CN110596394A - 组蛋白h2a泛素化的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组蛋白H2A泛素化的用途，具体提出了试剂盒，该试剂盒包括：试剂，所述试剂用于检测组蛋白H2A或功能类似物的泛素化水平，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，该试剂盒可以有效用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
Description
优先权信息
本申请请求2018年6月12日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为PCT/CN2018/090791的PCT申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明涉及人类健康领域，具体地，本发明涉及组蛋白H2A泛素化的用途，更具体地，本发明涉及试剂盒、试剂、筛选药物的方法、药物组合物、试剂在制备药物组合物中的用途、衰老相关疾病的细胞模型以及衰老相关疾病的动物模型。
背景技术
衰老以及很多与衰老相关的疾病都与功能减退以及蛋白损伤有关。越来越多的证据表明衰老与表观遗传、转录和蛋白质组学改变有关。然而，这些过程究竟是如何对成年人的生理学产生影响，近期才刚开始被逐渐揭示。
因此，研究开发出一种衰老相关疾病的生物标志物迫在眉睫。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本申请公开了一种用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定的生物标志物。并且，本申请是首次公开组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：试剂，所述试剂用于检测组蛋白H2A或功能类似物的泛素化水平，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。根据本发明实施例的试剂盒可以有效用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
在本发明的第二方面，本发明提出了用于检测组蛋白H2A泛素化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。发明人发现，上述试剂可以有效制备用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定的试剂盒。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂。根据本发明的实施例，所述试剂用于检测组蛋白H2A泛素化水平，所述试剂用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。根据本发明实施例的试剂可以有效用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。根据本发明的实施例，所述方法包括：将患有衰老相关疾病的受试者的细胞与候选药物接触；检测所述细胞的组蛋白H2A的泛素化水平；接触后相比于接触前，所述细胞的组蛋白H2A泛素化水平降低，是所述候选药物为目标药物的指示。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，能够降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的药物可以有效治疗哺乳动物衰老相关疾病。进而，利用根据本发明实施例的方法可以有效筛选获得用于治疗哺乳动物衰老相关疾病的药物。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病，所述药物组合物包括用于降低组蛋白H2A泛素化水平的试剂。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，包含能够降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的试剂的根据本发明实施例的药物组合物，可以有效治疗哺乳动物衰老相关疾病。
在本发明的第六方面，本发明提出了试剂在制备药物组合物中的用途，所述试剂用于降低组蛋白H2A的泛素化水平，所述药物组合物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，用于降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的试剂可以有效制备用于治疗哺乳动物衰老相关疾病的药物组合物。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种试剂。根据本发明的实施例，所述试剂用于降低组蛋白H2A的泛素化水平，所述试剂用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，能够降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的根据本发明实施例的试剂，可以有效治疗哺乳动物衰老相关疾病。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种衰老相关疾病的细胞模型。根据本发明的实施例，相比于野生型细胞，所述细胞模型中组蛋白H2A的泛素化水平高。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。由此，本领域技术人员可以理解的是，如果细胞模型中组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞，则所述细胞模型患有衰老相关疾病。进而，根据本发明实施例的细胞模型可以作为衰老相关疾病的研究模型。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种衰老相关疾病的动物模型。根据本发明的实施例，所述动物模型包括：细胞，所述细胞中组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。由此，本领域技术人员可以理解的是，如果动物模型中细胞的组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞，则所述动物模型患有衰老相关疾病。进而，根据本发明实施例的动物模型可以作为衰老相关疾病的研究模型。
附图说明
图1是根据本发明实施例的脉冲追踪标记后三种组织中15N％的定量检测示意图，其中：
labeling表示标记，antibody表示抗体，tissue lysis and digest表示组织裂解和消化，head表示头部，muscle表示肌肉，testis表示睾丸，days表示天，long-livedprotein表示长寿蛋白质，cluster表示簇，chromatin assembly or disassembly表示染色质装配或拆卸，cellular respiration表示细胞呼吸，protein-DNA complexassembly表示蛋白质-DNA复合物组装，respiratory electron transport chain表示呼吸电子传递链，oxidative phosphorylation表示氧化磷酸化，ATP synthesis coupledelectron transport表示ATP合成耦合电子传递，nucleosome organization表示核小体组织，chromatin assembly表示染色质组装，mitochondrial electron transport表示线粒体电子传递，nucleosome assembly表示核小体组装，retention time表示保留时间，peptide表示肽，relative intensity表示相对强度；
图2是根据本发明实施例的泛素化的15N％定量检测示意图，其中：
peptide表示肽，percentage表示百分比，whole表示全部，proteome表示蛋白质组，ubiquitome表示蛋白质泛素化，old formpercentage表示长寿蛋白质百分比，total表示一共，site表示位点，other表示其他，relative intensity表示相对强度，retentiontime表示保留时间；
图3是根据本发明实施例的衰老过程中组蛋白H2A泛素化变化情况的定量检测示意图，其中：
Drosophila表示果蝇，mouse表示小鼠，human表示人，ubH2A表示组蛋白H2A泛素化，tubulin表示微管蛋白，day表示天，fold change表示倍数变化，week表示周，young表示年轻，old表示年老，year表示年；
图4是根据本发明实施例的组蛋白H2A泛素化在衰老过程中的功能的示意图，其中：
