CN110603052A - 单独的和与程序性死亡受体1(pd-1)抗体组合的抗tigit抗体的稳定制剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的抗体的稳定制剂，其任选地进一步含有抗人程序性死亡受体1(PD‑1)抗体或其抗原结合片段。还提供了用本发明的制剂治疗各种癌症和慢性感染的方法。

Description

单独的和与程序性死亡受体1(PD-1)抗体组合的抗TIGIT抗体 的稳定制剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及治疗性抗体的制剂及其在治疗各种病症中的用途。在一个方面，本发明涉及包含与具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)结合的抗体或其抗原结合片段的制剂。在另一方面，这种制剂进一步包含抗人程序性死亡受体1(PD-1)抗体或其抗原结合片段。还提供了用本发明的制剂治疗各种癌症和慢性感染的方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月2日提交的U.S.S.N.62/500,278的权益，其内容通过引用以其整体并入本文中。
电子提交的序列表的引用
本申请的序列表通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子提交，文件名为“24453WOPCT-SEQTXT-01MAY2018.TXT”，创建日期为2018年5月1日，大小为227Kb。通过EFS-Web提交的此序列表是说明书的一部分并通过引用以其整体并入全文中。
背景技术
用于人类的抗体药物的恒定域氨基酸序列或可变域内的框架序列可能有所不同，但通常在CDR序列中差异最大。甚至与相同蛋白质、相同多肽或甚至潜在地相同表位结合的抗体可以包含完全不同的CDR序列。也可从人种系抗体序列或非人(例如啮齿类)种系抗体序列(例如在人源化抗体中)获得用于人类的治疗性抗体，从而导致潜在的CDR序列的进一步多样性。这些序列差异导致溶液中的稳定性不同以及对溶液参数的响应度不同。另外，氨基酸排列的微小变化或一个或几个氨基酸残基的变化可导致抗体稳定性和对序列特异性降解途径的敏感性显著不同。结果，目前尚无法预测优化抗体稳定性所需的溶液条件。必须分别研究每种抗体，以确定最佳的溶液制剂。Bhambhani等人(2012)J.Pharm.Sci.101:1120。
抗体也是相对较高分子量的蛋白质(～150,000Da)，例如与其他治疗性蛋白质(诸如激素和细胞因子)相比。结果，常常需要相对高体重含量(weight amount)的抗体药物剂量以获得期望的药物摩尔浓度。另外，通常期望皮下施用抗体药物，因为这使得能够自我施用(self-administration)。自我施用避免了与访问医疗机构进行施用(例如静脉内)相关的时间和费用。皮下递送受单次注射中在注射部位可实际递送的溶液体积限制，其通常为约1至1.5ml。
通常使用充满药物的液体溶液制剂而不是冻干形式的预先填充注射器或自动注射器来完成皮下自我施用，以避免需要患者在注射之前重悬药物。抗体药物在储存期间必须是稳定的以确保功效和一致的剂量，因此至关重要的是，无论选择哪种制剂，均应支持所需的特性，例如高浓度、透明度和可接受的粘度，并且还应在典型的存储条件下在可接受的长保质期内保持这些特性和药物功效。
TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是一种主要在活化T细胞和NK细胞上表达的免疫调节受体。TIGIT也称为VSIG9；VSTM3；和WUCAM。它的结构显示一个细胞外免疫球蛋白结构域、1型跨膜区和两个ITIM基序。TIGIT形成由T细胞上的阳性(CD226)和阴性(TIGIT)免疫调节受体和APC上表达的配体(CD155和CD112)组成的共刺激网络的一部分。
TIGIT结构的重要特征是在其胞质尾结构域中存在基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。与PD-1和TIGIT一样，TIGIT胞质区中的ITIM结构域预计会募集酪氨酸磷酸酶，诸如SHP-1和SHP-2，随后用T细胞受体(TCR)亚基上的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)将酪氨酸残基去磷酸化。因此，TIGIT与肿瘤细胞或TAMS表达的受体-配体CD155和CD112的接合可能参与了TCR信号传导和T细胞活化的抑制，可能参与了TCR信号传导和T细胞活化对建立有效抗肿瘤免疫而言是必需的。因此，对TIGIT具有特异性的拮抗剂抗体可抑制CD155和CD112诱导的T细胞反应的抑制并增强抗肿瘤免疫。
存在用于药物用途例如用于治疗各种癌症和传染病的抗TIGIT抗体的稳定制剂，以及与抗人PD-1抗体共同配制的抗TIGIT抗体的稳定制剂的需求。优选地，这样的制剂将表现出长的保质期，在存储和运输时是稳定的，以及将优选地在用于自我施用的药物存储的典型条件下，即在注射器中在冰箱温度下，在数月至数年中表现出稳定性，从而导致相应药品的保质期长。
发明概述
在一个方面，本发明包括抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的制剂，其包含(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)缓冲液，(iii)非还原性糖；(iv)非离子表面活性剂；和(v)抗氧化剂。在一个实施方式中，所述制剂进一步包含抗PD-1抗体，例如，派姆单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)。在另一实施方式中，所述制剂包含螯合剂。
在本发明的一个实施方式中，所述制剂包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mM至约20mM缓冲液；(iii)约6％至约8％重量/体积(w/v)非还原性糖；(iv)约0.01％至约0.10％(w/v)非离子表面活性剂；和(v)约1mM至约20mM抗氧化剂。在一个实施方式中，所述制剂进一步包含抗PD-1抗体，例如，派姆单抗或纳武单抗。在另一实施方式中，所述制剂进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂的pH在4.5-6.5之间。在特定的实施方式中，所述制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.2。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约pH 5.6至约pH 6.0。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约5.7。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约5.8。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约5.9。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约6.0。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约6.1。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约6.2。
在所述制剂的一个实施方式中，所述缓冲液为L-组氨酸缓冲液或乙酸钠，所述非还原性糖为蔗糖，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯80，并且所述抗氧化剂为蛋氨酸或其药学上可接受的盐。在一个实施方式中，所述抗氧化剂为L-蛋氨酸。在另一实施方式中，所述抗氧化剂为L-蛋氨酸的药学上可接受的盐，例如，蛋氨酸HCl。
在另一实施方式中，所述制剂包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mM至约20mM的L-组氨酸缓冲液或约5mM至约20mM的乙酸钠缓冲液；(iii)约6％至约8％w/v蔗糖；(iv)约0.01％至约0.10％(w/v)聚山梨酯80；和(v)约1mM至约20mM L-蛋氨酸。在另一实施方式中，所述制剂进一步包含抗PD-1抗体，例如，派姆单抗或纳武单抗。在一个实施方式中，所述制剂进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂的存在量为约1μM至约50μM。在一个实施方式中，所述螯合剂为DTPA。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA。在一个实施方式中，所述缓冲液为L-组氨酸缓冲液。在一个实施方式中，所述制剂包含约8mM至约12mM的L-组氨酸缓冲液。在另一实施方式中，所述制剂包含约5mM至约10mM的L-蛋氨酸。
在另一实施方式中，所述制剂包含重量比为约0.02％(w/v)聚山梨酯80。在一个实施方式中，所述抗TIGIT制剂包含重量比为约7％(w/v)的蔗糖。在任何这些实施方式中，所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。
在所述制剂的实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约10mg/ml至约100mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约10mg/ml、12.5mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml或100mg/ml。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约20mg/ml。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约25mg/ml。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约50mg/ml。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约75mg/ml。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约100mg/ml。
在一个方面，提供了一种制剂，其包含约20mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在一个方面，提供了一种制剂，其包含约25mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在一个方面，提供了一种制剂，其包含约50mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在一个方面，提供了一种制剂，其包含约75mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在一个方面，提供了一种制剂，其包含约100mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在上述任何制剂的一个方面，所述制剂的pH为约5.4至约6.2。在另一方面，所述制剂的pH为约5.5–6.2。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约5.8–6.1。在另一实施方式中，所述pH为约5.8。在另一实施方式中，所述pH为约5.9。在另一方面，所述pH为6.0。在另一实施方式中，所述pH为6.1。
在上述任何制剂的一个方面，所述制剂包含抗PD1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述抗PD1抗体为派姆单抗。在另一方面，所述抗PD1抗体为纳武单抗。
在另一方面，所述制剂可进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂为DTPA。在一个实施方式中，所述螯合剂为EDTA。在一个方面，所述螯合剂以约1μM至约50μM的量存在。在一个实施方式中，所述制剂包含约5μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约10μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约15μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约20μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约25μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约30μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约35μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约40μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约45μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述制剂包含约50μM的螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂为DTPA，其以上述任何量存在。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA，其以上述任何量存在。
在一个实施方式中，所述制剂包含在玻璃小瓶中。在另一实施方式中，所述制剂包含在注射装置中。在另一实施方式中，所述制剂为液体制剂。在一个方面，将所述制剂冷冻至至少低于-70℃。在另一实施方式中，所述制剂为来自冻干制剂的重构溶液。
在某些实施方式中，所述制剂在冷藏温度(2-8℃)下稳定至少3个月，优选6个月，更优选1年，甚至更优选长达2年。在所述制剂的一个实施方式中，在5℃下12个月后，如通过尺寸排阻色谱法所确定的，所述抗TIGIT抗体的％单体≥90％。在所述制剂的另一实施方式中，在5℃下12个月后，如通过尺寸排阻色谱法所确定的，所述抗TIGIT抗体的％单体≥95％。在所述制剂的另一实施方式中，在5℃下12个月后，如通过还原CE-SDS所确定的，所述抗TIGIT抗体的％重链和轻链≥90％。在所述制剂的另一实施方式中，在5℃下12个月后，如通过还原CE-SDS所确定的，所述抗TIGIT抗体的％重链和轻链≥95％。在所述制剂的另一实施方式中，在5℃下12个月后，如通过非还原CE-SDS所确定的，所述抗TIGIT抗体的％完整IgG≥90％。在所述制剂的另一实施方式中，在5℃下12个月后，如通过非还原CE-SDS所确定的，所述抗TIGIT抗体的％完整IgG≥95％。
在上述任何制剂的一个方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含三个轻链CDR和三个重链CDR，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：111或其变体的CDRL1，SEQ ID NO：112或其变体的CDRL2，SEQ ID NO：113或其变体的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：108或其变体的CDRH1，SEQ ID NO：154或其变体的CDRH2和SEQ ID NO：110或其变体的CDHR3。在上述任何制剂的一个方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含三个轻链CDR和三个重链CDR，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：111的CDRL1，SEQ IDNO：112的CDRL2，SEQ ID NO：113的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：108的CDRH1，SEQID NO：154的CDRH2和SEQ ID NO：110的CDHR3。在另一方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148或其变体的重链可变区和包含SEQ ID NO：152或其变体的轻链可变区。在另一方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148的重链可变区和包含SEQ ID NO：152的轻链可变区。在一个方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列或其变体的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列或其变体的人κ轻链恒定域。在一个方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域。在另一方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列的人重链IgG4恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域。在另一方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列或其变体的人重链IgG4恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列或其变体的人κ轻链恒定域。
在一个方面，本发明提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的共制剂，其包含(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，(ii)缓冲液，(iii)非还原性糖；(iv)非离子表面活性剂；和(v)抗氧化剂。在一个实施方式中，所述共制剂进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂为EDTA。在另一实施方式中，所述螯合剂为DTPA。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为1：2。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为1：1。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为2：1。
在本发明的一个实施方式中，所述共制剂包含(i)约1mg/ml至约200mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)约1mg/ml至约200mg/ml的抗人PD-1抗体；(iii)约5mM至约20mM缓冲液；(iv)约6％至约8％重量/体积(w/v)非还原性糖；(v)约0.01％至约0.10％(w/v)非离子表面活性剂；和(vi)约1mM至约20mM抗氧化剂。在一个实施方式中，所述共制剂进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂的存在量为约1μM至约50μM。在一个实施方式中，所述螯合剂为DTPA。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为1：2。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为1：1。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为2：1。在一个实施方式中，所述共制剂的pH在4.5-6.5之间。在特定的实施方式中，所述制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.2。在另一实施方式中，所述制剂的pH为约pH 5.8-6.0。
