CN110603268A - 将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其用途 - Google Patents

将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供将利用邻苯三酚(PG)成分(pyrogallol moiety)接合的透明质酸(HA，hyaluronic acid)用作底物的水凝胶平台。本发明的透明质酸‑邻苯三酚(HA‑PG)高分子结合物可通过使用氧化剂或调节pH的两种互不相同的方法迅速交联。本发明的水凝胶具有优秀的生物相容性，并且，可根据各自的交联方式有效调节交联速度、弹性、粘结力等的物理特性。本发明的水凝胶可根据这种优秀的稳定性和功能性利用于包括如给药、创伤治疗剂或防粘连剂的生物制药材料、医疗及化妆品等的各种领域。

Description

将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其 用途
技术领域
本发明涉及将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其用途。
背景技术
随着医疗及生物工业、化妆品等的产业市场急速扩张，对于功能性生物材料(biomaterials)的关心日益增加。尤其，相比于具有毒性或能够引发副作用的化学合成高分子，对于利用安全性得到确保的天然高分子的生物相容材料的研发备受关注。
进行了与作为生物相容材料的透明质酸有关的各种研究及研发。透明质酸为来源于生物的高分子，当适用于生物体时，几乎不产生副作用，由于所包含的糖的化学结构式，具有亲水性。并且，含有很多水分，在关节中具有物理缓冲效果及与摩擦有关的润滑效果，以参与皮肤的柔韧性而周知。并且，具有对于从外部的细菌侵入的保护特性，由于生物体内的透明质酸酶(hyaluronidase)，当向生物体内移植时，被生物降解，使各种药物与透明质酸相结合，来用作药物传递***的重要材料。尤其，在美国食品药品监督管理局承认透明质酸之后，广泛用作医疗用生物体材料、组织工程支架的材料及给药高分子。并且，在皮肤的各种互不相同的层具有丰富的透明质酸，例如，具有如水分供给功能、辅助细胞外基质组织的功能、起到填充物质的作用的功能及参与组织再生机制的功能的复合功能。但是，在老化的同时，皮肤中的透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白及除此之外的基质聚合物的量减少。例如，当重复暴露在太阳光下的紫外线时，真皮细胞减少他们的透明质酸的生产量，并增加其分解速度。这种物质的损失导致皱纹、毛孔、水分丢失和/或老化等的不优选状态。因此，作为改善皮肤状态的方法中的一种，广泛使用将透明质酸用作主要成分的填充物组合物。
作为现有的透明质酸相关技术，在各种文献中记载对使用如双环氧化物、双卤化物、甲醛放入等的具有两个官能团的化合物进行交联键的不溶性透明质酸衍生物进行合成的例。尤其，在美国专利第4582865号中公开通过使用二乙烯基砜来实现透明质酸的交联的例，在美国专利第4713448号中公开利用甲醛的交联反应，在美国专利第5356883号中公开通过使用各种碳化二亚胺来利用O-酰脲或N-酰脲对羧基进行改性的透明质酸衍生物胶的合成例。但是，在通过上述专利所公开的方法制备的透明质酸交联物中，与透明质酸分解酶有关的稳定性低，未反应化学物质的含量高，因此，具有诱发生物毒性的可能。并且，不易按照所要使用的用途调节交联或物性，在用作各种医疗用材料时受限。因此，依然需要研究可以维持优秀的生物相容性且容易调节透明质酸水凝胶的物性的技术。
因此，为了解决上述问题，本发明人坚持不懈地研发能够提高作为生物相容性物质的透明质酸的功能性的技术。最终，研发了利用邻苯三酚基进行改性的基于透明质酸的水凝胶平台技术，并据此完成了本发明。
发明内容
技术问题
如上所述，本发明的目的在于，提供利用邻苯三酚基对透明质酸进行改性来制备的透明质酸衍生物及其制备方法。
本发明的再一目的在于，提供包含对上述透明质酸衍生物进行交联的透明质酸衍生物水凝胶的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供具有透明质酸衍生物进行交联的结构的透明质酸衍生物水凝胶。
本发明的还有一目的在于，提供利用上述透明质酸衍生物水凝胶的药物传递载体或药物传递***(DDS，Drug Delivery System)。
本发明的又一目的在于，提供包含上述透明质酸衍生物水凝胶的组织工程支架等的医疗用材料。
本发明的又一目的在于，提供基于上述透明质酸衍生物的创伤治疗剂(wounddressing)或防粘连剂(adhesion barrier)。
本发明的又一目的在于，提供包含上述透明质酸衍生物水凝胶的填充物组合物。
本发明的又一目的在于，提供包括向个体的皮内或皮下注射上述填充物组合物的步骤在内的皮肤皱纹的改善方法。
但是，本发明所要实现的技术目的并不局限于在上述内容中提及的目的，普通技术人员可通过以下记载明确理解未提及的其他目的。
解决问题的方案
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供透明质酸水凝胶的制备方法，包括对利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物进行交联的步骤，上述透明质酸衍生物通过透明质酸与5'-羟基多巴胺之间的反应来利用棓酚基进行改性的透明质酸水凝胶的制备方法。
作为本发明的一实例，上述透明质酸衍生物可以为下述化学式1，其中，上述透明质酸衍生物的分子量可以为10000Da至2000000Da，上述透明质酸衍生物的棓酚基取代率可以为0.1％至50％。
化学式1
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数。
作为本发明的再一实例，在上述进行交联的步骤中，可通过添加氧化剂或pH调节剂来进行交联，上述氧化剂可以为高碘酸钠、过氧化氢、辣根过氧化物酶或酪氨酸酶，上述pH调节剂可以为氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶或氢氧化钡。
作为本发明的另一实例，在上述通过添加氧化剂来进行交联的步骤中，可形成透明质酸衍生物之间的下述化学式2的交联键。
化学式2
在上述化学式2中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
作为本发明的还有一实例，在上述通过添加pH调节剂来进行交联的步骤中，可形成透明质酸衍生物之间的下述化学式3的交联键。
化学式3
在上述化学式3中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
并且，在本发明中，作为通过对上述化学式1的透明质酸衍生物进行交联而制备的透明质酸水凝胶，例如，提供用于输送生物体活性物质的载体，上述生物体活性物质包含形成有透明质酸衍生物之间的上述化学式2或化学式3的交联键的透明质酸水凝胶及上述透明质酸水凝胶。在此观点中，在本发明的一实施例中，上述药物传递载体包含抗体、抗体片段、蛋白质、肽、多肽、低分子化合物(small molecule chemical compound)、脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)、小干扰核糖核酸(SiRNA)、基因及干细胞，上述干细胞包含成体干细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells)或诱导性多能干细胞(iPSC)，但并不限定于此。在此观点中，在本发明的再一实施例中，上述用于输送生物体活性物质的载体在生物体活性物质的生物体内及生物体外持续释放(sustained release)。
并且，在本发明中，作为通过对上述化学式1的透明质酸衍生物进行交联而制备的透明质酸水凝胶，例如，提供透明质酸水凝胶以及包含上述透明质酸水凝胶的组织工程支架，上述透明质酸水凝胶形成有透明质酸衍生物之间的上述化学式2或化学式3的交联键。
并且，本发明提供包含透明质酸衍生物水凝胶的填充物组合物，上述透明质酸衍生物水凝胶通过利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物或对上述透明质酸衍生物进行交联来制备。
在根据上述目的的本发明的一实施例中，上述透明质酸衍生物的分子量可以为10000Da至2000000Da，上述透明质酸衍生物的邻苯三酚基取代率可以为0.1％至50％，优选地，可以为1％至30％，更优选地，可以为2％至20％。在本发明的再一实施例中，相对于整个填充物组合物，可以含有0.1％(w/v)至15％(w/v)的上述透明质酸衍生物。
在本发明的另一实施例中，上述填充物组合物在体外处于液体状态，且在体内不存在交联剂的情况下可形成凝胶化状态。在本发明的又一实例中，上述填充物组合物可向选自由泪沟区域、眉间皱纹区域、眼角区域、额头区域、鼻梁区域、鼻子旁边皱纹区域、嘴旁边皱纹区域及颈部皱纹区域组成的组中的一个部位注射。作为本发明的又一实例，上述填充物组合物可还包含选自由成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、角化细胞生长因子(KGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、***(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)组成的组中的一种细胞生长因子。作为本发明的又一实例，上述填充物组合物可还包含选自由局部麻醉剂、抗氧化剂、维生素及它们的组合组成的组中的一种成分。
并且，本发明提供填充物组合物的制备方法，包括：通过向透明质酸的葡萄糖醛酸的骨骼导入邻苯三酚基来制备透明质酸衍生物的步骤；以及向水介质添加并混合上述透明质酸衍生物的步骤。
并且，本发明提供包括向个体的皮内或皮下注射上述填充物组合物的步骤的皮肤皱纹的改善方法。
并且，本发明提供包含利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物或对上述透明质酸衍生物进行交联来制备的透明质酸衍生物水凝胶的创伤治疗剂(wound dressing)或防粘连剂(adhesion barrier)。
发明的效果
本发明的透明质酸水凝胶的制备技术包括根据利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物在适当的氧化或特定pH条件下对上述透明质酸衍生物进行交联的步骤。在本发明中，水凝胶具有优秀的生物相容性，同时，可根据各自的交联方式有效调节交联速度、弹性、粘结力等的物理特性，可用于医疗及化妆品等各种领域。
附图说明
图1为示出本发明的透明质酸衍生物的合成过程的图。