survival ratio表示存活比例，median表示中位数，day表示天，eclosion表示羽化，normalized counts表示标准化计数，glutathione-mediateed detoxification表示谷胱甘肽介导的排毒，endoplasmic reticulum stress pathway表示内质网应激通路，serotonin degradation表示血清素降解，superpathway ofmelatonin degradation表示褪黑激素降解的超级途径，mitotic roles ofpolo-like kinase表示polo样激酶的有丝***作用，nicotine degradation II表示尼古丁降解II，melatonin degradation I表示褪黑激素降解I，unfoldedprotein response表示展开的蛋白质反应，nicotine degradationIII表示尼古丁降解III，PI3K/AKT signaling表示PI3K/AKT信号传导，thyroid hormonemetabolism表示甲状腺激素代谢；
图5是根据本发明实施例的抗氧化能力的增强有助于延长突变体的寿命的示意图，其中：
Oxidative stress表示氧化应激，survival ratio表示存活比例，median表示中位数，days treated表示处理天数，climbing flies表示攀爬的果蝇；
图6是根据本发明实施例的果蝇中长寿蛋白质组的分析示意图，其中：
Percentage表示百分比，oxidation reduction表示氧化还原，phosphorylation表示磷酸化，mitochondrial ATP synthesis表示线粒体ATP合成，ATP synthesis coupledelectron transport chain表示ATP合成耦合电子传递链，respiratory electrontransport chain表示呼吸电子传递链，electron transport chain表示电子传递链，oxidative phosphorylation表示氧化磷酸化，cellular respiration表示细胞呼吸，energy derivation by oxidation表示通过氧化产生能量，generation of energy表示生成能量，spindle elongation表示主轴伸长率，mitotic spindle elongation表示有丝***纺锤体伸长，mitotic spindle organization表示有丝***纺锤体组织，microtubulecytoskeleton organization表示微管细胞骨架组织，translation表示转化，cytoskeleton organization表示细胞骨架组织，microtubule-based process表示基于微管的过程，mitotic cell cycle表示有丝***细胞周期，protein folding表示蛋白质折叠，secretion表示分泌，vesicle-mediated transport表示囊泡介导的运输，secretionby cell表示细胞分泌，neurotransmitter transport表示神经递质转运，generationofsignal involved in cell-cell signaling表示产生参与细胞-细胞信号传导的信号，neurological systemprocess表示神经***过程，regulation ofneurotransmitterlevels表示调节神经递质水平，transmission ofnerve impulse表示传递神经冲动，synaptic transmission表示突触传递，cell-cell signaling表示细胞-细胞信号传导，hexose catabolic process表示己糖分解代谢过程，glucose catabolic process表示葡萄糖分解代谢过程，monosaccharide metabolic process表示单糖代谢过程，cellularcarbohydrate catabolic process表示细胞碳水化合物分解代谢过程，alcoholcatabolic process表示酒精分解代谢过程，microtubule-based movement表示基于微管的运动，generation of precursor metabolites and energy表示产生前体代谢物和能量，protein accession表示蛋白质加入，protein name表示蛋白质名称；
图7是根据本发明实施例的每种蛋白质泛素化位点的数量的条形示意图，其中：
Ubiquitylated sites perprotein表示每个蛋白质的泛素化位点；以及
图8是根据本发明实施例的Sce、Su(z)2无效等位基因的制备示意图，其中：
Zinc finger表示锌指，genomic DNAPCR表示基因组DNAPCR。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本申请是在至少部分现有研究内容中有关组蛋白H2A的泛素化与衰老过程之间的相关性的基础上作出的。
组蛋白是将DNA包装到核小体中的蛋白质。组蛋白负责维持核小体的形状和结构。一个染色质分子由至少一个核心组蛋白(DNA的每100个碱基对应一个核心组蛋白)组成。迄今已知有五个组蛋白家族，这些组蛋白被称为H1/H5，H2A，H2B，H3和H4。H2A、H2B、H3和H4被认为是核心组蛋白。核心的形成首先是通过两个H2A分子的相互作用发生的；然后，H2A与H2B形成二聚体；之后，当H3-H4也发生附着形成四聚体时，便形成了完整的核心分子。
组蛋白H2A由非等位基因变体组成。术语“组蛋白H2A”指非特异性的、仅有少量氨基酸发生变化的结构相近的蛋白质。其中，比较重要的变体包括H2A.1，H2A.2，H2A.X和H2A.Z。这些变体可以通过“HistoneDB with Variants”数据库来查询，该数据库可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/HistoneDB2.0/index.fcgi/type/H2A/#msa_div_browse或http://www.uniprot.org/uniprot获得。
越来越多的证据表明衰老与表观遗传、转录和蛋白质组学改变有关。然而，这些过程究竟是如何影响成人的生理学，近期才刚开始被逐渐揭示。对于长时间存活的组蛋白，甲基化和乙酰化等化学修饰构成了年龄调节的表观遗传变化，极大地影响了成年人的寿命。选择的组蛋白的标记水平，例如，在赖氨酸27(H3K27me3)处的三甲基化组蛋白H3，在不同的生物模型或组织类型中可能随着年龄的不同表现出或增加或减少的变化。因此，鉴定组蛋白修饰中的保守老化标志对于在衰老过程中共同表观遗传机制的研究具有潜在影响。在本申请中，发明人使用果蝇作为动物模型，并用稳定同位素转换方法以及富含抗体的泛素分析方法进行蛋白质组学实验，以***地研究长寿命蛋白质组。发明人利用研究数据绘制了第一张在果蝇头部、肌肉和睾丸组织中周转有限的蛋白质图谱，并进一步揭示出长寿命组蛋白H2A(ubH2A)的年龄调节泛素化可以作为衰老的新标志，且在果蝇、小鼠和人类中具有进化保守性。此外，突变果蝇中ubH2A的降低与延长的寿命以及增强的处理氧化应激的能力相关。综上，目前的研究结果揭示了一种新的将表观遗传调节与成年寿命联系起来的衰老的保守标志。
衰老的一个突出特征是蛋白质稳态网络的逐渐下降，特别是蛋白质质量控制***无法有效补充的长寿蛋白质。由此，长寿蛋白质可能在成年寿命期间遭受了异常的化学修饰和损害，从而导致其发生功能的改变或丧失，因此它们的鉴定对于目前对衰老过程的理解十分重要。本申请中，发明人进行了果蝇体细胞和生殖组织中周转有限的蛋白质的综合分析。此外，本申请发明人描述了果蝇的头部泛素修饰的长寿蛋白质组，并鉴定发现，ubH2A可以作为寿命的表观遗传调节子，也可能是衰老的保守染色质标记。
最近关于小鼠和大鼠中长寿命蛋白质的报道表明，具有较长寿命的蛋白质比以往所认识到的要更加广泛。本申请的定量研究显示，在果蝇的成年期主要在由有丝***后期细胞组成的头部和肌肉，在衰老过程中含有大量的具有缓慢或周转有限的蛋白质，相反，在果蝇的有丝***活跃的生殖组织-睾丸中，长寿蛋白的数量相对减少，表明细胞***与新蛋白质合成直接有助于蛋白质组的补充。
果蝇的寿命远远小于哺乳动物，但蛋白质的寿命却与哺乳动物十分相似，因此，发明人可以通过检测剩余的15N信号来进行长寿命蛋白质的规模化鉴定。重要的是，长寿命蛋白质组包含功能多样的蛋白质，可以调节许多生物学功能，例如核小体的组装或线粒体相关的生物学过程，其中，所有组蛋白都是长寿的，大部分线粒体蛋白也是长寿的，这与之前的相关报道保持一致。
虽然现在长寿蛋白质在多种生物模型中被广泛认知，但对于这些蛋白质在衰老过程中如何进行维持和修饰却仍然知之甚少。对于长寿命蛋白Nup93和Nup153，它们可以进行羰基的修饰，并且在老年小鼠的肝脏和肌肉中Nup93和Nup153的PAR化也显著增加。
泛素化修饰是靶蛋白的关键PTM信号，本申请通过分析泛素化和长寿蛋白质组之间的相关性扩展了研究范围。值得注意的是，本申请的研究结果显示，新合成的蛋白质与旧的蛋白质的泛素化水平存在显著区别。这一证据可能为衰老过程中UPS和蛋白质代谢率的下降提供直接支持，因为这会导致泛素化修饰蛋白的迟发性积累。此外，长寿命的线粒体蛋白也倾向于泛素化。由于泛素连接酶Parkin可以靶向底物，以实现蛋白酶体和自噬的降解，这一发现可能暗示了在衰老过程中，Parkin和线粒体蛋白质存在蛋白连接。
