型中有效地诱导新骨形成。因为该可注射组合物紧密地结合体温条件下由反相热敏感生物可吸收聚合物维持可持续时间段的血浆蛋白，因此，该可注射组合物能够在相对低的BMP浓度条件下使得新骨形成。

在另一实施方式中，本发明提供制备用于治疗骨缺损、诱导新骨形成并促进骨生长的自体骨移植物替代物组合物的方法，其中，所述方法包含如下步骤:

(1)组合：

a)自体血液(AB)、或自体血液和富含血小板的血浆(PRP)、或富含血小板的血浆(PRP)，

b)选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白，

c)凝血剂，其选自：离子溶液或纳米颗粒和Ca++微球偶联物中的药理学上可接受的钙盐；以及

d)耐压缩基质(CRM)；

(2)孵育步骤(1)中的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段。

在另一实施方式中，在步骤(2)之前加入其它成分。

在另一实施方式中，本发明提供制备用于治疗骨缺损、诱导新骨形成和促进骨生长的自体骨移植物替代物组合物的方法，其中，ABGS由如下步骤制备，所述步骤包括：

(1)组合：

a)自体血液，

b)选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-2,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白，

c)凝血剂，其选自：离子溶液或纳米颗粒和Ca++微球偶联物中的药理学上可接受的钙盐；

d)耐压缩基质(CRM)，

(d)任选地，外源提供的体外扩增的来自骨髓、脂肪组织、骨膜层和/或脐带的自体或同种异体间充质细胞(骨祖细胞)群；和/或

(e)任选地，脱矿骨基质；和

(2)孵育步骤(1)中的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段。

(1)组合：

a)自体血液，

b)成骨骨形态形成蛋白，

d)耐压缩基质(CRM)，

(d)反相热敏感生物可吸收聚合物，

(e)任选地，外源提供的体外扩增的来自骨髓、脂肪组织、骨膜层和/或脐带的自体或同种异体间充质细胞(骨祖细胞)群；和/或

(f)任选地，脱矿骨基质；和

(2)孵育步骤(1)中的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段，所述凝结物凝胶具有流变学，这样，其可在室温条件下以液相进行注射，并且，在温度升高至体温(37℃)时，该凝结物凝胶在递送位点/植入位点形成生物相容性凝胶。

本文所述的ABGS可被植入或注射(例如使用注射器)至骨缺损位点或需要进行新骨形成的位点(例如，脊柱融合，骨骼增大)。

优选地，用于本文所述的ABGS组合物中的成骨BMP选自：BMP-2,BMP-4,BMP-5,BMP-6,BMP-7,BMP-8,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。更优选地，所述成骨BMP是BMP-6。

在另一实施方式中，本文所述的ABGS中存在的成骨BMP的量为0.002mg至1mg成骨蛋白BMP(优选地为BMP-6)/ml自体血液。

在另一实施方式中，本文所述的ABGS包含耐压缩基质(CRM)，其选自：骨同种异体移植物，磷酸钙-碳酸钙复合物，生物可吸收聚合物或共聚物以及它们的组合。优选地，磷酸钙-碳酸钙复合物选自：羟磷灰石(HA)，磷酸三钙(TCP)以及它们的组合。

在另一实施方式中，本发明提供制备用于诱导新骨形成的ABGS植入物的套件，其包含：

用于自体血液采集的蝴蝶针组；

包括由橡胶套保护的针的冻干容器架；

连接所述蝴蝶针和所述冻干容器架的无菌管线；

用于释放真空或停止血液流动的管夹；

带有橡胶塞的冻干容器，其中含有与CRM混合的冻干的成骨骨形态形成蛋白BMP；

其中，CRM选自：骨同种异体移植物，羟磷灰石，磷酸三钙，以及它们的组合，成骨骨形态形成蛋白选自：BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。优选地，成骨骨形态形成蛋白是BMP-6。

在另一实施方式中，本发明提供用于制备用于诱导新骨形成的ABGS植入物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

a.自体血液；

b.选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,和BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白；

c.选自骨同种异体移植物，羟磷灰石，磷酸三钙和它们的组合的耐压缩基质(CRM)；

(2)在冻干瓶中混合成骨骨形态形成蛋白水溶液和CRM，其中，加入至CRM中的成骨骨形态形成蛋白水溶液的最优体积为完全润湿CRM；

(3)冻干成骨骨形态形成蛋白和CRM；

(4)添加自体血液；和

(5)孵育步骤(1)中的成分持续足以在CRM周围形成生物机械稳定的凝血块的时间段。

优选地，所述成骨骨形态形成蛋白是BMP-6。

本文所述的自体骨移植物替代物组合物还可用于治疗需要进行新骨形成或新骨生长的多种骨缺损中的任一种。可使用本文所述的ABGS治疗的这些骨缺损包括但不限于：骨干骨折，远端桡骨骨折，胫骨不连，骨质疏松骨折，骨囊肿缺损(例如，必须产生新骨以填充先前囊肿占据的空隙)，骨肿瘤缺损(例如，必须产生新骨以替代癌症缺失的或已经被手术移除的骨)，与先天性骨骼疾病(例如，低磷酸酯酶症，I型神经纤维瘤病，成骨不全)相关的假关节病和假骨折，骨质疏松骨折(例如，脊柱压缩骨折或非典型骨干骨折)，口腔骨缺损(例如，各种不同的牙齿缺损)，牙周缺损以及上颌面缺损或异常(包括颌、面部和头部中的骨增大)。

本文所述的“自体骨移植物替代物(ABGS)”还可用于促进多种整形外科和牙科适应症中的任何一种中的新骨形成，所述适应症包括但不限于：脊柱融合，高位胫骨截骨术以及上颌面增大。在ABGS中，BMP与自体血液凝结物结合，该自体血液凝结物随后由耐压缩基质加固以引导形成新骨组织。因为BMP-6不会过度结合BMP抑制剂Noggin(Song等人,J BiolChem.；285(16):12169-80(2010)，其在骨中富集并且还结合多数用于信号转导的BMP-6I型和II型受体(不像BMP2和BMP7)，所以BMP-6是优选的BMP。自体血液凝结物(ABC)是优选的用于递送BMP的底物，因为多数血浆蛋白与BMP6紧密结合，因此，在七天至十天内可持续且线性释放BMP6。在存在CRM的条件下，ABC还为成骨提供宽容的环境，不会刺激炎症和免疫反应，这与当植入BMP以及作为底物的动物衍生的胶原蛋白时观察到的炎症反应形成鲜明对照。而且，自体血液包含骨祖细胞(间充质干细胞)，其在形成凝结物过程中易于对BMP-6产生响应以在植入位点引起新骨形成。

上述自体骨移植物替代物组合物(ABGS)还可用于提高患有绝经后骨质疏松或高龄骨质疏松或类固醇诱导的骨质疏松的严重的骨质疏松患者体内的股骨头和椎骨体的骨矿物密度。这些严重的骨质疏松患者可能会在摔倒之后发生臀部和椎骨骨折。在这些患者中，可在多个位点将少量ABGS注射至骨小梁骨，从而促进骨生长并且提高股骨头和椎骨体的骨矿物密度。

附图说明

图1显示了由方法#2或#3制备的ABGS的显微照片以及来自志愿者的人血液的CRM。来自组织骨库的人同种异体移植物用作CRM；左边是总图，中间是X射线图，右边是显微CT扫描图。

图2A和图2B显示了ALLO+ABC植入物和ABC+ALLO+rhBMP6植入物在第七天和第35天的植入物(含有来自供体的同种异体移植物/同种异体骨的自体血液凝结物)的组织观察结果。

图2C和图2D显示了第7天和第35天的植入物的ABC/ALLO和ABGS(ABC/ALLO/rhBMP6)的显微CT分析。

图2E和图2F是举例说明大鼠皮下植入物第7天和第35天的ABC+ALLO和ABC+ALLO+rhBMP6的使用显微CT分析所定量的同种异体移植物体积和骨体积的图。

图3A显示了大鼠皮下位点植入的包含同种异体移植物(ALLO)的自体血液凝结块的组织显微照片。

图3B显示了当ALLO颗粒在ABC中进行配制时在大鼠皮下位点植入的组织显微照片。

图3C显示了配制含有ABC+ALLO+rhBMP6，ALLO颗粒的植入物并将其植入大鼠皮下位点时的组织显微照片。

图3D显示了举例说明ALLO，ALLO+ABC和ALLO+ABC+rhBMP6植入物的***性的组织切片的形态计数得到的多核FBGC的平均数的图。

图3E和图3F显示了酸性磷酸酶染色免疫组化表征的组织显微照片。

图4A是举例说明从不带有同种异体移植物和带有不同颗粒尺寸的同种异体移植物的ABGS中释放的rhBMP6的量的图。

图4B和图4C是举例说明从不带有同种异体移植物和带有不同颗粒尺寸的同种异体移植物的ABGS中累积释放rhBMP6的图。

图5显示了兔尺骨中可重现地诱导的新骨形成以及以如第6、9、13、16、19和23周所代表的剂量依赖方式通过射线照相法评估修复的重要尺寸缺损。

图6A和图6C显示了举例说明剂量依赖反应的射线照片以及各个显微CT兔尺骨分析。

图6B显示了图6A的X-射线的射线照相评分。

图6D显示了缺损的骨髓管和骨体积的形态分析。

图7显示了不同rhBMP6剂量条件下兔尺骨缺损的组织切片。

图8A显示了如第6周和第2周所代表的由胶原蛋白中的rhBMP7和自体血液凝结物(ABC)中的rhBMP6治疗的兔尺骨的X-射线。

图8B显示了举例说明如第6周和第2周所代表的由胶原蛋白中的rhBMP7和自体血液凝结物(ABC)中的rhBMP6和仅由胶原蛋白治疗的兔尺骨的X-射线评分的图。

图8C显示了举例说明如第6周和第2周所代表的由胶原蛋白中的rhBMP7和自体血液凝结物(ABC)中的rhBMP6和仅由胶原蛋白治疗的兔尺骨的骨体积(BV)的图。

图8D显示了举例说明BMP6和BMP7依赖头蛋白(Noggin)的活性的图。

图9显示了与单独的ABC和ABC+ALLO相比，带有和不带有ALLO的ABGS在不同的rhBMP6/ml ABC的剂量条件下用于兔的腰椎后外侧融合术(PLF)中的脊柱融合的X-射线图片，显微CT图片和大体解剖学图片。

图10A至图10D显示了举例说明显微CT分析确定的骨体积、小梁数量和小梁间连通性的定量测量结果的图。

图11A显示了ABGS植入物的组织学。其显示了新形成的骨和原生横突之间的界面上通过典型重塑和骨整合形成新骨。

图11B显示了与第0天相比，在ABGSS植入之后21天由ABC/rhBMP6植入物治疗的兔的血清组织学。

图12A显示了由62.5μg/ml rhBMP6和187.5μg/ml rhBMP6以及同种异体移植物骨和工具治疗的羊体内的脊柱融合的X-射线。

图12B显示了μCT扫描之后相同的羊标本。

图12C至图12F显示了脊柱融合骨体积(C)，小梁数量(D)，小梁分离(E)和连通性密度(F)的μCT定量分析。

图13A显示了带有完全与腰椎横突假体(白色箭头)形成一体的新形成的骨的大体解剖学羊脊柱融合样本。

图13B显示了腰椎(白色框)，横突(黑色框)和横突之间新形成的骨(灰色框)的双边四边形的区域，其中，在图13C至图13E中测量了形态参数。横突和新形成的骨的整体的更加精确的横切面在图13B的右侧图中显示(白色箭头)。