图2的(a)部分示出利用红外光谱仪(FT-IR)分析本发明的透明质酸衍生物的结构的结果，(b)部分示出利用核磁共振氢谱(H-NMR)分析本发明的透明质酸衍生物的结构的结果。
图3为简要示出通过互不相同的交联方式的透明质酸水凝胶的外观及交联键的变化的模式图。
图4的(a)部分示出在利用NaIO4的透明质酸水凝胶的制备过程中通过紫外-可见光吸收光谱(UV-vis)分析化学结构的变化的结果，(b)部分示出根据上述结果的交联机制的图。
图5的(a)部分示出在利用NaOH的透明质酸水凝胶的制备过程中通过紫外-可见光吸收光谱(UV-vis)分析化学结构的变化的结果，(b)部分示出根据上述结果的交联机制的图。
图6为确认本发明的透明质酸水凝胶的形成速度的图，(a)部分示出通过肉眼确认根据时间的推移形成水凝胶的结果，(b)部分示出确认根据时间的推移的弹性系数的变化的结果。
图7为确认本发明的透明质酸水凝胶的强度及弹性的图，(a)部分示出在0.1Hz至1Hz中确认弹性系数的变化的结果，(b)部分示出比较弹性系数与tanδ(G″/G')的结果。
图8为确认利用根据透明质酸衍生物的分子量及浓度的NaIO4进行交联的透明质酸水凝胶的轻度及弹性变化的图，(a)部分示出在0.1Hz至1Hz中确认弹性系数的变化的结果，(b)部分示出比较弹性系数与tanδ(G″/G')的结果。
图9为确认本发明的透明质酸水凝胶的粘结力的图，(a)部分示出检测根据板之间的距离通过流变设备施加的力的变化的结果，(b)部分示出对粘结力进行定量化并评价的结果。
图10为确认本发明的透明质酸水凝胶的膨润及分解方式的图，(a)部分示出对利用相对于透明质酸的摩尔浓度添加0.5X的5-羟基多巴胺并合成的透明质酸衍生物来制备的透明质酸水凝胶的鹏润率和分解率进行定量化并评价的结果，(b)部分示出对利用相对于透明质酸的摩尔浓度添加1.0X的5-羟基多巴胺并合成的透明质酸衍生物来制备的透明质酸水凝胶的鹏润率和分解率进行定量化并评价的结果。
图11为确认本发明的透明质酸水凝胶的细胞毒性及是否诱发炎症反应的图，(a)部分示出为了评价透明质酸-邻苯三酚(HAPG)水凝胶的毒性而对细胞进行包囊化(encapsulation)之后的第1天、第3天及第7天的活死(Live/Dead)染色(比例尺＝100μm)，(b)部分示出为了评价透明质酸-邻苯三酚(HAPG)水凝胶的毒性而对细胞进行包囊化之后的第1天、第3天及第7天的人脂肪干细胞(hADSCs)生存力，(c)部分示出当与利用NaIO4或NaOH溶液交联的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶共培养时，用于对从巨噬细胞(RAW264.7)分泌的TNF-α进行定量化的被酶联的免疫吸附试验结果(n＝4，**p<0.01vs脂多糖组(LPS group))。
图12为确认本发明的透明质酸水凝胶的生物体内相容性的图，(a)部分示出从小鼠的皮下部位向皮下部位移植之后第0天、第7天、第28天及第84天回收的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶(DS 8％)的形态，(b)部分示出透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)的体内(invivo)生物降解曲线图，(c)部分示出在移植之后的第28天与相邻的组织一同回收的水凝胶的苏木精-伊红(H&E)染色，(d)部分示出在移植之后的第28天与相邻的组织一同回收的水凝胶的甲苯胺蓝染色(比例尺＝300μm)。
图13为确认本发明的透明质酸水凝胶的生物体内分解方式的图，(a)部分示出向小鼠皮下移植之后通过肉眼确认水凝胶的体积变化的结果，(b)部分示出向小鼠皮下移植之后确认残留水凝胶的重量的结果。
图14为确认将利用NaIO4的水凝胶用作给药制剂的可能性的图，(a)部分示出冻结干燥之前或之后确认超细微粒的形成及残留与否的结果，(b)部分示出确认在上述超细微粒封片的牛血清白蛋白(BSA)的释放量的结果。
图15为确认将利用NaIO4的水凝胶用作给药制剂的可能性的图，(a)部分示出利用NaIO4的交联反应，(b)部分为示出透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒的形成(比例尺＝-50μm)的显微镜照片，(c)部分示出从块状透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶或透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒释放的血管内皮生长因子(VEGF)的累积量(磷酸盐缓冲液(PBS)，37℃)(n＝4)。
图16为示出在下肢缺血(hindlimb ischemia)小鼠模型中向血管内皮生长因子(VEGF)输送利用NaIO4的水凝胶及通过利用NaIO4的水凝胶治疗血管内皮生长因子(VEGF)的效果的图，(a)部分为示出向肌肉注射包含血管内皮生长因子(VEGF)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒并观察第0天(药物注射日)及第28天的结果照片，(b)部分示出对上述结果进行数值化的图(n＝4-5)，(c)部分为将正常小鼠组织作为对照组来示出苏木精-伊红(H&E)染色及马松三色法(MT)染色结果的图(比例尺＝-100μm)，(d)部分为示出在缺血的下肢中对纤维化部分进行定量化的图(n＝12，**p<0.01vs磷酸盐缓冲液组(PBS group)，##p<0.01vs透明质酸-邻苯三酚组(HA.PG group)，@p<0.05vs血管内皮生长因子组(VEGFgroup))，(e)部分示出相对于肌动蛋白α(α-SMA)(形成小动脉(arteriole formation))及血管性血友病因子(vWF)(形成毛细血管(capillary formation))缺血的下肢肌肉进行免疫染色的照片，黑色箭头分别示出缺血组织中的小动脉(肌动蛋白α呈阳性(α-SMApositive))及毛细血
管(血管性血友病因子呈阳性(vWF positive))的形成(比例尺＝100μm)，(f)部分示出缺血性肌肉中肌动蛋白α(α-SMA)染色成阳性的细胞腔和血管性血友病因子(vWF)阳性毛细血管的数(n＝18.20，*p<0.05，**p<0.01vs磷酸盐缓冲液组(PBS group)，##p<0.01vs透明质酸-邻苯三酚组(HA.PG group)，@p<0.01vs血管内皮生长因子组(VEGF group))。
图17为示出制备利用NaOH-介质交联的组织粘结性透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的图，(a)部分为示出通过NaOH-介质交联形成透明质酸衍生物水凝胶的图，(b)部分为比较通过NaOH或NaIO4交联的透明质酸衍生物水凝胶的粘结力的图，(c)部分为比较各透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的平均分离强度的图(n＝3，**p<0.01vs NaIO4组(group))。
图18的(a)部分为简要示出NaOH-诱导的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的化学粘结(adhesion chemistry)的图，(b)部分为示出对于各种小鼠器官(心脏、肾脏及肝)的直接粘结的照片。
图19的(a)部分示出在小鼠肝表面涂敷NaOH-诱导的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶并在7天之后对附着于肝组织表面上的水凝胶进行苏木精-伊红(H&E)染色的结果(比例尺＝500μm)，(b)部分为示出使用通过NaOH交联的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)来向小鼠肝移植人脂肪干细胞(hADSCs，human adipose tissue-derived stem cells)之后，同时示出本来的肝组织及本发明的水凝胶结构物内的人脂肪干细胞(hADSCs)的免疫染色的图，在移植之前检测出利用Dil标记的细胞(左侧)，对CD44进行免疫染色并利用DaPI对细胞核进行计数染色(右侧)(比例尺＝500μm)。
图20为示出本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液被体内氧化力凝胶化的图，图20的(a)部分为透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液被注射及体内氧化力凝胶化的图，图20的(b)部分为通过肉眼确认包含在体内形成的水凝胶的小鼠的皮肤的结果。
图21为示出向皮肤注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后确认在体内形成的水凝胶的体内维持与否的图，图5a为通过肉眼确认在体内形成的水凝胶的结果(第0周、第10周、第24周)，图5b为在约6个月的时间内测量在体内形成的水凝胶的重量变化的结果。
图22为确认本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的形成及向体内注射的条件的图，图22的(a)部分为简要示出透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的形成过程的模式图，图22的(b)部分为对能够向体内注射的针头的大小与以往的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))进行比较的结果。
图23为向皮肤注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后确认注射之前和之后的皱纹改善效果的图，图23的(a)部分为利用复制物对诱发皱纹的皮肤进行成型并进行比较的结果，图23的(b)部分为对皱纹的面积、长度及深度进行定量化并进行比较的结果。
图24为与以往的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))比较体内维持能力的图，图24的(a)部分为向皮肤注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品之后通过肉眼确认在体内形成的水凝胶的结果(第0天、第14天、第28天、第56天、第84天、第168天、第252天)，图24的(b)部分为在约9个月的的时间内测量在体内形成的水凝胶的重量变化的结果。