有趣的是，尽管泛素化修饰的蛋白质代谢影响个体蛋白质的稳定性，但是组蛋白随年龄的变化所发生的泛素化可能导致全局和位点特异性的染色质重塑，这反过来又会引发与细胞适应性改变有关的更广泛的基因表达效应。然而，ubH2A在限制果蝇寿命方面的确切作用仍不清楚。研究表明，在果蝇和人中，ubH2A存在于Polycomb调节基因的启动子区域，包括Hox基因。因此，ubH2A可能是通过引入额外的组蛋白标记参与转录抑制。此外，也有报道表明ubH2A与组蛋白H3第四位赖氨酸的甲基化水平具有相关性。因此，要想确定影响果蝇寿命调节的ubH2A的关键表观遗传效应，还需要进行更多的研究工作。由于ubH2A的变化可以作为果蝇、小鼠和人类中一种新的、保守的衰老相关的标志，因此，未来包括对衰老过程中ubH2A表观基因组的比较分析在内的研究可能会揭示出调节与年龄相关的生理衰退和疾病的通用作用机制。
试剂盒
在本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：试剂，所述试剂用于检测组蛋白H2A或功能类似物的泛素化水平，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。根据本发明实施例的试剂盒可以有效用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述组蛋白H2A在以下的至少之一位点泛素化：SEQ ID NO:1～9至少之一所示氨基酸序列的第119和/或120位的赖氨酸，SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第118和/或119位的赖氨酸，SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的第26和/或27位的赖氨酸。
MSGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKK TESHHKTK(SEQ ID NO:1)。
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MSGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPVYMAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKK TESHKAKSK(SEQ ID NO:6)。
MSGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYSERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGRVTIAQGGVLPNIQAVLLPKK TESHHKAK(SEQ ID NO:7)。
MSGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPVYMAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKK TESHKAKSK(SEQ ID NO:8)。
MSGPTKRGGKARAKVKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRQGNYAQRIGAGAPVYLAAVLEYLTAEVLELAGNAARDNKKTRITPRHLQLAIRNDEELNKLLGRVTIAQGGVLPNIQAVLLPKK TESHKSQTK(SEQ ID NO:9)。
SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYSERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGRVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKT ESHHKAK(SEQ ID NO:10)。
LNKLLGRVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTES HHKPKGK(SEQ ID NO:11)。
其中，SEQ ID NO:1表示Q99878：组蛋白H2A 1-J(Homo sapiens)的氨基酸序列；SEQ ID NO:2表示Q96KK5：组蛋白H2A 1-H(Homo sapiens)的氨基酸序列；SEQ ID NO:3表示Q16777：组蛋白H2A2-C(Homo sapiens)的氨基酸序列；SEQ ID NO:4表示A3KPC7：组蛋白H2A(Homo sapiens)的氨基酸序列；SEQ ID NO:5表示Q8CGP6：组蛋白H2A 1-H(Mus musculus)的氨基酸序列；SEQ ID NO:6表示Q64523：组蛋白H2A2-C(Mus musculus)的氨基酸序列；SEQID NO:7表示A3KPD0：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列；SEQ ID NO:8表示Q149V4：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列；SEQ ID NO:9表示Q8CGP4：组蛋白H2A(Musmusculus)的氨基酸序列；SEQ ID NO:10表示A0AUV1：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列；SEQ ID NO:11表示Q61668：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列。发明人发现，所述组蛋白H2A的泛素化位点在上述的至少之一时，根据本发明实施例的试剂盒可以更加有效地用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体。发明人发现，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体时，可以更加方便、高效地特异性检测组蛋白H2A的泛素化水平，进而，所述试剂盒可以更加有效地用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述抗体为单克隆抗体。发明人发现，使用单克隆抗体可以进一步特异性检测组蛋白H2A泛素化水平。
根据本发明的实施例，所述抗体包括选自05-678Millipore、#8240 CST及其衍生物的至少之一，进而，可以进一步特异性检测组蛋白H2A泛素化水平。
根据本发明的实施例，所述衰老相关疾病包括选自痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的至少之一。发明人发现，所述试剂盒对于痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的诊断或预后效果的确定更加准确。
根据本发明的实施例，所述衰老相关疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、路易体痴呆、血管性痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、精神***症、抑郁、轻度认知障碍以及与年龄相关的认知衰退的至少之一。发明人发现，所述试剂盒对于上述衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定更加准确。
根据本发明的实施例，所述检测组蛋白H2A泛素化水平是通过Western-Blotting进行的。发明人发现Western-Blotting可用于检测不同的组蛋白，并且ubH2A的相对丰度可通过Western-Blotting进行标准化。
用于检测组蛋白H2A泛素化水平的试剂在制备试剂盒中的用途
在本发明的第二方面，本发明提出了用于检测组蛋白H2A泛素化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。发明人发现，上述试剂可以有效制备用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定的试剂盒。
根据本发明的实施例，所述组蛋白H2A在以下的至少之一位点泛素化：SEQ ID NO:1～9至少之一所示氨基酸序列的第119和/或120位的赖氨酸，SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第118和/或119位的赖氨酸，SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的第26和/或27位的赖氨酸。发明人发现，所述组蛋白H2A的泛素化位点在上述的至少之一时，所述试剂制备的试剂盒可以更加有效地用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体。发明人发现，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体时，可以更加方便、高效地特异性检测组蛋白H2A泛素化水平，进而，所述试剂制备的试剂盒可以更加有效地用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述抗体为单克隆抗体。发明人发现，使用单克隆抗体可以进一步特异性检测组蛋白H2A泛素化水平。