图13C至图13E显示了骨体积(C)，结构模型指数(D)和骨厚度(E)的μCT定量分析。

图14显示了手术11周之后羊体内的腰椎前路椎体间融合术(ALIF)的X-射线和μCT扫描。

图15显示了血液凝结物结合BMP6的能力。

图16显示了从加载有BMP的陶瓷中BMP的释放以及Elisa分析测量的在三天的间隔时间内添加ABC对释放的作用。

图17举例说明了用于制备诱导新骨形成的ABGS的套件的示意性立体图。

图18举例说明了用于制备诱导新骨形成的ABGS的套件的示意性侧视图。

图19举例说明了包含冻干的内含物(BMP+CRM)的冻干容器。

图20举例说明了包含围绕冻干的rhBMP-6形成的机械稳定的凝血块和耐压缩基质的冻干容器。

图21显示了在大鼠皮下位点植入在带有磷酸三钙(TCP)的ABC和rhBMP6在第1天、第3天、第7天和第35天分析的磷酸三钙(TCP)。在第35天，在TCP颗粒之间形成新骨(最后一行)。

图22显示了第35天图21中的植入物的高分辨放大图，其表明新形成的骨围绕TCP颗粒，其表征为由骨取代TCP(缓慢取代)(白色箭头)。

图23显示了由2ml大鼠血液制备的并植入在不含BMP6，含有5μg或20μg BMP6的大鼠皮肤下方的富含血小板的血浆(PRP)凝胶。富含BMP6的PRP样品中的新形成的骨由白色圆圈标记。

具体实施方式

本发明提供用于治疗期望的位点处的骨缺损、诱导期望的位点处的新骨形成和促进期望的位点处的新骨生长的自体骨移植物替代物组合物(ABGS)。在有治疗需求的个体体内的特定位点产生骨或修复骨的手术中，根据本发明的ABGS可有利地代替自体移植物使用。根据本发明的一种实施方式的ABGS通过组合(混合)包含自体血液样本，成骨骨形态形成蛋白(优选地为BMP-6)以及耐压缩基质(CRM)的一组成分来形成。所述成分被孵育足以形成凝结物凝胶的时间段。根据本发明的另一实施方式的ABGS可通过如下步骤配制，首先在特定几何形状(例如，颗粒，圆柱或平板)的耐压缩基质上沉淀或冻干成骨骨形态形成蛋白(优选地为BMP-6)并随后添加自体血液并孵育足以围绕成骨骨形态形成蛋白和CRM的冻干组合形成生物机械稳定的凝血块的时间段。

根据本发明的进一步的实施方式的ABGS通过组合(混合)包含自体血液样本，成骨骨形态形成蛋白(优选地为BMP-6)和凝血剂的一组成分来形成。

根据本发明，本文所述的ABGS可易于植入或注射至或施加于需要或期望进行新骨生长的位点。

自体骨移植物替代物(ABGS)实质上在某种程度上模拟“活体自体移植物”：

1)自体骨移植物替代物使用不会引起炎症细胞因子风暴和异物反应的自体血液，因为其遮挡了耐压缩基质的表面(作为颗粒、圆柱体或平板)以遮挡T-细胞识别外来材料(例如，异位位点处的高矿物含量陶瓷)，

2)自体骨移植物替代物使循环中的骨祖细胞陷入血凝结物中，所述血凝结物可立即响应BMP，

3)自体骨移植物替代物不会通过产生抗体而引起免疫反应，不像传统的动物衍生的胶原蛋白那样，传统的动物衍生的胶原蛋白可充当对重组BMP产生免疫反应的佐剂，

4)自体骨移植物替代物允许BMP紧密结合至纤维蛋白网中的血浆蛋白，由此BMP滞留于局部可用或在几天内在植入位点被缓慢释放以活化BMP受体以招募间充质干细胞，产生成骨反应，

5)移植物中的耐压缩基质颗粒是生物相容的并且还提供良好的操作性。而且，矿物内含物(羟磷灰石)会被新形成的骨缓慢取代，

6)因为BMP-6不会过度地结合至头蛋白，该头蛋白是骨中富含的天然BMP抑制剂，因此BMP-6是优选的BMP(Song等人,J Biol Chem.；285(16):12169-80(2010))，自体骨移植物替代物使用相对于BMP-2或BMP-7较低剂量的BMP-6，这降低了安全顾虑并且避免了临床上使用过多剂量的BMP。

根据本发明的另一实施方式的ABGS可通过组合(混合)包含自体血液样本，成骨骨形态形成蛋白(BMP)，耐压缩基质(CRM)和反相热敏感生物可吸收聚合物的一组成分并将该成分孵育足以形成具有流变学的凝结物凝胶的时间段来配制，这样，所述组合物可在室温下以液相被注射并且随着温度升高至体温(合适地37℃)，所述组合物在递送位点/植入位点形成生物相容性凝胶。

为了更加清楚地理解本发明，对下列术语进行定义。术语“骨形态形成蛋白”，“BMP”，“成骨BMP”和“形态形成”是同义的并且是指转化生长因子-β(TGF-β)超家族的特定亚类蛋白质(即，BMP家族)中的任何成员(参见，例如，MassaguéJ(1998)TGF-βsignaltransduction.Annu Rev Biochem 67:753-791；Sampath TK,Rueger DC(1994)Structure,function and orthopedic application of osteogenic protein-1(OP-1).Complications in Orthopedics 9:101-107(1994)；U.S.Patent Nos.4,968,590；5,011,691；5,674,844；6,333,312)。所有这些BMP具有信号肽，前导结构域和羧基末端(成熟)结构域。所述羧基末端结构域是BMP单体的成熟形式并且包含高度保守的由七个半胱氨酸表征的区域称为“7-半胱氨酸结构域”，可形成半胱氨酸结的BMP-家族蛋白的标志(参见，Griffith等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,93:878-883(1996))。

BMP最初使用蛋白质纯化方法分离自哺乳动物的骨(参见，例如，Sampath,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7109-7113(1987)；Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9484-9488(1988)；Sampath,等人,J.Biol.Chem.265:13198-13205(1990)；U.S.PatentNo.5,496,552)。然而，在其他哺乳动物组织和器官中也检测到了BMP并且也已经从其他哺乳动物组织和器官中分离出了BMP，所述其他哺乳动物组织和器官包括肾脏、肝脏、肺、大脑、肌肉、牙齿和肠。BMP还可使用标准体外重组DNA技术进行制备，以在原核细胞培养物或真核细胞培养物中表达(参见，例如，Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2220-2224(1990)；Wozney等人,Science,242:1528-1534(1988))。一些BMP是商售的，也用于局部使用(例如，由Stryker生产的BMP-7用于治疗长骨骨不连骨折(Kalamazoo,Michigan,U.S.)。BMP-2由Wyeth生产并用于长骨急性骨折(Madison,NewJersey,U.S.)，还用于骨移植物中的脊柱融合，所述骨移植物使用处理过的牛I型胶原蛋白海绵载体以及可植入的前凸螺纹融合器(LT/Lumbar Tapered Fusion Device by MedtronicSofamorDanek USA,Inc.；Memphis,Tennessee,U.S.))。

BMP通常以相同单体多肽的二聚体(同源二聚体)存在，所述二聚体通过疏水相互作用和至少一个链间(单体之间)二硫键而保持在一起。在本文所述的组合物和方法中有用的BMP是具有成骨活性的那些BMP，即，能够刺激骨形成。成骨(或“骨诱导”)活性可使用多种标准分析方法中的任一种检测。这些成骨分析方法包括异位骨形成分析方法，其中，包含胶原蛋白和BMP的载体基质被植入于啮齿类动物体内的异位位点并监测骨形成(Sampath TKand Reddi AH Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:7599-7603(1981))。在这种分析方法的变形方法中，可将基质植入于异位位点并且将BMP给药于该位点，例如，通过静脉内注射至啮齿类动物。分析BMP成骨活性的另一方式是用BMP孵育培养的间充质祖细胞并随后监控细胞分化为软骨细胞和/或成骨细胞(参见，例如，Asahina等人,Exp.Cell.Res.,222:38-47(1996))。具有成骨活性并且因此用于本文所述的组合物和方法的BMP包括但不限于：BMP-2,BMP-4,BMP-6,BMP-7,BMP-9,BMP-12,BMP-13以及其异源二聚体，无论BMP是从天然来源(如果有的话)纯化的，由真核细胞(例如，哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，鱼细胞)或原核细胞(例如，细菌细胞)重组生成的，还是全部或部分通过体外蛋白质合成方法生产的。具有成骨活性的BMP还可具有一种或多种其他有益的药理学活性，例如，能够修复或再生受损的软组织或器官(例如，缺血性肾脏(Vukicevic等人,J.Clin.Invest.,102:202-214(1998)))。

术语“药学上可接受的”是指如下材料：其不是生物学上的、化学上的并且不会以任何其他方式不与身体化学物质和代谢物相容并且还不会不利地影响成骨BMP的期望的有效活性或不会不利地影响可根据本发明给药于个体以促进骨生长的组合物中的任何其他成分的期望的有效活性。一个或多个指定的成分或步骤还描述了“基本由相同的指定成分或步骤构成的”相应的更加具体限定的组合物或方法，这是指所述组合物或方法包括指定的必要成分或步骤并且可能还包括不会实质上影响组合物或方法的基本的且新的特性的额外的成分或步骤。还应当理解的是，本文所述的“包括或基本由一种或多种指定的成分或步骤构成的”任何组合物或方法也描述了“由指定的成分或步骤构成的”相应的更加具体限定的并且以封闭的方式限定的组合物或方法，以排除任何其他未指定的成分或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何指定的必要成分或步骤的已知的或公开的等同物可由该成分或步骤取代。除非另有说明，其他术语的含义与本领域技术人员所理解和使用的含义相同，所述领域包括整形外科手术领域，医药领域，免疫领域，生物化学领域，分子生物学领域和组织再生领域。

本文所述的骨移植物替代物中存在的BMP促进祖细胞诱导新骨生长，所述祖细胞存在于或迁移至植入了骨移植物替代物的缺损位点。任何成骨骨形态形成蛋白(BMP)可用于本文所述的组合物和方法中，包括，其类似物，两个BMP的异源二聚体以及两个或多个BMP的组合(混合物)。优选的用于本文所述的骨移植物替代物中的成骨BMP包括但不限于：BMP-2,BMP-4,BMP-5,BMP-6,BMP-7,BMP-9,BMP-12,BMP-13，其异源二聚体以及它们的组合。用于本文所述的骨移植物替代物中的更加优选的成骨BMP选自：BMP-2,BMP-4,BMP-6,BMP-7，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。最优选地，用于本文所述的骨移植物替代物中的BMP是BMP-6。

