CN110596228A

CN110596228A - 一种基于差分离子迁移谱-质谱联用的差向异构体的分离方法

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Publication number: CN110596228A
Application number: CN201910845986.5A
Authority: CN
Inventors: 陈相峰; 吴日; 陈德华; 杨敏莉; 张峰
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-09-09
Also published as: CN110596228B

Abstract

本公开建立了一种基于差分离子迁移‑质谱联用的O‑糖基化肽段差向异构体的分离和鉴定方法，属于生物医药和食品/保健品的检测和分析领域。本公开的方法能够检测O‑乙酰氨基葡萄糖化的差向异构体蛋白质或多肽，这为研发治疗神经性***疾病等的新药奠定了良好的基础，同样的，在生物医药和食品/保健品分析领域中具有十分重要的意义。而且本公开首次使用差分离子迁移谱‑质谱联用的技术实现了生物体中十分重要的物质‑O‑糖基化蛋白质或肽段的分离和识别，推动了生物大分子O‑糖基化蛋白质或肽段的鉴定技术的发展。

Description

一种基于差分离子迁移谱-质谱联用的差向异构体的分离方法

技术领域

本公开涉及一种基于差分离子迁移谱-质谱联用的差向异构体的分离方法，属于生物医药和食品/保健品的检测分析领域。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

在生物体中，蛋白质糖基化是一种细胞中广泛存在、复杂的蛋白质翻译后修饰，大约有50％的人类蛋白质分子是糖基化的。糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，比如，免疫***中几乎所有的关键分子都是糖蛋白，免疫球蛋白糖链异常是自身免疫疾病的元凶；透明带糖蛋白ZP3决定了卵子与***的结合，其糖链是精-卵结合的牵线人；等等。

糖基化类型主要可分为两种：N-糖基化和O-糖基化，而其中，O-糖基化包含有一个单糖单元在细胞功能和失调方面具有重要的作用，比如，蛋白质的O-乙酰氨基葡萄糖化被发现参与多个信号网络，与神经性***疾病(比如阿兹海默氏症等)、自身免疫性疾病等疾病密切相关。可见，对于糖蛋白的研究具有十分重要的生物学意义和临床应用价值，尤其是研究作为生物医药等的复合糖蛋白/肽。

目前，复合糖立体化学的鉴定归属基于所有去糖基化酶和具有严格的底物特异性。但是最新的研究表明，pp-α-GanT2肽能够介导生物合成含有乙酰基葡糖胺和乙酰基半乳糖胺残基的差向异构糖肽。在药物和食品/保健品领域，这种差向异构糖肽往往只有一种形式是具有活性的，或者是不同差向异构糖肽具有不同的功能活性的，或者是只有一种形式能表征药物疗效的，所以在实际中，需要准确分离、识别非目的差向异构糖肽是否存在以及测定其含量等。所以为了避免对于糖肽结构的错判等问题，需要开发快速和/或高灵敏度的复合糖差向异构体的区分方法。目前，基于质谱的糖肽和糖蛋白中糖基团的归属和定位作为主要的手段，仍然存在技术挑战。多种串联质谱技术，包括碰撞裂解，电子捕获裂解和电子诱导裂解，电子转运裂解，以及复合裂解技术，被用来进行糖基化修饰位点的定位。但是，包含单个差向异构单糖的非对映复合糖异构体仍然不能通过质谱进行区分。

发明内容

针对以上背景技术，本公开建立了一种基于差分离子迁移-质谱联用的O-糖基化肽段差向异构体的分离和鉴定方法。通过在差分离子迁移谱注入微量的挥发性有机调节剂，实现了糖肽差向异构体的基线分离，为实现糖肽差向异构体的完全分离奠定基础，在生物医药和食品/保健品分析领域中具有十分重要的意义。

具体的，本公开采用以下技术方案：

在本公开的第一个方面，提供一种O-糖基化肽段差向异构体的分离方法，该方法包括：

以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱技术进行分离；其中，以正丙醇(又称1-丙醇)、正丁醇(又称1-丁醇)、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

在本公开的第二个方面，提供一种O-糖基化肽段差向异构体的检测分析方法，该方法包括：

以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱-质谱联用进行分离；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

在本公开的第三个方面，提供一种判断是否含有O-糖基化肽段差向异构体的方法，该方法包括：

以怀疑含有O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱进行测定；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

在本公开的第四个方面，提供一种O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定方法，该方法包括：

以含有至少两种互为O-糖基化蛋白质差向异构体的混合物为待分析样品，对待分析样品进行预处理，产生含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的多种肽段混合液；然后采用所述O-糖基化肽段差向异构体的分离或检测分析方法进行操作，即可实现O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定。