在所述共制剂的一个实施方式中，所述缓冲液为L-组氨酸缓冲液或乙酸钠缓冲液，所述非还原性糖为蔗糖，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯80，并且所述抗氧化剂为L-蛋氨酸。在另一实施方式中，所述共制剂包含(i)约1mg/ml至约100mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；(ii)约1mg/ml至约100mg/ml的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段；(iii)约5mM至约20mM的L-组氨酸或约5mM至约20mM的乙酸钠缓冲液；(iv)约6％至约8％w/v蔗糖；(v)约0.01％至约0.10％(w/v)聚山梨酯80；和(vi)约1mM至约20mM L-蛋氨酸。在一个实施方式中，所述共制剂任选地包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂的存在量为约1μM至约50μM。在一个实施方式中，所述螯合剂为DTPA。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA。在所述共制剂的一个实施方式中，所述缓冲液为L-组氨酸缓冲液。在一个实施方式中，所述共制剂包含约8mM至约12mM的L-组氨酸缓冲液。在另一实施方式中，所述共制剂包含约5mM至约10mM L-蛋氨酸。在另一实施方式中，所述共制剂包含重量比为约0.02％w/v聚山梨酯80。在一个实施方式中，所述共制剂包含重量比为约7％(w/v)的蔗糖。
在所述共制剂的实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约1mg/ml至约100mg/ml。在所述共制剂的实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约10mg/ml至约100mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约10mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约12.5mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约20mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约25mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约50mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约75mg/ml。在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约100mg/ml。
在所述共制剂的一些实施方式中，所述抗人PD-1抗体的浓度为约1mg/ml至约100mg/ml。在所述共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体的浓度为约10mg/ml至约100mg/ml。在另一实施方式中，所述抗人PD-1抗体的浓度为20mg/ml。在另一实施方式中，所述抗人PD-1抗体的浓度为25mg/ml。
在一个实施方式中，所述共制剂包含约20mg/ml的抗PD1抗体、约20mg/ml的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖，约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在一个实施方式中，所述共制剂包含约25mg/ml的抗PD1抗体，约25mg/ml的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖，约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在一个实施方式中，所述共制剂包含约50mg/ml的抗PD1抗体，约50mg/ml的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖，约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
在上述任何制剂的一个方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含三个轻链CDR和三个重链CDR，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：111或其变体的CDRL1，SEQ ID NO：112或其变体的CDRL2，SEQ ID NO：113或其变体的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：108或其变体的CDRH1，SEQ ID NO：154或其变体的CDRH2和SEQ ID NO：110或其变体的CDHR3。在上述任何制剂的一个方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含三个轻链CDR和三个重链CDR，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：111的CDRL1，SEQ IDNO：112的CDRL2，SEQ ID NO：113的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：108的CDRH1，SEQID NO：154的CDRH2和SEQ ID NO：110的CDHR3。在另一方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148或其变体的重链可变区和包含SEQ ID NO：152或其变体的轻链可变区。在另一方面，所述制剂包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148的重链可变区和包含SEQ ID NO：152的轻链可变区。在一个方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列或其变体的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列或其变体的人κ轻链恒定域。在一个方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域。在另一方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列或其变体的人重链IgG4恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列或其变体的人κ轻链恒定域。在另一方面，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段进一步包含包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列的人重链IgG4恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域。
在上述任何制剂的一个方面，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含三个轻链CDR和三个重链CDR，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：1或其变体的CDRL1，SEQ ID NO：2或其变体的CDRL2，SEQ ID NO：3或其变体的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：6或其变体的CDRH1，SEQ ID NO：7或其变体的CDRH2和SEQ ID NO：8或其变体的CDHR3。在上述任何制剂的一个方面，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含三个轻链CDR和三个重链CDR，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：1的CDRL1，SEQ ID NO：2的CDRH2，SEQ ID NO：3的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：6的CDRH1，SEQ ID NO：7的CDRH2和SEQ ID NO：8的CDRH3。在另一方面，所述制剂包含抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：4或其变体的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9或其变体的重链可变区。在另一方面，所述制剂包含抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：4的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的重链可变区。在另一方面，所述制剂包含抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQID NO：5的轻链和包含SEQ ID NO：10的重链。在另一方面，所述制剂包含抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：5或其变体的轻链和包含SEQ ID NO：10或其变体的重链。在上述任何制剂的一个方面，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段为派姆单抗。在另一方面，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段为纳武单抗。
在上述任何共制剂的一个方面，所述制剂包含(i)包含三个轻链CDR和三个重链CDR的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：111的CDRL1，SEQID NO：112的CDRL2，SEQ ID NO：113的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：108的CDRH1，SEQ ID NO：154的CDRH2和SEQ ID NO：110的CDHR3和(ii)包含三个轻链CDR和三个重链CDR的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链CDR包括SEQ ID NO：1的CDRL1，SEQ IDNO：2的CDRL2、SEQ ID NO：3的CDRL3并且所述重链CDR包括SEQ ID NO：6的CDRH1、SEQ IDNO：7的CDRH2和SEQ ID NO：8的CDRH3。
在任何以上共制剂的一个方面，所述制剂包含(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148的重链可变区和包含SEQ ID NO：152的轻链可变区和(ii)抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：4的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的重链可变区。
在任何以上共制剂的另一方面，所述制剂包含(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148的重链可变区并进一步包含包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：152的轻链可变区并进一步包含包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域和(ii)抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQID NO：5的轻链和包含SEQ ID NO：10的重链。
在任何以上共制剂的另一方面，所述制剂包含(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQ ID NO：148的重链可变区并进一步包含包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：152的轻链可变区并进一步包含包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域和(ii)抗人PD1抗体或其抗原结合片段，其包含包含SEQID NO：5的轻链和包含SEQ ID NO：10的重链。
在上述任何制剂的一个实施方式中，所述制剂包含在玻璃小瓶中。在另一实施方式中，所述制剂包含在注射装置中。在另一实施方式中，所述制剂为液体制剂。在一个方面，将所述制剂冷冻至至少低于-70℃。在另一实施方式中，所述制剂为来自冻干制剂的重构溶液。
本发明提供了一种在有需要的哺乳动物受试者(例如人)中治疗慢性感染或癌症的方法，所述方法包括：施用有效量的本文所述的抗TIGIT制剂或共制剂。
附图说明
图1显示在各种储存条件下在9个月内制剂的pH稳定性。
图2显示在各种储存条件下在9个月内制剂的聚山梨酯80浓度稳定性。
图3显示在各种储存条件下在9个月内制剂的ELISA稳定性数据中的效力。
图4显示在各种储存条件下在9个月内制剂的UP-SEC稳定性数据中的单体(％)。
图5显示在各种储存条件下在9个月内制剂的UP-SEC稳定性数据中的高分子量(HMW)种类(％)。
图6显示在各种储存条件下在9个月内制剂的UP-SEC稳定性数据中的低分子量(LMW)种类(％)。
图7显示在各种储存条件下在9个月内制剂的CE-SDS还原稳定性数据中的纯度重链+轻链(％)。
图8显示在各种储存条件下在9个月内制剂的CE-SDS非还原稳定性数据中的纯度完整IgG(％)。
发明详述
在一个方面，本发明提供了包含抗TIGIT抗体及其抗原结合片段的制剂，其包含蛋氨酸。还提供了抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的共制剂，其包含蛋氨酸。在每种情况下，所述制剂和共制剂任选地包含螯合剂。
I.定义与缩写
如整个说明书和所附权利要求书所使用的，以下缩写适用：
API 活性药物成分
CDR 除非另有说明，否则使用Kabat编号***定义的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
CHO 中国仓鼠卵巢
CI 置信区间
DTPA 二亚乙基三胺五乙酸
EC50 导致50％功效或结合的浓度
ELISA 酶联免疫吸附法
FFPE ***固定，石蜡包埋
FR 框架区
HRP 辣根过氧化物酶
HNSCC 头颈鳞状细胞癌
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
IHC 免疫组化(immunohistochemistry)或免疫组化的(immunohistochemical)
mAb 单克隆抗体
MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸
NCBI 国家生物技术信息中心
NSCLC 非小细胞肺癌
PCR 聚合酶链反应
PD-1 程序性死亡1(又称程序性细胞死亡-1和程序性死亡受体1)
PD-L1 程序性细胞死亡1配体1
PD-L2 程序性细胞死亡1配体2
PS80 聚山梨酯80
TNBC 三阴性乳腺癌
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
VL 免疫球蛋白轻链可变区
v/v 体积/体积
WFI 注射用水
w/v 重量/体积
为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文件别处特别地定义，否则如本文所用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如在整个说明书中以及在所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另外清楚地指出。
除非上下文清楚地指出了所指示的可能性之一，否则对“或”的提及指示一种或两种可能性。在一些情况下，使用“和/或”来突出一种或两种可能性。
如本文所用，“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”癌症意指将本发明的制剂施用于患有免疫状况或癌性状况或被诊断出患有癌症或病原性感染(例如病毒，细菌、真菌)的受试者，以达到至少一种积极的治疗效果，例如，减少癌细胞的数量、减少肿瘤的大小、减少癌细胞浸入周围器官的速率或降低肿瘤转移或肿瘤生长的速率。“治疗”可包括以下一项或多项：诱导/增加抗肿瘤免疫反应，刺激对病原体、毒素和/或自身抗原的免疫反应，刺激对病毒感染的免疫反应，减少一种或多种肿瘤标志物的数量，抑制肿瘤细胞的生长或存活，消除或减小一种或多种癌性病变或肿瘤的大小，降低一种或多种肿瘤标志物的水平，改善、降低癌症的严重程度或持续时间，相对于未治疗的类似患者的预期生存期，延长患者的生存期。
“免疫状况”或“免疫病症”涵盖例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫病症或疾病。“免疫状况”还指感染、持续性感染和增生状况，诸如癌症、肿瘤和血管生成，包括抵抗免疫***根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性状况”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管生成和癌前性状况诸如发育不良。
可以以许多方式测量癌症中的积极治疗效果(参见，W.A.Weber,J.Nucl.Med.50:1S-10S(2009))。例如，关于肿瘤生长抑制，根据NCI标准，T/C≤42％为最小水平的抗肿瘤活性。T/C<10％被认为是高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝所治疗的中位肿瘤体积/对照的中位肿瘤体积×100。在一些实施方式中，通过施用本发明的制剂实现的治疗为无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或总生存期(OS)中的任何一种。PFS，也称为“肿瘤进展时间”，是指治疗期间和治疗后癌症不生长的时间长度，并且包括患者经历完全响应或部分响应的时间量，以及患者经历稳定的疾病的时间量。DFS是指患者在治疗期间和治疗后保持无病的时间长度。OS是指与初始(naive)或未治疗的个体或患者相比预期寿命的延长。尽管本发明的制剂、治疗方法和用途的实施方式可能无法有效地在每位患者中获得积极的治疗效果，但它应在统计学上显著数量的受试者中实现，如通过本领域已知的任何统计检验所确定的那样，诸如Student’s t检验、chi2检验、根据Mann和Whitney进行的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。
术语“患者”(在本文中可替代地称为“受试者”或“个体”)是指能够用本发明的制剂治疗的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔子)，最优选人。在一些实施方式中，患者为成年患者。在其他实施方式中，患者为儿科患者。
术语“抗体”是指表现出期望的生物学活性的任何形式的抗体。因此，它以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人源化的、完全人抗体和嵌合抗体。“亲本抗体”是为了预期用途修饰抗体之前将免疫***暴露于抗原而获得的抗体，所述预期用途例如是用作人治疗性抗体的抗体的人源化。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整的抗体具有两个结合位点。重链的羧基端部分可以限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，将人轻链分类为κ和λ轻链。此外，通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区相连，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.编,第2版Raven Press,N.Y.(1989)。
通常，重链和轻链的可变域均包含位于相对保守的框架区(FR)内的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。所述CDR通常由框架区对齐，从而能够结合至特定表位。通常，从N-端到C-端，轻链和重链可变域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutesof Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公开号91-3242期(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等人，(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等人，(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等人，(1989)Nature 342:878-883的定义，将氨基酸分配至每个结构域。
