CN110607360A - 一种评估慢性心力衰竭预后的引物组、试剂盒及评估慢性心力衰竭预后的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评估慢性心力衰竭预后的引物组、试剂盒及评估慢性心力衰竭预后的方法，属于基因检测领域。所述引物组包括：第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物、第四下游引物、第五上游引物、第五下游引物、第六上游引物、第六下游引物、第七上游引物、第七下游引物、第八上游引物和第八下游引物。引物组扩增的基因分别对应预后敏感的八个风险等位基因，能够保证评估结果的准确性和全面性；该方法通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与预后相关的突变，从而判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种评估慢性心力衰竭预后的引物组、试剂盒及评估慢性心力衰竭预后的方法。
背景技术
慢性心力衰竭是心血管疾病的终末状态以心脏射血分数不能满足机体需要而产生的，主要临床症状为慢性疲劳、气短、呼吸困难、肺淤血和水肿。在普通人群中，女性患病高于男性，患病率为9/1000，目前我国约有400万慢性心力衰竭患者。虽然当前有新的药物及辅助设施用于治疗慢性心力衰竭，但慢性心力衰竭的预后不佳，五年的生存率与恶性肿瘤相当，故早期进行预后评估，并通过评估结果进行积极治疗极为重要。
现有的慢性心力衰竭的预后评估技术主要为氨基末端脑钠尿肽(NT-proBNP)检测和中心动脉压检查。NT-proBNP检测是利用心脏功能标志物NT-proBNP水平反映慢性心衰病情的恶化程度，该检测方法虽然已经广泛应用于慢性心力衰竭的评估，但该检测方法的精确性会受年龄和肥胖程度的影响。中心动脉压检查会给患者带来创伤，通常适用于慢性心力衰竭的急危重患者。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的引物组、试剂盒及评估慢性心力衰竭预后的方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的引物组，所述引物组包括：第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物、第四下游引物、第五上游引物、第五下游引物、第六上游引物、第六下游引物、第七上游引物、第七下游引物、第八上游引物和第八下游引物，所述第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述第二上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述第三上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述第三下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述第四上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述第四下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，所述第五上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，所述第五下游引物的序列如序列表中SEQ IDNO:10所示，所述第六上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述第六下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:12所示，所述第七上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，所述第七下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:14所示，所述第八上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:15所示，所述第八下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的试剂盒，所述试剂盒包括：上述引物组。
具体地，所述试剂盒还包括：TaKaRa Ex Taq HS、10×Ex Taq、dNTP Mixture、Primer Pool 1/2、基因组DNA和灭菌水。
再一方面，本发明实施例提供了一种采用上述引物组评估慢性心力衰竭预后的方法，所述方法包括：
提取待测样本的基因组DNA；
通过所述引物组扩增所述基因组DNA，得到八个扩增产物；
将所述八个扩增产物分别进行桑格测序，得到八个测序产物，每个所述测序产物均为纯合野生型测序产物、杂合子型测序产物或纯合突变型测序产物；
对所述测序产物进行赋值，当所述扩增产物对应的SNP位点为保护因素时，所述纯合野生型测序产物为0，所述杂合子型测序产物为-1，所述纯合突变型测序产物为-2；当所述扩增产物对应的SNP位点为危险因素时，所述纯合野生型测序产物为0，所述杂合子型测序产物为1，所述纯合突变型测序产物为2；
通过所述第一上游引物、所述第一下游引物、所述第二上游引物、所述第二下游引物、所述第四上游引物、所述第四下游引物、所述第六上游引物、所述第六下游引物、所述第八上游引物和所述第八下游引物扩增得到的所述扩增产物对应的SNP位点为所述危险因素；
通过所述第三上游引物、所述第三下游引物、所述第五上游引物、所述第五下游引物、所述第七上游引物和所述第七下游引物扩增得到的所述扩增产物对应的SNP位点为所述保护因素；
将赋值后所述八个测序产物相加，且相加之和为X，若-3≤X≤0，则所述待测样本为低风险，若1≤X≤3，则所述待测样本为中等风险，若X＞3，则所述待测样本为高风险。
具体地，所述扩增的程序为：95℃预变性10s，55℃变性30s，共进行35个循环；72℃退火30s；10℃延伸1h。