图25为与以往的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))比较体内维持能力的图，图25的(a)部分为向皮肤注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品之后通过肉眼确认在体内形成的水凝胶的结果(第0天、第14天、第28天、第56天、第84天、第168天)，图25的(b)部分为在约9个月的时间内测量在体内形成的水凝胶的体积变化的结果。
图26为确认在体内形成的水凝胶的体内粘结力的图，图26的(a)部分为玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品的结果，图26的(b)部分为透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)的结果。
图27为与以往的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))比较注射可能性的图，利用各种大小的针头(21G、25G、29G、30G)注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品并确认压力输出力变化的结果。
图28为与以往的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))比较注射可能性的图，图28的(a)部分为利用30G的针头注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品并确认压力输出力变化的结果，图28的(b)部分为利用29G的针头注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品并确认压力输出力变化的结果。
图29为与以往的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))比较注射可能性的图，图29的(a)部分为利用各种大小的针头(21G、25G、29G、30G)注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品并比较挣脱力(Break Loose Force)的结果，图29的(b)部分为利用各种大小的针头(21G、25G、29G、30G)注射本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)、Megafill产品、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品并比较动态滑移力(Dynamic Glide Force)的结果。
图30为确认向皮肤注射封片有本发明的表皮细胞生长因子(20ng/ml、1μg/ml、20μg/ml)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后确认注射之前和之后的皱纹改善效果，图30的(a)部分为利用复制物对诱发皱纹的皮肤进行成型并进行比较的结果，图30的(b)部分为对皱纹的面积、长度及深度进行定量化并进行比较的结果。
图31为向皮肤注射封片有本发明的表皮细胞生长因子(20ng/ml、1μg/ml、20μg/ml)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后对其的OCT冰冻切片进行苏木精-伊红(H&E)染色来实施病理组织检查的结果。
图32为根据时间的推移(1个月)对以往的填充物产品(玻丽朗玻尿酸(Perlane))及未封片表皮细胞生长因子的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液和封片有本发明的表皮细胞生长因子(10μg/ml)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之间的皮肤组织再生效果的图，对OCT冰冻切片进行苏木精-伊红(H&E)染色来实施病理组织检查的结果。
图33为根据时间的推移(1个月)对以往的填充物产品(玻丽朗玻尿酸(Perlane))及未封片表皮细胞生长因子的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液和封片有本发明的表皮细胞生长因子(10μg/ml)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之间的皮肤组织再生效果的图，对OCT冰冻切片进行马松三色法(MT，Masson's Trichrome)染色来实施病理组织检查的结果。
图34为在伤口部位涂敷本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后通过肉眼确认伤口部位的水凝胶形成及水凝胶的粘结与否的结果。
图35为简要示出以粉末形态对本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液进行剂型化的过程的图。
图36为向皮肤注射从本发明的冰冻干燥粉末形态进行再增溶的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后通过肉眼确认在体内形成的水凝胶的结果。
图37为确认本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的保存稳定性的图，在常温(25℃)或冷藏(4℃)状态保存透明质酸-邻苯三酚(HAPG)溶液并确认保存容器内的凝胶化与否的结果。
图38为确认本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的保存稳定性的图，向保存容器注入氮气来阻隔透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液与氧之间的接触之后，在冷藏(4℃)状态下保存3天，另一方面，在冷冻(-80℃)状态下以10天的时间保存透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液，之后，向皮肤注射这些溶液并通过肉眼确认在体内形成的水凝胶的结果。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明提供透明质酸水凝胶的制备方法，包括对利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物进行交联的步骤，上述透明质酸衍生物通过透明质酸与5'-羟基多巴胺之间的反应来利用棓酚基进行改性。
在本发明中使用的术语“透明质酸(Hyaluronic acid，HA)”为以重复单位包含借助D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid，GlcA)及n-乙酰葡糖胺(GlcNAc)基、β1，3-糖苷键(β1，3-glycosidic bond)相连的二糖的高分子量的线形多糖，指代透明质酸及其的盐，但并不限定于此，上述盐的例示有钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等。
透明质酸的二糖重复单位(repeating unit)如下述化学式4，上述重复单位可以为1个至1000个，但并不限定于此。
化学式4
可从眼球的玻璃样液、关节的滑液，鸡冠等发现透明质酸，作为生物相容性高度生物材料而周知。透明质酸水凝胶具有作为生物材料的高适用可能性，但是，由于天然高分子本身所导致的机械特性的局限，难以用作生物材料(例，药物载体、组织工程支架)。因此，本发明人向透明质酸导入具有高氧化能力的棓酚基来制备了透明质酸衍生物(制备例1)，在适当的氧化或特定pH条件(pH 8～9)下对这种透明质酸衍生物进行交联来制备了水凝胶(制备例2)，可有效调节交联速度、弹性、粘结力等的物理特性(实施例1及实施例3)。
本发明中使用的术语“透明质酸衍生物”或“透明质酸-邻苯三酚高分子结合物”均包含透明质酸或向上述透明质酸的盐的葡萄糖醛酸的骨骼导入棓酚基的透明质酸或其的的盐。
作为一具体例，可借助上述化学式4的二糖重复单位的末端，具体地，其的羧基与5'-羟基多巴胺之间的反应来制备。通过上述反应制备的透明质酸衍生物包含一个以上的下述化学式5的重复单位，可表示为如下述化学式1。
化学式5
化学式1
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数。
并且，上述透明质酸衍生物的分子量可以为10000Da至2000000Da，上述透明质酸衍生物的棓酚基取代率可以为0.1％至50％，但并不限定于此。
上述“取代率”意味着透明质酸或其盐的特定功能团被棓酚基取代或改性。利用棓酚基的取代率由整个透明质酸重复单位中导入棓酚基的重复单位的比例定义，可由大于0且为1以下的数值、大于0％且为100％以下的数值或大于0摩尔百分比且为100摩尔百分比以下的数值表达。
本发明中使用的术语“水凝胶”意味着具有充分量的水分的亲水性高分子的三维结构，由于本发明的目的，上述水凝胶表示利用棓酚基进行改性的在透明质酸衍生物之间形成的水凝胶。
上述透明质酸水凝胶的制备过程可通过上述透明质酸衍生物的交联反应进行，为了上述交联反应，可追加包括与上述透明质酸衍生物和磷酸盐缓冲液(PBS)等混合来制备透明质酸水凝胶前体溶液的步骤。这种交联能够以通过照射紫外线(UV)的化学交联、物理交联或生物交联形成为水凝胶。其中，作为通过照射紫外线(UV)的化学交联具有光交联(photo-crosslinking)或利用反应***联剂(reactive crosslinker)的交联等，作为生物交联具有利用肝素与生长因子的内聚力的交联或利用脱氧核糖核酸(DNA)等的互补键合的交联等，作为物理交联具有通过氢键的交联、通过疏水性(hydrophobic)相互作用的交联或利用静电相互作用的交联等，优选地，可通过添加氧化剂或pH调节剂来进行交联。上述氧化剂可以为高碘酸钠、过氧化氢、辣根过氧化物酶或酪氨酸酶，上述pH调节剂可以为氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶或氢氧化钡，但并不限定于此。
作为一具体例，在通过添加上述氧化剂进行交联的情况下，形成透明质酸衍生物之间的下述化学式2的交联键。在化学式2中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
化学式2
作为再一具体例，在通过添加上述pH调节剂来进行交联的情况下，形成透明质酸衍生物之间的下述化学式3的交联键。在化学式3中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
化学式3