“特异性结合”特定靶蛋白的抗体是这样的抗体：与其他蛋白相比，其表现出优先结合该靶标，但该特异性不需要绝对结合特异性。如果抗体结合会确定靶蛋白在样品中的存在，例如不产生不希望的结果诸如假阳性，则该抗体被认为对其预定靶标是“特异性的”。可用于本发明的抗体或其结合片段将以比与非靶蛋白的亲和力大至少2倍、优选地大至少10倍、更优选地大至少20倍和最优选地大至少100倍的亲和力结合靶蛋白。如本文所用，在以下情况下，就说抗体特异性结合包含给定氨基酸序列(例如成熟的人TIGIT或人PD-1的氨基酸序列)的多肽：所述抗体结合包含该序列的多肽，但不结合缺乏该序列的蛋白。
“嵌合抗体”是指这样的抗体：其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种(例如，人)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一物种(例如，小鼠)或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这样抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可。
如本文所用，“共同配制的(Co-formulated)”或“共制剂(co-formulation)”或“共制剂(coformulation)”或“共同配制的(coformulated)”是指至少两种不同的抗体或其抗原结合片段，其被配制在一起并作为组合产品存储在单个小瓶或容器(例如注射装置)中，而不是单独配制和储存，然后在施用前混合或分开施用。在一个实施方式中，所述共制剂含有两种不同的抗体或其抗原结合片段。
术语“药学上有效的量”或“有效量”意指将足够的治疗组合物或制剂引入患者以治疗疾病或状况的量。本领域技术人员认识到，该水平可以根据患者的特征诸如年龄、体重等而变化。
术语“约”，当修饰物质或组合物的量(例如，mM或M)、制剂组分的百分比(v/v或w/v)，溶液/制剂的pH或表征方法中的步骤的参数的值等时，是指可能例如通过在物质或组合物的制备、表征和/或使用中涉及的典型测量、处理和取样程序；通过这些程序中的工具错误；通过用于制备或使用组合物或实施程序的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等而发生的数值量的变化。在某些实施方式中，“约”可以意指±0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的变化。
如本文所用，“x％(w/v)”等于x g/100ml(例如5％w/v等于50mg/ml)。
本发明的制剂包括重构或呈液体形式时具有生物活性的抗体及其片段。
术语“癌症”、“癌性(cancerous)”或“恶性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长不受控制为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃肠(道)癌(gastrointestinal(tract)cancer)、肾癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、成淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、结直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)、***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。
“Chothia”意指在Al-Lazikani等人，JMB 273:927-948(1997)中描述的抗体编号***。
如本文所用，“Kabat”意指由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)开创的免疫球蛋白比对和编号***。
“生长抑制剂”当在本文中使用时是指在体外或体内抑制细胞，尤其是过表达本文中所鉴定的任何基因的癌细胞的化合物或组合物。因此，生长抑制剂是显著降低所述细胞在S期过表达此类基因的百分比的抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻止细胞周期进程(在S期以外的地方)的药剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻滞剂包括长春胺类(vincas)(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和topo II抑制剂诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素和依托泊苷。阻滞G1的那些试剂也会溢出到S期阻滞中，例如DNA烷化剂诸如达卡巴嗪、氮芥和顺铂。进一步的信息可以在The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel编，第1章，标题为“Cell cycle regulation,oncogens,and antineoplastic drugs”(Murakami等人)(WB Saunders:Philadelphia，1995)中找到。
术语“TIGIT结合片段”、“其抗原结合片段”、“其结合片段”或“其片段”包括仍基本上保留其与抗原(人TIGIT)结合和抑制其活性(例如，阻断人TIGIT与其天然配体的结合)的生物学活性的抗体的片段或衍生物。
因此，术语“抗体片段”或TIGIT结合片段是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。TIGIT抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。通常，结合片段或衍生物保留其TIGIT抑制活性的至少10％。在一些实施方式中，结合片段或衍生物保留其TIGIT抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)，尽管具有足以发挥期望的生物学效应的亲和力的任何结合片段都将是有用的。在一些实施方式中，抗原结合片段以比无关抗原的亲和力至少大两倍，优选至少大十倍，更优选至少大20倍，最优选至少大100倍的亲和力与其抗原结合。在一个实施方式中，抗体的亲和力大于约109升/mol，例如通过Scatchard分析确定的。Munsen等人(1980)Analyt.Biochem.107:220-239。还意图TIGIT结合片段可以包括具有基本上不改变其生物学活性的保守氨基酸取代的变体。
术语“PD-1结合片段”、“其抗原结合片段”、“其结合片段”或“其片段”包括仍基本上保留其与抗原(人PD-1)结合和抑制其活性(例如，阻断PD-1与PDL1和PDL2的结合)的生物学活性的抗体的片段或衍生物。因此，术语“抗体片段”或PD-1结合片段是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。通常，结合片段或衍生物保留其PD-1抑制活性的至少10％。在一些实施方式中，结合片段或衍生物保留其PD-1抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)，尽管具有足以发挥期望的生物学效应的亲和力的任何结合片段都将是有用的。在一些实施方式中，抗原结合片段以比无关抗原的亲和力至少大两倍，优选至少大十倍，更优选至少大20倍，最优选至少大100倍的亲和力与其抗原结合。在一个实施方式中，抗体的亲和力大于约109升/mol，例如通过Scatchard分析确定的。Munsen等人(1980)Analyt.Biochem.107:220-239。还意图PD-1结合片段可以包括具有基本上不改变其生物学活性的保守氨基酸取代的变体。
“人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生的话，人抗体可能含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”是指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
“人源化抗体”是指含有来自非人(例如，鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。啮齿动物抗体的人源化形式通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，尽管为了增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性或为了其他原因可以包括某些氨基酸取代。
本发明的抗体还包括具有修饰的(或封闭的)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见，例如，美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58:640-656。这种修饰可用于增强或抑制免疫***的各种反应，在诊断和治疗中可能具有有益作用。Fc区的包括氨基酸变化(取代、缺失和***)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。Fc的变化也可以改变治疗性抗体中抗体的半衰期，并且更长的半衰期将导致给药频率降低，同时增加了便利性并减少了材料的使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731(734-35)。
“完全人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可能含有鼠类碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。可以通过噬菌体展示或其他分子生物学方法，在人类中、在具有人免疫球蛋白种系序列的转基因动物中产生完全人抗体。
“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如如通过Kabat编号***(Kabat等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.)测定的轻链可变域中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)和重链可变域中的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)，和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))和重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3))(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除本文中定义为CDR残基的高变区残基以外的那些可变域残基。CDR和FR残基根据Kabat的标准序列定义确定。Kabat等人(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitutes of Health，Bethesda Md。
“保守修饰的变体”或“保守取代”是指氨基酸的取代是本领域技术人员已知的，并且可以在通常不改变所得分子的生物学活性的情况下，甚至在多肽的必需区域中进行。这样的示例性取代优选根据表1所示的那些进行，如下所示：
表1.示例性的保守氨基酸取代
另外，本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代不会实质上改变生物活性。参见，例如，Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版)。
如整个说明书和权利要求书所用，短语“基本上由……组成(consistsessentially of)”或变体诸如“基本上由……组成(consist essentially of)”或“基本上由……组成(consisting essentially of)”指示包括任何列举的要素或要素集合，并任选地包括具有与列举的要素类似或不同的性质的其他要素，所述其他要素不会实质上改变指定的剂量方案、方法或组合物的基本或新的特性。作为非限制性实例，基本上由列举的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括不会实质上影响结合化合物的特性的一个或多个氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的取代。
“包含(comprising)”或变体诸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”或包含(comprised of)在整个说明书和权利要求书中以包括性含义使用，即，指定所述特征的存在，但不排除可能实质上增强本发明的任何实施方式的操作或实用性的其他特征的存在或添加，除非由于表达语言或必要的暗示上下文另外要求。
“分离的抗体”和“分离的抗体片段”是指纯化状态，并且在这样的上下文中意指命名的分子基本上不含有其他生物学分子诸如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物，或其他物质诸如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”无意是指完全不存在这种物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以实质上干扰如本文中所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指基本上均一的抗体的群体，即，除了可能以小量存在的可能的天然存在的突变外，包含所述群体的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括许多在它们的可变域(特别是它们的CDR)中具有不同氨基酸序列的不同抗体，它们经常对不同表位是特异性的。修饰词“单克隆的”指示所述抗体获自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人(1975)Nature256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。也可以使用在例如Clackson等人(1991)Nature 352:624-628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。也参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
“肿瘤”当它应用于诊断出癌症或疑似具有癌症的受试者时，是指恶性的或潜在恶性的任何大小的肿瘤或组织团块，并包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体瘤是组织的异常生长或团块，通常不含有囊肿或液体区域。不同类型的实体瘤用形成它们的细胞的类型来命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液的癌症)通常不形成实体瘤(美国国立癌症研究所(National Cancer Institute)，癌症术语词典(Dictionary of CancerTerms))。
术语“肿瘤大小”是指可以测量为肿瘤的长度和宽度的肿瘤的总大小。肿瘤大小可通过本领域已知的多种方法来确定，例如，通过在从受试者取出后测量肿瘤的尺寸(例如，使用测径器)，或当在体内时使用成像技术，例如，骨扫描、超声、CT或MRI扫描。
如本文所用，“可变区”或“V区”意指IgG链的片段，其在不同抗体之间的序列是可变的。它延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的113。
术语“缓冲液”涵盖那些将本发明制剂的溶液pH保持在可接受范围内的试剂，或者对于本发明的冻干制剂，在冻干之前提供可接受的溶液pH。
术语“冻干(lyophilization)”、“冻干的(lyophilized)”和“冷冻干燥(freeze-dried)”是指如下方法，通过该方法首先将待干燥的材料冷冻，然后通过在真空环境中升华来除去冰或冷冻的溶剂。冻干前的制剂中可包括赋形剂，以增强冻干产品在储存时的稳定性。
术语“药物制剂”是指如下制剂，所述制剂在该形式中允许活性成分有效，并且其不含有对要施用所述制剂的受试者有毒的其他组分。术语“制剂”和“药物制剂”在全文中可互换使用。
“药学上可接受的”是指可以合理地施用于受试者以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂(媒介物(vehicle)、添加剂)和组合物，并且其“通常被认为是安全的”，例如，其是生理学上可耐受的并且当施用于人时，通常不产生***反应或类似的不适反应，诸如胃部不适等。在另一实施方式中，该术语是指由联邦或州政府的监管机构批准的或列在美国药典或另一种普遍认可的药典中的分子实体和组合物，其可用于动物，尤其是人类。
“重构”制剂为通过将冻干的蛋白质制剂溶解在稀释剂中以使蛋白质分散在重构制剂中而制备的制剂。所述重构制剂适于施用，例如肠胃外施用，并且可以任选地适于皮下施用。
“重构时间”为用溶液将冻干的制剂再水合为不含颗粒的澄清溶液所需的时间。
“稳定的”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编，Marcel Dekker,Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。可以在选定的温度下选定的时间段内测量稳定性。例如，在一个实施方式中，稳定的制剂是在冷藏温度(2-8℃)下观察至少12个月没有显著变化的制剂。在另一实施方式中，稳定的制剂是在冷藏温度(2-8℃)下观察至少18个月没有显著变化的制剂。在另一实施方式中，稳定的制剂是在室温(23-27℃)下观察至少3个月没有显著变化的制剂。在另一实施方式中，稳定的制剂是在室温(23-27℃)下观察至少6个月没有显著变化的制剂。在另一实施方式中，稳定的制剂是在室温(23-27℃)下观察至少12个月没有显著变化的制剂。在另一实施方式中，稳定的制剂是在室温(23-27℃)下观察至少18个月没有显著变化的制剂。抗体制剂的稳定性标准如下。通常，如通过SEC-HPLC所测量的，不超过10％，优选不超过5％的抗体单体发生降解。通常，所述制剂是无色的，或者通过目测分析是澄清至微乳白色的。通常，所述制剂的浓度、pH和重量摩尔渗透压浓度变化不超过+/-10％。效力通常在对照或参考的60-140％以内，优选80-120％以内。通常，观察到不超过10％，优选不超过5％的抗体截短，即，例如通过HP-SEC确定的％低分子量种类。通常，观察到不超过10％，优选不超过5％的抗体聚集，即例如通过HP-SEC确定的％高分子量种类。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射测量，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，则所述抗体在药物制剂中“保持其物理稳定性”。蛋白质构象的变化可以通过确定蛋白质三级结构的荧光光谱法和确定蛋白质二级结构的FTIR光谱法进行评估。
如果抗体没有显示出显著的化学变化，则所述抗体在药物制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过检测和定量蛋白质的化学变化形式来评估。经常改变蛋白质化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法进行评估)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法进行评估)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法进行评估)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等进行评估)。
如果抗体在给定时间的生物活性在制备药物制剂时展现的生物活性的预定范围内，则抗体在药物制剂中“保持其生物学活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。