具体地，所述待测样本为外周血样本、体液样本或组织器官样本。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：该引物组扩增的基因分别对应预后敏感的八个风险等位基因，能够保证评估结果的准确性和全面性，同时，该引物组得到的扩增产物其长度在500bp左右，并将SNP位点设计在扩增产物的中间位置，即约250bp的位置，这能够有效防止5’端干扰结果以及3’端的钝化现象，这使得该引物组能够分别准确扩增待测样本中SNP位点，从而使扩增产物能够准确反映慢性心力衰竭预后情况。八个扩增引物能够在一个PCR扩增模式下同时进行测序，从而进一步保证了测序的准确性。该方法通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与预后相关的突变，从而判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过桑格测序分型点突变，其准确度可达到100％，由于慢性心力衰竭的结局具有明显的异质性，原发因素的不同，也会导致结局的不同的特点，本发明从基因组先天结构出发，选取预后敏感的风险等位基因，建立遗传预后评估模型，可在慢性心力衰竭的A期和B期对心力衰竭患者进行评估，从而进一步指导患者治疗的依从性和规范性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例三提供的第一上游引物和第一下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图2是本发明实施例三提供的第二上游引物和第二下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图3是本发明实施例三提供的第三上游引物和第三下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图4是本发明实施例三提供的第四上游引物和第四下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图5是本发明实施例三提供的第五上游引物和第五下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图6是本发明实施例三提供的第六上游引物和第六下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图7是本发明实施例三提供的第七上游引物和第七下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图；
图8是本发明实施例三提供的第八上游引物和第八下游引物得到的扩增产物对应的测序产物的分型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的引物组，适用于评估汉族原发性扩张性心肌病和缺血性扩张性心肌病患者的慢性心力衰竭预后，该引物组包括：第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物、第四下游引物、第五上游引物、第五下游引物、第六上游引物、第六下游引物、第七上游引物、第七下游引物、第八上游引物和第八下游引物，第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，第二上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，第二下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，第三上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，第三下游引物的序列如序列表中SEQ IDNO:6所示，第四上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，第四下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，第五上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，第五下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，第六上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，第六下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:12所示，第七上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，第七下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:14所示，第八上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:15所示，第八下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
本发明实施例提供的引物组对应的基因如表1所示。
表1为实施例一提供的引物组对应的基因、SNP位点和风险等位基因
本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的引物组，该引物组能够分别准确扩增待测样本中的APOB基因对应的rs679899 SNP位点、HRG基因对应的rs1042464 SNP位点、TLN2基因对应的rs1320191 SNP位点、SLC25A13基因对应的rs2301629 SNP位点、SOD3基因对应的rs2536512 SNP位点、SYNM基因对应的rs3134587 SNP位点、AGXT基因对应的rs4273214 SNP位点和AGXT基因对应的rs33958047 SNP位点，得到八个扩增产物，将八个扩增产物分别进行桑格测序，得到八个测序产物，然后根据产物的类型对测序产物进行赋值，将赋值后所述八个测序产物相加，根据相加之和判断待测样本为低风险、中等风险或高风险，该引物组扩增的基因分别对应预后敏感的八个风险等位基因，能够保证评估结果的准确性和全面性，同时，该引物组得到的扩增产物其长度在500bp左右，并将SNP位点设计在扩增产物的中间位置，即约250bp的位置，这能够有效防止5’端干扰结果以及3’端的钝化现象，这使得该引物组能够分别准确扩增待测样本中SNP位点，从而使扩增产物能够准确反映慢性心力衰竭预后情况。八个扩增引物能够在一个PCR扩增模式下同时进行测序，从而进一步保证了测序的准确性。同时，引物组得到的扩增产物其长度在500bp左右，这使得整个测序反应和数据分析判读能在一天之内完成，提高了评估的时效性。