在本发明的一实施例中，在利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物的交联步骤中，分别利用作为氧化剂的高碘酸钠或作为pH调节剂的氢氧化钠制备了透明质酸水凝胶(参照制备例2)，结果，可在通过各自的交联方式制备的透明质酸水凝胶确认优秀的生物相容性和交联速度、强度、弹性、粘结力、分解方式等物理特性的显著差异(参照实施例1至实施例3)。
在本发明的一实施例中，提供包含本发明的透明质酸衍生物或透明质酸水凝胶的填充物组合物。本发明的填充物组合物以在水介质混合导入有棓酚基的透明质酸衍生物的液体或溶液状态提供。尤其，在向体内注射的情况下，即使这种溶液不包含交联成分，能够以没有个人之间的偏差的方式仅通过体内氧化力形成水凝胶，来补充皮肤组织，并可维持皮肤的水分。作为一具体例，上述水介质为磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)，相对于整个填充物组合物，优选地，包含0.1％(w/v)至20.0％(w/v)的上述透明质酸衍生物，更优选地，包含0.3％(w/v)至10.0％(w/v)的上述透明质酸衍生物，还可根据在该领域周知的水介质及填充物组合物内的含量比进行各种变形或变更来制备。
本发明中使用的术语“填充物”意味着向皮内或皮下注入生物相同材料来改善皱纹并恢复美观上的容积等的补充皮肤组织的能够注射的物质。目前，作为在美国食品及药物管理局(FDA)或韩国食品医药品安全厅(MFDS)中承认的填充物制备用物质，具有胶原蛋白、透明质酸、羟基磷灰石、多元酸等。其中，透明质酸为与人体构成成分相似的物质，可不进行皮肤过敏反应直接使用，具有每1个分子牵引214个水分子的特性，可有效维持皮肤的水分，约占据目前填充物市场的90％。在本发明的填充物组合物中，使用导入具有高氧化力的棓酚基的透明质酸衍生物，可在不添加交联剂的情况下，仅通过体内氧化力形成水凝胶，提高生物相容性，通过如上所述的方式在体内形成的水凝胶可长时间维持透明状态的形态(至少6个月以上)，可根据上述透明质酸的特性呈现优秀的皱纹改善效果，相比于以往的填充物产品，不仅具有优秀的粘结力及体内稳定性，还可与压力输出力无关地，稳定地向目标部位注射(实施例2及实施例3)。
并且，本发明的填充物组合物能够以粉末形态，更具体地，能够以冰冻干燥的粉末形态进行剂型化，从而提供使用便利性及保存稳定性。另一方面，在向皮肤注射上述填充物组合物之前，需要在如磷酸盐缓冲液(PBS)的水介质溶解来进行乳化的预处理步骤，还可根据保存及剂型状态直接适用增溶的填充物组合物。
作为另一具体例，为了有效地赋予皮肤再生效果，本发明的填充物组合物可还包含细胞生长因子或维生素。上述细胞生长因子为促进细胞***、生长及分化的多肽的总称，优选地，可选自由成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、角化细胞生长因子(KGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、***(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)组成的组中，可含有浓度为20ng/ml至20μg/ml的上述细胞生长因子，但并不限定于此。
作为又一实例，本发明的填充物组合物可还包含局部麻醉剂来缓解注射过程中的疼痛。上述局部麻醉剂可选自由氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米卡因(amylocaine)、奥布卡因(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、贝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁氧卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普鲁卡因、可卡乙碱、***、环美卡因、二丁卡因、二甲异喹、二甲卡因、地哌冬、二环胺、脱水芽子碱、芽子碱、氯乙烷、依替卡因、β-尤卡因、尤普罗辛、非那可明、甲醛卡因、海克卡因、羟丁卡因、异丁基对氨基苯甲酸、亮氨卡因甲磺酸盐、左沙屈尔、利多卡因、甲哌卡因、美普卡因、美布卡因、氯甲烷、麦替卡因、纳衣卡因、奥他卡因、奥索卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、非那卡因、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、丙吗卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因(propipocaine,)、丙氧卡因、假***、吡咯卡因(pyrrocaine)、罗哌卡因、布比卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏及它们的盐组成的组中，相对于整个填充物组合物的重量，优选地，含有0.1重量百分比至5.0重量百分比的上述麻醉剂，更优选地，含有0.2重量百分比至1.0％重量百分比的上述麻醉剂，但并不限定于此。
作为还有一具体例，本发明的填充物组合物可还包含抗氧化剂，来防止在体内凝胶化而生成的水凝胶的氧化及分解。上述抗氧化剂可选自由多元醇、甘露醇及山梨醇组成的组中，相对于整个填充物组合物的重量，优选地，含有0.1重量百分比至5.0重量百分比的上述抗氧化剂，更优选地，含有0.2重量百分比至1.0％重量百分比的上述抗氧化剂，但并不限定于此。
作为本发明的再一实施方式，本发明提供填充物组合物的制备方法，包括：向透明质酸的葡萄糖醛酸的骨骼导入棓酚基来制备透明质酸衍生物的步骤；以及向水介质添加并混合上述透明质酸衍生物的步骤。
在本发明中，在向水介质添加并混合上述透明质酸衍生物的步骤中，为了防止液体状的填充物组合物在注射之前凝胶化，优选地，可在阻隔与氧及其他氧化源的接触的状态(例如，注入氮气)下以约4℃至28℃和/或pH 4至8的条件下进行。
作为一具体例，上述水介质为磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)，上述透明质酸衍生物可以为借助透明质酸与5'-羟基多巴胺之间的反应的上述化学式1，本发明的填充物组合物可添加上述细胞生长因子局部麻醉剂、抗氧化剂、维生素及它们的组合来制备。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供包括向个体的皮内或皮下注射上述填充物组合物的步骤的皮肤皱纹改善方法。在本发明中，上述填充物组合物目标部位可以为个体的脸部、颈部、耳朵、胸部、臀部、胳膊、手等的身体的任一部位，优选地，皮肤的皱纹区域可以为选自由泪沟区域、眉间皱纹区域、眼角区域、额头区域、鼻梁区域、鼻子旁边皱纹区域、嘴旁边皱纹区域及颈部皱纹区域组成的组中的一个部位，但并不限定于此。并且，在本发明中，“个体”意味着需要改善皮肤皱纹的目标，更具体地，均包括人类或非人类的灵长类等。
尤其，与压力输出力无关地，可简单地向目标部位注入或注射本发明的填充物组合物。在上述注射的步骤中，可通过使用各种大小的注射器(Needle)或***管(Cannula)来向皮内或皮下注射填充物组合物，例如，作为填充物的注射方法，可利用少量多次注射的续穿刺法(Serial punture)、使针头刺入10mm左右之后拔出的同时少量注射的直线注射法(Linear threading)、刺入依次之后不拔出通过直线注射法(Linear threading)注射的针头并旋转略微的角度来再次以相同方法重复注射的扇形注射法(Fanning)等。
作为本发明的还有一实施方式，作为对上述化学式1的的透明质酸衍生物进行交联来制备的透明质酸水凝胶，提供：透明质酸水凝胶，形成有透明质酸衍生物之间的上述化学式2的交联键；以及包含上述透明质酸水凝胶的药物传递载体、药物传递***或组织工程支架。
并且，作为本发明的又一实施方式，作为对上述化学式1的透明质酸衍生物进行交联来制备的透明质酸水凝胶，提供：透明质酸水凝胶，形成有透明质酸衍生物之间的上述化学式3的交联键；以及包含上述透明质酸水凝胶的药物传递载体、药物传递***或组织工程支架。
本发明的透明质酸水凝胶可用作作为药物传递用有效骨骼的细胞外基质，由于上述棓酚基被改性的透明质酸衍生物的优秀的氧化能力，可实现纳米或微米单位的超细微粒形态。上述药物没有特殊限制，优选地，可包含化学物质、小分子、肽、抗体、抗体片段、核酸、蛋白质、基因、病毒、细菌、抗菌剂、抗真菌剂、抗癌剂、抗炎剂或它们的混合物等，核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或小干扰核糖核酸(SiRNA)，但并不限定于此。
并且，本发明的透明质酸水凝胶可基于优秀的弹性及粘结力用作组织工程支架。组织工程学意味着在支架(scaffold)培养从患者的组织分离的细胞或干细胞来制备细胞-支架复合物之后，再次向生物体内移植所制备的细胞-支架复合物，上述透明质酸水凝胶可由与生物组织相似的支架实现，来实现生物组织及脏器的再生最佳化。因此，可用于基因治疗剂或细
胞治疗剂。
并且，本发明的水凝胶还可用作化妆品及创伤治疗剂、伤口被覆材料、防粘连剂或牙科用基质等的医疗用材料，但并不限定于此。
以下，为了便于理解本发明，提出优选实施例。但是，下述实施例仅用于更加易于理解本发明，本发明的内容并不局限于下述实施例。
发明实施方式
制备例
制备例1：制备利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物