存在于本文所述的骨移植物替代物中的耐压缩基质(CRM)提供生物相容性支架，其既在结构上支撑也被所植入的自体骨移植物替代物的成骨BMP成分刺激的新骨生长逐渐代替。用于本文所述的自体骨移植物替代物中的CRM包括任何耐压缩基质，该基质目前用于已被批准用于脊柱融合的设备中。目前已批准的脊柱融合设备中的CRM的特性在于：其能够经受由局部脊柱肌肉组织和椎骨施加于植入的骨移植物替代物上的局部作用力。在本文所述的自体骨移植物替代物中使用的CRM包括同种异体移植物(由其他个体而非有治疗需求的个体的骨制备的骨移植物)，生物可吸收聚合物或共聚物(例如，聚乳酸，聚乙交酯，等等)，合成的磷酸钙-碳酸钙复合物(例如，羟磷灰石(HA)，磷酸三钙(TCP)以及它们的组合)。在本文所述的骨移植物替代物中使用的CRM还可包括同种异体移植物和一种或多种磷酸钙-碳酸钙复合物和/或生物可吸收的聚合物或共聚物或它们的组合。在根据本发明的骨移植物替代物中使用的CRM颗粒的颗粒尺寸为74μm至8mm，这使用这些颗粒尺寸的筛网获得。

在本文所述的自体骨移植物替代物中使用的CRM颗粒尺寸为74μm至8mm。优选的CRM几何形状或形状包括基于骨缺损的特定尺寸的圆柱形，平板状，片状或网状。CRM的几何形状或形状可具有选自圆柱形，平板状，片状，网状中的任何一种形状或具有基于骨缺损的其他任何形状。

耐压缩基质的几何形状取决于医学适应症。带有ABC和BMP6的组合物中的CRM颗粒和孔尺寸应当优选地与骨缺损尺寸相容。例如，在牙科应用中，在进行牙齿抽取之后填充骨缺损方面，CRM颗粒尺寸应当为72至420μm，CRM的量为覆盖整个ABGS体积的大约30％。对于***更多的牙科植入物陶瓷的牙科医学中的牙槽嵴增高术而言，CRM颗粒尺寸可优选地为0.5mm至4mm。对于诸如胫骨不连之类的长骨的骨缺损而言，颗粒尺寸为3mm至8mm的CRM可填充长度为1cm至3cm的缺损。对于长骨缺损的长度大于3cm且高达10cm而言，可联合使用ABC和BMP6以及圆柱体或平板形式的CRM。CRM颗粒的孔尺寸大小应当为足以允许血管在其中生长，这将进一步促进原位(骨末端之间)或异位位点(远离骨骼)中的新骨的形成。

而且，对于长骨的骨缺损(例如，胫骨不连)而言，长度为1cm至3cm的缺损可被由合成的磷酸钙-碳酸钙(陶瓷)或颗粒尺寸为3mm至8mm的同种异体移植物构成的CRM填充。对于长度大于3cm且长度高达10cm的长骨缺损而言，圆柱体或平板状的陶瓷可与ABC和BMP6联合使用。优选地，圆柱体或平板可由20％羟磷灰石(HA)和80％磷酸三钙(TCP)制成，其是在连接至血液收集单元的无菌冻干容器中与BMP(优选地BMP6)一同冻干的，所述血液收集单元使得合适量的血液覆盖随后待***在大的骨缺损之间或脊柱椎骨的横突之间的圆柱体或平板，优选地，所述血液收集单元使得合适量的血液覆盖随后待***在腰椎的横突之间的圆柱体或平板，以诱导异位骨形成并支撑两个相邻的腰椎的融合。类似的原理可用于融合胸椎椎骨。陶瓷颗粒的孔尺寸大小应为足以允许血管在其中生长，这将进一步促进原位(骨末端之间)或异位位点(远离骨骼)中的新骨形成。陶瓷圆柱体将具有中心核骨架，用于独特地沿着这种核元件联合单个陶瓷颗粒以提供更好的生物机械稳定结构，用于由于退行性椎间盘疾病而患有腰椎背痛的患者体内的节段骨缺损以及两个或多个椎骨的脊柱融合。

反相热敏感聚合物是泊洛沙姆(Poloxamer)，其可以是由聚氧丙烯(聚(丙烯氧化物))的中心疏水链以及其侧面的两个聚氧乙烯(聚(乙烯氧化物))亲水链构成的非离子三嵌段共聚物。总体参见US3,740,421。泊洛沙姆包括产品Synperonics(Croda Inc.,EdisonNJ)，其具体是泊洛沙姆407，Pluronic(BASF Corporation,Florham Park,NJ)以及Kolliphor(BASF Corporation,Tarrytown,NY)，聚乙氧基化的蓖麻油和血管内阻塞凝胶，该凝胶由20％(盐水中的重量百分比)的纯化的泊洛沙姆407构成。泊洛沙姆407/Pluronic F-127共聚物(乙烯氧化物和丙烯氧化物嵌段)购自BASF(Mount Olive，NJ)，用于当前研究。将聚合物溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至最终聚合物浓度为20％-40％重量/体积。在这个浓度条件下，聚合物表现出热可逆性质，在室温下为流体状态并且在体温下为凝胶状态。例如，20％凝胶通过将20g Pluronic F-127添加至100ml冷PBS中并在4℃下搅拌过夜以适于溶解来制备。随后通过0.22μm过滤器过滤溶液进行灭菌。泊洛沙姆是生物相容的水溶性聚合物家族，其具有反相热敏感性质(即，随温度升高粘度提高)。具体而言，所使用的泊洛沙姆是无毒生物相容的水可溶的并且其粘度随着使用范围内的温度升高而降低。在室温条件下，所述组合物是可注射的但是是有粘性的。在加热至体温之后，该组合物经历温度诱导的相变而不会产生化学组成的有效改变—不会固化—以形成聚合的塞子或平板。在室温条件下或低于室温的条件下，所述组合物的粘度为适于通过注射器注射的粘度，例如，ABGS表现出由带有20G-1.5”的针头的5-15cc注射器递送。ABGS可以是可塑的软粘胶。所述组合物具有重量百分比为50-80％的液体。CRM的平均颗粒尺寸为颗粒筛网测定的70μm至425μm，或1-5mm。所述组合物的成分溶解于/悬浮于自体血液。ABGS可包括放射性对比剂。

本文所述的带有或不带有自体骨髓抽取物或者带有或不带有从自体骨髓或自体脂肪或自体骨膜或同种异体脐带扩增得到的MSC的自体骨移植物替代物组合物(自体血液凝结物/BMP-6/CRM或BMP6/CRM/自体血液凝结物或BMP6/CRM/富含自体或同种异体血小板的血浆或自体血液/BMP-6/CRM/反相热敏感聚合物)提供宽松的微环境以通过克服不理想的反应来诱导有效新骨形成，所述不理想的反应可能由于使用骨同种异体移植物或高矿物(磷酸钙或碳酸钙或硫酸钙)动物衍生的胶原蛋白的合成陶瓷或胶原蛋白-CRM复合物支架而发生，所述胶原蛋白-CRM复合物支架已被批准使用人体内的BMP。具体而言，本文所述的ABGS的植入不会触发快速和强力炎症和免疫反应(“炎症风暴”)和异物反应(多核巨细胞的形成)，所述异物反应可在目前已批准的骨移植物替代物的植入位点(具体在异位位点)发生。“炎症风暴”包括过量浸润，炎症，产生细胞因子的细胞(例如，单核细胞，多形核白细胞，巨噬细胞，成肌纤维细胞，纤维细胞)，免疫反应或异物反应(多核巨细胞的形成)。为了克服CRM/CRM-胶原蛋白复合物激发的炎症风暴和动物衍生的胶原蛋白触发的免疫反应和纤维发生反应，将高浓度BMP用于当前设备中，造成不必要的安全问题考量和远离植入位点的异位骨的形成。在“炎症风暴”过程中，这些炎性/免疫(非祖细胞)细胞群显著多于间充质干细胞(骨祖细胞)群，所述间充质干细胞群在与成骨BMP接触时发生响应形成新骨。非祖细胞的“炎症风暴”的初步触发由于BMP骨移植物替代物中存在当前用作支架的CRM成分而出现。

根据这个观点，在异位位点，被当前批准的骨移植物替代物中的CRM所招募的多核异物巨细胞数量足以影响或否则抑制成骨祖细胞响应成骨BMP和产生骨缺损所需的足够的新骨的能力，或使其消失或数量显著减少。相反，包含在当前批准的骨移植物替代物中发现的类似的或可比较的CRM成分的本文所述的自体骨移植物替代物(ABGS)在植入或施加于需要新骨生长的位点时不会引起细胞的炎症风暴。反而，本文所述的ABGS中的CRM提供了最初的类矿物结构(在凝结物凝胶中)，该最初的类矿物结构在所需治疗中数量和种类，例如修复骨缺损或融合相邻骨节段新骨生长过程中逐渐被吸收和被取代。这种意想不到的生物学的发现说明本文所述的ABGS的自体血液成分负责抑制或干扰由CRM成分触发“炎症风暴”并且通过抑制多核巨细胞的形成抑制异物反应，所述多核巨细胞的形成在不存在凝结物的条件下可能发生。

较强的“炎症风暴”的产生可能是当前已批准的非自体血液凝结物骨移植物替代物(例如批准用于脊柱融合的那些替代物)为什么使用相对较大量的成骨BMP(例如，大于12-40mg/脊柱适应症水平)以促进新骨生长的原因。使用相对较大量的BMP可引起远离局部植入位点的位点处骨形成这一事实使得管理机构担心潜在的不良副作用的发生。相反，本文所述的ABGS包括自体血液凝结物凝胶并且有利地使用显著低于当前已批准的骨移植物替代物设备中的量的BMP以促进新骨生长。通常，本文所述的自体骨移植物替代物组合物中存在的BMP的量比当前已批准的骨移植物替代物设备中使用的BMP量低五倍至二十倍。在非限定性实例中，本发明中的ABGS可包括0.002mg至1mg BMP/ml自体血液。优选地，BMP是BMP-6，其不与头蛋白(其是骨中所富含的天然BMP拮抗剂)结合并且作用横跨大多数I型和II型BMP受体。

任选地，本文所述的ABGS可进一步包含同种异体脱矿骨基质(或“脱矿骨基质”)，其是源自同种异体骨的凝胶组合物并且包含可增强新骨生长的残留因子。由于该基质是凝胶状态，本文所述的ABGS可通过植入(将骨移植物替代物放置在位点内或位点处)或通过注射(例如，使用注射器)给药于需要进行新骨生长的位点。除非另有说明，术语“植入(implanted和implantation)”还可被理解为包含将本文所述的骨移植物替代物通过注射施加于缺损位点。

任选地，ABGS可由获自或扩增自自体骨髓或脂肪组织或者同种异体骨髓或脂肪组织的间充质干细胞(骨祖细胞)增强。在一些情况下，ABGS可富含有来自局部骨、肌肉和筋膜的组织碎片。ABGS的这种细胞/组织增强水平在给定位点处(例如，远端胫骨)和罕见的遗传性疾病(低磷酸酯酶症，I型神经纤维瘤病和成骨不全症)中使BMP的响应细胞最小化的情况下是有优势的。此外，包含反相热敏感生物可吸收聚合物的ABGS将会作为在室温下可注射的并且在体温下达到固体-凝胶样结构而提供生物相容性和易操作性。自体血液的存在可防止由加至ABGS中的CRM引起的炎症风暴并且提供生物相容性，并且自体血液提供“自体移植物”组织等同物。