术语“等渗的”是指感兴趣的制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂通常具有约270-328mOsm的渗透压。低渗压力为250-269mOsm，高渗压力为328-350mOsm。渗透压可以例如使用蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。
II.本发明的制剂和共制剂
在一个方面，本发明提供了生物制剂，其包含与人TIGIT特异性结合的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段作为活性药物成分。在这样的制剂中包括蛋氨酸减少抗TIGIT抗体的Fc区中的蛋氨酸残基的氧化，在包含SEQ ID NO：110的CDRH3的抗TIGIT抗体的实例中，为色氨酸(tryoptophan)。这样的制剂可以进一步包含螯合剂，诸如DTPA，其可以进一步减少氧化。
在一个方面，本发明还提供了抗TIGIT抗体与抗PD-1抗体的共制剂。派姆单抗的主要降解途径包括在过氧化物应力下重链CDR3中蛋氨酸105(Met105)(例如，SEQ ID NO：10的M105)的氧化以及当暴露于光时Met105和Fc蛋氨酸残基的氧化。对于测试的降解水平，派姆单抗在大多数应力条件下均保持其生物活性。然而，通过表面等离振子共振(SPR)观察到过氧化物应力样品对PD-1的亲和力降低。暴露的蛋氨酸残基或抗体的CDR中的蛋氨酸残基可能会通过氧化影响抗体的生物学活性。蛋氨酸的添加能够减少派姆单抗重链CDR内的Met105的氧化。
抗PD-1抗体及其抗原结合片段
在一个方面，本发明提供了稳定的生物制剂，其包含与人PD-1特异性结合的作为活性药物成分(PD-1API)的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段(例如人或人源化抗PD-1抗体)共同配制的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，以及使用本发明制剂的方法。任何抗PD-1抗体或其抗原结合片段可用于本发明的共制剂和方法中。在特定实施方式中，所述PD-1API为抗PD-1抗体，其选自派姆单抗和纳武单抗。在特定实施方式中，所述抗PD-1抗体为派姆单抗。在替代实施方式中，所述抗PD-1抗体为纳武单抗。表2提供了示例性抗人PD-1抗体派姆单抗和纳武单抗的氨基酸序列。表3显示了可用于本发明的共制剂和方法中的替代PD-1抗体和抗原结合片段。
在一些实施方式中，用于本发明的共制剂的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的三个轻链CDR和/或CDRH1、CDRH2和CDRH3的三个重链CDR。
在本发明的一个实施方式中，CDRL1为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的变体，CDRL2为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的变体，并且CDRL3为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的变体。
在一个实施方式中，CDRH1为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：6的变体，CDRH2为SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：7的变体，并且CDRH3为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：8的变体。
在一个实施方式中，三个轻链CDR为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，并且三个重链CDR为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
在本发明的一个替代实施方式中，CDRL1为SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：11的变体，CDRL2为SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：12的变体，并且CDRL3为SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：13的变体。
在一个实施方式中，CDRH1为SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：16的变体，CDRH2为SEQID NO：17或SEQ ID NO：17的变体，并且CDRH3为SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：18的变体。
在一个实施方式中，三个轻链CDR为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，并且三个重链CDR为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
在一个替代实施方式中，三个轻链CDR为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13，并且三个重链CDR为SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
在本发明的另一实施方式中，CDRL1为SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：21的变体，CDRL2为SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：22的变体，并且CDRL3为SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：23的变体。
在又一实施方式中，CDRH1为SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：24的变体，CDRH2为SEQID NO：25或SEQ ID NO：25的变体，并且CDRH3为SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：26的变体。
在另一实施方式中，三个轻链CDR为SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，并且三个重链CDR为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。
本发明的一些抗人PD-1抗体和抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区。在一些实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的变体，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：9的变体。在进一步的实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：14的变体，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：19的变体。在进一步的实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：27的变体，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：28的变体、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：29的变体、或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：30的变体。在这样的实施方式中，变体轻链或重链可变区序列与参考序列相同，除了具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述取代在构架区中(即，在CDR以外)。在一些实施方式中，一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代是保守取代。
在本发明的共制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或抗原结合片段包含包含或由SEQ ID NO：4组成的轻链可变区和包含或由SEQ ID NO：9组成的重链可变区。在另一实施方式中，所述抗人PD-1抗体或抗原结合片段包含包含或由SEQ ID NO：14组成的轻链可变区和包含或由SEQ ID NO：19组成的重链可变区。在本发明制剂的一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或抗原结合片段包含包含或由SEQ ID NO：28组成的轻链可变区和包含或由SEQ ID NO：27组成的重链可变区。在另一实施方式中，所述抗人PD-1抗体或抗原结合片段包含包含或由SEQ ID NO：29组成的轻链可变区和包含或由SEQ ID NO：27组成的重链可变区。在另一实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含包含或由SEQ ID NO：30组成的轻链可变区和包含或由SEQ ID NO：27组成的重链可变区。
在另一实施方式中，本发明的共制剂包含抗人PD-1抗体或抗原结合蛋白，其具有与上述VL结构域或VH结构域之一至少95％、90％、85％、80％、75％或50％的序列同源性的VL结构域和/或VH结构域，并表现出与PD-1的特异性结合。在另一实施方式中，本发明的共制剂的抗人PD-1抗体或抗原结合蛋白包含具有至多1、2、3、4或5个或更多个氨基酸取代的VL和VH结构域，并表现出与PD-1的特异性结合。
在以上任何实施方式中，所述PD-1API可以是特异性结合人PD-1的全长抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述PD-1API为选自任何类别的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)的全长抗PD-1抗体。优选地，所述抗体为IgG抗体。可以使用任何同种型的IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以将不同的恒定域附加至本文提供的VL和VH区。例如，如果本发明的抗体(或片段)的特定预期用途是要求改变效应器功能，则可以使用除IgG1以外的重链恒定域。
尽管IgG1抗体提供较长的半衰期和效应器功能，例如补体激活和抗体依赖性细胞的细胞毒性，但对于抗体的所有用途而言，此类活性可能并不是理想的。在这种情况下，例如可以使用IgG4恒定域。
在本发明的实施方式中，所述PD-1API为抗PD-1抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含或由SEQ ID NO：5所示的氨基酸残基序列组成，所述重链包含或由SEQ ID NO：10所示的氨基酸残基序列组成。在替代实施方式中，所述PD-1API为抗PD-1抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含或由SEQ ID NO：15所示的氨基酸残基序列组成，所述重链包含或由SEQID NO：20所示的氨基酸残基序列组成。在进一步的实施方式中，所述PD-1API为抗PD-1抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含或由SEQ ID NO：32所示的氨基酸残基序列组成，所述重链包含或由SEQ ID NO：31所示的氨基酸残基序列组成。在另外的实施方式中，所述PD-1API为抗PD-1抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含或由SEQ ID NO：33所示的氨基酸残基序列组成，所述重链包含或由SEQ ID NO：31所示的氨基酸残基序列组成。在另外的实施方式中，所述PD-1API为抗PD-1抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含或由SEQ ID NO：34所示的氨基酸残基序列组成，所述重链包含或由SEQ ID NO：31所示的氨基酸残基序列组成。在本发明的一些共制剂中，所述PD-1API为派姆单抗或派姆单抗生物类似药。在本发明的一些共制剂中，PD-1API为纳武单抗或纳武单抗生物类似药。
通常，本发明的抗PD-1抗体和抗原结合片段以及抗TIGIT抗体和抗原结合片段的氨基酸序列变体将具有与参考抗体或抗原结合片段(例如重链、轻链、VH、VL或人源化序列)的氨基酸序列至少75％的氨基酸序列同一性，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％、98％或99％的氨基酸序列同一性。关于序列的同一性或同源性在本文中被定义为候选序列中与抗PD-1残基相同的氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入空位(gap)之后，如果必要的话，以达到最大百分比的序列同一性，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。N端、C端或内部延伸、缺失或***抗体序列中的任一个均不得解释为影响序列同一性或同源性。
序列同一性是指当两个序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等效位置相同的程度。可以使用BLAST算法确定序列同一性，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul,S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等人，(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等人，(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等人，(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等人，(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等人，"A model of evolutionary change in proteins."Atlas of ProteinSequence and Structure,(1978)第卷5,增刊3.M.O.Dayhoff(编),第345-352页,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人，"Matrices fordetecting distant relationships."Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第卷5,增刊3."M.O.Dayhoff(编),第353-358页,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等人，(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.等人，(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268；Karlin,S.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877；Dembo,A.等人，(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multiple distinctlocal alignments."Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai编),(1997)第1-14页,Plenum,New York。
同样，任何类别的轻链都可以用于本文的组合物和方法中。具体地，κ、λ或其变体可用于本发明的组合物和方法中。
表2.示例性的PD-1抗体序列
表3.在本发明的共制剂、方法和用途中可用的另外的PD-1抗体和抗原结合片段。
在本发明的共制剂的一些实施方式中，PD-1API(即抗PD-1抗体或其抗原结合片段)以约25mg/mL至约100mg/mL的浓度存在。在替代实施方式中，API以约10mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约75mg/mL或约100mg/mL的浓度存在。
抗TIGIT抗体及其抗原结合片段
在一个方面，本发明提供了包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的生物制剂，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段特异性结合人TIGIT(例如人或人源化的抗TIGIT抗体)作为活性药物成分(TIGIT API)，以及使用本发明的制剂的方法。
在另一方面，本发明还提供了生物共制剂，其包含(i)与人TIGIT特异性结合的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段(例如人或人源化的抗TIGIT抗体)和(ii)与人PD-1特异性结合的抗人PD-1抗体或其抗原结合片段。任何抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可用于本发明的包括所述共制剂的制剂和方法中。示例性的抗TIGIT抗体序列列于下表4和5中。
表4示例性的抗TIGIT抗体
在一些实施方式中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的三个轻链CDR和/或CDRH1、CDRH2和CDRH3的三个重链CDR。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：35的CDRH1，包含SEQ ID NO：36的CDRH2，包含SEQ ID NO：37、103、104、105、106、107或160中任一个的CDRH3，包含SEQ ID NO：38的CDRL1，包含SEQ ID NO：39、89、90、91、92、93、94、95、96、97或69中任一个的CDRL2和包含SEQ ID NO：40、98、99、100、101、102或162中任一个的CDRL3。
在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：81的CDRH1，包含SEQ ID NO：82的CDRH2，包含SEQ ID NO：83的CDRH3，包含SEQ ID NO：84的CDRL1，包含SEQ ID NO：85的CDRL2和包含SEQ ID NO：86的CDRL3。
在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：108的CDRH1，包含SEQ ID NO：109、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、154、155或167中任一个的CDRH2，包含SEQ ID NO：110、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186或187中任一个的CDRH3，包含SEQ IDNO：111的CDRL1，包含SEQ ID NO：112、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142或168中任一个的CDRL2和包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列的CDRL3。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：35的CDRH1，包含SEQ ID NO：36的CDRH2，包含SEQ ID NO：37的CDRH3，包含SEQ ID NO：38的CDRL1，包含SEQ ID NO：39的CDRL2和包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDRL3。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：108的CDRH1，包含SEQ ID NO：109、154或145中任一个的CDRH2，包含SEQ ID NO：110的CDRH3，包含SEQ ID NO：111的CDRL1，包含SEQ ID NO：112的CDRL2和包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列的CDRL3。