如图1所示，制备了本发明的利用棓酚基进行改性的透明质酸衍生物。具体地，在水(TDW)中完全溶解透明质酸(MW 200K，Lifecore Biomedical，IL，USA)，添加了1当量的N-羟基丁二酰亚胺(NHS，N-hydroxysuccinimide，Sigma，St.Louis，MO，USA)和1.5当量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ehtylcarbodiimide hydrochloride，Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，30分钟之后，添加了作为邻苯三酚(PG)成分的1当量的5-羟基多巴胺(5-hydroxydopamine，Sigma)，来在pH 4～4.5的条件下以24小时的时间进行了反应。将两个不同摩尔比的反应物用于制备透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)高分子结合物(透明质酸(HA)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)：N-羟基丁二酰亚胺(NHS)：邻苯三酚(PG)＝1：1.5：1：1或2：1.5：1：1)。之后，利用基于磷酸盐缓冲液(PBS)及水的透析(Cellu/Sep(商标名)，dialysismembrane(6.8KDa cut-off，Membrane Filtration Products Inc.，Seguin，TX，USA))去除1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、5'-羟基多巴胺，通过冰冻干燥蒸发溶剂来制备了本发明的透明质酸衍生物。为了确认上述透明质酸衍生物的合成而利用红外光谱仪(Fourier transform-infrared spectroscopy，Vertex70，Bruker，Billerica，MA，USA)及核磁共振氢谱(proton Nuclear magnetic Resonance，Bruker 400MHz，Bruker)分析的结果，如图2的(a)部分所示，可在约1580cm-1中确认在1700cm-1波数区域中通过强峰新形成的酰胺键，如图2的(b)部分所示，可通过与6.5ppm及3ppm相邻的峰分别确认5'-羟基多巴胺的芳香族的苯环及-CH2CH2-的结构。从上述结果可知，可利用在透明质酸的羧基与5'-羟基多巴胺的胺基之间形成的酰胺键向本发明的透明质酸衍生物导入5'-羟基多巴胺。为了计算与透明质酸(HA)骨骼有关的棓酚基的取代程度，在1mg/ml的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH5)溶解透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)高分子结合物，在283nm的紫外-可见光分光光度计(UV-visible spectrophotometer，Cary 100UV-vis，Varian Inc.，Palo Alto，CA，USA)中测量了溶液的吸光度。利用通过5-羟基多巴胺溶液(5-hydroxydopamine solution)(浓度(concentration)为1mg/mL)的连续稀释获取的标准曲线计算了利用邻苯三酚(PG)取代的透明质酸(HA)内的羧基地百分比(％)。
制备例2：制备透明质酸水凝胶
对上述制备例1的透明质酸衍生物进行交联(cross-linking)来制备了透明质酸水凝胶，在此情况下，交联方式分别利用了作为氧化剂的高碘酸钠(NaIO4)或作为pH调节剂(pH 8～9)的氢氧化钠(NaOH)。具体地，向磷酸盐缓冲液(PBS)溶解上述透明质酸衍生物之后(1％(w/v)、2％(w/v))，相对于透明质酸衍生物溶液的体积，以1.5：1～4：1的比例混合4.5mg/ml的NaIO4或0.08M的NaOH并进行交联，如图3所示，分别通过它们制备了呈亮褐色或青色的透明质酸水凝胶。
为了具体确认上述透明质酸水凝胶的交联，利用紫外-可见光吸收光谱(UV-vis，Ultraviolet-visible spectroscopy)进行分析。如图4所示，在利用NaIO4的情况下，随着时间的推移可知，可确认350～400nm波长区域产生变化(图4的(a)部分)，这意味着在氧化过程中瞬间形成和减少作为中间体的自由基，之后通过自由基聚合反应形成双苯酚(biphenol)(图4的(b)部分)。并且，如图5所示，在利用NaOH情况下，随着时间的推移可知，可确认600nm波长区域产生变化(图5的(a)部分)，这意味着在氧化过程中通过[5+2]互变异构化(tautomerization)形成电荷转移复合物及苯并曲酮(benzotropolone)(图5的(b)部分)。
实施例
实施例1.根据交联方式的透明质酸水凝胶的物性变化
在本实施例中，根据上述制备例2的交联方式的差异比较了透明质酸水凝胶的物性变化。另一方面，在上述水凝胶的制备步骤中，可通过透明质酸与5'-羟基多巴胺的摩尔浓度比(0.5X(透明质酸(HA)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)：N-羟基丁二酰亚胺(NHS)：5-羟基多巴胺溶液(5'-hydroxydopamine)＝2：1.5：1：1)、1X(透明质酸(HA)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)：N-羟基丁二酰亚胺(NHS)：5-羟基多巴胺溶液(5'-hydroxydopamine)＝1：1.5：1：1))将棓酚基的取代率调节为4～5％(0.5X)或8～9％(1X)(未示出)，还比较了根据5'-羟基多巴胺的取代程度的水凝胶的物性变化。具体地，根据交联方式比较了根据时间的推移的水凝胶形成及弹性系数的变化，并分别比较分析了根据交联方式及5'-羟基多巴胺的取代程度的弹性、粘结力、膨润及分解方式。
1-1.比较透明质酸水凝胶的形成速度
如图6的(a)部分所示，在利用NaIO4的情况下，通过瞬间交联反应形成了亮褐色的水凝胶，相反，在利用NaOH的情况下，相对缓慢地形成了青色的水凝胶。并且，测量了根据时间的推移的储能模量(G')和损失弹性率(G″)，比较了利用NaIO4对导入邻苯二酚基的透明质酸衍生物进行交联的水凝胶(HA-CA(NaIO4))与上述结果。结果，如图6的(b)部分所示，均进行氧化并稳定地形成了水凝胶(G'>G″)。尤其，当通过储能模量曲线与损耗模量曲线相接触的时间点确认水凝胶的形成时间时，在利用NaOH进行交联的情况下，消耗约2～3分钟，在HA-CA(NaIO4)的情况下，消耗约30秒钟，相反，在利用NaIO4的情况下，以无法测量的速度快速进行交联。
在透明质酸的粘弹性系数中，在0.1～1Hz的频率范围(frequency range)内检测并分析了扫频模式(frequency sweep mode)内的储能模量(G')及损耗模量(G″)。在1Hz(n＝45)中储存系数除以损耗系数来计算了透明质酸的弹性。在透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)的凝胶动力学(Gelation kinetics)中，分别在10％及1Hz的所调节的菌株及频率且在时间扫描模式中测量了流变仪(rheometer)(MCR 102，Anton Paar，VA，USA)。在最初测量G1及G″的30分钟之后添加了两种氧化剂(NaIO4及NaOH)。在流变仪(MCR102，Anton Paar)中记录探针与底物板之间完全交联的水凝胶的分离应力来测量了水凝胶的粘结性(n＝3)。探针的牵引速度为5μm/sec。
1-2.比较弹性及粘结力
如图7的(a)部分所示，虽具有交联方式或5'-羟基多巴胺的取代程度的差异，均测量出储能模量(G')比损耗模量(G″)一定定水平，可确认可以稳定地形成水凝胶。并且，计算表示水凝胶的强度的弹性系数(Elastic modulus)与表示弹性程度的tanδ(G″/G')的结果，如图7的(b)部分所示，在利用NaIO4的情况下，水凝胶的强度更优秀，在低取代率中也具有优秀的弹力，相反，在利用NaOH的情况下，根据取代率的增加获取了优秀的弹力。并且，在相同交联方式的情况下，可知，随着5'-羟基多巴胺的取代率的增加，上述各个优秀的物性也提高(0.5X<1X)。并且，根据上述结果，确认利用根据透明质酸衍生物的分子量(40kDa、200kDa、500kDa)及浓度(1％(w/v)、2％(w/v))的NaIO4进行交联的水凝胶的物性差异的结果，如图8所示，相比于损耗模量(G″)，储能模量(G')均高于一定水平，可确认稳定地形成了水凝胶(图8a)，可知，透明质酸的分子量的大小越大、浓度越高，水凝胶的强度及弹力得到提高(图8的(b)部分)。并且，为了评价水凝胶的粘结力，在流变设备(Bohlin AdvancedRheometer，Malvern Instruments，Worcestershire，UK)的各板之间对水凝胶进行交联，增加上述板的间隔的同时测量了向设备施加的力，比较了利用NaIO4对导入有邻苯二酚基的透明质酸衍生物进行交联的水凝胶(HA-CA(NaIO4))与上述结果。结果，如图9所示，通过NaOH形成的水凝胶及HA-CA(NaIO4)呈现出优秀的粘结力，相反，在通过NaIO4形成的水凝胶中几乎观察不到粘结力。
1-3.比较膨润及分解方式
如图10所示，根据交联方式及5'-羟基多巴胺的取代程度示出了稍有不同的膨润及分解方式。测量残留于特定时间点(第0天、第1天、第2天、第3天、第5天、第7天、第14天及第28天)的水凝胶的重量来评价了膨润特性。具体地，在磷酸盐缓冲液(PBS)中以37℃的温度条件培养透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)，并以下述是计算了膨润率：(Wt-Wi)/Wi×100，其中，Wt为各时间点的水凝胶的重量，Wi为初始时间点的水凝胶的重量(n＝4～5)。为了调查分解曲线图，利用透明质酸酶(hyaluronidase，5units/mL，Sigma)处理膨润3天的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶，在每个时间点测量了残留的透明质酸的重量(n＝4～7、0、2、5、12、24、48及72小时)。相比于利用NaOH的情况，在利用NaIO4的情况下，膨润率低且更快速地进行分解，在相同的交联方式中5'-羟基多巴胺的取代率增加的情况下，这种膨润率及分解速度呈减少的倾向。根据这种结果，即使利用相同结构的透明质酸衍生物，水凝胶可根据交联方式以不同的结合形态进行交联(制备例2)，这导致如强度、弹性、粘结力、膨润及分解的固有物理特性的变化。并且，与此相反地，即使采用相同的交联方式，如上所述的物理特性也根据透明质酸衍生物的结构变化。
实施例2.分析细胞毒性及生物相容性
在本实施例中，评价上述制备例2的透明质酸水凝胶的细胞毒性及生物相容性。首先，为了确认在三维(3D)细胞培养中的毒性及是否诱发炎症反应，在水凝胶培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cell，hADSC)(1.0×106cells per 100μL ofhydrogel)，根据制备公司的提示在各时间点(time point)(第1天、第3天及第7天)对细胞活性/细胞毒性试剂盒(LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行了活死(Live/Dead)染色。利用共聚焦显微镜(confocalmicroscope)(LSM 880，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)观察了被染色的细胞，从荧光图像对活细胞和死细胞进行计数来对生存力进行了定量化(n＝4～5)。从美国模式培养物集存库(ATCC，Manassas，VA，USA)购入人脂肪干细胞(hADSC)，并在低血清生长试剂盒(GrowthKit-low serum)(ATCC)及补充1％的青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin)(Invitrogen)的间充质干细胞培养基(Mesenchymal Stem Cell Basal Medium)(ATCC)中进行培养。