根据本发明的实施例，所述抗体包括选自05-678Millipore、#8240 CST及其衍生物的至少之一，进而，可以进一步特异性检测组蛋白H2A泛素化水平。
根据本发明的实施例，所述衰老相关疾病包括选自痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的至少之一。发明人发现，所述试剂制备的试剂盒对于痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及年龄相关病症的诊断或预后效果的确定更加准确。
根据本发明的实施例，所述衰老相关疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、路易体痴呆、血管性痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、精神***症、抑郁、轻度认知障碍以及与年龄相关的认知衰退的至少之一。发明人发现，所述试剂制备的试剂盒对于上述衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定更加准确。
根据本发明的实施例，所述检测组蛋白H2A泛素化水平是通过Western-Blotting进行的。发明人发现Western-Blotting可用于检测不同的组蛋白，并且ubH2A的相对丰度可通过Western-Blotting进行标准化。
试剂
在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂。根据本发明的实施例，所述试剂用于检测组蛋白H2A泛素化水平，所述试剂用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。根据本发明实施例的试剂可以有效用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述组蛋白H2A在以下的至少之一位点泛素化：SEQ ID NO:1～9至少之一所示氨基酸序列的第119和/或120位的赖氨酸，SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第118和/或119位的赖氨酸，SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的第26和/或27位的赖氨酸。发明人发现，所述组蛋白H2A的泛素化位点在上述的至少之一时，根据本发明实施例的试剂可以更加有效地用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体。发明人发现，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体时，可以更加方便、高效地特异性检测组蛋白H2A泛素化水平，进而，可以更加有效地用于衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
根据本发明的实施例，所述抗体为单克隆抗体。发明人发现，使用单克隆抗体可以进一步特异性检测组蛋白H2A泛素化水平。
根据本发明的实施例，所述抗体包括选自05-678Millipore,#8240 CST以及其衍生物的至少之一，进而，可以进一步特异性检测组蛋白H2A泛素化水平。
根据本发明的实施例，所述衰老相关疾病包括选自痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的至少之一。发明人发现，所述试剂对于痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的诊断或预后效果的确定更加准确。
根据本发明的实施例，所述衰老相关疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、路易体痴呆、血管性痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、精神***症、抑郁、轻度认知障碍以及与年龄相关的认知衰退的至少之一。发明人发现，所述试剂对于上述衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定更加准确。
根据本发明的实施例，所述检测组蛋白H2A泛素化水平是通过Western-Blotting进行的。发明人发现Western-Blotting可用于检测不同的组蛋白，并且ubH2A的相对丰度可通过Western-Blotting进行标准化。
筛选药物的方法
在本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。根据本发明的实施例，所述方法包括：将患有衰老相关疾病的受试者的细胞与候选药物接触；检测所述细胞的组蛋白H2A的泛素化水平；接触后相比于接触前，所述细胞的组蛋白H2A泛素化水平降低，是所述候选药物为目标药物的指示。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，能够降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的药物可以有效治疗哺乳动物衰老相关疾病。进而，利用根据本发明实施例的方法可以有效筛选获得用于治疗哺乳动物衰老相关疾病的药物。
药物组合物
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病，所述药物组合物包括用于降低组蛋白H2A泛素化水平的试剂。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，包含能够降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的试剂的根据本发明实施例的药物组合物，可以有效治疗哺乳动物衰老相关疾病。
试剂在制备药物组合物中的用途
在本发明的第六方面，本发明提出了试剂在制备药物组合物中的用途，所述试剂用于降低组蛋白H2A的泛素化水平，所述药物组合物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，用于降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的试剂可以有效制备用于治疗哺乳动物衰老相关疾病的药物组合物。
试剂
在本发明的第七方面，本发明提出了一种试剂。根据本发明的实施例，所述试剂用于降低组蛋白H2A的泛素化水平，所述试剂用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性，患有衰老相关疾病的细胞的组蛋白H2A泛素化水平高于正常细胞中组蛋白H2A泛素化水平。由此，本领域技术人员可以理解的是，能够降低患有衰老相关疾病的哺乳动物的细胞中组蛋白H2A泛素化水平的根据本发明实施例的试剂，可以有效治疗哺乳动物衰老相关疾病。
细胞模型
在本发明的第八方面，本发明提出了一种衰老相关疾病的细胞模型。根据本发明的实施例，相比于野生型细胞，所述细胞模型中组蛋白H2A的泛素化水平高。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。由此，本领域技术人员可以理解的是，如果细胞模型中组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞，则所述细胞模型患有衰老相关疾病。进而，根据本发明实施例的细胞模型可以作为衰老相关疾病的研究模型。
动物模型
在本发明的第九方面，本发明提出了一种衰老相关疾病的动物模型。根据本发明的实施例，所述动物模型包括：细胞，所述细胞中组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞。如前所述，本申请首次公开了组蛋白H2A泛素化与衰老相关疾病之间的相关性。由此，本领域技术人员可以理解的是，如果动物模型中细胞的组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞，则所述动物模型患有衰老相关疾病。进而，根据本发明实施例的动物模型可以作为衰老相关疾病的研究模型。
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例
一、实验方法
1、果蝇培养
将果蝇在25℃、60％湿度、12小时光照和12小时黑暗循环的培养条件下进行培养。使用的WT(对照)系是5905(FlyBase ID FBst0005905，w1118)。本申请使用的所有果蝇系已与5905连续五代回交以获得均一的遗传背景，以便确保表型与背景变化无关。
2、果蝇长寿蛋白组的切换稳定同位素标记
将3d年龄的雄性和雌性果蝇在由10％(w/v)15N标记的酿酒酵母(Silantes GmbH，Germany)、150mM蔗糖、6mM对羟基苯甲酸甲酯和0.5‰丙酸组成的培养基中杂交培养。果蝇在25℃和60％相对湿度下保持12小时光照/12小时黑暗的循环培养条件。5天后除去亲代果蝇。11天后，收集新生的子代果蝇并将其转移至15N喂食条件下再培养5天。之后将子代果蝇切换为正常的14N喂食条件，直到30d和60d的年龄。