在另一实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：154的CDRH2、包含SEQ ID NO：110的CDRH3、包含SEQID NO：111的CDRL1、包含SEQ ID NO：112的CDRL2和包含SEQ ID NO：113的CDRL3。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含可变重链区和可变轻链可变区。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：41的可变重链区和包含SEQ ID NO：42的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：87的可变重链区和包含SEQ ID NO：88的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：114的可变重链区和包含SEQ ID NO：115的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：43-58、65-75和87中任一个的可变重链区和包含SEQ ID NO：59-64、76-80和88中任一个的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：144-149中任一个的可变重链区和包含SEQ ID NO：150-153中任一个的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：148的可变重链区和包含SEQ ID NO：152的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：147的可变重链区和包含SEQ ID NO：150的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：148的可变重链区和包含SEQ ID NO：153的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：163的可变重链区和包含SEQ ID NO：165的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：169的可变重链区和包含SEQ ID NO：171的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：164的可变重链区和包含SEQ ID NO：166的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：170的可变重链区和包含SEQ ID NO：172的可变轻链区。
表5.示例性的抗TIGIT抗体序列
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：188的CDRH1，包含SEQ ID NO：189的CDRH2，包含SEQ ID NO：190、220、221或222中任一个的CDRH3，包含SEQ ID NO：191的CDRL1，包含SEQ ID NO：192的CDRL2和包含SEQ ID NO：193、232、233、234、235、236或237中任一个的CDRL3。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：204的CDRH1，包含SEQ ID NO：205、256、257、258、259、260、261、262或263中任一个的CDRH2，包含SEQ ID NO：206的CDRH3，包含SEQ ID NO：207的CDRL1，包含SEQ ID NO：208的CDRL2和包含SEQ ID NO：209的CDRL3。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含可变重链区和可变轻链可变区。在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：194的可变重链区和包含SEQ ID NO：195的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：196的可变重链区和包含SEQ ID NO：200的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：210的可变重链区和包含SEQ ID NO：211的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：212的可变重链区和包含SEQ ID NO：216的可变轻链区。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含可变重链区和可变轻链区，所述可变重链区包含SEQ ID NO：197、198、199、223、224、225、226、227、228、229、230和231中的任一个并且所述可变轻链区包含SEQ ID NO：201、202、203、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255中的任一个。
在一个实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含可变重链区和可变轻链区，所述可变重链区包含SEQ ID NO：213、214、215、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285和286中的任一个并且所述可变轻链区包含SEQ ID NO：217、218和219中的任一个。
可用于本文所述的制剂中的其他抗TIGIT抗体包括例如在PCT国际申请号WO2016/106302；WO 2016/011264；和WO 2009/126688中公开的那些。
表6：示例性的重链序列
在任何上述实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是包含任何上述可变重链和任何人重链恒定域的抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段是IgG同种型的，并且包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人重链恒定域。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG1恒定域(SEQ ID NO：291)或其变体，其中所述变体包含多达20个经修饰的氨基酸取代。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段是包含人重链IgG1恒定域的抗体，所述人重链IgG1恒定域包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG1恒定域，其中所述IgG1恒定域被岩藻糖基化。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG4恒定域或其变体，其中所述变体包含多达20个经修饰的氨基酸取代。在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG4恒定域，其中228位的氨基酸(使用EU编号方案)已从Ser取代为Pro。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG4恒定域，所述人重链IgG4恒定域包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列。
在任何上述实施方式中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可包含任何上述可变轻链和人轻链恒定域。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人κ轻链恒定域或其变体，其中所述变体包含多达20个经修饰的氨基酸取代。在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人λ轻链恒定域或其变体，其中所述变体包含多达20个经修饰的氨基酸取代。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人κ轻链恒定域，所述人κ轻链恒定域包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列。
制剂
本发明的制剂使抗体聚集体(高分子量种类)和微粒，高和低分子量种类的形成最小化，使蛋氨酸残基的氧化最小化，并确保抗体随时间保持生物学活性。
在一个方面，本发明包括抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的各种制剂。例如，本发明包括包含以下成分的制剂：(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，(ii)缓冲液(例如，L-组氨酸或乙酸盐)，(iii)非还原性糖(例如，蔗糖)；(iv)非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80)；和(v)抗氧化剂(例如，L-蛋氨酸)。在一个实施方式中，所述制剂进一步包含抗PD-1抗体。在一个实施方式中，所述制剂进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂以约1μM至约50μM的量存在。在一个实施方式中，所述螯合剂为二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA。
在另一方面，本发明还包括抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗人PD-1抗体或其抗原结合片段的各种共制剂。在一个实施方式中，所述制剂包含(i)抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，(ii)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，(iii)缓冲液(例如，L-组氨酸或乙酸盐)，(iv)非还原性糖(例如，蔗糖)，(v)非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80)和(vi)抗氧化剂(例如，L-蛋氨酸)。在一个实施方式中，所述制剂进一步包含螯合剂。在一个实施方式中，所述螯合剂以约1μM至约50μM的量存在。在一个实施方式中，所述螯合剂为二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA。
本发明的药物制剂可包括缓冲液。
可用于本发明的药物制剂和方法的缓冲液包括琥珀酸盐(钠或钾)、L-组氨酸、磷酸盐(钠或钾)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(钠)、乙酸盐(钠)等。在本发明的一个实施方式中，缓冲液以约1-20mM(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20mM)的浓度存在于所述制剂中。在本发明的特定实施方式中，所述缓冲液为组氨酸，例如，L-组氨酸缓冲液。
本发明的缓冲液的pH在约4.5至约6.5；约5.0-6.2；约5.5-6.0的范围内；且优选具有约5.8的pH。为了获得示例性制剂，探索了pH范围为5.0-6.0的组氨酸和乙酸盐缓冲液的适用性。当列举pH值的范围，诸如“在pH 5.5和6.0之间的pH”时，所述范围意图包括所列举的值。例如，约5.0至约6.0的范围包括5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0。除非另有说明，否则pH是指本发明的冻干制剂重构后的pH。通常使用标准玻璃泡(glassbulb)pH计在25℃下测量pH。如本文所用，包含“pH X的组氨酸缓冲液”的溶液是指pH为X且包含组氨酸缓冲液的溶液，即，所述pH意图是指溶液的pH。
在本发明的一个实施方式中，所述抗TIGIT制剂以及抗TIGIT和抗人PD-1的共制剂包含非还原性糖。如本文所用，“非还原糖”为不能用作还原剂的糖，因为它不含有或不能转化为含有游离醛基或游离酮基。非还原性糖的实例包括但不限于二糖类，例如蔗糖和海藻糖。在本发明的一个实施方式中，所述非还原性糖的存在量为约1-10％(w/v)(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％)。在另一实施方式中，所述非还原性糖的存在量为约6％至约8％(w/v)(6、7或8％)。在另一实施方式中，所述非还原性糖的存在量为约6％(w/v)。在另一实施方式中，所述非还原性糖的存在量为约7％(w/v)。在另一实施方式中，所述非还原性糖的存在量为约8％(w/v)。在一个实施方式中，所述非还原性糖为蔗糖、海藻糖或棉子糖。在另一实施方式中，所述非还原性糖为蔗糖。在另一实施方式中，所述蔗糖以6-8％w/v存在。在一个实施方式中，所述蔗糖以约6％(w/v)存在。在一个实施方式中，所述蔗糖以约7％(w/v)存在。在一个实施方式中，所述蔗糖以约8％(w/v)存在。
本发明的制剂还包含表面活性剂。如本文所用，表面活性剂为本质上是两亲性的表面活性剂。可以将表面活性剂添加到本文的制剂中，以在加工条件诸如纯化、过滤、冷冻干燥、运输、储存和递送期间提供稳定性，减少和/或防止聚集或者防止和/或抑制蛋白质损伤。在本发明中，表面活性剂可用于为一种或多种活性成分提供额外的稳定性。
可用于本发明的包括所述共制剂的制剂中的非离子表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨酯，以商品名(Uniquema Americas LLC，Wilmington，DE)出售)，包括聚山梨酯-20(聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯)、聚山梨酯-40(聚氧乙烯山梨醇单棕榈酸酯)、聚山梨酯-60(聚氧乙烯山梨醇单硬脂酸酯)和聚山梨酯-80(聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)；聚氧乙烯烷基醚，例如58(Uniquema Americas LLC，Wilmington，DE)和35；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；X-100(UnionCarbide Corp.，Houston，TX)和X-114；NP40；司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80和司盘85；乙二醇和丙二醇的共聚物(例如， 系列的非离子表面活性剂，例如F68、10R5、F 108、F 127、F38、 L44、L62(BASF Corp.，Ludwigshafen，Germany)；和十二烷基硫酸钠(SDS)。在一个实施方式中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20。在一个实施方式中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯20。在另一实施方式中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。
本发明制剂中包括的非离子表面活性剂的量为足以执行期望的功能的量，即稳定所述活性药物成分(即抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，或抗TIGIT抗体或其抗原结合片段和抗人PD-1抗体或其抗原结合片段二者)所需的最小量。所述非离子表面活性剂的所有百分比均以w/v％列出。通常，所述表面活性剂以约0.008％至约0.1％w/v的浓度存在。在本发明这一方面的一些实施方式中，所述表面活性剂在制剂中的存在量为约0.01％至约0.1％；约0.01％至约0.09％；约0.01％至约0.08％；约0.01％至约0.07％；约0.01％至约0.06％；约0.01％至约0.05％；约0.01％至约0.04％；约0.01％至约0.03％、约0.01％至约0.02％、约0.015％至约0.04％；约0.015％至约0.03％、约0.015％至约0.02％、约0.02％至约0.04％、约0.02％至约0.035％或约0.02％至约0.03％。在特定的实施方式中，所述表面活性剂的存在量为约0.02％。在替代实施方式中，所述表面活性剂的存在量为约0.01％、约0.015％、约0.025％、约0.03％、约0.035％或约0.04％。
在本发明的示例性实施方式中，所述表面活性剂为选自以下的非离子表面活性剂：聚山梨酯20和聚山梨酯80。在优选的实施方式中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。
在特定的实施方式中，本发明的包括所述共制剂的制剂包含约0.01％至约0.04％w/v聚山梨酯80。在进一步的实施方式中，本文所述的制剂包含约0.008％w/v、约0.01％w/v的量的聚山梨酯80。在一个实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.015w/v％。在另一实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.02％w/v。在另一实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.025％w/v。在另一实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.03％w/v。在另一实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.035％w/v。在另一实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.04％w/v。在另一实施方式中，聚山梨酯80的量为约0.045％w/v。在特定的实施方式中，本发明的制剂包含约0.02％w/v聚山梨酯80。
本发明的包括所述共制剂的制剂还包含蛋氨酸或其药学上可接受的盐作为抗氧化剂。在一个实施方式中，所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。在另一实施方式中，所述蛋氨酸为L-蛋氨酸的药学上可接受的盐，例如，蛋氨酸HCl。在本发明的一个实施方式中，蛋氨酸以约1-20mM(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20mM)的浓度存在于制剂中。在另一实施方式中，所述蛋氨酸以约5mM至约10mM(5、6、7、8、9和10mM)存在。在另一实施方式中，所述蛋氨酸以约10mM存在。
本发明的包括所述共制剂的制剂还可进一步包含螯合剂。在本发明的一个实施方式中，螯合剂以约5-30μM(例如，5、10、15、20、25或30μM)的浓度存在于制剂中。在一个实施方式中，所述螯合剂为DTPA。在另一实施方式中，所述螯合剂为EDTA。
冻干药物组合物
治疗性蛋白质的冻干制剂提供几个优点。
冻干制剂通常比溶液制剂具有更好的化学稳定性，因此增加了半衰期。冻干制剂也可以根据临床因素，例如施用途径或剂量(dosing)，以不同的浓度重构。例如，如果需要皮下施用，可以以高浓度(即以小体积)重构冻干制剂，或者如果是静脉内施用，则可以以较低浓度重构。如果对特定受试者需要高剂量，特别是如果必须将注射量降至最低的皮下施用，则也可能需要高浓度。一种这样的冻干抗体制剂公开于美国专利号6,267,958中，其通过引用整体并入本文。另一种治疗性蛋白质的冻干制剂公开于美国专利号7,247,707中，其通过引用整体并入本文。
通常，在重构高浓度药物产品(DP，在一个示例性实施方式中，为人源化抗PD-1抗体派姆单抗或其抗原结合片段)的预期下，即在小体积水中重构的预期下，制备冻干制剂。然后用水或等渗缓冲液随后稀释可以容易地用于将DP稀释至较低浓度。通常，本发明的冻干制剂中所包括的赋形剂的含量在以高DP浓度重构时将导致大致等渗的制剂，例如用于皮下施用。