并且，通过使用迁移小室***(permeable supports with 3.0μm pores，Corning，New York，NY，USA)在水凝胶共培养免疫细胞(Raw 264.7)，之后，利用酶联免疫吸附剂测定(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)测量了通过炎症反应分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)的量。在培养一晚上的Raw 264.7细胞之后，在96-well plate(2.0×104cells per well)上下种之后，通过迁移小室的上部***部加载50μl的水凝胶之后，再次培养24小时。通过使用肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒(kit)(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)对从共培养中获取的培养基内的肿瘤坏死因子(TNF-α)的量进行了定量化。
为了评价透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的体内(in vivo)生物相容性，向ICR小鼠的皮下移植了通过NaIO4或NaOH形成的100μl的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶(最终浓度(final concentration)为2％[w/v])。在移植之前，利用***(ketamine)(100mg/kg，Yuhan，Seoul，Korea)及甲苯噻嗪(xylazine)(20mg/kg，Bayer Korea，Ansan，Korea)对小鼠(5周龄雄鼠(5-week-old male)，OrientBio，Seongnam，Korea)进行麻醉。为了组织分析，在预设的时间点(第0天、第7天、第14天、第28天及第84天)与相邻的组织一同回收了透明质酸结构物。在4％的低聚甲醛(paraformaldehyde)(Sigma)中以2天的时间固定所回收的透明质酸，并在OCT化合物(Leica Biosystems，Wetzlar，Hesse，Germany)中进行包埋，之后，以6μm的厚度切断。对通过体内(in vivo)实验切断的试样进行苏木精-伊红(H&E)染色来评价了水凝胶维持程度。通过进行甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色来调查了移植透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶之后的免疫反应。通过测量在各时间点回收的水凝胶结构物的残留重量来评价了透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的体内(in vivo)分解(n＝3～5)。
结果，如图11及图12所示，到培养之后7天为止，根据交联方式的两种形态的水凝胶均未呈现细胞毒性(图11的(a)部分、(b)部分)。在处理上述两种形态的水凝胶的情况下，仅检测出少量的通过脂多糖(LPS)增加的肿瘤坏死因子(TNF-α)，与未进行任何处理的对照组(NT)相比，也没有较大差异(图11的(c)部分)。并且，如图12所示，在向小鼠移植上述水凝胶的情况下，未发现特别的炎症，可以确认，在移植的水凝胶附近没有巨噬细胞等炎症相关细胞的增殖的情况下，很好地维持其结构(图12的(c)部分及(d)部分)。
实施例3.分析生物体内分解方式
在本实施例中，向小鼠皮下移植了在交联方式(NaIO4/NaOH)及进行反应的5'-羟基多巴胺的摩尔比(0.5X、1X)不同的透明质酸水凝胶。在移植当天、据此的1周、4周及12周后牺牲小鼠，采取各自的水凝胶并通过肉眼确认了它们的膨润程度，并通过计算生物体内残留量来分析了生物体内分解方式等。
结果，如图13所示，可以确认利用NaIO4进行交联的水凝胶的膨润程度更少，并可更快速进行生物体内的分解。并且，在相同的交联方式中5'-羟基多巴胺(棓酚基)的取代率增加的情况下，呈现出分解速度减少的倾向。
上述实施例2及实施例3的结果启示本发明的透明质酸水凝胶可用于如药物传递***、组织工程支架等的生物材料领域。尤其，当考虑上述实施例1等的固有物理特性时，呈现较快的交联速度及生物体内分解方式的通过NaIO4形成的水凝胶为微粒形态的药物传递载体，呈现优秀的粘结力及较慢的生物体内分解方式的通过NaOH形成的水凝胶可用作组织工学用支架等。
实施例4.通过形成超细微粒来用作药物传递***
4-1.利用透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶超细微粒的蛋白质持续释放(sustained release)
在本实施例中，作为通过NaIO4形成的水凝胶的一实施方式，制备了具有纳米或微米单位的直径的超细微粒形态的给药制剂并确认了其功效。首先，利用水包油乳化(Oil/water emulsion)方式诱导制备例2的透明质酸衍生物溶液(透明质酸-邻苯三酚(HA-PG))的形成为乳液，在向上述溶液添加氧化剂(NaIO4)之后，确认了冰冻干燥及干燥之后的超细微粒的形成及存在。并且，通过混合透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液与蛋白质(牛血清白蛋白，bovine serum albumin，BSA)来制备为乳液形态之后，通过添加氧化剂(NaIO4)来进行交联，以此制备了封片有牛血清白蛋白(BSA)的超细微粒，并确认14天的超细微粒的蛋白质释放方式。结果，如图14所示，通过如上所述的制备过程生成了成分为透明质酸水凝胶的超细微粒，进行冰冻干燥过程也不会变形(图14的(a)部分)。并且，在呈块状的水凝胶(透明质酸-邻苯三酚水凝胶(HA-PG bulk hydrogel))中几乎没有释放封片的蛋白质，相反，在上述超细微粒(透明质酸-邻苯三酚微粒(HA-PG particle))中以规定速度释放蛋白质(图14的(b)部分)，通过超细微粒形态的NaIO4形成的水凝胶可以用作给药制剂。
4-2.利用透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶超细微粒的抗体的持续释放
首先，作为以治疗为目的的用于时序释放及调节生长因子的方法，利用NaIO4-介质交联的超高速胶形成并以水包油(oil/water)乳化方法制备了透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶超细微粒(图15的(a)部分)。可简单地向油包水(water-in-oil)乳液添加透明质酸-邻苯三酚(HAPG)溶液来制备透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒。通过NaIO4的透明质酸-邻苯三酚(HAPG)乳液的快速化学交联，在油中以数分钟的时间生成了大量的微米以下的透明质酸(HA)粒子。所生成的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒呈现平均直径为8.8μm(±3.9μm)的球形(图15的(b)部分)。有意思的是，通过透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒被封片的血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)在60天的时间内逐渐释放，相反，从水凝胶结构物几乎没有释放块状形态的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)(图15(c))。在本发明人的以往的研究中，本发明人确认，由于在凝胶化过程中蛋白质与被氧化的邻苯二酚强力结合，几乎没有释放在被邻苯二酚-改性的海藻酸水凝胶内封片的生长因子(growth factor)。与邻苯二酚基相同地，邻苯三酚(PG)基也可以诱导与生长因子的水凝胶结构物的强力结合。但是，由于呈微粒形状的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)为了释放生长因子而显著增加的表面积，可以释放血管内皮生长因子(VEGF)。
为了外周血管疾病中的治疗，与血管内皮生长因子(VEGF)，Peprotech，RockyHill，NJ，USA)结合的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒用于促进血管生成。在向肌肉注射含有透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)超细微粒的血管内皮生长因子(VEGF)(血管内皮生长因子(VEGF)负荷剂量(dose)：在每只小鼠(6μg)的情况下，在对大腿动脉(femoral artery)进行切除及结扎来制备的下肢缺血小鼠模型中呈现出显著得到改善的治疗效果。从Orientbio Inc.购入小鼠(Balb/c，6周龄雌鼠(6-week-old female)，OrientBio)。从注射之日起4周之后，在利用含有血管内皮生长因子(VEGF)的透明质酸-邻苯三酚(HAPG)超细微粒进行处理的组中，没有任何下肢折断或组织坏死(tissue necrosis)。相反，在没有磷酸盐缓冲液(PBS)或血管内皮生长因子(VEGF)的情况下仅处理透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)的组中，仅20％的缺血性下肢得到改善(图16的(a)部分)。相同剂量(每只小鼠6μg)的血管内皮生长因子(VEGF)的单一(Single bolus)给药改善一定的缺血性下肢，下肢缺血小鼠的50％依然呈现出下肢损失或组织坏死(图16的(b)部分)。并且，在通过苏木精-伊红(H&E)及马松三色法(Massons’s trichrome，MT)染色确认的组织分析中，在透明质酸-邻苯三酚(HAPG)/血管内皮生长因子(VEGF)组的缺血小鼠模型中呈现出最少的肌肉损伤及纤维化症状(图16的(c)部分、(d)部分)。并且，在用于小动脉染色的肌动蛋白α(α-smooth muscleactin，α-SMA)及用于毛细血管染色的血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)免疫组织化学分析中，相比于对照组(磷酸盐缓冲液(PBS)、透明质酸-邻苯三酚(HAPG)以及血管内皮生长因子(VEGF))，透明质酸-邻苯三酚(HAPG)/血管内皮生长因子(VEGF)组中的小动脉及毛细血管显著增加(图16的(e)部分、(f)部分)。这种结果呈现血管形成的实质改善。通过利用NaOH-介质交联来制备了用于无创且无注射(injection-free)的细胞移植的粘结性水凝胶支架，(图17的(a)部分)。在之前的研究中确认，邻苯二酚-改性聚合物通过与蛋白质内的被氧化的邻苯二酚的各种亲核物质(nucleophiles)有关的高结合亲和力呈现强组织粘结力。