在一些情况下，ABGS可由代替自体血液(AB)的富含同种异体或自体血小板的血浆(PRP)制备。由于ABGS的各种不同的性质，本文所述的自体骨移植物替代物组合物的优势在于使用获取自有治疗需求的个体的自体移植物的多种治疗中的一种或多种中用于代替“自体移植物”。这样的治疗包括但不限于：脊柱融合，骨骼骨折修复，高位胫骨截骨术，牙科修复，牙周修复，假关节病，与罕见的骨骼疾病相关的假骨折以及上颌面增强。具体而言，本文所述的ABGS用于治疗多种骨缺损中的任一种。这些骨缺损可包括但不限于：骨干骨折，桡骨远端骨折，胫骨不连骨折，骨质疏松骨折(例如，椎骨压缩骨折以及非典型骨干骨折)，骨囊肿(其中，必须产生骨以填充空隙)，骨肿瘤(其中，新骨必须代替因癌症而损失的骨或已由手术移除的骨)，口腔缺损，牙周缺损以及各种不同的上颌面异常现象。本文所述的自体骨移植物替代物的使用有利地扩展了这些手术操作的应用，而不受可安全地从需要这种治疗的个体中获取的自体移植物的量的限制。本发明的可植入组合物仅仅将药学上可接受的成分用于制备。

术语“同种异体移植物”是本领域的术语并且是指已通过无菌方式进行制备用于植入患者体内的来自尸体的骨头。同种异体移植物可通过商业方式获自组织骨库。

术语“失调(disorder)”或“疾病(disease)”是同义的并且是指病理学状态，与病因或病原体无关。骨或其他组织中的“缺损”是指异常或有缺陷的组织生长位点。“疾病或失调”可通过一种或多种组织中的一种或多种缺陷来表征。本文使用的术语“治疗(treatment和treating)”是指缓解疾病或失调的一种或多种症状或表现的任何方案，该方案抑制、遏制或反转(导致逆转)疾病或失调或预防疾病或失调的发作。术语“治疗”包括对疾病的一种或多种症状或表现的预防(防止)，包括改善或抑制一定程度的包括疼痛在内的症状或表现，相反，所述症状或表现可在没有进行治疗的条件下表征疾病。

“治疗有效量”是化合物(例如，成骨BMP蛋白)的促进期望部位的骨生长的量，并且该量是实现期望的终点而言理想的量，所述期望的终点例如但不限于：相邻椎骨的稳定的脊柱融合，用新骨填充骨缺损，骨缺损的远端的架桥，或者纠正或重建口腔或上颌面损伤或异常现象。这样的终点可以通过标准方法学追踪新骨形成来确定，所述标准方法学例如由主治外科医生或其他有技术的医师进行的X-射线或视觉检查。

以“包含”一种或多种指定的成分或步骤在本文中进行描述的组合物或方法是开放式限定方式，其是指所述指定的成分或步骤是必需的，但是其他成分或步骤可添加在所述组合物或方法范围内。为了避免冗长，可以理解的是，本文所述的任何组合物或方法以“包含(或其包含)”来描述。

对陶瓷释放研究的描述

在存在rhBMP6而不存在磷酸钙-碳酸钙复合物的条件下形成的凝结物(下文称为陶瓷)用于进行比较。可以发现，含有rhBMP6/ABC的ABGS最初释放较大的量，该量在10天之后稳定地下降至非常低的水平。

相反，在含有rhBMP6/ABC/陶瓷的ABGS的情况下，10天之后仍然可以看到显著释放。因此，陶瓷具有较长的持续作用。

磷酸三钙(TCP)-羟磷灰石(HA)TPC-HA的颗粒尺寸具有一些效果，但是所有尺寸均可结合BMP。

在预加载了BMP陶瓷但未添加ABC的情况下，至少在6天之后才会观察到早期释放。随后释放在10天并且可能超过10天内逐渐增加。

然而，当预加载的陶瓷与ABC混合时，产生一些释放，随后出现间隔性较少释放。这产生了仅预加载的陶瓷的释放曲线和不带有陶瓷的ABC的释放曲线的结合。最初的释放假设是由于添加了含有来自凝血反应的一些纤溶蛋白酶的ABC产生的。这可在某种程度上修饰了一些BMP，从而减弱了其与陶瓷的结合能力。

对BMP6的修饰以导致释放可能是除去富含精氨酸N-末端环，该N-末端环还包含发夹结合位点。这种最初释放在没有添加ABC的条件下并未观察到。因此，由于添加ABC而发生的释放可能是由于存在于凝结物中的蛋白质或蛋白酶与BMP发生相互作用所致。然而，不是所有BMP可以以这种方式被立即转化，这解释了陶瓷中可滞留BMP。最后，残留的蛋白质酶有更多的时间发挥作用，蛋白酶也将被释放。

这被称为改进：更加延迟并更长期持续释放。

而且，与CRM的结合是非常紧密的(通过100mM磷酸盐进行释放，但在仅盐水/培养基中没有出现释放)。这可总结得到：陶瓷与BMP通过离子相互作用非常紧密地结合，这样在最初的几天里几乎没有释放。这更有利于新骨形成的紧密定位。

并且，这种紧密结合预防过度释放以及骨形成的扩散。

图16举例说明了获自不同颗粒尺寸的陶瓷的BMP6释放结果。陶瓷由CaP(Biomaterials LLC)制成。将不同尺寸的陶瓷放置于艾本德(Eppendorf)管中，每个管中140mg陶瓷。随后，将200μl含有20mM pH为6的甘氨酸缓冲液中的50μg BMP6药物底物的溶液添加至干陶瓷中，其中，所述溶液立即被吸收。随后允许室温下进行相互作用15分钟。

该200μl体积的液体被更细级别的陶瓷颗粒快速吸收，而较大的颗粒具有显著较小的吸收液体的能力。

将带有湿陶瓷的管放入负80摄氏度冰箱中持续30分钟，随后将其转移至-18℃下的带有隔板的GEA SL-2冻干器中并随后冷冻干燥24小时。此时，材料完全干燥并且保持真空稳定在20微巴保留压力下。

随后，用来自RnD***的BMP6 Elisa分析方法对预加载BMP的干燥陶瓷进行为期10天的BMP释放研究。同时，在预加载的冻干基质的管中加入血液，轻微混合之后与陶瓷颗粒可形成凝结物。除去血清后的凝结物中样品也进行10天内BMP释放评估。

而且，为了比较释放动力学，另一种样品“ABC+BMP6”(即，50μg BMP和200μl血液)凝固以形成凝结物，该凝结物中的血清也被除去。

对于测量BMP6的释放而言，上述凝结物样品和不带有ABC的BMP6-基质样品首先分别用1ml组织培养基漂洗一次，随后添加1ml新鲜培养基持续1天。收集1ml作为Elisa检测样品并在3天后更换新鲜培养基。再次进行收集并且在第6天更换培养基，在第10天再次进行收集，用于Elisa分析。

研究结果在图16的小图A至G中显示，其举例说明了由Elisa分析所测试的在第一个10天中体外ABGS中释放rhBMP6。小图A显示了从ABC+BMP6凝结物中的释放，小图B、D和E显示了从不同颗粒尺寸(即，1至4mm(B)，0.5至2.5mm(D)，0.5至1.5mm(E))的陶瓷中的释放。小图C、F和G显示了从带有凝结物的陶瓷中的相应的释放，再次比较粗颗粒，中等颗粒和细颗粒。

比较七个不同的BMP载体(每个140mg，含有50ng rhBMP6)在10天内的BMP6的释放。Y轴显示了释放进入1ml无血清细胞培养基中的BMP6的毫克数，该培养基用于浸泡载体，其中，每隔几天(X轴)更换培养基并通过Elisa进行分析。

小图A：0.14ml ABC+BMP6，不含陶瓷。小图B、D和F显示了带有BMP6但不带有ABC的陶瓷。小图C、E和G显示了带有BMP6并添加有ABC的陶瓷。小图B：大颗粒尺寸陶瓷(1000-4000μm)；小图C：与B相同但添加有ABC；小图D：中等颗粒尺寸的陶瓷(500-2500μm)；小图E：与D相同但添加有ABC；小图F：小颗粒尺寸陶瓷(500-1500μm)，小图G：与F相同但添加有ABC。每个小图中的第一个数据点(W)代表获自载体的首次洗涤(1ml)的BMP6。

结论：预加载有BMP6但不含ABC的陶瓷显示出BMP的延迟释放，而添加有ABC的陶瓷显示出双相释放，初始阶段类似于ABC+BMP6，但是随后持续比ABC+BMP6长得多的时间。因此，组合给出更加均匀并延长的释放。

实施例1：制备自体骨移植物替代物组合物(ABGS)

自体骨移植物替代物(ABGS)由如下成分构成：

1)重组人BMP6(rhBMP6)；

2)自体血液；以及

3)水溶液或纳米颗粒或微球形式的钙盐或锶盐或镁盐(低mM浓度)；或者

1)重组人BMP6(rhBMP6)；

2)自体血液；

3)水溶液或纳米颗粒或微球形式的钙盐或锶盐或镁盐(低mM浓度)；和

4)耐压缩基质(CRM)。

制备方法

方法#1：不带有耐压缩基质(CRM)成分的可比较的骨移植物

可比较的骨移植物由如下成分构成：

1)重组人BMP6(rhBMP6)；

2)自体血液；

3)水溶液或纳米颗粒或微球形式的钙盐或锶盐或镁盐(低mM浓度)。

自体血液抽取自患者的外周或局部采集(局部血液)。对于临床前研究而言，在使用兔子的情况下，自体血液可采集自耳边缘静脉，或者在使用绵羊的情况下，自体血液可采集自颈部静脉，将特定体积的自体血液放入不带有任何抗凝物质，补充有5mM/ml至50mM/ml血液钙盐或锶盐或镁盐(例如，氯化物、碳酸盐、碳酸氢盐、葡糖酸盐)溶液或纳米颗粒或微球溶液形式的管中。将冻干的rhBMP6溶解于少量注射用水(10-500μL)中，随后与自体血液(0.2ml至10ml)混合。在rhBMP6与自体血液混合之后，立即(1分钟之内)将其放置于室温以使其凝结成具有限定结构以及由刚度、弹性和张力决定的流变性质。

方法#2：具有耐压缩基质(CRM)成分的可比较的骨移植物

自体骨移植物替代物(ABGS)由如下成分组成：

1)重组人BMP6(rhBMP6)；

2)自体血液；

3)水溶液或纳米颗粒或微球形式的钙盐或锶盐或镁盐(低mM浓度)；

4)耐压缩基质(CRM)。

自体血液抽取自患者外周或进行局部采集(局部血液)。对于临床前研究而言，在使用兔子的情况下，自体血液采集自耳边缘静脉，或者在使用绵羊的情况下，自体血液采集自颈部静脉，将由适应症特定体积的自体血液放入不带有任何抗凝物质，补充有0.1ml50mM CaCl₂溶液的管中。将冻干的rhBMP6溶解于少量注射用水(10-200μL)中，随后与自体血液混合。在rhBMP6与自体血液混合之后，立即加入颗粒形式的CRM并随后将其放置于室温以凝结成具有限定结构以及由刚度、弹性和张力(参比)决定的流变性质(参考)。