实施例二
本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的试剂盒，该试剂盒包括：实施例一提供的引物组。
具体地，该试剂盒还包括：TaKaRa Ex Taq HS、10×Ex Taq、dNTP Mixture、PrimerPool 1/2、基因组DNA和灭菌水。
本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的试剂盒，该试剂盒能够分别准确扩增待测样本中的APOB基因对应的rs679899 SNP位点、HRG基因对应的rs1042464 SNP位点、TLN2基因对应的rs1320191 SNP位点、SLC25A13基因对应的rs2301629 SNP位点、SOD3基因对应的rs2536512 SNP位点、SYNM基因对应的rs3134587 SNP位点、AGXT基因对应的rs4273214 SNP位点和AGXT基因对应的rs33958047 SNP位点，得到八个扩增产物，将八个扩增产物分别进行桑格测序，得到八个测序产物，然后根据产物的类型对测序产物进行赋值，将赋值后所述八个测序产物相加，根据相加之和判断待测样本为低风险、中等风险或高风险，该引物组扩增的基因分别对应预后敏感的八个风险等位基因，能够保证评估结果的准确性和全面性。
实施例三
本发明实施例提供了一种采用实施例一提供的引物组评估慢性心力衰竭预后的方法，该方法包括：
患者向某，年龄44岁，男性，入院诊断扩张性心肌病，冠状动脉粥样硬化，有心律失常病史，否认糖尿病、高血压病史，无烟酒嗜好，身高175cm，体重53kg，入院血压123/81mmHg，心率88次/分，纽约心功能分级(NYHA)4级，空腹血糖4.66(mmol/L)，ALT 55(U/L)，AST36(U/L)，TC 4.11(mmol/L)，TG1.08(mmol/L)，Cr 76(umol/L)，HDL 1.49(mmol/L)，LDL2.31(mmol/L)，NT-proBNP 2650ng/L，心脏彩超检查左室射血分数25％，左室内径77cm，左房内径45cm，室间隔9cm，左室后壁额8cm。患者长期服用药物有酒石酸美托洛尔片、地高辛、呋塞米片、安体舒通片和卡托普利片。经过中心动脉压检查检测，该患者被评估为中等风险。
具体地，待测样本可以为患者的外周血样本、体液样本或组织器官样本。
在本实施例中，待测样本为患者的外周血样本，患者入院当日取该患者空腹静脉血5mL，并经过EDTA抗凝处理后，于4℃保存。
采用天根生化科技(北京)有限公司提供的血液DNA提取试剂盒提取该患者的外周血的基因组DNA，并于-20℃保存。
通过引物组扩增基因组DNA，得到八个扩增产物；
具体地，扩增体系如表2所示，具体如下：
表2为扩增体系
具体地，扩增的程序为：95℃预变性10s，55℃变性30s，共进行35个循环；72℃退火30s；10℃延伸1h。
将八个扩增产物分别进行桑格(Sanger)测序，得到八个测序产物，每个测序产物均为纯合野生型测序产物、杂合子型测序产物或纯合突变型测序产物；
对测序产物进行赋值，当扩增产物对应的SNP位点为保护因素时，纯合野生型测序产物为0，杂合子型测序产物为-1，纯合突变型测序产物为-2；当扩增产物对应的SNP位点为危险因素时，纯合野生型测序产物为0，杂合子型测序产物为1，纯合突变型测序产物为2；本发明实施例提供的待测样本的八个测序产物分别如图1至图8所示。
通过第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第四上游引物、第四下游引物、第六上游引物、第六下游引物、第八上游引物和第八下游引物扩增得到的扩增产物对应的SNP位点为危险因素；
通过第三上游引物、第三下游引物、第五上游引物、第五下游引物、第七上游引物和第七下游引物扩增得到的扩增产物对应的SNP位点为保护因素；
将赋值后八个测序产物相加，且相加之和为X，若-3≤X≤0，则待测样本为低风险，若1≤X≤3，则待测样本为中等风险，若X＞3，则待测样本为高风险。
在本实施例中，依据引物组中引物的顺序待测样本的赋值为：2、0、-2、1、-1、2、1和0，将赋值后八个测序产物相加，经过计算可知相加之和X为3，即X落入中等风险范围内，可见该待测样本为中等风险。这与患者的中心动脉压检查检测结果一致，可见本发明实施例提供的评估慢性心力衰竭预后的方法是准确的。
本发明实施例提供了一种评估慢性心力衰竭预后的方法，该方法通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与预后相关的突变，从而判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过桑格测序分型点突变，其准确度可达到100％，由于慢性心力衰竭的结局具有明显的异质性，原发因素的不同，也会导致结局的不同的特点，本发明从基因组先天结构出发，选取预后敏感的风险等位基因，建立遗传预后评估模型，可在慢性心力衰竭的A期和B期对心力衰竭患者进行评估，从而进一步指导患者治疗的依从性和规范性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 一种评估慢性心力衰竭预后的引物组、试剂盒及评估慢性心力衰竭预后的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgtacaaa atgggctaga gaac 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggaattcca accctaggtt tt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggcactta agaaggcgag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcccattc acattttgct gc 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caaaaaccag acgtgtagac acct 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttgtcact tgtctcagag gacg 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgatgcggc tgttagaagt tagt 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatcacattt ttggatgtcc actg 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catgctggcg ctactgtgt 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggtccccg aactggtg 18