实施例5.确认利用体内氧化力的透明质酸填充物组合物的凝胶化及皱纹改善效果
5-1.形成及维持利用体内氧化力的水凝胶
向小鼠的皮下注射了在制备例1中制备的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液，之后，确认了所注射的上述透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液是否不添加交联剂也可在体内进行凝胶化。并且，在体内条件下，测量了约6个月的时间内的所形成的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的重量变化，从而确认了所形成的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶是否可在体内长时间维持。
结果，如图20及图21所示，以液体状向皮下注射的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液在5分钟内被凝胶化来在体内形成了透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶，可知，所形成的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶以透明的状态且以没有较大的重量变化的方式在体内维持6个月。并且，如图22所示，在上述透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液暴露在体内氧化条件的情况下，轻松形成具有强自我氧化能力的棓酚基之间的醌，来使透明质酸聚合，从而形成透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶。因此，与以聚合的形态的剂型形成的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))不同地，本发明的填充物组合物可用作溶液状态的剂型，因此，可更易于向皮肤注射，含有各种追加成分。即，本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液在不添加交联剂的状态下在体内形成水凝胶并稳定地维持，由此，可以确认可用作填充物组合物的可能性。
5-2.确认皱纹改善效果
根据上述实施例5-1的结果确认透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的皱纹改善效果。具体地，以0.2μg/day的剂量、1周5次的频率向无毛(hairless)小鼠注射总共6周的骨化三醇(Calcitriol)，来诱发了皮肤的皱纹。之后，向皮肤的皮下注射透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液，利用复制物对注射之前和注射之后诱发皱纹的皮肤进行成型，利用皱纹分析仪测量并比较了皱纹的面积、长度及深度。结果，如图23所示，注射透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之前的皱纹的面积、长度及深度分别为约6mm2、约36mm、约90μm，相反，注射透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后的皱纹的面积、长度及深度分别为约2mm2、约19mm、约68μm，可以确认，皱纹的面积、长度及深度均显著减少。这种结果意味着本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液可以用作用于改善皮肤皱纹的填充物用组合物。
5-3.与以往的填充物产品进行比较
(1)比较体内粘结力及固定性
以约9个月的时间测量并比较了基于具有各种分子量的透明质酸衍生物(200KDa、1MDa)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶与以往销售中的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))的体内维持及分解方式，来更具体地确认了将透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液用作填充物的可能性。与此同时，对本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液与通过玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品生成的水凝胶的体内粘结力或固定性。结果，如图24及图25所示，Megafill、玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品距注射日起的约一个月之后呈现体内的水凝胶的重量及体积减少的倾向，相反，透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶在9个月的时间内以没有重量及体积的较大变化的方式维持其形状，可知，透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶的体内维持能力优秀。并且，确认水凝胶的体内粘结力的结果，如图26所示，玻丽朗玻尿酸(Perlane)产品呈现未固定于皮，而是向特定部位聚集的现象，相反，通过透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的水凝胶粘结及固定于注射部位，在生物体内很好地维持，这种优秀的体内粘结力为借助如胺基、硫醇基(thiol group)等存在于皮肤的官能团与本发明的透明质酸衍生物之间的反应的结果(图22的(a)部分)。即，相比于以往的填充物产品，本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液具有更优秀的体内稳定性及粘结性。
(2)比较注射可能性(Injectabilitytest)
利用万能试验机(Universal testing machine，UTM)测量了以往的基于具有各种分子量的透明质酸衍生物(200KDa、1MDa)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)水凝胶与根据在以往销售中的填充物产品(Megafill，玻丽朗玻尿酸(Perlane))之间的针头的大小(21G、25G、29G、30G)的压力输出力变化，还对作为最初移动注射器所需的力的挣脱力(Break LooseForce)与作为维持移动中的注射器的运动型所需的力的动态滑移力(Dynamic GlideForce)进行定量化并比较，从而具体确认了透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的优秀的注射可能性。结果，如图27及28，Megafill的粒子大小大，因此无法通过小尺寸的针头挤压，仅可通过21G以下的针头挤压，玻丽朗玻尿酸(Perlane)的粒子大小也大，因此，在29G及30G的针头中呈现出不规则形态的压力输出力，相反，本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa、1MDa)可通过小的力在包括29G及30G的所有大小的针头中有效地被挤压。并且，比较挣脱力(Break Loose Force)及动态滑移力(Dynamic Glide Force)的结果，如图29所示，相比于无法顺畅地挤压而无法测量的Megafill及呈现出高力(force)值的玻丽朗玻尿酸(Perlane)，本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液(200KDa，1MDa)呈现出显著低的力(force)值，与注射器的压力输出力，即，针头的大小无关地，容易注射。这种结果意味着本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液可向目标部位直接注射，可以更加稳定地进行注射。
5-4.包含细胞生长因子的功能性填充物组合物
通过上述实施例5-2的方法向诱发皱纹的无毛(Hairless)小鼠的皮肤注射了封片有表皮细胞生长因子(EGF；20ng/ml、1μg/ml、20μg/ml)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液，利用复制物对注射之前和注射之后的诱发皱纹的皮肤进行成型，利用皱纹分析仪测量并比较皱纹的免疫、长度及深度，在注射上述封片有表皮细胞生长因子(EGF)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后，采取一个月之后的上述皮肤组织并制备OCT冰冻切片，通过苏木精-伊红(H&E)(Hematoxylin&eosin)染色实施了病理组织检查，从而确认用作功能性填充物的可能性。并且，在向上述无毛(Hairless)小鼠注射封片有表皮细胞生长因子(EGF)(10μg/ml)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液、透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液及作为以往的产品的玻丽朗玻尿酸(Perlane)之后的一个月之后，通过与上述内容相同的方法利用苏木精-伊红(H&E)染色及马松三色法(MT，Masson's trichrome)染色比较了皮肤组织再生的差异。
结果，如图30所示，相比于注射之前，在注射封片有表皮细胞生长因子(EGF)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的情况下，可以确认，与所形成的皱纹的大小无关地，皱纹的面积、长度及深度均显著减少。并且，如图31所示，皮肤的真皮层内胶原纤维被破坏而使密度不紧凑且排列不规则，相反，被封片的表皮细胞生长因子的浓度越增加，呈规则排列胶原纤维的倾向，可以确认，皮肤再生及皱纹改善的显著效果。同时，如图32及图33所示，在注射封片有表皮细胞生长因子(EGF)的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液的情况下，相比于其他对照组(不注射填充物(No filler)、注射玻丽朗玻尿酸(Perlane)、注射透明质酸-邻苯三酚(HA-PG))，可以确认，由于诱发的皱纹，变厚的表皮层显著变薄，真皮层的胶原蛋白的密度大大提高。这种结果意味着还可将用于皮肤皱纹改善的细胞生长因子适用于本发明的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液来用作功能性填充物。