在本公开的第五个方面，提供一种判断是否含有O-糖基化蛋白质差向异构体的方法，该方法包括：

以怀疑含有O-糖基化蛋白质差向异构体的混合物为待分析样品，对待分析样品进行预处理，产生含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的多种肽段混合液；采用差分离子迁移谱进行测定；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)本公开实现了糖肽差向异构体的基线分离，不使用昂贵的分离色谱柱，有机溶剂(即挥发性的有极气体调节剂)的消耗量不超过20微升，绿色环保，分析时间短于超高效液相色谱***，灵敏度高，最高可达到fM级别，样品之间无需对于***的延时冲洗，不存在样品间的交叉污染，操作简便。

(2)蛋白质的O-乙酰氨基葡萄糖化被发现参与多个信号网络，与神经性***疾病(比如阿兹海默氏症等)、自身免疫性疾病等疾病密切相关。而本公开的方法能够检测O-乙酰氨基葡萄糖化的差向异构体蛋白质或多肽，这为研发治疗神经性***疾病等的新药奠定了良好的基础。

(3)本公开首次使用差分离子迁移谱-质谱联用的技术实现了生物体中十分重要的物质-O-糖基化蛋白质或肽段的分离和识别，推动了生物大分子O-糖基化蛋白质或肽段的生物检测技术的发展。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1是本公开三个糖肽的质谱图；

图2是本公开补偿电压随1-丙醇浓度的变化趋势；

图3是本公开补偿电压与调节剂浓度的变化图，(a)1-丁醇；(b)乙腈；(c)1-丙硫醇；

图4是本公开糖肽差向异构体的叠加信号谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

术语解释：

差向异构体：在立体化学中，含有多个手性中心的立体异构体中，只有一个手性中心的构型不同，其余的构型都相同的非对映体叫差向异构体；比如，与葡萄糖互为差向异构体的有：甘露糖(C2)，阿洛糖(C3)，半乳糖(C4)。

O-糖肽键：指单糖的异头碳与羟基氨基酸的羟基O原子共价结合而成的O-糖苷键。

异头碳：单糖由直链变成环状结构时，羰基碳原子成为新的手性中心，导致C1差向异构化，产生两个非对映异构体，其中，在环状结构中，半缩醛碳原子称为异头碳原子。

基线分离、准基线分离：基线分离一般认为是相邻两个峰的分离度大于1.5，或者相邻两峰的峰谷位于基线上，准基线分离可以理解为具备了两个峰基线基本分离的条件。

正如背景技术所介绍的，目前对包含单个差向异构单糖的非对映复合糖异构体仍然不能通过质谱进行区分，为了解决如上的技术问题，在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种O-糖基化肽段差向异构体的分离方法，该方法包括：以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱技术进行分离；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂，纯度为HPLC级别。

在本公开的一个或多个实施方式中，O-糖基化肽段为一个单糖和一段多肽(或称肽段)通过O-糖肽键形成的包含单个差向异构单糖的非对映复合糖异构体，其中，所述单糖包括但不仅仅限于葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基甘露糖、乙酰氨基半乳糖、乙酰氨基阿洛糖，或者是采用其他基团修饰的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖；等等，所述多肽的长度为2～100个氨基酸分子；进一步的，所述多肽的长度为2～50个氨基酸分子；更进一步的，所述多肽的长度为3～25个氨基酸分子，研究发现，此范围长度的糖基化肽段能够更好的实现差向异构体的分离。不同长度的肽段或者特定序列的肽段可以进行制备，主要通过生物方法(比如酶解)、化学方法(比如水解)和/或者物理方法(比如超声波)的方式进行，这属于常规的现有技术，在此不再赘述。

在本公开的一个或多个实施方式中，所述样品可以是生物样品或非生物样品。

生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是，例如，人或其它动物物种。生物样品包括生物体液，诸如全血、血清、血浆、痰、淋巴液、***、***粘液、***物、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊液、泪液、粘液等；生物组织，诸如毛发、皮肤、来自器官或其它机体部分的切片或切除组织；等等。在许多情况下，所述样品是全血、血浆或血清。

非生物样品包括但不限于，例如食品、保健品等，其也可以使用根据本公开所述的原理的O-糖基化肽段进行分析。

在本公开的一个或多个实施方式中，所述差分离子迁移谱技术中，采用电喷雾离子源、正离子模式。经过试验验证，电喷雾电压为3.0～3.5kV，使得目标物信号强度高，更有利于后续的目标物之间的分离。