3、果蝇的Pulse-SILAC标记
用含有10％(w/v)13C-赖氨酸标记的酿酒酵母(Silantes GmbH，Germany)、150mM蔗糖、6mM对羟基苯甲酸甲酯和0.5‰丙酸的培养基开始培养5d年龄的果蝇。将果蝇保持在25℃和60％相对湿度的12小时光照/12小时黑暗的循环培养条件中。用13C-赖氨酸标记5天后收取头部组织。
4、MS分析
样品制备
将头部、肌肉和睾丸组织在含有8M尿素、100mM Tris-HCl、pH8.5、150mm NaCl和蛋白酶抑制剂(Pierce，USA)的冰冷却尿素裂解缓冲液中进行匀浆。将匀浆物在14000g转速下离心10分钟，并使用BCA蛋白质测定法(Pierce，USA)测定上清液的蛋白质浓度。依据过滤辅助样品制备的标准流程，采用胰蛋白酶消化蛋白质。
碱性反相(RP)色谱
使用Agilent 1260HPLC***在XBridge BEH C18柱上进行离线碱性RPHPLC分级分离。对于老化蛋白质组或泛素化蛋白质组的分析，分别通过72分钟的碱性RP HPLC梯度分级分离500μg或8mg的肽。样品注射后，将72个级分收集到1.5mL的Eppendorf管(Eppendorf，UK)中，然后将得到的小的级分以非连续方式合并成7-8个大的级分。即将原始级分1、9、17、25、33、41、49、57和65进行组合以产生第一个合并的级分，其他七个级分以类似的方式合并。将级分在真空浓缩器中干燥至完全。使用识别K-GG残余的抗体对每个级分的肽进行LC-MS分析或泛素化富集。
泛素化富集
将每种级分约1mg的肽混合物溶于200μL的IP缓冲液(包含50mM MOPS pH 7.2，10mM磷酸钠，50mM NaCl和0.3％NP40)中。将总共80μL的K-GG泛素残余基序抗体磁珠缀合物(PTM-1104，PTM Biolabs，China)用冷的PBS洗涤三次，然后在相同条件下置于8个自制的C8StageTips中。将重悬多肽的各个级分加入到C8StageTips中，并使用200g的离心力流过磁珠。使用IP缓冲液以及不含NP40的IP缓冲液分别洗涤珠子2次以除去非特异性结合肽，然后用H2O在200g的离心力下洗涤3次。为了洗脱肽，加入40μL的0.2％三氟乙酸(TFA)并在100g的条件下离心以收集肽。最后将得到的肽干燥至完全。
LC-MS/MS
在与NanoLC-1000HPLC***(Thermo Fisher Scientific，USA)偶联的三杂交Orbitrap融合质谱仪上进行在线LC-MS/MS分析。通过内部制造的15-cm无泡柱，用C18树脂(1.9-μm，Dr。Maisch GmbH，Germany)以300nL/min的流速分离肽混合物。质谱以数据依赖模式获得，在Orbitrap中进行一次全扫描(m/z：350-1800；分辨率：60000；AGC目标值：5×105)，然后在线性阱中进行MS2扫描(32％标准化碰撞能量；AGC目标值：10000，最大注射时间：50ms或200ms，分别用于组织裂解物或泛素化分析)。前体选择的动态排除设定为60秒。
蛋白质鉴定和15N定量分析
60d年龄的果蝇的头部、肌肉和睾丸被用来分析长寿命的蛋白质。使用IntegratedProteomics Pipeline-IP2(Integrated Proteomics Applications，San Diego，CA，http://www.integratedproteomics.com/)，利用Uniprot Drosophila数据库(下载日期：2016年2月)检索属于一个样品的不同级分的原始数据，同时分别设定20ppm和400ppm的前体和片段质量耐受值。将胰蛋白酶设定为酶，对于组织裂解物或泛素化富集样品，最大允许切割次数为1和2次。静态修饰是Carbamidomethyl(C)(+57.02Da)，而动态修饰是所有样品的甲硫氨酸(+15.99Da)的氧化，以及仅针对泛素化富集样品的赖氨酸(+114.04Da)的双甘氨酸化(diGly)。同时使用相同的参数进行15N分析。使用CENSUS计算每种肽的14N和15N的比例。蛋白质定量分析需要两种肽，而泛素化蛋白质的定量分析仅需要一种泛素化肽。
组蛋白修饰的Western印迹分析
所有动物程序均经中国科学院动物护理与使用委员会审查批准，符合“中国科学院实验动物护理与使用指南”。使用来自30d和60d果蝇的解剖的头部，通过蛋白质印迹法来分析单泛素化组蛋白H2A的水平。衰老雄性C57BL/6小鼠样品获自中国上海的华东师范大学。2名女性和12名男性的人类前额叶皮质获自中国湖北省中国脑库中心(CBBC)。在含有50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂(Pierce，USA)的RIPA缓冲液中用马达研杵裂解等量的组织。将蛋白质混合物在4℃、16000g的条件下离心10分钟，以便除去未溶解的角质素，然后在NuPAGE 12％Bis-Tris凝胶(GeneScript，China)上分离。之后将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，USA)上。对于小鼠脑部样品，以1：1000(抗ubH2A，05-678，来自小鼠，Millipore，USA)的比例稀释一抗；对于果蝇头部以及人类脑部样品，以1：2000(抗ubH2A，#8240，来自兔，CST，USA)的比例稀释一抗；对于果蝇、小鼠和人类其他样品，以1：2000(抗H2A，07-146，来自兔，Millipore，美国)的比例稀释一抗，并在4℃下过夜孵育。将HRP缀合的第二抗体，即抗小鼠抗体(31430，Pierce，USA)和抗兔抗体(31460，Pierce，USA)以1：10000的比例稀释，并在室温下温育1小时。通过ImageQuant TL(GE Healthcare，UK)定量检测信号强度。将组蛋白修饰的相对丰度标准化为组蛋白H2A信号强度，并且使用学生t检验进行统计分析。
5、CRISPR-Cas9
将两个用于靶基因的sgRNA质粒注射到蝇胚中。通过单-果蝇-PCR检测来筛选突变体。为此，将单只果蝇在50μL挤压缓冲液(10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，25mM NaCl，1mMEDTA，200μg/mL蛋白酶K)中匀浆，然后在37℃下孵育30分钟，接着在95℃下灭活10分钟。Scec244和Su(z)2c433的筛选引物分别缺失。
Scec244的筛选引物如下：
F：5'-GTCGCTGTACGAGCTGCAGCGCAAG-3'(SEQ ID NO：12)；
R：5'-CGATGTGCCCGAATGACCCGGATCC-3'(SEQ ID NO：13)。
Su(z)2c433的筛选引物如下：
F：5'-CGATCCAACCACTGTGGATTACTG-3'(SEQ ID NO：14)；
R：5'-GTAGGCAG TACCTCATCCTTGTAG-3'(SEQ ID NO：15)。
携带缺失的雌性果蝇连续五代回交到WT(5905)雄性果蝇中，以获得均匀的遗传背景，减轻背景效应。
6、寿命
在羽化当天收集成年雄性果蝇，并在25℃、60％湿度和12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养果蝇，每瓶中饲养20只果蝇。每隔一天将果蝇转移到新的小瓶中并进行存活评分。
7、GSH/GSSG测量
收取100只蝇头并立即在液氮中冷冻。使用均质器(Precellys 24，BertinTechnologies，Germany)将组织用300μL ddH2O均质。然后在-80℃下冷冻30分钟并在室温下解冻，然后进行5次30s启动、30s停止的超声循环。将裂解物在4℃下使用10000g离心5分钟。将上清液转移至10kDa截止分子量的旋转过滤器(Millipore，USA)，然后在4℃下使用10000g离心30分钟以除去蛋白质。根据制造商的说明(S0053，Beyotime Biotechnology，China)进行测试。通过Multiskan GO(Thermo Fisher Scientific，USA)检测412nm处的吸光度。
8、攀登测试
将10只雄性果蝇转移到空瓶中，在黑暗中适应30分钟。果蝇被轻拍到小瓶的底部，按照在5秒内能够爬上距离底部2厘米处的果蝇的比例进行计数。在给定年龄对每种基因型进行10次生物学重复。
9、氧化应激测试
每个小瓶中有20只每种基因型的雄性果蝇。在测试之前，将果蝇用1％琼脂培养基预处理6小时，然后转移到含有H2O2的培养基中。之后，将果蝇转移到放置有预先浸泡在含有1.5mL 10％葡萄糖和2％H2O2(Sinopharm Chemical Reagent，China)的混合溶液中的一小片Kimwipe滤纸的小瓶中。每12小时对死去的果蝇进行计数，并使用Prism软件(Graphpad)生成存活曲线和统计分析。
10、RT-qPCR