方法#3：带有耐压缩基质(CRM)成分的自体骨移植物替代物

将CRM(颗粒形式或圆柱体形式或平板形式或网状形式)浸泡或充分润湿于溶解于少量(10μL-1000μL)注射用水中的rhBMP6中，并在真空下进行冻干。向冻干的CRM-rhBMP6复合物中加入足量的自体血液，其不含有任何抗凝物质并补充有0.1ml 50mM CaCl₂，随后将其放置于室温下以使其凝结成具有限定结构以及由刚度、弹性和张力(参比)决定的流变性质。

方法#4：带有耐压缩基质(CRM)成分的自体骨移植物替代物

用于制备用于诱导新骨形成的ABGS的方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)组合：

a.自体血液；

b.重组人成骨骨形态形成蛋白BMP-6(rhBMP-6)；

c.选自骨同种异体移植物，羟磷灰石，磷酸三钙以及它们的组合的耐压缩基质12(CRM)；

(2)在冻干容器10中混合rhBMP6的水溶液和耐压缩基质12(CRM)，其中，添加至CRM中的rhBMP-6水溶液的最优体积为完全润湿CRM；

(3)冻干rhBMP-6和耐压缩基质12(CRM)；

(4)添加自体血液；以及

(5)孵育冻干的成骨骨形态形成蛋白和耐压缩基质12(CRM)以及自体血液持续足以围绕冻干的rhBMP-6和耐压缩基质12(CRM)形成生物机械稳定的凝血块13的时间段。

首先，在冻干容器10中将rhBMP6的水溶液与耐压缩基质12(CRM)混合，所述冻干容器10可在真空条件下由橡胶塞9密封并由铝盖或额外的螺旋盖拧压密封。添加至所选择的耐压缩基质12(CRM)的rhBMP6水溶液的最优体积为完全润湿CRM。用于润湿的rhBMP6水溶液的体积可以是仅仅足够的或等于耐压缩基质12(CRM)的体积，这取决于CRM的几何形状(多孔或非多孔，颗粒或圆柱体)。如果水溶液的体积超过了润湿体积，那么可能会沿着冻干容器10的表面产生一些干的rhBMP6。进行冷冻干燥直至完全干燥。在冷冻干燥rhBMP6/CRM之后，将冻干容器10在真空下关闭(橡胶塞推动到底)，优选地储藏冷冻在-20℃或4℃。

其次，自体血液自患者静脉采集(例如通过典型的静脉切开术)至含有冻干的rhBMP6-CRM的真空采血管(如图19所示)。带有夹子3的较长无菌管线5可能会促进血液进入冻干容器10。带有冻干的内容物(rhBMP6+CRM)12的冻干容器10放置于冻干容器架上2以确保安全刺穿冻干容器10的橡胶塞9，确保针1通过隔膜无菌***。针1可被另一橡胶套4保护以进一步确保无菌性。冻干容器架2通过无菌管线5连接至用于静脉切开术的针7并且最初由小塑料软管夹夹住。

图17至图20举例说明了用于制备用于诱导新骨形成的ABGS植入物的套件。例如，用于制备用于诱导新骨形成的ABGS植入物的套件包括：

用于采集自体血液的蝴蝶针组6，7，8；

包括由橡胶套9保护的针1的冻干容器架2；

连接蝴蝶针组6，7，8和冻干容器架2的无菌管线5；

用于释放真空或停止血流的管夹3；

带有橡胶塞9的冻干容器10，其含有与耐压缩基质12(CRM)混合的冻干rhBMP6。

耐压缩基质12(CRM)选自：骨同种异体移植物，羟磷灰石，磷酸三钙以及它们的组合。

冻干容器10可具有任何适于容纳耐压缩基质12(CRM)的形状，其中，耐压缩基质12(CRM)可具有选自圆柱体，平板，片状，网状中的任一种的形状或基于骨缺损的任何其他形状。

实施例#2：CRM评估方法(大鼠皮下植入物)

下列CRM用于制备ABGS：

同种异体移植物

TCP

HA

TCP/HA凝结物

硫酸钙

磷酸钙-碳酸钙复合物(陶瓷)

生物可吸收聚合物

生物可吸收凝胶

下列给定几何形状的CRM用于制造ABGS：

颗粒尺寸为74μm至8mm

CRM可为颗粒形式或可具有选自圆柱形、平板、片状、网站中的任一种的形状或可具有基于骨缺损的任何其他形状

使用实施例#1所述的方法#2或#3，由rhBMP6配制具有各种不同的物理性质的CRM。自体骨移植物替代物组合物ABGS的细胞响应和骨诱导活性通过植入皮下位点或通过经皮注射至啮齿动物的腹部筋膜或骨骼肌袋进行评估。在植入/注射后第1、3、7和12-35天，收获植入物并且通过组织学评估细胞响应和骨形成活性(Sampath,TK.以及Reddi,AH.PNAS1981)。

如下制备ABGS：将0.25ml至0.5ml的大鼠全血与合适量的BMP(例如，2-200μg重组BMP-6/ml血液)混合并随后添加CRM(同种异体移植物，来自供体的同种异体骨(ALLO)或磷酸三钙(TCP)或TCP与羟磷灰石(HA)的复合物)，将其放置60分钟以在1ml注射器中进行凝结。在除去血清之后，体积约为125μl至300μl的ABC被植入体内。大多数rhBMP-6(>95％)结合至ABC。在两个至四个大鼠体内分别测试4个至8个植入物中的每个rhBMP-6剂量的成骨反应。在腋窝以下的腹部皮肤上建立小口袋以植入由自体血液/rhBMP-6/CRM制备的ABGS。将ABGS(约125μl至300μl，不带有血清)植入并单次缝合筋膜并用三针缝合皮肤。为了分析异位骨形成，在植入后28天使用1076显微CT设备(SkyScan，Belgium)扫描动物。在所有动物组中观察到异位骨形成并且通过显微CT分析进行定量。异位骨的定量显示出剂量依赖性。细胞响应和骨形成通过不同时间间隔的组织学进行评估，接着在较高的放大条件下出现更加明显的缓慢取代。

单独的自体血液凝结物(ABC)的皮下植入后1天至3天内招募迁移的间充质干细胞(骨祖细胞)并形成组织胶囊，该胶囊随后在第7天至第9天溶解，而含有rhBMP6植入物的ABC在第7天诱导MSC分化成软骨内成骨，新形成的骨随后在第21天至第35天进行重塑，填充有含有功能性骨髓成分的小骨。图2A和图2B显示了第7天和第35天的ALLO+ABC植入物和ABC+ALLO+rhBMP6植入物的植入物组织学观察结果。在第7天已观察到在含有rhBMP6的植入物中软骨内成骨的形成迹象。在第35天，在ABC/ALLO/rhBMP6植入物之间出现较强的骨形成并且在带有ALLO颗粒的同位点出现了较强的骨形成，该植入物通过典型的骨重塑被缓慢取代(由新形成的骨取代被吸收的同种异体移植物。图2C和图2D显示了如全显微CT显现的第7天和第35天植入物(尤其是ALLO颗粒和不含ALLO颗粒的新形成的重塑的骨)中的ABC/ALLO和ABGS(ABC/ALLO/rhBMP6)的显微CT分析。ALLO和ABC的单独植入无法诱导骨形成并且围绕植入物形成纤维组织样胶囊，随后在第18天至第21天进行内被吸收。在含有rhBMP6的ABC/ALLO植入物中，骨形成可由同种异体移植物的渐进分辨率观察到。图2E和图2F代表了使用显微CT分析所定量的大鼠皮下植入物第7天和第35天的ABC+ALLO和ABC+ALLO+rhBMP6的同种异体移植物体积和骨体积。

实施例#3：自体血液的意想不到的生物活性

大鼠皮下植入物分析用于评估含有CRM的ABGS中的自体血液在克服炎症和异物反应方面所起的作用(使用方法#2或#3，将同种异体移植物和/或合成的陶瓷(磷酸三钙或羟磷灰石或其组合)用于产生ABGS)。在不同剂量条件下测试rhBMP6骨形成活性。ABC/rhBMP6/ALLO植入物由大鼠74μm至420μm的同种异体移植物颗粒加入到0.1g/ml至0.5g/ml自体血液中制成。

为了识别含有植入物的同种异体移植物中的炎症和异物排斥，在第1天、第3天和第7天收获植入物并用H&E/或甲苯胺蓝染色对切片进行染色并且在石蜡包埋的切片上通过组织化学检测酸性磷酸酶。所检测的各个组包括仅同种异体移植物组，与ABC混合的同种异体移植物或含有ABC和25μg rhBMP6/ml自体血液的同种异体移植物，在第7天或第14天从动物中移出植入物并进行异物巨细胞分析。

结果显示当植入于大鼠皮下位点时同种异体移植物(ALLO)颗粒由于异位位点的高矿物含量在第1天至第3天通过招募单核巨噬细胞而诱导炎症和异物反应，所述单核巨噬细胞随后在第7天至第14天融合形成多核异物巨细胞(FBGC)(图3A)。当在ABC内配制ALLO颗粒时，多核FBGC的炎症损害和及其数量显著降低(图3B和图3D)。在含有ABC+ALLO+rhBMP6的ABGS植入物中，有非常少或没有FBGC，ALLO颗粒同位点带有软骨内成骨形成(图3C和图3D)。图3D表示从ALLO，ALLO+ABC和ALLO+ABC+rhBMP6植入物中各***性的组织切片中通过形态计数得到的多核FBGC的平均数。由ALLO植入物招募的多核FBGC细胞还通过酸性磷酸酶染色的免疫组化进行表征，通过添加ABC减少多核FBGC(图3E和图3F)。当使用陶瓷(磷酸三钙或羟磷灰石或其组合)作为CRM时也观察到类似的结果(参见图21)。

实施例#4：ABGS中的rhBMP6体外药代动力学和体外累积释放以及植入物中rhBMP6的滞留

含有人血液和同种异体移植物的ABGS如方法#2或#3所述的那样进行配制。血液样本从健康人志愿者肘静脉处的采集至不含抗凝剂的管中。抽取之后，使血液和同种异体移植物(颗粒尺寸为2mm至5mm或5mm至8mm)以及两种浓度(62.5μg/ml血液或125μg/ml血液)的rhBMP6混合。在完全凝结(60分钟)之后，ABC+rhBMP6+同种异体移植物用1ml基础培养基漂洗。将每种植入物放置在含有3ml Dulbecco改良的Eagle培养基的falcon管中。将管在37℃下孵育10天并在第1、3、6、8和10天更换培养基。从ABC+同种异体移植物中释放到培养基中的BMP6的量通过rhBMP6特异性ELISA(R&D systems,DY507)进行测定。