在本公开的一个或多个实施方式中，所述差分离子迁移谱技术的参数为：平板型电极，平板间距为1.4mm，长度为80mm，宽度为20mm，补偿电压的扫描范围为-50V～+100V，色散场常数设置为127Td。

在本公开的一个或多个实施方式中，所述差分离子迁移谱技术的参数：载气：使用99.999％纯度的氮气；含有气体调节剂的载气的流速在一定程度上影响差向异构体的分离效果，含有气体调节剂的载气流速优选为300mL/min。

在本公开的一个或多个实施方式中，所述差分离子迁移谱技术的参数：待分析样品的进样速度为0.4～0.6μL/min；进一步选择为0.5μL/min。

在本公开的一个或多个实施方式中，气体调节剂的浓度为0.2～0.5％；进一步选择为0.45％。本公开中所述的浓度是指气体调节剂与载气的摩尔比，0.45％即是指气体调节剂与载气的摩尔比为0.45/100。经过试验验证，该浓度范围内的气体调节剂能够保证不同O-糖基化肽段的准基线分离效果。

在本公开的一个或多个实施方式中，当待分析样品为包含葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖的O-糖基蛋白质或肽段时，气体调节剂选择为正丙醇，能够实现O-糖基蛋白质或肽段差向异构体的有效分离。

在本公开的第二个典型的实施方式中，提供一种O-糖基化肽段差向异构体的检测分析方法，目的是鉴定和定量测定每种O-糖基化肽段差向异构体，该方法包括：

以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱-质谱联用进行分离和鉴定；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

在本公开的一个或多个实施方式中，质谱的参数为：选择离子模式选择糖肽的质子化母离子[M+H]⁺：1238.62，采集其质谱信号，离子源的进样流速为：0.5μL/min，加热氮气的温度为：220℃，离子在六极杆中的累积时间为0.5s。

做其他的样品时，这些参数可以根据实际情况优化调整的，并不限定特定数值。

在本公开的一个或多个实施方式中，鉴定时，需建立标准品数据库，获取不同O-糖基化肽段差向异构体在差分离子迁移谱信号峰的最高峰对应的补偿电压值，就可以鉴定出O-糖基化肽段差向异构体的具体种类和含量(通过补偿电压确定分析目标物质的存在，应用峰面积或峰高可进行半定量或定量的测定)。进一步的，标准品溶液的溶剂体系为体积比为50:50的甲醇-水体系，添加0.1v/v％的乙酸。该溶剂体系有利于糖基化肽段的稳定，添加乙酸的目的是促进其离子化，乙酸可以提供质子给糖肽。

在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种判断是否含有O-糖基化肽段差向异构体的方法，该方法包括：

以怀疑含有O-糖基化肽段差向异构体的分析物为待分析样品，采用差分离子迁移谱进行测定；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

在本公开的第四个典型的实施方式中，提供一种O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定方法，该方法包括：

在本公开的一个或多个实施方式中，所述预处理的方法是：通过生物方法(比如酶解)、化学方法(比如水解)和/或者物理方法(比如超声波)将O-糖基化蛋白质降解为多种肽段亦或是具有特定长度的肽段，这属于常规的现有技术技术，在此不再赘述。

在本公开的第五个典型的实施方式中，提供一种判断是否含有O-糖基化蛋白质差向异构体的方法，该方法包括：

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例中所使用的试验器材：所使用的装置采用现有技术中的差分离子迁移谱仪与布鲁克9.4TFTMS质谱仪器相连接。

实施例中所使用的材料：所选的糖肽为EIDYIT(Gal)PAR、EIDYIT(Glc)PAR和EIDYIT(Man)PAR，其中，E-苏氨酸，I-缬氨酸，D-苯丙氨酸，Y-酪氨酸，T-苏氨酸，P-脯氨酸，A-丙氨酸，R-赖氨酸，Gal-半乳糖，Glc-葡萄糖，Man-甘露糖，T(Gal)-在苏氨酸残基上连接半乳糖，T(Glc)-在苏氨酸残基上连接葡萄糖，T(Man)-在苏氨酸残基上连接甘露糖。肽段的氨基酸序列源自蛋白质-精氨酸脱亚胺酶ArginineDeiminase(ADI)。差向异构单糖为葡萄糖、半乳糖和甘露糖，糖基化位点为苏氨酸残基。

实施例1

电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源。将糖肽EIDYIT(Gal)PAR、EIDYIT(Glc)PAR和EIDYIT(Man)PAR分别采用电喷雾质谱(ESI-MS)技术进行测定。