解剖50个头部并在含有1mL Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific，USA)的1.5mL的管中匀浆。按照制造商的说明进行RNA分离。将RNA重悬于DEPC处理的无RNase水(Thermo Fisher Scientific，USA)中。根据制造商的说明(Thermo Fisher Sicentific，USA)，使用TURBO DNAfree试剂盒去除残留的DNA污染物。使用用于RT-PCR的SuperScriptIII First-strand合成***(Thermo Fisher Scientific，USA)，通过随机引物将1μg的总RNA用于逆转录。使用具有SYBR选择的主混合物(Thermo Fisher Scientific，USA)的QuantStudio6Flex实时PCR***进行分析。使用2-ΔΔCT方法进行定量分析，采用RP49基因作为内部对照。
靶基因GSTO1的引物：
F：5'-AGATCCCGTATCACAGCATCTAC-3'(SEQ ID NO：16)；
R：5'-GCTCGTCCAGATATTCACAAATC-3'(SEQ ID NO：17)。
RP49的引物：
F：5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3'(SEQ ID NO：18)；
R：5'-ATCTCGCCGCAGTAAACGC-3'(SEQ ID NO：19)。
11、PolyA选择的mRNA-seq
将头部组织在含有1mL Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific，USA)的1.5mL的管中匀浆。按照制造商的说明进行RNA分离。将RNA重悬于DEPC处理的无RNase水(Invitrogen，USA)中。根据制造商的说明(Invitrogen，USA)，使用TURBO DNA free试剂盒除去残留的DNA污染物。使用用于Illumina的VAHTS mRNA-seq v2library Prep Kit，利用1μg的总RNA产生测序文库。通过Bioanalyzer 2100(Agilent，USA)检查文库质量。通过qRT-PCR参照标准文库进行定量检测。将文库以等摩尔量合并在一起，终浓度为2nM。用0.1MNaOH(Sigma，USA)进行标准化文库的变性。汇集的变性文库在IlluminaNextSeq550平台上进行测序，使用单端100bps。使用STAR2.3.0e的默认参数将测序读段匹配到参考基因组文库dm6上。通过HTSeq-0.5.4e htseq-count计算每个基因的读段数，参数为“-mintersection-strict-s no”。计数文件输入R包DESeq，以便进行标准化，并且将差异表达基因设定为小于0.05的p值。(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)。
12、GO和途径分析
用David进行果蝇LLPs和ELLP的生物途径分析。通过独创性途径分析-IPA(QIAGEN，USA)进行mRNA基因的差异表达分析。
13、数据可行性
MS数据已经以登录号IPX0001204000进行保藏在iProX；Illumina RNA-seq数据已经通过NCBI门户，在BioProject登录号PRJNA453196和SRA登录号SRR7059190下保藏在序列读取档案(SRA)中。
二、实验结果
1、同位素标记方法展示长寿蛋白质组
为了研究长寿的蛋白质组，发明人在果蝇中采用了脉冲-SILAM方法(在哺乳动物中用氨基酸进行稳定同位素标记)(图1A)。简单来说，在子宫内开始用15N标记的饲料喂养果蝇。羽化后第5天，将果蝇的饮食从15N标记的重型饲料更换为14N标记的轻型饲料，使得在成年寿命期间新合成的蛋白质可以包含14N标记，从而可以通过质谱法将新合成的蛋白质组与旧的蛋白质组分离开来。通过使用该方法，发明人发现，在果蝇中，蛋白质组具有年龄依赖性的变化。发明人从5d，30d和60d年龄的果蝇中分离出了头部和肌肉组织的非***的体细胞，以及睾丸中有丝***活跃的组织。对从出生前就15N喂养的5d年龄的果蝇进行质谱分析，结果显示15N标记的肽占所分析总肽的99.7％以上(图6a)，表明标记效率较高，接近100％。发明人将三个年龄果蝇的头部、肌肉和睾丸共计307419033034种蛋白质进行了定量分析(图6b)。蛋白质组在衰老过程中的代谢表现为新蛋白质的合成和旧蛋白质的减少，如重15N标记蛋白质比例的减少(图1B)。年轻和老年的果蝇之间单个蛋白质的14N和15N标记的肽的相对比例显著不同，反映了它们具有显著不同的代谢率(图1B)。为了绘制出果蝇的长寿命蛋白质组(LLP)图谱，发明人首先将长寿命蛋白质定义为相比于第5天时接近100％的15N标记率，在第60天时具有至少10％的15N标记率的蛋白质。值得注意的是，该标准比之前使用5％截止值的小鼠LLP的研究更为严格。分析表明，肌肉蛋白质组的长寿蛋白比例最高，其中1903种蛋白中有1502种是LLP，比例为78.9％；头部蛋白质组中3074种蛋白中有1715种是LLP，比例为55.8％(图6c)。相比之下，细胞有丝***活跃的果蝇睾丸中仅有928个LLP，占鉴定的睾丸蛋白的30.6％。Gene Ontolgoy(GO)分析发现，三种组织共有的LLP与能量的产生有关(图6d)，头部特异性LLP参与神经传递，而肌肉和睾丸中的LLP参与代谢过程(图6e)。总之，通过脉冲-SILAM对果蝇衰老蛋白质组的研究揭示出LLP在调节能量代谢和组织特异性功能(例如神经传递)中具有重要作用。
发明人接着使用Fuzz C-means方法依据15N的比例进行了蛋白质的分类。该分析分析了一组蛋白质，其在60天时保留了超过70％的15N形式，因此为果蝇中极其长寿的蛋白质(ELLP)(图1C)。最终，发明人分别在头部、肌肉和睾丸中编目了276、503和306种ELLP(图1C)。三种组织共有的16种ELLP中，4种是层粘连蛋白(图6f)。在果蝇中的这一发现与先前在大鼠中的LLP研究一致，表明核蛋白的层粘连蛋白是进化上保守的ELLP。此外，对头部和肌肉共有的149种ELLP的GO分析表明，组装的核小体是富集最显著的类目(p＝5.2e-9，Fisher精确检验)(图1D)。引人注目的是，所有先前报道的鼠的长寿组蛋白都在此类别中被发现，证明组蛋白作为ELLP也具有高度进化保守性(图1E)。此外，发明人在果蝇中鉴定出了一组新的结构蛋白也属于ELLP，如肌动蛋白，原肌球蛋白和副肌球蛋白。
2、泛素化在长寿蛋白质中的比例比新合成的蛋白质中更高
鉴于泛素化在调节蛋白质代谢中可以起到关键作用，发明人怀疑泛素化可能与长寿蛋白质组有关。为了解决这个问题，发明人将脉冲-SILAM与富含抗体的泛素化相结合，从而可以定量检测旧的和新合成的蛋白质上的泛素。在来自60d的年龄较大的蝇头中，鉴定发现2068种蛋白质中有5317个特异的泛素化位点，并定量检测出988种蛋白质中的2734个特异性泛素化位点。结果显示，虽然定量检测的451种蛋白仅含有一个泛素化位点，但另外537种蛋白具有多个位点，其中37种蛋白甚至含有超过10种修饰(图7)。发明人接下来研究了泛素化修饰是否在旧的与新合成的蛋白之间具有差异性。肽谱匹配(PSM)分析发现，虽然在60天时15N标记的旧的蛋白占整个蛋白质组的28％，但它们却代表了泛素化蛋白质组的59％(图2A)。因此，长寿蛋白质组中泛素化修饰显著增加。同样地，如上述脉冲-SILAM实验所揭示的那样(p＝2.2e-16，Mann-Whitney-Wilcoxon检验)(图2B)，长寿蛋白质组中，大多数泛素化蛋白质(～64％)在15N/14N形式上占比更大。因此，长寿蛋白质的泛素化比新合成的蛋白质更显著。
3、UbH2A是一种高度保守的衰老标志
发明人接下来研究了一组具有显著泛素化水平的长寿蛋白质，该组包括肌球蛋白重链、电压依赖性阴离子选择性通道、钠/钾转运ATP酶，以及组蛋白(图2C和表1)。表1中，根据PSM总数对泛素化位点的丰度进行排名。相比于新合成的蛋白质，大多数泛素化位点主要集中在长寿蛋白质，因为长寿蛋白质15N的标记比例更高。有趣的是，发明人发现，泛素化组蛋白H2A(ubH2A)的118和119位赖氨酸和多种泛素化组蛋白H2B显著富集(图2D、图2E和表2)。表2中，PSM的总数表示泛素化位点的丰度。
表1：十个丰度最高的泛素化位点
表2：组蛋白H2A和H2B的泛素化位点定量分析
由于哺乳动物中的H2A119K，120K(果蝇中的K118和K119)是组蛋白单泛素化的保守位点，因此发明人想知道这种修饰在不同物种中是否也随着年龄的增长发生变化(图3A)。发明人首先通过蛋白质印迹法检测了ubH2A的水平，并发现在年老的果蝇中ubH2A的水平显著增加(图3B)。发明人进一步分析了年轻和年老的小鼠(分别为32周和104周)后发现，与年轻小鼠相比，老年小鼠脑中ubH2A的积累显著增加(图3C)。更引人注目的是，来自老年人的前额皮质样本中ubH2A的丰度显著增加(图3D)。综上，研究结果表明随年龄调节的ubH2A的增加是衰老的高度保守标志。
4、在果蝇中，降低ubH2A可延长成年果蝇的健康期
为了理解泛素化修饰的长寿蛋白质的生物学意义，发明人决定研究H2A泛素化究竟是如何影响果蝇的成年期的。研究表明Sce和Su(z)2用于调节H2A泛素化。发明人使用CRISPR/Cas9诱变产生Scec244和Su(z)2c433的位点特异性无效突变体(图8a和8b)。图8中，为了使Sce和Su(z)2基于CRISPR/Cas9方法丧失功能等位基因，发明人使用sgRNA1和sgRNA2来诱导位点特异性缺失。PCR分析证实Scec244/+和Su(z)2c433/+是缺失突变体。为了命名新的突变体，修饰基因的上标包含字母c，表示CRISPR/Cas9方法，后面跟着基因组缺失的大小。