实施例6.伤口敷料、创伤治疗剂及防粘连剂用制剂
在以1cm×1cm的大小切开小鼠的背部皮肤的伤口诱发动物模型涂敷透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后，利用周围的活性氧进行交联，并确认了伤口部位的水凝胶形成及据此的粘结与否，从而确认用作伤口治疗用敷料制剂的可能性。结果，如图34所示，在伤口部位涂敷透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液之后的10分钟内形成水凝胶膜，由此，可以确认稳定地被粘结。这种结果意味着透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液具有优秀的氧化能力，可以用作不添加额外的添加剂也可均匀地涂敷的新形态的伤口敷料材料。
实施例7.分析粉末剂型化及保存稳定性
7-1.粉末剂型化
如图35所示，对制备例1的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液进行冰冻干燥来制备了粉末形态的填充物组合物，来确认填充物组合物的粉末(powder)剂型化可能性。之后，将上述粉末形态的填充物组合物溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7)来进行再增溶(Resolubilization)之后，向小鼠的皮下注射并观察了水凝胶形成与否。结果，如图36所示，可以确认，与以往相同的，在冰冻干燥粉末状态下再增溶的本发明的填充物组合物通过体内氧化力进行交联来形成水凝胶。这种结果意味着能够进行粉末剂型化的本发明的填充物组合物可向使用人员提供使用便利性及保存容易性。
7-2.分析保存稳定性
首先，以常温(25℃)或冷藏(4℃)状态保存制备例1的透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液并确认了保存容器内的凝胶化与否，从而确认了填充物组合物的具体保存稳定性。并且，向保存容器注入氮气来阻隔透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液与氧之间的接触之后，在冷藏(4℃)状态下保存3天，另一方面，在冷冻(-80℃)状态下以10天的时间保存透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液，之后，向小鼠的皮下注射这些溶液来观察了水凝胶的形成与否。结果，如图37所示，由于高氧化力，本发明的填充物组合物在常温条件下1天之内进行凝胶化，且在冷藏状态下3天之内进行凝胶化。相反，如图38所示，在阻隔氧的条件下，在处于冷藏状态的情况下，3天之后也未进行凝胶化，在以冷冻状态保存透明质酸-邻苯三酚(HA-PG)溶液且10天之后解冻的情况下，不仅维持溶液的性质，在向小鼠的皮肤注射其的情况下，可以确认，也与以往相同地，通过体内氧化力进行交联来形成水凝胶。这种结果意味着可在阻隔氧的条件下或冷冻状态下可长时间保存本发明的填充物组合物。
如上所述的本发明的说明用于例示本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员可在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下容易进行变形，来使本发明呈其他具体形态。因此，在以上内容中记述的实施例在所有方面仅为例示，并不限定本发明。

Claims (29)

1.一种透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，
包括对利用邻苯三酚基进行改性的透明质酸衍生物进行交联的步骤，
在上述透明质酸衍生物中，透明质酸被邻苯三酚基改性。
2.根据权利要求1所述的透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，
上述透明质酸衍生物由下述化学式1表示：
化学式1：
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数。
3.根据权利要求1或2所述的透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，在上述进行交联的步骤中，通过添加氧化剂或pH调节剂来进行交联。
4.根据权利要求3所述的透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，上述氧化剂为选自由高碘酸钠、过氧化氢、辣根过氧化物酶及酪氨酸酶组成的组中的一种。
5.根据权利要求3所述的透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，
在上述通过添加氧化剂来进行交联的步骤中，形成下述化学式2的交联键：
化学式2：
在上述化学式2中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
6.根据权利要求3所述的透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，上述pH调节剂为选自由氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶及氢氧化钡组成的组中的一种。
7.根据权利要求3所述的透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，
在上述通过添加pH调节剂来进行交联的步骤中，形成下述化学式3的交联键：
化学式3：
在上述化学式3中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
8.一种透明质酸水凝胶，通过对下述化学式1的透明质酸衍生物进行交联来制备，其特征在于，
形成有下述化学式2的交联键：
化学式1：
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数，
化学式2：
在上述化学式2中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
9.根据权利要求8所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，上述透明质酸衍生物的分子量为10000Da至2000000Da。
10.根据权利要求8所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，上述透明质酸衍生物具有0.1％至50％的棓酚基取代率。
11.一种透明质酸水凝胶，通过对下述化学式1的透明质酸衍生物进行交联来制备，其特征在于，
形成有下述化学式3的交联键：
化学式1：
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数，
化学式3：
在上述化学式3中，HA'为利用酰胺基取代羧基的透明质酸。
12.根据权利要求11所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，上述透明质酸衍生物的分子量为10000Da至2000000Da。
13.根据权利要求11所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，上述透明质酸衍生物具有0.1％至50％的棓酚基取代率。
14.一种组织工程支架，其特征在于，包含权利要求8至13中任一项所述的透明质酸水凝胶。
15.一种药物传递载体，其特征在于，包含权利要求8至13中任一项所述的透明质酸水凝胶。
16.根据权利要求5所述的药物传递载体，其特征在于，上述药物为包含抗体、抗体片段、脱氧核糖核酸、核糖核酸或小干扰核糖核酸的核酸、肽、基因、蛋白质、干细胞或化合物。
17.一种填充物组合物，其特征在于，包含权利要求8至13中任一项所述的透明质酸水凝胶。
18.一种防粘连组合物，其特征在于，包含权利要求8至13中任一项所述的透明质酸水凝胶。
19.一种伤口敷料用组合物，其特征在于，包含权利要求8至13中任一项所述的透明质酸水凝胶。
20.一种透明质酸衍生物，其特征在于，
由利用邻苯三酚基进行改性的下述化学式1表示：
化学式1：
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数。
21.一种填充物组合物，其特征在于，包含利用邻苯三酚基进行改性的透明质酸衍生物。
22.根据权利要求21所述的填充物组合物，其特征在于，
上述透明质酸衍生物由下述化学式1表示：
化学式1：
在上述化学式1中，R1为羟基或n为1至1000的整数。
23.根据权利要求22所述的填充物组合物，其特征在于，上述透明质酸衍生物的分子量为10000Da至2000000Da。
24.根据权利要求22所述的填充物组合物，其特征在于，上述透明质酸衍生物具有1％至20％的棓酚基取代率。
25.根据权利要求22所述的填充物组合物，其特征在于，相对于整个填充物组合物，含有0.1％(w/v)至10％(w/v)的上述透明质酸衍生物。
26.根据权利要求21所述的填充物组合物，其特征在于，上述组合物在生物体外处于液体状态，且在生物体内在不存在交联剂的情况下形成凝胶化状态。
27.根据权利要求21或26所述的填充物组合物，其特征在于，上述组合物向选自由泪沟区域、眉间皱纹区域、眼角区域、额头区域、鼻梁区域、鼻子旁边皱纹区域、嘴旁边皱纹区域及颈部皱纹区域组成的组中的一个部位注入。
28.根据权利要求21或26所述的填充物组合物，其特征在于，上述组合物还包含选自由成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、角化细胞生长因子、转化生长因子-α、转化生长因子-β、粒细胞集落刺激因子、***、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子-BB、脑源性神经营养因子及胶质细胞源性神经营养因子组成的组中的一种细胞生长因子。
29.根据权利要求21或26所述的填充物组合物，其特征在于，上述组合物还包含选自由局部麻醉剂、抗氧化剂、维生素及它们的组合组成的组中的一种成分。
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