从不带有同种异体移植物的ABGS中释放的rhBMP6的量和从带有两种不同的颗粒尺寸的同种异体移植物的ABGS中释放的rhBMP6的量在图4A中显示。ABGS是由来自志愿者血液和来自病人诊所的骨组织库中的人同种异体移植物制备。rhBMP6在最初的3-6天内易于释放，随后，释放稳定。虽然包含同种异体移植物的ABGS显示出略微较多的rhBMP6释放，但未达到统计学上显著意义。第1、3、6、8和10天累积的测量释放量以及所计算的从ABGS中的总释放量(％)约为rhBMP6总剂量的3％至9％(图4B至图4C)。同种异体移植物的添加看起来具有略微更多的累积释放。如体外所检测的，rhBMP6主要结合至带有或不带有同种异体移植物的ABGS中的血浆蛋白。rhBMP6的药代动力学可能随着蛋白质被响应细胞摄取以触发软骨内成骨分化而在植入位点处发生改变。

含有陶瓷或ALLO的ABGS中的rhBMP6的结合和释放特性

添加的rhBMP6通过离子相互作用和疏水相互作用紧密地且特异性地结合至陶瓷表面和孔内部，并且需要100mM磷酸盐洗脱结合的蛋白。rhBMP6和凝结物的结合是基于蛋白质-蛋白质的，其中，血浆蛋白和红细胞表面的细胞膜通过疏水相互作用结合，并且rhBMP6和凝结物的结合也可能涉及高亲和性结合至肝素样糖胺聚糖，因为已知BMP6结合硫酸肝素。因此，通过两种(正交)机理将rhBMP6滞留在含有陶瓷-rhBMP6-ABC的ABGS中。

凝结物非常高的结合能力可通过SDS-PAGE和带有抗-BMP6的免疫印迹法演示。(注：由于抗体的交叉反应而在所有泳道的顶部看到一些高分子量背景)。凝结物结合BMP6的能力在图15中显示。泳道2至13显示出添加递增的BMP量在凝结物中用于与BMP结合,，并且随后通过SDS样品缓冲液的溶解定量释放的BMP。甚至添加至800μg/ml血液的情况下，并未在血清上清液中有显著量的BMP6以及未出现凝结物饱和迹象。这很重要，因为没有过量释放BMP，就没有出现过度骨形成。图16显示了如Elisa分析所测量的在3天时间间隔内从预先加载的陶瓷中释放的BMP。

实施例#5：ABGS的目标产品特性：自体移植物模拟物

我们提供了含有分散于自体血液凝结物(ABC)中的重组人BMP6(rhBMP6)以及同种异体移植物(ALLO)颗粒的自体骨移植物替代物(ABGS)，其能够诱导新骨形成。选择BMP6作为优选的骨形态形成蛋白，因为其不会过度结合至头蛋白(Noggin，骨中富含的天然BMP抑制剂)。BMP6还结合至大多数I型和II型BMP受体并且在成骨细胞培养中表现出高特异性碱性磷酸酶活性，因此，使其可在相对于BMP2或BMP7较低的剂量条件发挥作用。选择自体血液凝结物(ABC)作为载体，因为：1)降低炎症，2)提供循环骨祖细胞，3)促进rhBMP6与纤维蛋白网中的血浆蛋白紧密结合并且可被缓慢释放完整蛋白，4)降低免疫反应并且避免产生rhBMP6的抗体，以及5)最终提供允许软骨内成骨分化的环境。ALLO颗粒均匀添加至整个ABC以提供生物相容性，好的操作性和耐压缩性。

含有ABC和ALLO的ABGS被制造为具有明确界定的流变学特质。添加同种异体移植物颗粒降低凝结所需的时间并且改善操作性。我们首次观察到了ABC具有意想不到的固有生物特质，因其可克服由含有较多的Ca/P的矿物(ALLO)在异位位点所引起的异物反应。ABC显著降低了围绕在同种异体移植物颗粒周围多核异物巨细胞的形成从而允许招募间充质干细胞，所述间充质干细胞随后响应rhBMP6效应使软骨内成骨进行分化。rhBMP6的结合和释放特性以及诱导最优骨形成所需的量在带有同种异体移植物或不带有同种异体移植物的ABGS中相似。在加入同种异体移植物的ABGS中新形成的骨是紧实的并且如在大鼠皮下植入物中通过显微CT分析和组织学分析所检测到的，所述新形成的骨随后经历了典型的骨重塑，模拟了自体移植物在原位点处所观察到的新骨成骨。ABGS(ABC/同种异体移植物/rhBMP6)诱导软骨内成骨并且ALLO颗粒通过被缓慢取代而形成新的骨(图22)。包含合成陶瓷的ABGS(ABC/TCP/rhBMP6)在图22中显示。ABGS以剂量依赖的方式以rhBMP6有效剂量为100μg/ml ABC诱导成骨。

牛来源的胶原蛋白亦可用作载体以递送BMP；如中的牛跟腱衍生的酸性可溶的复溶的I型胶原蛋白网或中的作为带有合成的陶瓷的平板状复合物用于递送rhBMP2。如and中，牛干骨衍生的非可溶I型胶原蛋白作为颗粒和/或与CM-纤维素结合作为可注射的软粘胶被用于BMP7/OP1的载体。牛源胶原蛋白是通过化学方法或γ-射线法进行灭菌以用于临床，这为胶原性载体中添加了不想要的修饰。在此，我们提供自体血液凝结物作为天然载体以递送rhBMP6(ABGS)与作为耐压缩基质的同种异体移植物(ALLO)结合以促进腰椎后外侧融合并最小化地降低不利事件，例如：1)在使用动物来源的胶原蛋白佐剂进行递送时产生BMP的抗体，2)由于使用高剂量BMP而易于从植入位点释放出来产生神经炎症，以及3)由于生物机械骨支撑的功能性损伤而引起神经压缩。

实施例#6：ABGS(AB相对对比于富含自体血小板的血浆)

ABGS用源自自体血液(AB)的富含血小板的血浆(PRP)蛋白以及rhBMP6配制与由自体血液凝结物(ABC)进行配制相比较。此外，由ABC和PRP配制的ABGS，ABGS-ABC(仅由ABC配制)，ABGS-PRP(用PRP配制)和ABGS-ABC/PRP(ABC和PRP共同配制)均在大鼠皮下植入分析中检测进行检测。图23显示了由大鼠自体PRP制备并植入大鼠皮在14天之后仍没有形成骨，而在自体PRP中添加5μg和20μg BMP-6后以剂量依赖方式诱导新骨(白色圆圈中所示)。

实施例#7：预测临床结果所进行的临床前研究

兔体内的骨干节段缺损模型

ABGS在闭合临界骨尺寸缺损方面的功效在兔尺骨节段缺损模型中进行检测。1.5ml的ABC自兔耳边缘静脉采集。将25μg，50μg和100μg rhBMP6和浓度为50mM的氯化钙加至血液中并通过旋转管进行混合。ABC+rhBMP6在注射器中将其放置于室温以使其凝结60-90分钟来制备。液体部分(血清)被清除，将同质的、凝聚的、可注射的且可塑的ABGS凝胶留待使用。

实验在雄性实验用兔(穴兔(Oryctolagus cuniculus)，新西兰品种，10周龄(体重为2.3-2.5kg))进行规程操作。将动物随机分为四组(每组n＝5)：A)对照：仅使用ABC填充骨缺损处；B)使用ABC+rhBMP6(25μg/ml)填充缺损；C)使用ABC+rhBMP6(50μg/ml)填充缺损；以及D)使用ABC+rhBMP6(100μg/ml)填充缺损。在另一实验中(每组n＝5)，将ABGS(1.5ml ABC+rhBMP6(100μg/ml))与胶原蛋白(150mg)+rhBMP7(100μg/100mg)在植入之后第2周和第8周进行比较。

17mm(大缺损)的尺骨节段被移走以造成缺损并将ABGS植入缺损位点，桡骨保持完整维持机械稳定性，无需使用内部或外部的设备固定。右前肢的影像学放射图片在手术之后并在23周骨愈合时间段内获取。在实验过程中，没有出现副作用。通过影像学放射线照相术，显微CT定量和组织学方法分析愈合结果。

单独植入ABC没有引起新骨的形成并且未能实现缺损的减少(图5)。然而，通过影像学可见，含有rhBMP6的ABC以可重现的方式诱导新骨形成并且修复缺损。在第6周、第9周、第13周、第16周、第19周和第23周所显示的新骨以剂量依赖的方式被诱导生成(图5)，在第23周显示出所有兔尺骨(图6A和图6C)。显微CT分析检测到，通过骨体积(BV)和骨髓体积(MV)分析，骨质量以剂量依赖的方式增加，达到类似于对侧的完整骨。(图6D)。通过组织学进一步确定了骨质量，如图7中展示的每组中的代表性样品(图7)。剂量为100μg rhBMP6/mlABC导致皮质建立以及重塑髓管而完全修复。组织学评估确认100μg rhBMP6/ml ABC的治疗使兔体内的尺骨临界性尺寸缺损完全闭合(图7)。

在相同模型中，我们平行比较了rhBMP7/牛骨胶原蛋白设备与ABGS(rhBMP6/ABC)。单独的胶原蛋白无法诱导骨形成，但是含有rhBMP7的胶原蛋白诱导新骨形成(图8A)。rhBMP7/牛骨胶原蛋白商售设备包含3.5mg rhBMP7/g胶原蛋白，为了填充兔尺骨缺损，我们使用300mg的胶原蛋白，其中，胶原蛋白载体中的rhBMP7的总量为1.06mg。如图8A所示，将该rhBMP7/胶原蛋白诱导的尺骨缺损的减少与ABGS(1.5ml血液中100μg rhBMP6)进行比较。在第2周和第6周ABGS诱导新的均匀的骨的形成并且经历重塑以重建相邻宿主骨的新皮质，而rhBMP7/胶原蛋白的骨形成被延迟。显微CT分析确认了含有rhBMP6的ABGS在手术后第8周诱导形成大约2倍多的骨体积(图8B至图8C)。

该临床前研究的结果使得我们能够(1)对具有远端桡骨骨折(DRF)的患者进行试验疗法(First-in-Human，FIH)随机的安慰剂对照的且双盲的临床I期安全研究以及(2)对具有高位胫骨截骨术(HTO)的患者进行试验疗法(First-in-Human，FIH)随机的安慰剂对照的且双盲的临床I/II期药效以及安全性研究。

兔体内腰椎后外侧融合术(PLF)研究

评估腰椎后外侧融合术(PLF)兔模型中ABGS的脊柱融合骨诱导活性。在雄性新西兰白色实验兔(穴兔(Oryctolaguscuniculus)，新西兰品种，14周龄，体重为3kg至5kg)体内进行研究规程操作。28只骨骼成熟的兔经历腰椎L5-L647之间的双外侧横突间融合。将动物分成七个实验组，每组4支，分别为：单独的ABC作为对照；带有50μg(0.05mg/ml，125μg/设备)rhBMP6的ABC，带有100μg(0.1mg/ml，250μg/设备)rhBMP6的ABC，带有200μg(0.2mg/ml，500μg/设备)rhBMP6，ABC加200μ(0.2mg/ml；500μg/设备)和灭活的兔骨同种异体移植物(0.3g/ml)，ABC加400μg(0.4mg/ml；1000μg/设备)rhBMP6和灭活的兔骨同种异体移植物(0.3g/ml),带有400μg(0.4mg/ml，1000μg/设备)rhBMP6和灭活的兔骨同种异体移植物(0.3g/ml)，不带有rhBMP6的ABC和灭活的兔骨同种异体移植物(0.3g/ml)作为对照。设备制剂中的ABC的体积为2.5ml/植入侧。