寿命分析表明，缺乏Scec244的动物比WT的动物更长寿(图4B)，同时ubH2A相应地降低(图4A)。由于表观遗传效应通常是剂量依赖性的，发明人进一步使用Scec244和Su(z)2c433反式杂合双突变体研究分析了成体存活率。值得注意的是，双突变体对延长寿命和降低ubH2A的作用表现出更显著的影响(图4B和4A)。这一证据表明，降低ubH2A可以有效延长成年期。
组蛋白修饰的生物学作用使得染色质与基因表达建立了相关性，特别是ubH2A水平的上调与基因抑制有关。发明人好奇，特定基因的转录变化是否可以解释衰老的ubH2A依赖性调节。因此，发明人使用解剖的头部组织，在WT以及产生了比单突变体具有更强的生命延伸表型的(图4B)Scec244和Su(z)2c433反式杂合双突变体上产生polyA选择的mRNA的RNA-seq数据集。有趣的是，通路分析和qRT-PCR实验显示，与年龄一致的WT型相比，双突变体中谷胱甘肽相关途径GSTO1显著上调(图4C、4D和4E)。此外，发明人进一步研究了作为细胞氧化还原状态的重要指标的谷胱甘肽，这些数据显示突变体中GSH/(GSH+GSSG)比率显著高于WT(图4F)，表明在长寿命Scec244和Su(z)2c433双突变体中细胞氧化还原电位得到改善。
之后，发明人想要了解，Scec244单突变体以及Scec244和Su(z)2c433双突变体中增强的氧化还原电位能力是如何在衰老过程中转化为适应性和抗逆性。为了阐明这一点，发明人研究了与年龄相关的表型。对攀爬能力的分析表明，突变体比年龄匹配的WT具有更强的运动性(图5B)。为了检测对氧化应激的敏感性，发明人使用了过氧化氢(H2O2)，作为活性氧(ROS)的来源。发明人发现，相比于WT，Scec244单突变体以及Scec244和Su(z)2c433双突变体的抗氧化性显着增强(图5A)。综上，研究结果表明，基因突变导致的ubH2A的降低与长寿相关，ubH2A的降低可以显著增强反映成年健康状况的处理压力的能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院上海有机化学研究所
<120> 组蛋白H2A泛素化的用途
<130> PIDC3181950
<160> 19
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<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q99878：组蛋白H2A 1-J（Homo sapiens）的氨基酸序列
<400> 1
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
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Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Thr Lys
115 120 125
<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q96KK5：组蛋白 H2A 1-H (Homo sapiens)的氨基酸序列
<400> 2
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
<210> 3
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q16777：组蛋白H2A 2-C (Homo sapiens)的氨基酸序列
<400> 3
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Met Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His Lys Ala Lys Ser
115 120 125
Lys
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A3KPC7：组蛋白H2A (Homo sapiens)的氨基酸序列
<400> 4
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
<210> 5
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q8CGP6：组蛋白 H2A 1-H (Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 5
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
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<210> 6
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q64523：组蛋白H2A 2-C (Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 6
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1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
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Lys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A3KPD0：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 7
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Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
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<210> 8
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q149V4：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 8
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
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Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
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115 120 125
Lys
<210> 9
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q8CGP4：组蛋白H2A (Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 9
Met Ser Gly Pro Thr Lys Arg Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Val Lys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Gln Gly Asn Tyr Ala Gln Arg Ile Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Val Leu
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Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Thr
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
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Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His Lys Ser Gln Thr
115 120 125
Lys
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A0AUV1：组蛋白H2A (Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 10
Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg
20 25 30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala Pro
35 40 45
Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu Glu
50 55 60
Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile Pro
65 70 75 80
Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile Gln
100 105 110
Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
<210> 11
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Q61668：组蛋白H2A(Mus musculus)的氨基酸序列
<400> 11
Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu
1 5 10 15
Pro Asn Ile Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His
20 25 30
Lys Pro Lys Gly Lys
35
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Scec244的正向筛选引物
<400> 12
gtcgctgtac gagctgcagc gcaag 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Scec244的反向筛选引物
<400> 13
cgatgtgccc gaatgacccg gatcc 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Su（z）2c433的正向筛选引物
<400> 14
cgatccaacc actgtggatt actg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Su（z）2c433的反向筛选引物
<400> 15
gtaggcagta cctcatcctt gtag 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶基因GSTO1的正向引物
<400> 16
agatcccgta tcacagcatc tac 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶基因GSTO1的反向引物
<400> 17
gctcgtccag atattcacaa atc 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RP49的正向引物
<400> 18
ccgcttcaag ggacagtatc tg 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RP49的反向引物
<400> 19
atctcgccgc agtaaacgc 19
Claims (12)
1.一种试剂盒，其特征在于，包括：试剂，所述试剂用于检测组蛋白H2A或功能类似物的泛素化水平，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组蛋白H2A在以下的至少之一位点泛素化：
SEQ ID NO:1～9至少之一所示氨基酸序列的第119和/或120位的赖氨酸，
SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第118和/或119位的赖氨酸，
SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的第26和/或27位的赖氨酸；
任选地，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体；
任选地，所述抗体为单克隆抗体；
任选地，所述抗体包括选自05-678Millipore、#8240CST及其衍生物的至少之一；
任选地，所述衰老相关疾病包括选自痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的至少之一；
任选地，所述衰老相关疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、路易体痴呆、血管性痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、精神***症、抑郁、轻度认知障碍以及与年龄相关的认知衰退的至少之一；
任选地，所述检测组蛋白H2A泛素化水平是通过Western-Blotting进行的。
3.用于检测组蛋白H2A泛素化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述组蛋白H2A在以下的至少之一位点泛素化：
SEQ ID NO:1～9至少之一所示氨基酸序列的第119和/或120位的赖氨酸，
SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第118和/或119位的赖氨酸，
SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的第26和/或27位的赖氨酸；
任选地，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体；
任选地，所述抗体为单克隆抗体；
任选地，所述抗体包括选自05-678Millipore、#8240CST及其衍生物的至少之一；
任选地，所述衰老相关疾病包括选自痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的至少之一；
任选地，所述衰老相关疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、路易体痴呆、血管性痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、精神***症、抑郁、轻度认知障碍以及与年龄相关的认知衰退的至少之一；
任选地，所述检测组蛋白H2A泛素化水平是通过Western-Blotting进行的。
5.一种试剂，其特征在于，所述试剂用于检测组蛋白H2A泛素化水平，所述试剂用于哺乳动物衰老相关疾病的诊断或预后效果的确定。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述组蛋白H2A在以下的至少之一位点泛素化：
SEQ ID NO:1～9至少之一所示氨基酸序列的第119和/或120位的赖氨酸，
SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第118和/或119位的赖氨酸，
SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的第26和/或27位的赖氨酸；
任选地，所述试剂是泛素化组蛋白H2A的特异性抗体；
任选地，所述抗体为单克隆抗体；
任选地，所述抗体包括选自05-678Millipore,#8240CST以及其衍生物的至少之一；
任选地，所述衰老相关疾病包括选自痴呆症、神经退行性疾病、神经障碍以及其它年龄相关病症的至少之一；
任选地，所述衰老相关疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、路易体痴呆、血管性痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、精神***症、抑郁、轻度认知障碍以及与年龄相关的认知衰退的至少之一；
任选地，所述检测组蛋白H2A泛素化水平是通过Western-Blotting进行的。
7.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病，其特征在于，包括：
将患有衰老相关疾病的受试者的细胞与候选药物接触；
检测所述细胞的组蛋白H2A的泛素化水平；
接触后相比于接触前，所述细胞的组蛋白H2A泛素化水平降低，是所述候选药物为目标药物的指示。
8.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病，其特征在于，包括：用于降低组蛋白H2A泛素化水平的试剂。
9.试剂在制备药物组合物中的用途，所述试剂用于降低组蛋白H2A的泛素化水平，所述药物组合物用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。
10.一种试剂，其特征在于，所述试剂用于降低组蛋白H2A的泛素化水平，所述试剂用于治疗哺乳动物衰老相关疾病。
11.一种衰老相关疾病的细胞模型，其特征在于，相比于野生型细胞，所述细胞模型中组蛋白H2A的泛素化水平高。
12.一种衰老相关疾病的动物模型，其特征在于，包括：细胞，所述细胞中组蛋白H2A的泛素化水平高于野生型细胞。
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- 2019-04-15 CN CN201910300035.XA patent/CN110596394B/zh not_active Expired - Fee Related
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