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggaaagaaa acagaagtga aagc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaactgcttc aggatactgg taac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgccccaag aagaagctgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgcagctca tttggaaggc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcagtgccca gatttgaacc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcctttcctg gtcactcctt g 21
Claims (6)
1.一种评估慢性心力衰竭预后的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物、第四下游引物、第五上游引物、第五下游引物、第六上游引物、第六下游引物、第七上游引物、第七下游引物、第八上游引物和第八下游引物，所述第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述第二上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二下游引物的序列如序列表中SEQ IDNO:4所示，所述第三上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述第三下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述第四上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述第四下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，所述第五上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，所述第五下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，所述第六上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述第六下游引物的序列如序列表中SEQID NO:12所示，所述第七上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，所述第七下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:14所示，所述第八上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:15所示，所述第八下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
2.一种评估慢性心力衰竭预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：TaKaRa Ex Taq HS、10×Ex Taq、dNTP Mixture、Primer Pool 1/2、基因组DNA和灭菌水。
4.一种采用如权利要求1所述的引物组评估慢性心力衰竭预后的方法，其特征在于，所述方法包括：
提取待测样本的基因组DNA；
通过所述引物组扩增所述基因组DNA，得到八个扩增产物；
将所述八个扩增产物分别进行桑格测序，得到八个测序产物，每个所述测序产物均为纯合野生型测序产物、杂合子型测序产物或纯合突变型测序产物；
对所述测序产物进行赋值，当所述扩增产物对应的SNP位点为保护因素时，所述纯合野生型测序产物为0，所述杂合子型测序产物为-1，所述纯合突变型测序产物为-2；当所述扩增产物对应的SNP位点为危险因素时，所述纯合野生型测序产物为0，所述杂合子型测序产物为1，所述纯合突变型测序产物为2；
通过所述第一上游引物、所述第一下游引物、所述第二上游引物、所述第二下游引物、所述第四上游引物、所述第四下游引物、所述第六上游引物、所述第六下游引物、所述第八上游引物和所述第八下游引物扩增得到的所述扩增产物对应的SNP位点为所述危险因素；
通过所述第三上游引物、所述第三下游引物、所述第五上游引物、所述第五下游引物、所述第七上游引物和所述第七下游引物扩增得到的所述扩增产物对应的SNP位点为所述保护因素；
将赋值后所述八个测序产物相加，且相加之和为X，若-3≤X≤0，则所述待测样本为低风险，若1≤X≤3，则所述待测样本为中等风险，若X＞3，则所述待测样本为高风险。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的程序为：95℃预变性10s，55℃变性30s，共进行35个循环；72℃退火30s；10℃延伸1h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样本为外周血样本、体液样本或组织器官样本。
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