在更大体积的水中进行重构以产生较低的DP浓度将必定会降低重构溶液的张度，但这种降低在非皮下(例如静脉内)施用的意义不大。如果在较低DP浓度下期望等渗性，可在标准的小体积水中重构冻干的粉末，然后用等渗稀释液(例如0.9％氯化钠)进一步稀释。
本发明的冻干制剂是通过将预冻干溶液冻干(冷冻干燥)而形成的。冷冻干燥是通过将制剂冷冻并随后在适合于初次干燥的温度下使水升华来完成的。在这种条件下，产品温度低于制剂的共晶点(eutectic point)或塌陷温度(collapse temperature)。通常，在通常约50至250mTorr的范围的合适压力下，初次干燥的存放温度(shelf temperature)将在约-30至25℃的范围内(假设产品在初次干燥期间保持冷冻)。制剂、容纳样品的容器(例如，玻璃小瓶)的大小和类型以及液体的体积决定了干燥所需的时间，所述时间的范围可为数小时至几天(例如40-60hrs)。二次干燥阶段可以在约0-40℃下进行，这主要取决于容器的类型和大小以及所用蛋白质的类型。二次干燥时间取决于产品中期望的残留湿度水平(moisture level)，并且通常需要至少约5小时。
通常，冻干制剂的含水量(moisture content)小于约5％，并且优选小于约3％。压力可以与初次干燥步骤中所用的压力相同。冷冻干燥条件可根据制剂和小瓶大小而变化。
在一些情况下，可能希望在要进行蛋白质重构的容器中冻干蛋白质制剂，以避免转移步骤。在这种情况下，所述容器可以是例如3、5、10、20、50或100cc的小瓶。
在施用之前将本发明的冻干制剂重构。所述蛋白质可以约10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或100mg/mL或更高浓度例如150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL或300mg/mL至多约500mg/mL的浓度重构。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约10-300mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约20-250mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约150-250mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约180-220mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约50-150mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约100mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约75mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约50mg/ml。在一个实施方式中，重构后的蛋白质浓度为约25mg/ml。在意图皮下递送重构的制剂的情况下，高蛋白质浓度特别有用。然而，对于其他施用途径，例如静脉内施用，较低浓度的蛋白质(例如约5-50mg/mL)可能是期望的。
重构通常在约25℃的温度下进行以确保完全水合，尽管根据需要可以采用其他温度。重构所需的时间将取决于例如稀释剂的类型、赋形剂(一种或多种)和蛋白质的量。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
液体药物组合物
通过将液体形式的药用物质(例如，抗人源化的PD-1)(例如，在水性药物制剂中的派姆单抗)和用缓冲液将它交换到期望的缓冲液中(作为纯化过程的最后一步)，可以制备液体抗体制剂。在该实施方式中不存在冻干步骤。将最终缓冲液中的药用物质浓缩至期望的浓度。将诸如蔗糖和聚山梨酯80等赋形剂加入到药用物质中，并使用适当的缓冲液将它稀释至最终的蛋白质浓度。使用0.22μm过滤器过滤最终配制的药用物质，并填充到最终的容器(例如玻璃小瓶)中。
III.使用方法
本发明还涉及一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的任何制剂，即本文所述的任何制剂。在该方法的一些特定的实施方式中，通过静脉内施用将所述制剂施用于所述受试者。在其他实施方式中，通过皮下施用将所述制剂施用于所述受试者。在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明的任何制剂。
在本发明的任何方法中，所述癌症可以选自：黑素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、胃肠道癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、淋巴瘤、肾癌、间皮瘤、卵巢癌、食道癌、***癌、胆道癌、结肠直肠癌、***、甲状腺癌、唾液癌、***癌(例如激素难治性***腺癌)、胰腺癌、结肠癌、食道癌、肝癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤(neoplastic malignancies)。
在一些实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
在替代实施方式中，所述肺癌为小细胞肺癌。
在一些实施方式中，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤。
在其他实施方式中，所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。在特定的实施方式中，所述淋巴瘤为纵隔大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方式中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
在进一步的实施方式中，所述乳腺癌为ER+/HER2-乳腺癌。
在一些实施方式中，所述膀胱癌为尿路上皮癌。
在一些实施方式中，所述头颈癌为鼻咽癌。在一些实施方式中，所述癌症为甲状腺癌。在其他实施方式中，所述癌症为唾液癌。在其他实施方式中，所述癌症为头部和颈部的鳞状细胞癌。
在一个实施方式中，本发明包括一种在人患者中治疗转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明的制剂。在特定的实施方式中，所述患者患有PD-L1表达高的肿瘤[(肿瘤比例评分(TPS)≥50％)]，并且先前未用含铂化学疗法治疗过。在其他实施方式中，所述患者患有PD-L1表达的肿瘤(TPS≥1％)，并且先前用含铂化学疗法治疗过。在其他实施方式中，所述患者患有PD-L1表达(TPS≥1％)的肿瘤，并且先前未用含铂化学疗法治疗过。在特定的实施方式中，所述患者在接受含铂化学疗法时或之后疾病发展。在某些实施方式中，PD-L1 TPS通过FDA批准的测试确定。在某些实施方式中，所述患者的肿瘤没有EGFR或ALK基因组畸变。在某些实施方式中，所述患者的肿瘤具有EGFR或ALK基因组畸变，并且在接受抗PD-1抗体或其抗原结合片段之前，在接受EGFR或ALK畸变(一种或多种)治疗时或之后疾病发展。
在一些实施方式中，所述癌症为具有高水平的微卫星不稳定性(MSI-H)的转移性结直肠癌。
在一些实施方式中，所述癌症为具有高水平的微卫星不稳定性(MSI-H)的转移性结直肠癌。
在一些实施方式中，所述癌症为具有高水平的微卫星不稳定性(MSI-H)的实体瘤。
在一些实施方式中，所述癌症为具有高突变负担的实体瘤。
在一些实施方式中，所述癌症选自：黑素瘤、非小细胞肺癌、复发性或难治性经典霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、尿路上皮癌、食道癌、胃癌和肝细胞癌。
在上述治疗方法的其他实施方式中，所述癌症为血红素恶性肿瘤。在某些实施方式中，所述血红素恶性肿瘤为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV阳性DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、髓样细胞白血病1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合症(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
在本文所述的方法和治疗中涵盖表现出改善的无疾病存活和总存活的恶性肿瘤(其与肿瘤浸润性淋巴细胞在活组织检查或外科手术材料中的存在有关)，例如黑素瘤、结肠直肠癌、肝癌、肾癌、胃癌/食管癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌。已知这样的癌症亚型易受T淋巴细胞的免疫控制。另外，包括使用本文所述的抗体可以抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。
可以从用本文所述的制剂治疗中受益的其他癌症包括与病毒持续感染相关的那些癌症，所述病毒例如人免疫缺陷病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒、已知在病因上与例如卡波西氏肉瘤、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、***、外阴癌、***癌、***癌和口癌有关的人***瘤病毒。
所述制剂还可用于预防或治疗感染和传染病。因此，本发明提供了一种在哺乳动物受试者中治疗慢性感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的制剂。在该方法的一些特定的实施方式中，通过静脉内施用将所述制剂施用于所述受试者。在其他实施方式中，通过皮下施用将所述制剂施用于所述受试者。
这些试剂可单独使用或与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。所述抗体或其抗原结合片段可用于刺激对人类感染的病毒的免疫应答，所述病毒包括但不限于：人免疫缺陷病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、人***瘤病毒和疱疹病毒。拮抗剂抗PD-1抗体或抗体片段可用于刺激对细菌或真菌寄生虫以及其他病原体感染的免疫应答。乙型和丙型肝炎以及HIV的病毒感染属于被认为是慢性病毒感染的那些感染。
本发明的制剂可以与一种或多种“另外的治疗剂”组合施用于患者。另外的治疗剂可以是生物治疗剂(包括但不限于针对下列物质的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、其他生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、OX-40、4-1BB和ICOS)、免疫原性剂(例如，减毒癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞(诸如以肿瘤衍生抗原或核酸脉冲刺激的树突细胞)、免疫刺激性细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF)，以及转染有编码免疫刺激细胞因子(诸如但不限于GM-CSF)的基因的细胞。
如上所述，在本发明方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。在特定的实施方式中，所述另外的治疗剂为抗LAG3抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述另外的治疗剂为表达IL-12的新城疫病毒载体。在另一实施方式中，所述另外的治疗剂为迪那昔布(dinaciclib)。在更进一步的实施方式中，所述另外的治疗剂为STING激动剂。
合适的施用途径可例如包括肠胃外递送，包括肌肉内、皮下以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内。药物可以多种常规方式施用，例如腹膜内、肠胃外、动脉内或静脉内注射。必须限制溶液体积的施用方式(例如皮下施用)需要冻干制剂以能够以高浓度重构。
选择另外的治疗剂的剂量取决于几个因素，包括实体的血清或组织更新率，症状水平，实体的免疫原性以及所治疗的个体中靶细胞、组织或器官的可及性。另外的治疗剂的剂量应为提供可接受水平的副作用的量。因此，每种另外的治疗剂(例如生物治疗剂或化学治疗剂)的剂量和给药频率将部分取决于特定的治疗剂、所治疗的癌症的严重程度以及患者特征。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可得到的。参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)NewEngl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)NewEngl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'DeskReference,第57版)；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月)。
临床医师可以例如使用本领域已知或怀疑会影响治疗或预计影响治疗的参数或因素来确定适当的剂量方案，并且将取决于例如患者的临床病史(例如，先前的疗法)、要治疗的癌症的类型和阶段以及在联合疗法中对一种或多种治疗剂产生反应的生物标志物。
可获得各种文献参考以促进选择用于其他治疗剂的药学上可接受的载体或赋形剂。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)；Hardman等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(编)(1993)PharmaceuticalDosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner andKotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY。
可以通过连续输注或以例如一天、每周1-7次、一周、两周、三周、每月、每两个月等的间隔的剂量来施用药物抗体制剂。优选的剂量方案为涉及避免显著不希望的副作用的最大剂量或剂量频率的剂量方案。总的每周剂量通常为至少0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg体重或更高。参见，例如，Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:133-144。小分子治疗剂，例如肽模拟物、天然产物或有机化学试剂的期望剂量以moles/kg为基准与抗体或多肽基本相同。
本发明的实施方式还包括一种或多种本文所述的生物制剂(i)用于、(ii)用作用于以下的药物或组合物，或(iii)用于制备用于以下的药物：(a)疗法(例如，人体疗法)；(b)药物；(c)诱导或增加抗肿瘤免疫反应；(d)减少患者中一种或多种肿瘤标志物的数量；(e)停止或延缓肿瘤或血液癌的生长；(f)停止或延缓PD-1相关疾病或抗TIGIT相关疾病的进展；(g)阻止或延迟癌症进展；(h)稳定PD-1相关疾病或抗TIGIT疾病；(i)抑制肿瘤细胞的生长或存活；(j)消除或缩小一种或多种癌性病变或肿瘤的大小；(k)减少PD-1相关疾病或抗TIGIT疾病的进展、发作或严重程度；(l)降低PD-1相关或抗TIGIT相关疾病诸如癌症的临床症状的严重程度或持续时间；(m)相对于类似未治疗患者的预期生存期而言，延长患者的生存期；n)诱导癌症状况或其他PD-1相关或抗TIGIT相关疾病的完全或部分缓解；o)治疗癌症；或p)治疗慢性感染。
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989第2版，2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)MolecularCloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,Academic Press,San Diego,CA)中。标准方法还出现在Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley andSons,Inc.New York,NY，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产、蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in MolecularBiology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页)。
描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化(Coligan等人(2001)CurrentProtocols in Immunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow andLane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Harlow and Lane,出处同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可得到的(参见，例如，Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,JohnWiley,Inc.,New York)。
可以制备单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体(参见，例如，Sheperd and Dean(编)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann andDubel(编)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow and Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,第139-243页；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165:6205；He等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Footeand Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利号6,329,511)。
人源化的一个替代方案是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或在转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
抗原的纯化对于产生抗体不是必需的。可以用带有目标抗原的细胞免疫动物。然后可以从经免疫的动物分离脾细胞，并且可以使所述脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如，Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity13:233-242；Preston等人，出处同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗体可以缀合至例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其他目的，并且包括例如偶联至染料、放射性同位素、酶或金属(例如，胶体金)的抗体(参见，例如，Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式细胞计量术的方法，包括荧光活化细胞分选(FACS)，是可得到的(参见，例如，Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical LaboratoryPractice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley andSons,Hoboken,NJ)。适合用于修饰核酸(包括用作例如诊断试剂的核酸引物和探针、多肽和抗体)的荧光试剂是可得到的(Molecular Probesy(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述了免疫***的组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(编)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可得到的(例如，参见，GenBank,VectorSuite(Informax,Inc，Bethesda，MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.，San Diego，CA)；(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