图9显示了如与单独的ABC和ABC+ALLO组相比的，不同剂量rhBMP6/ml ABC条件下带有ALLO和不带有ALLO的ABGS的X-射线图片，显微-CT图片和大体解剖学图片。通过ABGS在两个两侧横突之间新形成的骨是紧密的并且在植入物中均匀分布，并可从围绕植入物外周的软组织分离，如在第14周所检测到的。含有rhBMP6浓度为50μg/ml ABC(125μg/植入物)的组显示出新骨形成，但在4只兔子中只有两只中实现融合，这说明rhBMP6的量可能不足。在rhBMP6 100μg/ml ABC(250μg/植入物)的条件下，在所有兔体内观察到完全融合。在rhBMP6200μg/ml ABC(500μg/植入物)的条件下，所有兔再次显示出在两侧发生融合但不并未多于在100μg/ml ABC组中所观察到的量。因为ALLO能够诱导炎症并且形成多核FBGC，我们配制了包含2x200μg/ml ABC的rhBMP6或4x 400μg/ml ABC的rhBMP6(500或1000μg/植入物)的ABGS植入物。包含200μg/ml ABC(500μg/植入物)的rhBMP6的ABGS+ALLO诱导完全融合，骨体积可与具有100μg/ABC的rhBMP6(250μg/植入物)的ABGS的骨体积相媲美，并且，rhBMP6的量增加至400μg/ml ABC(1000μg/植入物)不会进一步增加骨体积。仅具有ABC的组或具有ABC+ALLO的组没有融合，即使ABC本身含有内源循环骨祖细胞和ALLO颗粒中存在生长因子以及ALLO被吸收之后可释放内源BMP。横突之间的接触区域以及新形成的骨是无法区分的并且融合至一个连续的骨节段。图10A至图10D显示了显微-CT分析确定的骨体积、小梁数量和小梁间连接性的定量测量结果。ABGS在rhBMP6为100μg/ml ABC时看起来是最佳剂量并且剂量加倍并未必然地增加骨形成参数。包含200或400μg/mL ABC的rhBMP6的ABGS+ALLO植入物也导致新骨形成，其作用可与不带有ALLO且rhBMP6浓度为100μg/mL ABC的ABGS相比。

ABGS植入物的组织学显示出典型重塑的新骨形成以及在新形成的骨和天然横突之间的界面上的骨整合(图11A)。在含有ALLO植入物的ABGS中，新形成的骨经历快速骨重塑并ALLO颗粒被完全同化，并且通过缓慢取代而最终将其取代，如在200μg/ml(500μg/植入物)在低倍和高倍放大条件下在ABC/rhBMP6/ALLO中所显示的(图11A)。ABC/ALLO的组织学显示出除了纤维组织形成之外缺乏新骨形成。而且，值得一提的是，如与第0天相比，在ABGS植入之后第21天在由ABC/rhBMP6植入物治疗的兔的血清中没有检测到抗-rhBMP6抗体(图11B)。图11C和图11D举例说明了在1mg和2mg rhBMP6条件下在第0天和第21天依赖于血清稀释的吸光度。

绵羊体内腰椎后外侧融合术(PLF)

在雌性绵羊(盘羊属(Ovis spp.)，混合品种，年龄为2岁至3岁，带有健康证明文件，体重为60kg至70kg)体内进行研究规程操作。

在绵羊体内进行两种不同的PLF实验。在第一实验中，8只雌性绵羊采用单独的ABC(n＝2)和含有62.5μg/ml(0.5mg总量)的rhBMP6但无需使用工具的ABC(n＝6)治疗。在第二实验中，14只绵羊给于含有187.5μg/ml(1.5mg总量)rhBMP6的ABC。将动物分为三组：A组，单独的ABC(n＝2)，B组，带有工具的ABC/rhBMP6(n＝6)，以及C组，带有工具的ABC/rhBMP6/和失活的绵羊同种异体移植物(2g/植入物)(n＝6)。手术在全身麻醉下进行，并且由相同的手术团队对所有动物进行手术。用于植入物制备的自体血液样本(16mL)采集自动物的颈部静脉并且制备用于每个动物的两侧的两个植入物(每个8mL)，在横突的侧面进行去皮质术直至出血明显，之后将植入物植入。将绵羊随机分组并接受双侧放置于横突和椎板处的合适的植入物。手术后由兽医立即进行术后和第8周和第27周研究结束的临床和放射线成像监控。在实验过程中，在任何实验组中均未观察到不利作用。

我们评估了不带有ALLO且rhBMP6剂量为62.5μg/ml ABC(0.5mg/植入物)或rhBMP6剂量为187.5μg/ml ABC(1.5mg/植入物)的ABGS。如通过X-射线(图12A)和显微CT(图12B)所检测的，植入后6个月两组均诱导新骨生成并且实现完全融合。两种剂量之间形成的骨的量没有明显不同，这说明rhBMP6的剂量在约100μg/mL ABC的范围内看起来是有效剂量并且在兔和绵羊PLF研究中有效剂量范围内没有出现明显不同。对带有ALLO且rhBMP6的量为187.5μg/mL ABC(1.5mg/植入物)的带有且不带有工具的ABGS的检测也诱导新骨生成并且显示出新骨生成显著多于不带有ALLO的ABGS(图12C至图12F)。由ABGS和工具治疗的绵羊的双侧新骨形成成功率为约83％(2/12植入物没有完全融合)，而将同种异体移植物骨添加至ABGS使融合的成功率提高至93％(1/12植入物没有完全融合)(参见，图12)。

绵羊PLF研究的双侧和横向横突之间的空间的带有新生成的骨的脊柱融合的大体解剖学显微照片在图13A中显示，来自代表性的绵羊的相同的显微CT-分析在图13B中显示。异位位点处新生成的骨和天然横突之间的骨整合是不可区分的并且融合是紧密的且较强的。显微-CT分析检测的骨体积，结构模型指数和新融合的骨的骨厚度以及相邻的天然横突和腰椎的定量测量结果在图13C至图13E中显示。与天然横突骨和相邻的腰椎相比，新生成的骨具有增加的骨体积，小梁数量和小梁间连接性。界定ALLO颗粒的剂量和物理特性以及在绵羊体内单个节段和多节段的横突之间长期持续成功进行腰椎融合所需的量(质量/ABC体积)的实验正在进行中。兔和绵羊PLF的研究结果使得我们能够(3)评估随机双盲对照II期中针对自体移植物的腰椎后外侧融合(PLF)的有效性。

绵羊体内的腰椎椎体间融合研究

本实验在绵羊体内测试了带有rhBMP6的ABGS在植入DePuy Cervical CFRP I/F融合器之后腰椎前路椎体融合方面的效力。10只雌性绵羊(美利奴羊，Merinolandschafbreed，年龄3岁至4岁，体重50kg至60kg)用于实验并将其分为两个实验组，即，对照组：填充有不含rhBMP6的ABC的融合器(n＝4)，以及实验组：填充有含有250μg/ml rhBMP6的自体血液凝结物的融合器(n＝5)。

手术在全身麻醉下进行并且由同一的手术团队对所有动物进行手术。用于植入物制备的血液样本(2ml)从颈部静脉采集。融合器由碳纤维加固的聚合物制成并且融合器的宽度/深度/高度为15mm x 12mm x 5mm。在切除椎间盘(L5-L6)并且锉磨端板的软骨之后，将填充有约1cc血液凝结物融合器植入椎体间，而将剩下的1cc凝结物围绕融合器两侧分布。绵羊在手术之后立即和7周和11周之后实行临床和放射线照相监控。

达到融合成熟的时间长度通过手术检查、放射线照相术和μCT分析来评估。在持续一致的参数条件下拍照形成脊柱的前后和侧面平片放射线图片。融合的状态在未加修饰的平片放射线图片上评估。由三个不知情的整形外科手术医生独立地评价放射线照片。计算机断层扫描以评估横截面和三个维度上的融合。

实验在手术后第11周终止并且，除一只来自对照组的绵羊由于呼吸感染而死亡外所有动物均存活。没有记录任何与死亡率，部分或全部麻痹，神经刺激和/或疼痛，食物摄取减少和体重减少有关的副作用。没有观察到异位骨化，水肿或任何其他可见的形态改变。在接受rhBMP6的绵羊体内，在融合器内部和外部出现新生成的骨(n＝5)，并且新骨与两个椎体融合。在对照动物的融合器内有一些骨生成，但是融合不完全。在由带有rhBMP6的ABGS治疗的绵羊体内新生成的骨的骨体积和厚度显著高于对照动物。11周之后绵羊体内的腰椎前路椎体间脊柱融合(ALIF)模型的结果在图14中显示。

参考图14的X-射线照片，对照组两个椎体(黑色箭头)之间的空间并未被新生成的骨融合，如μCT扫描中白色箭头所指示的融合器内部的骨和红色箭头所指示的融合器外部的空间(侧视和仰视)所证明的。在由ABGS和rhBMP6治疗的绵羊的X-射线照片中，两个相邻的椎体之间具有新生成的骨，这在μCT扫描中通过连续的骨(侧视和仰视方向上的白色箭头)和融合器外部的空白空间(侧视和仰视方向上的深色箭头)得到证实。使用用于ALIF的椎间融合器(人)的该绵羊实验表明，与对照动物体内的不完全融合相比，带有rhBMP6(250μg/ml)的ABGS导致两个相邻腰椎的完全融合。

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Claims

1.一种用于诱导新骨形成，促进骨生长和治疗骨缺损的自体骨移植物替代物组合物(ABGS)，其中，所述组合物包含:

(i)自体血液；

(ii)选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白；

(iii)耐压缩基质(CRM)；和

(iv)凝血剂；

其中，所述自体血液形成包含成骨骨形态形成蛋白和耐压缩基质CRM的凝结物凝胶。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述自体血液还包含富含血小板的血浆(PRP)，其中，自体血液和富含血小板的血浆(PRP)的比例为1:1，2:1和3:1，优选为1:1。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述自体血液被富含血小板的血浆(PRP)代替。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述凝血剂是离子溶液或纳米颗粒和Ca⁺⁺微球的偶联物中的药理学上可接受的钙盐。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述耐压缩基质(CRM)选自：骨同种异体移植物，磷酸钙-碳酸钙复合物，生物可吸收聚合物或共聚物，硫酸钙，生物可吸收水凝胶以及它们的组合。

6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述磷酸钙-碳酸钙复合物选自：羟磷灰石(HA)，磷酸三钙(TCP)以及它们的组合。

7.如权利要求5或6所述的组合物，其中，所述耐压缩基质(CRM)的颗粒尺寸为74μm至8mm，所述颗粒尺寸取决于骨缺损。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，所述耐压缩基质(CRM)具有选自圆柱体、平板、片状、网状中任一种的形状或基于骨缺损的任何其他形状。

9.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的自体骨髓抽出物群，所述自体骨髓抽出物含有骨祖细胞。

10.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的体外扩增的间充质干细胞群。

11.如权利要求10所述的组合物，其中，外源提供的体外扩增的间充质干细胞群是来自骨髓、脂肪组织、骨膜或脐带的自体的或免疫匹配的同种异体的间充质干细胞群。

12.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含来自患者相邻局部骨、骨骼肌和/或筋膜的外源提供的切碎的组织碎片。

13.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含同种异体脱矿骨基质。

14.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的富含血小板的血浆(PRP)，其是纤连蛋白网和/或选自PDGF,IGF,VEGF和TGF-β的生长因子的来源。

15.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含反相热敏感生物可降解聚合物。

16.如权利要求15所述的组合物，其中，所述反相热敏感生物可降解聚合物是选自乙烯氧化物和丙烯氧化物嵌段的pluronate。

17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中，所述成骨蛋白是BMP-6。

18.如权利要求17所述的组合物，其中，每ml自体血液中存在0.002mg成骨蛋白BMP-6至1mg成骨蛋白BMP-6。

19.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中，每ml自体血液中存在0.002mg至1mg成骨蛋白BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。

20.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是可注射的、可挤压的或可植入的。

21.权利要求1至20中任一项所述的组合物的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

a)自体血液、或自体血液和富含血小板的血浆(PRP)、或富含血小板的血浆(PRP)；

b)选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13，其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白；

c)耐压缩基质(CRM)，以及

d)凝血剂；

(2)孵育步骤(1)中的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段。

22.如权利要求21所述的制备方法，其中，在步骤(2)之前还添加自体骨移植物替代物组合物的成分。

23.如权利要求22所述的制备方法，其中，所述方法还包括如下步骤:

(1)组合：

a)自体血液，

c)耐压缩基质(CRM)；

d)凝血剂；

e)任选地，外源提供的来自骨髓、脂肪组织、骨膜层或脐带的体外扩增的自体或同种异体间充质细胞群；和/或

f)任选地，脱矿骨基质；

(2)孵育步骤(1)的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段。

24.如权利要求22所述的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

a)自体血液；

c)耐压缩基质(CRM)；

d)凝血剂；

e)反相热敏感生物可吸收聚合物；

f)任选地，外源提供的来自骨髓、脂肪组织、骨膜层或脐带的体外扩增的自体或同种异体间充质细胞群；和/或

g)任选地，脱矿骨基质；

(2)孵育步骤(1)的成分持续足以形成具有流变学的凝结物凝胶的时间段，这样，所述凝结物凝胶可在室温下以液相进行注射并且随温度升高至体温在递送位点/植入位点形成生物相容性凝胶。

25.权利要求1至20中任一项所述的组合物用于治疗有治疗需求的个体体内的特定位点处需要新骨形成的骨缺损、促进骨生长和/或在手术中诱导骨产生或骨修复。

26.权利要求25中所述的组合物用于治疗腰椎后外侧融合术，腰椎前路椎体间融合术，成人脊柱侧凸，外伤(脊柱重建)，上颌面颅骨重建或高位胫骨截骨术。

27.一种用于诱导新骨形成、促进骨生长以及治疗骨缺损的自体骨移植物替代物组合物(ABGS)，其中，所述组合物包括：

(i)自体血液；

(iii)凝血剂；

其中，所述自体血液形成包含成骨骨形态形成蛋白和自体凝血剂的凝结物凝胶。

28.如权利要求27所述的组合物，其中，所述自体血液还包含富含血小板的血浆(PRP)，其中，所述自体血液和所述富含血小板的血浆(PRP)的比例为1:1，2:1和3:1，优选地为1:1。

29.如权利要求27所述的组合物，其中，所述自体血液被富含血小板的血浆(PRP)代替。

30.如权利要求27所述的组合物，其中，所述凝血剂是离子溶液或纳米颗粒和Ca⁺⁺微球偶联物中的药理学上可接受的钙盐。

31.如权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的包含骨祖细胞的自体骨髓抽取物群。

32.如权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的体外扩增的间充质干细胞群。

33.如权利要求32所述的组合物，其中，所述外源提供的体外扩增的间充质干细胞群是来自骨髓、脂肪组织、骨膜或脐带的自体的或免疫匹配的同种异体的间充质干细胞群。

34.如权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的来自患者相邻局部骨、骨骼肌和/或筋膜的切碎的组织碎片。

35.如权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含同种异体脱矿骨基质。

36.如权利要求27所述的组合物，其中，所述组合物还包含外源提供的富含血小板的血浆(PRP)，其是纤维蛋白网和/或选自PDGF,IGF,VEGF和TGF-β的生长因子的来源。

37.如权利要求27所述的组合物，其中，所述组合物还包含反相热敏感生物可降解聚合物。

38.如权利要求37所述的组合物，其中，所述反相热敏感生物可降解聚合物是选自乙烯氧化物和丙烯氧化物嵌段的pluronate。

39.如权利要求27至38中任一项所述的组合物，其中，所述成骨蛋白是BMP-6。

40.如权利要求39所述的组合物，其中，每ml自体血液中存在0.002mg至1mg成骨蛋白BMP-6。

41.如权利要求27至38中任一项所述的组合物，其中，每ml自体血液中存在0.002mg至1mg成骨蛋白BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13,其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。

42.如权利要求27至41中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是可注射的、可挤压的或可植入的。

43.权利要求27至42中任一项所述的组合物的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

b)选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13,其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白；

d)凝血剂；以及

(2)孵育步骤(1)中的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段。

44.如权利要求43所述的制备方法，其中，在步骤(2)之前还添加自体骨移植物替代物组合物的成分。

45.如权利要求44所述的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

a)自体血液；

d)凝血剂；

e)任选地，外源提供的来自骨髓、脂肪组织、骨膜层或脐带的体外扩增的自体或同种异体间充质细胞群，和/或

f)任选地，脱矿骨基质；以及

(2)孵育步骤(1)的成分持续足以形成凝结物凝胶的时间段。

46.如权利要求44所述的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

a)自体血液；

d)凝血剂；

e)反相热敏感生物可降解聚合物；

f)任选地，脱矿骨基质；以及

(2)孵育步骤(1)的成分持续足以形成具有流变学的凝结物凝胶的时间段，这样，所述凝结物凝胶在室温下以液相形式被注射并且在温度升高至体温时在递送位点/植入位点形成生物相容性凝胶。

47.权利要求27至42任一项所述的组合物用于治疗有治疗需求的个体体内的特定位点处需要新骨形成的骨缺损、促进骨生长和/或在手术中诱导骨产生或骨修复。

48.权利要求47所述的组合物用于治疗与长骨和脊柱有关的假关节病，胫骨不连骨折，低磷酸酯酶症，成骨不全，I型神经纤维瘤病，非典型骨质疏松骨折，牙科适应症，牙周修复，牙科/骨植入物，牙槽嵴增高术，骨质疏松骨折，非典型股骨骨折，椎体骨折或远端桡骨骨折。

49.用于诱导新骨形成的植入物的自体骨移植物替代物组合物(ABGS)，其中，所述组合物包含：

(i)自体血液；

(ii)选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13,其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白；

(iii)耐压缩基质(CRM)；并且

50.如权利要求49所述的组合物，其中，所述耐压缩基质(CRM)选自骨同种异体移植物和/或磷酸钙-碳酸钙复合物。

51.如权利要求50所述的组合物，其中，所述磷酸钙-碳酸钙复合物选自羟磷灰石(HA)，磷酸三钙(TCP)以及它们的组合。

52.如权利要求50或51所述的组合物，其中，所述耐压缩基质(CRM)的颗粒尺寸为74μm至8mm，所述颗粒尺寸取决于骨缺损。

53.如权利要求49至52中任一项所述的组合物，其中，所述耐压缩基质(CRM)具有选自圆柱形，平板，片状，网状中的任一种形状或具有基于骨缺损的任何其他形状。

54.如权利要求49至53中任一项所述的组合物，其中，所述成骨骨形态形成蛋白优选地为BMP-6。

55.如权利要求49至53中任一项所述的组合物，其中，每ml自体血液中存在0.002mg至1mg的成骨骨形态形成蛋白BMP-6。

56.如权利要求49至53中任一项所述的组合物，其中，每ml自体血液中存在0.002mg至1mg的BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13,其类似物，其异源二聚体以及它们的组合。

57.如权利要求49至56中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是可植入的。

58.一种用于制备用于诱导新骨形成的自体骨移植物替代物组合物植入物的套件，其包括：

用于采集自体血液的蝴蝶针组(6，7，8)；

包含由橡胶套(4)保护的针(1)的冻干容器架(2)；

连接所述蝴蝶针组(6，7，8)和所述冻干容器架(2)的无菌管线(5)；

用于释放真空或停止自体血液流动的管夹(3)；

用于容纳混合有耐压缩基质(12)(CRM)的冻干的BMP-6的冻干容器(10)，其包括橡胶塞(9)。

59.如权利要求58所述的套件，其中，所述耐压缩基质(12)(CRM)选自骨同种异体移植物，羟磷灰石，磷酸三钙以及它们的组合。

60.如权利要求59所述的套件，其中，所述耐压缩基质(CRM)的颗粒尺寸为74μm至8mm，所述颗粒尺寸取决于骨缺损。

61.如权利要求58至60中任一项所述的套件，其中，所述耐压缩基质(CRM)具有选自圆柱形，平板，片状，网状中的任一种形状或具有基于骨缺损的任何其他形状。

62.用于制备权利要求49至57中任一项所述的用于诱导新骨形成的自体骨移植物替代物组合物植入物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)组合：

a.自体血液；

b.选自BMP-6,BMP-2,BMP-7,BMP-4,BMP-5,BMP-8,BMP-9,BMP-12,BMP-13,其类似物，其异源二聚体以及它们的组合的成骨骨形态形成蛋白；

c.选自骨同种异体移植物，羟磷灰石，磷酸三钙以及它们的组合的耐压缩基质(12)(CRM)；

(2)在冻干容器(10)中混合成骨骨形态形成蛋白的水溶液和所述耐压缩基质(12)(CRM)，其中，加至耐压缩基质(12)CRM中的成骨骨形态形成蛋白的水溶液的最优体积为完全润湿所述耐压缩基质(12)CRM；

(3)冻干所述成骨骨形态形成蛋白和所述耐压缩基质(12)CRM；

(4)添加自体血液；以及

(5)孵育冻干的成骨骨形态形成蛋白和耐压缩基质(12)(CRM)以及自体血液持续足以围绕冻干的成骨骨形态形成蛋白和耐压缩基质(12)(CRM)形成生物机械稳定的凝血块(13)的时间段。

63.如权利要求62所述的方法，其中，所述成骨骨形态形成蛋白优选地为BMP-6。

64.权利要求49至57中任一项所述的组合物用于治疗有治疗需求的个体体内的特定位点处需要新骨形成的骨缺损。

65.权利要求64所述的组合物用于治疗腰椎后外侧融合术，腰椎椎体间融合术，成人脊柱侧凸，外伤(脊柱重建)，上颌面颅骨重建或高位胫骨截骨术。