分析方法
适用于评估产品稳定性的分析方法包括尺寸排阻色谱法(SEC)、动态光散射测试(DLS)、差示扫描量热法(DSC)、异天冬氨酸(iso-asp)定量、效力、340nm处的UV、UV光谱法和FTIR.SEC(J.Pharm.Scien.,83:1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11:485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15:1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14:1133-1140(1986))测量产品中的单体百分比并给出可溶性聚集体的量的信息。DSC(Pharm.Res.,15:200(1998)；Pharm.Res.,9:109(1982))给出蛋白质变性温度和玻璃化转变温度的信息。DLS(AmericanLab.,November(1991))测量平均扩散系数，并给出可溶性和不可溶性聚集体的量的信息。340nm处的UV测量340nm处的散射光强度并给出有关可溶性和不可溶性聚集体的量的信息。UV光谱法测量278nm处的吸光度并给出蛋白质浓度的信息。FTIR(Eur.J.Pharm.Biopharm.,45:231(1998)；Pharm.Res.,12:1250(1995)；J.Pharm.Scien.,85:1290(1996)；J.Pharm.Scien.,87:1069(1998))测量酰胺一区(amide one region)的IR光谱，并给出蛋白质二级结构的信息。
样品中的异天冬氨酸含量使用Isoquant异天冬氨酸检测***(IsoquantIsoaspartate Detection System，Promega)进行测量。所述试剂盒使用酶蛋白异天冬氨酰基甲基转移酶(PIMT)特异性检测目标蛋白中异天冬氨酸残基的存在。PIMT在α-羧基位置催化甲基从S-腺苷-L-蛋氨酸向异天冬氨酸的转移，在此过程中产生S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)。这是相对较小的分子，并且通常可以使用试剂盒中提供的SAH HPLC标准品通过反相HPLC进行分离和定量。
抗体的效力或生物同一性(bioidentity)可以通过其结合抗原的能力来测量。抗体与其抗原的特异性结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法来定量，例如，免疫测定，诸如ELISA(酶联免疫吸附测定)。
为了描述和公开可能与本发明结合使用的方法和材料的目的，本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。
已经参考附图在本文中描述了本发明的不同实施方式，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方式，并且在不脱离所附权利要求所限定的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中进行各种改变和修改。
实施例
实施例1
抗TIGIT制剂缓冲液筛选
对三种抗TIGIT抗体进行高通量制剂开发研究，每种抗TIGIT抗体均具有以下CDR：SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ ID NO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQ ID NO：112的LCDR2和SEQ ID NO：113的LCDR3，以评估(1)生物物理/生物化学不稳定倾向；(2)预制剂(pH、盐和缓冲液)条件和(3)与整个平台制剂的相容性。通过以下分析样品：UV/Vis分光光度法以分析代表较大聚集体的浊度(A350)，尺寸排阻色谱法(UP-SEC)以检测高分子量种类的形成，毛细管等电聚焦(cIEF)以测量应力对分子表面电荷的分布的影响，还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)以检测重链或轻链的蛋白水解裂解，亚可见(sub-visible)颗粒分析以检测亚可见聚集体。
所述高通量制剂筛选包括在三种所选缓冲液种类中配制的1mg/mL抗TIGIT抗体：pH值范围为5.0至6.2的乙酸盐缓冲液，pH值范围为5.6至6.8的柠檬酸盐缓冲液和pH值范围为5.0至6.8的L-组氨酸缓冲液。因此，检查了范围为5.0至6.8的pH值和0-150mM NaCl的离子强度。将样品在50℃下应力10天，并使用差示扫描荧光(DSF)分析热稳定性，使用尺寸排阻色谱法(UP-SEC)分析胶体稳定性，使用Guava(一种基于流式细胞仪的亚可见特征测定)分析聚集倾向，浊度(A350测量)，电荷变异图(cIEF)和使用Caliper分析碎片化属性。
基于从所述研究中获得的结果，赋予蛋白质最大稳定性的制剂为pH在5.6至6.2范围内的10mM L-组氨酸。pH范围为5.6至6.2的10mM L-组氨酸显示出通过UP-SEC监测到的最小聚集，ΔSEC主成分(Main)范围在-1.63％至-1.85％之间(相比于其他缓冲液和pH条件的SEC主成分范围在-2.0％至-5.0％之间)(数据未显示)。cIEF曲线显示，在50℃下10天后，注意到样品的主成分和碱性种类的相对峰面积减少，而酸性变体的相对峰面积增加(cIEF主成分范围在-9.0％至-11.3％之间)(数据未显示)。暴露于高温下后，碱性变体的减少和酸性变体的增加是mAb的常见现象。盐的加入降低了整个研究组合物中蛋白质的稳定性。
实施例2
抗TIGIT制剂pH范围研究
在这项研究中，在10mM L-组氨酸缓冲液中以50mg/mL的浓度测试了具有以下CDR的抗TIGIT抗体：SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ ID NO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQ ID NO：112的LCDR2和SEQ ID NO：113的LCDR3。将7％(w/v)蔗糖添加到制剂中，以增加分子的体积稳定性(bulk stability)(作为稳定剂和非离子张力调节剂)。在10mM L-组氨酸缓冲液、7％蔗糖中，在pH 5.5、pH 6.0和pH 6.5下配制抗TIGIT抗体。此类制剂的稳定性评估如下：
(1)在避光的加速热和储存稳定性条件(5℃、25℃和40℃长达6个月)下监测分子的稳定性。
(2)还进行了冻融(freeze-thaw)应力和搅拌应力的稳定性研究。
(3)在含有不同浓度的聚山梨酯80(PS-80)的制剂中进行搅拌研究，以评估制剂中PS-80的浓度。
(4)进行了光应力研究以评估制剂中L-蛋氨酸的要求。
材料与方法
热稳定性研究(3个月)
在10mM L-组氨酸缓冲液、7％蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酯80中，在pH 5.5、pH 6.0或pH 6.5下配制50mg/mL抗TIGIT抗体。将得到的制剂无菌过滤并填充在2R小瓶中，用氯丁基塞塞住并用密封的铝盖盖住。稳定性研究在5℃(环境湿度)、25℃(60％相对湿度)和40℃/(75％相对湿度)下进行。使用UP-SEC、HP-IEX、cIEF(所选样品)、MFI、CE-SDS(非还原“NR”和还原“R”)、还原肽谱(MFI和还原肽谱在所选时间点进行)分析样品。
针对在10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/ml PS-80，pH 6.0中配制的25mg/ml抗TIGIT抗体进行了1个月的热稳定性研究。将得到的制剂无菌过滤并填充在2R小瓶中，用氯丁基塞塞住并用铝密封塞盖住。稳定性研究在5℃(环境湿度)、25℃(60％相对湿度)和40℃/(75％相对湿度)下进行一个月。使用UP-SEC、cIEF和CE-SDS(NR和R)分析样品。
搅拌稳定性研究
在具有各种浓度的聚山梨酯80(0、0.1和0.2mg/mL)的10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，pH 6.0中配制50mg/mL抗TIGIT抗体。将得到的制剂无菌过滤并填充在2R小瓶(1.2mL填充体积)中，用氯丁基塞塞住并用密封的铝盖盖住。将样品在18-22℃下在水平位置以300RPM搅拌长达7天。使用UP-SEC、MFI、CE-SDS(NR和R)分析样品。
冻融稳定性
在10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，pH 6.0中配制50mg/mL抗TIGIT抗体。将得到的制剂无菌过滤并填充在2R小瓶中，用氯丁基塞塞住并用密封的铝盖盖住。将样品在-80℃至18-22℃下进行5次冻融循环(在冷冻条件下和在室温下至少24小时，直到完全融化)。使用UP-SEC、MFI、CE-SDS(NR和R)分析样品。
光应力稳定性研究
早期的开发研究表明，存在暴露的色氨酸残基以及一些蛋氨酸，这些蛋氨酸在光应力下易于氧化。在含或不含L-蛋氨酸的制剂(制剂1：10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，pH 6.0和制剂2：10mM L-组氨酸缓冲液，10mM L-蛋氨酸，7％蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80，pH 6.0)中在ICH光应力条件下进行可见光(CWF、0.1x ICH、0.2xICH、0.5x ICH、1x ICH)的研究。使用UP-SEC、cIEF、CE-SDS(NR和R)和还原肽谱分析样品。
结果
热稳定性结果
50mg/ml制剂：对于所有测试的稳定性指示测定，在所有pH值下3个月后，在5℃下均未观察到显著变化(数据未显示)。在25℃和40℃下，pH 5.5和pH 6.0显示出相似的稳定性，并且这些条件比pH 6.5更稳定(数据未显示)。在25℃和40℃下，UP-SEC、CE-SDS(NR)和cIEF测定在pH 6.5时的降解速率相对高于pH 5.5和pH 6.0时的降解速率，并且与基准分子相比时也如此。因此，认为pH范围为5.5至6.0(pI为8.7)是合适的。在所有温度和pH值下3个月后，未观察到抗TIGIT抗体发生氧化、脱酰胺或异构化。
25mg/ml制剂：对于所有测试的测定，在25℃和40℃下观察到降解。发现降解速率类似于50mg/ml条件(见上文)。
搅拌稳定性研究
不含聚山梨酯80的制剂在7天结束时显示可见的颗粒。亚可见颗粒分析显示，在含有浓度为0.2mg/mL聚山梨酯80的制剂中，10μm或更大的颗粒显著减少。使用其他测定未见到样品之间的显著差异。
冻融稳定性
在所有测试的测定中，在5次冻融循环后，未见到分子稳定性的变化。
光应力稳定性研究
当通过UP-SEC、cIEF、CE-SDS(NR和R)测试时，当两种制剂的样品暴露于0.5x ICH或以上的光应力下时，观察到降解。低于0.5x ICH的条件设置对于两种制剂均未显示出显著的降解。在光应力为0.5x或更高的条件下还原肽谱数据显示出色氨酸和蛋氨酸残基发生氧化。制剂中的10mM L-蛋氨酸降低了蛋氨酸残基的氧化水平，但不影响色氨酸的氧化水平。
结论
基于前述，认为10mM L-组氨酸缓冲液、10mM L-蛋氨酸、7％蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酯80pH 5.5-6.0足以赋予稳定性以在冷藏条件下维持保存期限。
实施例3
其他pH研究
在具有不同pH(范围为5.0至6.5)的六个10mM组氨酸缓冲液中配制具有以下CDR的抗TIGIT抗体：IgG1骨架上的SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ ID NO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQ ID NO：112的LCDR2和SEQ ID NO：113的LCDR3。在8周内在2～8℃、25℃和40℃下研究了不同制剂的热稳定性。
通过将10mM L-组氨酸缓冲液滴定到10mM L-组氨酸-HCl缓冲液中来制备不同pH(5.0～6.5)的组氨酸缓冲液。在4℃和4500rpm～5000rpm的条件下，使用离心装置，通过四至五轮超滤(每轮105～260min)，将抗TIGIT抗体缓冲液交换(buffer exchanged)到六种具有不同pH的不同组氨酸缓冲液中。缓冲液交换后，将特定量的蔗糖和聚山梨酯80储备液(1％，w/w)添加到不同pH值的溶液中以达到目标量，还添加适量的相应组氨酸缓冲液以调节抗体浓度至约50mg/ml。
然后将所述制剂用0.22-μm膜滤器进行无菌过滤。将3mL的每个样品无菌填充至6mL玻璃小瓶中，以进行T0、4周(4W)和8周(8W)热稳定性研究。将1mL的每个样品无菌填充至6mL玻璃小瓶中，以进行两周(2W)热稳定性研究。填充后立即将填充的小瓶塞住并卷曲密封(crimp-over-sealed)。以上所有步骤均在生物安全柜中进行。将这些小瓶放入有盖的盒子中，并在不同的温度条件下储存以进行热稳定性研究。
结果与讨论
在所有条件下，所有样品的外观在四周内保持不变。然而，在8周后，在2～8℃和25℃的样品显示出淡黄色，而在40℃的样品显示出更深的淡黄色。在研究期间所有样品均为淡乳白色且无可见颗粒。在研究期间未见到所有样品的蛋白质浓度有相当大的变化。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估样品的胶体稳定性，确定纯度：单体的百分比、高分子量种类(HMW)的百分比和晚洗脱峰(LMW种类)。使用具有TSKGel G3000SWXL尺寸排阻色谱柱(300×7.8mm，5μm)的Agilent 1260Infinity***进行分析。流动相为50mM PB，300mMNaCl，pH 7.0±0.2，流速设置为1.0mL/min。将样品稀释至10mg/mL以用于注射，并用UV检测器在280nm处检测。
下表列出了UPSEC数据：
如上表所示，在所有样品中，SEC主峰％在2～8℃下是稳定的，然而，在25℃和40℃下，观察到显著的主峰％降低。在40℃的样品中，主峰％降低的速率比在25℃的样品中快。在40℃下8周，pH 6.2和6.5样品中的HMW％较大，而pH 5.0和5.3样品中的LMW％较大。
为了评估制剂的化学稳定性，进行了毛细管等电聚焦(cIEF)以评估化学稳定性并监测电荷变体曲线随时间的变化。简而言之，将20μL(2.0mg/mL)的参考标准品或样品与0.5μL的pI 5.85标记物、0.5μL的pI 9.77标记物、1μL的Pharmalyte 3-10、0.5μL的Pharmalyte5-8、0.5μL的Pharmalyte 8-10.5、35μL的1％甲基纤维素、37.5μL的8M尿素混合。添加纯净水以补足最终体积为100μL。然后用配备有碳氟化合物涂层的全柱检测毛细管的iCE-3毛细管等电聚焦分析仪分析混合物。通过两个步骤进行聚焦：(1)1.5kV 1min，和(2)3kV 8min。在实验过程中，将自动进样器托盘保持在5℃。
评估酸性变体、％主峰和％碱性变体的水平的cIEF数据在下表中。
如上表所见，在2～8℃下，所有样品中的cIEF主峰％、酸性峰％和碱性峰％相对稳定且相当。
在2～8℃下，cIEF主碱性峰％也增加了；pH 5.0和5.3缓冲液样品的增加大于其他样品。在25℃下，主峰％、酸性峰％和碱性峰％在前两周内是稳定的，但在四周后略微变化，其中主峰％降低，而酸性峰％相应地增加。不同制剂的变化速率(change rate)具有可比性。在40℃下，发现即使在两周后，所有制剂中的主峰％显著降低，而酸性峰％则显著增加，但每种制剂的变化程度相似。碱性峰％也增加了；pH 5.0和5.3缓冲液样品的增加大于其他样品。
为了评估制剂的纯度，进行了非还原Caliper分析。简而言之，将购买的样品缓冲液与10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液以20：1的体积比混合，并将100mM N-乙基马来酰亚胺溶液以0.7：20的体积比添加到混合溶液中(称为样品变性溶液)。首先将标准品或样品稀释至1mg/mL，并将2μL的稀释标准品或样品与7μL的样品变性溶液混合。将混合物在70℃下孵育10min。将35μL的纯净水添加到孵育的溶液中，并将42μL的混合溶液转移到96孔板中进行分析。使用HT Antibody Analysis 200测定，用LabChip GX II HT对样品板进行分析。
下表显示了用于评估％纯度的非还原Caliper分析数据：
如上表所示-在2～8℃下八周，每种制剂的Caliper_非还原纯度是相对稳定的。在25℃下8周，每种制剂的纯度略微降低。在40℃下，纯度显著下降，尤其是当样品处于pH 5.0和5.3缓冲液中时，降低比其他样品快得多。在研究过程中分子大小稳定(数据未显示)。
为了进一步评估制剂的纯度，还进行了还原Caliper分析。简而言之，将购买的样品缓冲液与10％SDS溶液以20：1的体积比混合，并将1M二硫苏糖醇溶液以0.7：20的体积比添加到混合溶液中(称为样品变性溶液)。首先将标准品或样品稀释至1mg/mL，并将2μL的稀释标准品或样品与7μL的样品变性溶液混合。将混合物在70℃下孵育10min。将35μL的纯净水添加到孵育的溶液中，并将42μL的混合溶液转移到96孔板中进行分析。使用HT AntibodyAnalysis200测定，用LabChip GX II HT对样品板进行分析。
下表显示了用于评估％纯度的还原Caliper分析数据：
如上所见，在2～8℃和25℃下八周，每种制剂的Caliper_还原纯度是相对稳定的。在40℃下，发现所有制剂的Caliper_R纯度均明显下降。pH 5.0缓冲液中样品的纯度降低最大，其次是pH 5.3缓冲液中的样品。pH 5.6、5.9和6.2缓冲液的降低速率相当但较慢。pH6.5缓冲液中样品的纯度降低最慢。在研究中，纯度下降可能是由于重链(HC)％降低而轻链(LC)％稳定。在8W内的所有样品中，抗体轻链和重链大小均稳定。
实施例4
不含蛋氨酸的抗TIGIT制剂
在pH范围为5.0至6.5的10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/mL PS-80中，以50mg/mL的浓度测试具有以下CDR的抗TIGIT抗体：SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ ID NO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQ ID NO：112的LCDR2和SEQID NO：113的LCDR3。在避光的加速热和储存稳定性条件下监测分子的稳定性。除了热稳定性，还进行了冻融稳定性、搅拌稳定性、光应力稳定性研究。测试了包括UP-SEC、cIEF、CE-SDS、MFI和还原肽谱在内的稳定性。
结果
热稳定性研究(8周)
对于所有测试的稳定性指示测定，针对所有测试的不稳定倾向，抗TIGIT抗体在5℃下都是稳定的。在40℃下使用UP-SEC、Caliper CE-SDS、cIEF、MFI观察到的降解速率高于25℃。在25℃和40℃下，以下结果是显著的：
UP-SEC：从5.0至6.5的所有pH值都观察到％单体下降。在较低pH值(5.0和5.3)下，主峰下降主要是由于％低分子量(LMW)种类的增加，而在pH 6.5下，％单体下降主要是由于％高分子量(HMW)种类的增加。在加速稳定性8周后，％单体下降在pH 6.5时最高(数据未显示)。
cIEF：在25℃和40℃下，从5.0至6.5的所有pH值都观察到cIEF主峰下降。在较高pH值(6.3-6.5)下，主峰下降主要是由于酸性变体的增加，而在pH 5.0和5.3下，主峰下降是由于酸性以及碱性变体的增加(数据未显示)。
CE-SDS(Caliper)：非还原CE-SDS主峰下降主要是在40℃下观察到的，由于存在碎片化种类(fragmented species)。较低pH值(5.0和5.3)下的制剂显示出比其余pH值相对更高的碎片化率。
还原CE-SDS(Caliper)分析表明，在5℃和25℃下八周，每种制剂的纯度相对稳定。在40℃下，发现所有制剂的纯度均明显下降。pH 5.0缓冲液中的样品的纯度降低最大，其次是pH 5.3缓冲液中的样品。
MFI：在40℃下，所有制剂均观察到亚可见颗粒增加。相对于其余缓冲液，pH 6.3和6.5的亚可见颗粒增加最高。
还原肽谱：在所鉴定的不稳定倾向中，相对于初始样品，在40℃下8周后，只有M254显示出氧化的相对增加。
结论：10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/mL PS-80，pH5.6-6.3足以支持抗TIGIT抗体在8周内的储存稳定性。
搅拌稳定性研究
将50mg/mL抗TIGIT制剂(在10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，pH 5.8以及任一0、0.1、0.2和0.3mg/mL PS-80中)在18-22℃下以100RPM温和搅拌长达7天时，未观察到可溶性聚集体、带电变体、碎片化或亚可见颗粒的变化。
冻融稳定性
将50mg/mL抗TIGIT抗体(在10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/mL PS-80，pH5.8)进行5次冷冻/解冻(在-80℃下冷冻2小时，然后在室温下解冻1小时)时，未观察到可溶性聚集体、带电变体、碎片化或亚可见颗粒的变化。
光应力稳定性研究
将50mg/ml制剂在可见光应力(5000lx)下进行48小时。在这些条件下，在～0.2xICH条件(12H光照)下，可溶性聚集体、带电变体、亚可见颗粒、pH、浓度、碎片化和氧化变化很小。在～1x(48H光照下)条件下，可溶性聚集体、酸性变体、碎片化、亚可见颗粒和蛋氨酸氧化增加。
结论
基于这些研究，10mM L-组氨酸缓冲液，7％蔗糖，0.2mg/mL PS-80pH 5.3-6.3能够支持抗TIGIT抗体的稳定性。暴露于严重的光应力后观察到蛋氨酸氧化。如实施例2所述，添加10mM L-蛋氨酸减少了蛋氨酸残基的氧化。
实施例5
聚山梨酯80筛选
将具有以下CDR的抗TIGIT抗体：SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ ID NO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQ ID NO：112的LCDR2和SEQ ID NO：113的LCDR3配制到四(4)个pH 5.8、10mM L-组氨酸缓冲液和不同PS-80浓度的制剂(如下所示)中。在20℃下7天的搅拌或不搅拌条件下研究了不同制剂中的蛋白质稳定性。
使用实验室规模的TFF缓冲液交换***将所述制剂配制为pH5.8的10mM L-组氨酸缓冲液。然后将配制的具有不同聚山梨酯80含量的蛋白质用0.22-μm膜滤器进行无菌过滤。然后将2mL的每个样品无菌填充至6-mL玻璃小瓶中。填充后立即将填充的小瓶塞住并卷曲密封(crimp-over-sealed)。样品分为搅拌组和非搅拌组。在搅拌组中，将这些小瓶转移到有盖的盒子中，然后放入恒温振荡器中，并在20℃，100rpm下搅拌长达7天。在非搅拌组中，将这些小瓶转移到有盖的盒子中，并放入恒温振荡器中，但将振荡器在20℃下静置长达7天。
在3和7天后研究了在有或没有搅拌的情况下在不同制剂中的抗体稳定性。
用于评估高分子量种类(HMW或聚集体)、％单体和LMW(低分子量种类)水平的UPSEC数据在下表中：
可以看出，在有或没有搅拌的条件下，聚山梨酯80含量对SEC纯度没有显著影响。在搅拌或不搅拌的条件下长达7天，聚山梨酯80含量对cIEF测定中的pI、主峰、酸性峰和碱性峰的百分比均无显著影响。
如下表所示，在有或没有搅拌的情况下长达7天，聚山梨酯80含量对Caliper_非还原纯度没有显著影响。
还进行了还原Caliper分析。在有或没有搅拌的情况下在7天内，PS-80含量对Caliper_还原纯度没有显著影响。
为了测量亚可见颗粒，从玻璃小瓶容器中取出了大约1500μL的每个样品，并根据用户手册通过Micro-Flow Imaging(MFI)测试。报告了不同尺寸范围的颗粒浓度，包括1～2μm、2～5μm、5～10μm、10～25μm和>25μm(见下文)。在有或没有搅拌的情况下长达7天，聚山梨酯80含量对颗粒浓度没有显著影响。
实施例6
螯合剂的添加
该研究比较了具有以下CDR的抗TIGIT抗体在10mM L-组氨酸缓冲液(pH＝5.8)、0.02％(w/v)聚山梨酯80、10mM L-蛋氨酸(“L-Met”)、7％w/v蔗糖中在存在或不存在20uM或50uM DTPA的情况下的稳定性：SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ IDNO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQ ID NO：112的LCDR2和SEQ ID NO：113的LCDR3。
将三种制剂填充至小瓶中，并在5℃(环境湿度)、25℃(60％相对湿度)和40℃(75％相对湿度)下避光十八周进行稳定性分级(staged on stability)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估样品的胶体稳定性以用于确定单体百分比的纯度，以及高分子量种类(HMW)和晚洗脱峰(LMW种类)的百分比。用于评估％HMW(聚集体)、％单体和％LMW水平的UPSEC数据在下表中：
如上表所示，在5℃、25℃和40℃下，所有三种制剂在长达18周的时间点均显示出％HMW峰和％LMW峰增加(以及％单体峰随之降低)的趋势。在25℃下，与40℃相比，两种制剂均显示出相似的趋势，但变化较小。在5℃下，未观察到实质性变化。
与制剂2(20uM DTPA)和制剂3(50uM DTPA)相比，制剂1显示出％HMW和％LMW增加更大。另外，与制剂2和3相比，制剂1显示出％单体降低更大。用HP-IEX分析见到相似的结果(数据未显示)。
为了评估DTPA是否可以保护制剂免受氧化应力(oxidative stress)，将三种制剂填充至小瓶中并暴露于光(0.5X ICH和1X ICH)。如下表所见，与制剂2(20uM DTPA)和制剂3(uM DTPA)相比，制剂1的M254、M430和W104(易氧化的蛋氨酸和色氨酸)的％氧化增加更大。因此，DTPA可以进一步改善抗TIGIT抗体制剂的稳定性。
实施例7
抗TIGIT抗体制剂的长期稳定性
本实施例描述了在L-组氨酸缓冲液、L-蛋氨酸、蔗糖、聚山梨酯80和注射用水中配制的抗TIGIT抗体的长期稳定性数据，如下所示：
将溶液填充到具有弹性塞和铝密封的USP 1型玻璃小瓶中。然后将小瓶在三种不同的存储条件下孵育：5℃(环境湿度)、25℃(60％相对湿度)和40℃(75％相对湿度)。对于所有存储条件在时间零、1个月、3个月、6个月，在9个月(5℃和25℃存储条件)、12个月(5℃和25℃存储条件)、18个月(5℃储存条件)、24个月(5℃储存条件)和36个月(5℃条件)收集数据。
结果
结果证明了当在5℃的推荐长期条件下储存18个月时抗TIGIT抗体的总体物理和化学稳定性。在推荐的储存条件下，没有观察到可测量的效力损失，并且纯度在规格范围内。结果列在下表中：
蛋白质浓度
所有时间点和条件的蛋白质浓度稳定性数据均未表现出随储存时间或条件而变化的任何显著变化，并且所有结果均在45-55mg/ml的接受标准内。
pH
在5℃、25℃和40℃条件下，pH没有显著变化。图1列出了时间点0到9个月的pH数据。
聚山梨酯80
在9个月和18个月时，在5℃的推荐储存条件下聚山梨酯80含量稍微降低至0.13mg/ml(18个月的数据未显示)。在25℃(加速)和40℃(应力)下，观察到聚山梨酯80的降低趋势。在40℃下，聚山梨酯80浓度在6个月时降低至0.06mg/ml，而在25℃下聚山梨酯80含量在9个月时降低至0.07mg/ml。长达9个月的聚山梨酯80浓度数据列于图2中。
通过ELISA的效力结合
所获得的ELISA结果在任何时间点或条件下均无明显趋势。长达9个月的效力数据列于图3中。
通过UP-SEC的纯度
通过UP-SEC长达9个月的纯度数据在以下图4中以％单体，图5中以％高分子量种类，并且图6中以％低分子量种类表示。
在5℃的推荐储存条件下，在18个月的稳定性中，％单体略微下降，而％高分子量种类相应地略微增加。从初始到18个月的％低分子量种类低于等于0.4％的定量极限(<QL)。在25℃条件下，从初始到12个月的％单体降低，而％高分子量种类相应地增加。在9和12个月时，据报告％低分子量种类高于QL。
在40℃的应力条件下，％单体从98.7％降低至93.8％，而高分子量种类从1.33％相应地增加至2.63％，低分子量种类从<QL增加至3.53％。考虑到存储条件的性质，这个结果并不意外。
还原和非还原CD-SDS
图7和8显示通过还原和非还原CD-SDS确定的长达9个月的纯度数据。在5℃的长期储存条件下，还原(％重链和轻链)或非还原(％完整IgG)CE-SDS没有明显的趋势，并且结果在≥90.0％的GMP药品接受标准之内。在25℃加速条件下，非还原条件观察到降低趋势。对于还原CE-SDS条件，也观察到降低趋势。对于还原和非还原CE-SDS，长达9个月时间点的所有结果均在GMP接受标准之内。在40℃应力条件下，在6个月时，还原和非还原CD-SDS结果均低于为GMP药品设定的≥90.0％接受标准。非还原CE-SDS结果在3个月时不符合规格，结果为88.9％，然后在6个月时进一步降低至79.6％。对于还原CE-SDS，％重链和％轻链从3个月时的94.2％降低至6个月时的87.7％。考虑到条件的性质，这种降低在40℃下并不意外。
通过HP-IEX的电荷变体
在5℃(长期储存)下，％酸性变体从初始的21.46％略微增加至9个月时的22.49％，总主成分(Total Main)从68.8％相应地略微降低至9个月时的67.1％。％碱性变体在9个月时开始略微增加，从6个月时的10.15％增加至9个月时的10.38％。在25℃(加速)下，总主成分从初始时间点的68.8％降低至9个月时的47.6％。随着总主成分的降低，观察到酸性变体从21.46％相应地增加至39.86％，碱性变体从9.70％略微增加至11.51％。在40℃(应力)下，总主成分显著降低至6个月时的10.1％，而酸性变体相应地显著增加至80.02％，碱性变体相应地显著增加至9.95％。
颗粒物
通过mHIAC测量颗粒物。从初始到9个月，在5℃条件下的结果远低于以下接受标准：对于≥10μm，每个容器≤6000个颗粒，对于≥25μm，每个容器≤600个颗粒。据报告，在25℃下，≥10μm的颗粒从初始时间点的每个容器13个颗粒增加至9个月时的每个容器460个颗粒。对于≥25μm的颗粒，颗粒降低了，结果为9个月时每个容器3个颗粒。25℃数据的所有时间点都在≥10μm和≥25μm分析的接受标准之内。在40℃条件下的数据显示，≥10μm的颗粒急剧增加，9个月时每个容器8258个颗粒。该结果超出每个容器≤600个颗粒的接受标准。9个月的稳定性时间点时≥25μm的颗粒的结果增加至每个容器124个颗粒，满足≥25μm的接受标准(每个容器≤600个颗粒)。
浊度
由分光光度法在350nm处的吸光度确定浊度。在5℃的长期储存条件下，直到9个月的时间点都没有明显的变化。
在25℃条件下，在3个月时略微增加，结果为0.163AU，并继续增加至9个月，结果为0.196AU。在40℃时，从1个月开始以0.188AU出现了更为明显的增加，然后在9个月时大大增加至0.453AU。
结论
基于所述数据，在18个月的测试日期，在针对pH、蛋白质浓度、外观和可见颗粒(数据未显示)以及效力和颗粒物(数据未显示)的稳定性研究过程中，在5℃的储存条件下未观察到重大变化或趋势。除了颜色略微增加和PS-80含量降至0.13mg/ml外，在5℃下进行的任何稳定性测试均未观察到明显的变化或趋势。
基于5C的长期稳定性的数据，含有L-组氨酸缓冲液、蔗糖、聚山梨酯80和L-蛋氨酸的抗TIGIT制剂的预期保存期限为30个月。预期进一步包含螯合剂的制剂将减少观察到的聚山梨酯80的降解。
实施例8
抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体的共制剂。
将两种抗体共同配制为单一制剂，对患者更方便，并且将两种抗体一起给药增加了依从性。将两种抗体共同配制为单一制剂，对患者更方便，并且将两种抗体一起给药增加了依从性。一种IgG1主链上具有以下CDR的抗TIGIT抗体与派姆单抗共同配制：SEQ ID NO：108的HCDR1，SEQ ID NO：154的HCDR2，SEQ ID NO：110的HCDR3，SEQ ID NO：111的LCDR1，SEQID NO：112的LCDR2和SEQ ID NO：113的LCDR3。基于蛋白质间相互作用(如下所示)，发现共制剂(如下所示)在pH 5.0-6.0范围内是稳定的。因此，选择pH5.0、5.5和6.0的共制剂(P1T1)，并与两个对照(PD1抗体和抗TIGIT抗体)一起置于5℃、25℃和40℃下的额外热稳定性)。
如下将所述制剂制成液体制剂：
将每种制剂以1mL填充到2R小瓶中。通过肉眼检查、蛋白质浓度、微流成像(MFI)(颗粒评估)、混合模式尺寸排阻色谱法(SEC)(聚集评估)、IEX(电荷变体评估)和UP-SEC(聚集评估)来测量稳定性。
热稳定性方案如下：
测量不同共制剂的指示胶体和热稳定性的蛋白间相互作用。如正扩散相互作用参数(KD)值KD>0所示，排斥性蛋白质间相互作用表明一种具有较低的聚集倾向的稳定制剂。发现用于共制剂的Kd具有正的KD值，其指示排斥性和稳定的蛋白质间相互作用，这表明聚集倾向较小且稳定的共制剂。
基于正扩散相互作用参数(KD)或KD＞0，与单一抗体制剂相似，当共同配制在一起时，预期抗体共同配制时表现良好。

Claims (30)

1.一种制剂，其包含：
(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；
(ii)约5mM至约20mM缓冲液；
(iii)约6％至约8％重量/体积(w/v)非还原性糖；
(iv)约0.01％至约0.10％(w/v)非离子表面活性剂；和
(v)约1mM至约20mM抗氧化剂。
2.权利要求1所述的制剂，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含三个轻链CDR和三个重链CDR，所述三个轻链CDR包括SEQ ID NO：111的CDRL1、SEQ ID NO：112的CDRL2、SEQ ID NO：113的CDRL3并且所述三个重链CDR包括SEQ ID NO：108的CDRH1、SEQ ID NO：154的CDRH2和SEQ ID NO：110的CDRH3。
3.权利要求1或2所述的制剂，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含包含SEQID NO：148的重链可变区和包含SEQ ID NO：152的轻链可变区。
4.权利要求3所述的制剂，其中所述抗TIGIT抗体包含(i)包含SEQ ID NO：291的氨基酸序列的人重链IgG1恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域；或(ii)包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列的人重链IgG4恒定域和包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列的人κ轻链恒定域。
5.权利要求1-4中任一项所述的制剂，其中所述制剂的pH在5.3和6.2之间。
6.权利要求1-5中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液为L-组氨酸缓冲液，所述非还原性糖为蔗糖，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯80，并且所述抗氧化剂为L-蛋氨酸，所述制剂包含：
(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；
(ii)约5mM至约20mM的L-组氨酸缓冲液；
(iii)约6％至约8％(w/v)蔗糖；
(iv)约0.01％至约0.10％(w/v)聚山梨酯80；和
(v)约1mM至约20mM L-蛋氨酸。
7.权利要求1-6中任一项所述的制剂，其包含约8mM至约12mM的L-组氨酸缓冲液。
8.权利要求6-7中任一项所述的制剂，其包含约5mM至约10mM L-蛋氨酸。
9.权利要求6-8中任一项所述的制剂，其包含重量比为约0.02％w/v聚山梨酯80。
10.权利要求1-9中任一项所述的制剂，其包含约10mg/ml至约100mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
11.权利要求10所述的制剂，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约10mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml或100mg/ml。
12.权利要求1-11中任一项所述的制剂，其包含约25mg/mL的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
13.权利要求1-11中任一项所述的制剂，其包含约50mg/mL的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
14.权利要求1-11中任一项所述的制剂，其包含约75mg/mL的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
15.权利要求1-11中任一项所述的制剂，其包含约100mg/mL的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
16.权利要求1-15中任一项所述的制剂，其中所述制剂的pH为约5.5-6.3。
17.权利要求16所述的制剂，其中所述制剂的pH为约5.8-6.0。
18.权利要求1-17中任一项所述的制剂，其进一步包含抗PD1抗体或其抗原结合片段。
19.权利要求18所述的制剂，其中所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的三个轻链CDR，以及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8的三个重链CDR。
20.权利要求18-19中任一项所述的制剂，其中所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的可变轻区，以及包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的可变重区。
21.权利要求16-19中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含抗人PD-1抗体，所述抗人PD-1抗体为派姆单抗。
22.权利要求18-21中任一项所述的制剂，其中所述抗PD1抗体与所述抗TIGIT抗体的比例为1：1。
23.权利要求18-22中任一项所述的制剂，其包含约20mg/ml的抗PD1抗体、约20mg/ml的抗TIGIT抗体、10mM L-组氨酸缓冲液、约7％w/v蔗糖、约0.02％w/v聚山梨酯80和约10mM L-蛋氨酸。
24.权利要求1-23中任一项所述的制剂，其进一步包含螯合剂。
25.权利要求24所述的制剂，其中所述螯合剂为DTPA。
26.权利要求1-25中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含在玻璃小瓶或注射装置中。
27.权利要求1-26中任一项所述的制剂，其为液体制剂，其被冷冻至至少低于-70℃，或为来自冻干制剂的重构溶液。
28.权利要求1-27中任一项所述的制剂，其中在5℃下12个月后：
(i)如通过尺寸排阻色谱法所确定的，所述抗TIGIT抗体的％单体≥95％；
(ii)如通过还原CE-SDS所测定的，所述抗TIGIT抗体的％重链和轻链≥90％；
(iii)如通过还原CE-SDS所测定的，所述抗TIGIT抗体的％重链和轻链≥95％；
(iv)如通过非还原CE-SDS所测定的，所述抗TIGIT抗体的％完整IgG≥90％；和/或
(v)如通过非还原CE-SDS所测定的，所述抗TIGIT抗体的％完整IgG≥95％。
29.一种在有需要的人患者中治疗癌症或慢性感染的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1-28中任一项所述的制剂。
30.权利要求1-28中任一项所述的制剂在制备用于治疗癌症或用于治疗慢性感染的药物中的用途。
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