试验条件和参数为：电喷雾电压为3.0kV，选择离子模式选择糖肽的质子化母离子[M+H]⁺：1238.62，采集其质谱信号，离子源的进样流速为：0.5μL/min，加热氮气的温度为：220℃，离子在六极杆中的累积时间为0.5s。

试验结果如图1所示，可见三个糖肽的正离子模式下的电喷雾质谱图，其质子化的母离子[M+H]⁺的质量数完全一致，均为1238.63。其碰撞裂解和电子激发裂解产生的二级谱图碎片离子也一致，可见通过质谱无法实现对于三个糖肽差向异构体的有效区分。

实施例2

配置待分析样品1：

溶剂体系为体积比为50:50的甲醇-水体系，添加0.1v/v％的乙酸(即：体系中含有体积分数为0.1％的乙酸)，加入两种糖肽，使体系中EIDYIT(Gal)PAR和EIDYIT(Glc)PAR的浓度均为1.0μmol/L。

配置待分析样品2：

溶剂体系为体积比为50:50的甲醇-水体系，添加0.1v/v％的乙酸(即：体系中含有体积分数为0.1％的乙酸)，加入两种糖肽，使体系中EIDYIT(Man)PAR和EIDYIT(Glc)PAR的浓度均为1.0μmol/L。

差分离子迁移谱技术参数设置如下：

电喷雾电压为3.0kV，正离子模式。

平板型电极，尺寸为20毫米宽，80毫米长，平板间距为1.4毫米。

补偿电压的扫描范围为-50至+100V，色散场常数设置为127Td。

样品的进样速度为0.5μL/min。

载气：使用99.999％纯度的氮气。

含有气体调节剂的载气流速为300mL/min。

选用气体调节剂添加到差分离子迁移谱仪气路中。

质谱条件：选择离子模式选择糖肽的质子化母离子[M+H]⁺：1238.62，采集其质谱信号，离子源的进样流速为：0.5μL/min，加热氮气的温度为：220℃，离子在六极杆中的累积时间为0.5s。

第一组试验：将浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.45％的1-丙醇作为气体调节剂，将待分析样品1和待分析样品2采用差分离子迁移谱技术进行检测。具体的过程为：将待分析样品离子化后，通过差分离子迁移谱进行分离，然后质谱进行选择离子采集，通过扫描补偿电压，获得补偿电压与调节剂浓度的关系以及相应的分离效果图。

第二组试验：将浓度分别为0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20、0.25、0.30、0.35、0.4％的1-丁醇作为气体调节剂，将待分析样品1采用差分离子迁移谱技术进行检测。

第三组试验：将浓度分别为0、0.05、0.10、0.125、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.4、0.5％的乙腈作为气体调节剂，将待分析样品1采用差分离子迁移谱技术进行检测。

第四组试验：将浓度分别为0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.4％的1-丙硫醇作为气体调节剂，将待分析样品1采用差分离子迁移谱技术进行检测。

试验结果如图2、图3和图4，图2和图3为差分离子迁移谱补偿电压随着载气中气体调节剂浓度的变化关系。

其中，图2(a)为差向异构糖肽EIDYIT(Gal)PAR和EIDYIT(Glc)PAR补偿电压与气体调节剂1-丙醇浓度的关系，随着气体调节剂1-丙醇浓度的逐步增加，这两条糖肽的补偿电压逐步增加，并随着浓度的增加，补偿电压逐步的分离。

图2(b)为差向异构糖肽EIDYIT(Man)PAR和EIDYIT(Glc)PAR补偿电压与1-丙醇调节剂浓度的关系，规律与图2(a)相类似。

图3(a)中采用1-丁醇作为气体调节剂的规律与图2(a)相类似。对于EIDYIT(Gal)PAR，在使用1-丙醇和1-丁醇作为气体调节剂时，会出现两个峰，推测其原因为存在两个质子化母离子的构像。可见，采用醇类(1-丙醇和1-丁醇)作为气体调节剂，随着气体调节剂浓度的增加，糖肽差向异构体通过差分离子迁移谱所需的补偿电压变化影响非常明显，变化量为14-16V之间。采用1-丁醇时，两种糖肽的补偿电压的差别不明显，难以实现分离。

图3(b)为采用乙腈作为气体调节剂的补偿电压变化规律。糖肽差向异构体的补偿电压的变化约为5V，但是对于糖肽差向异构体，两者的补偿电压变化值一致，难以实现分离。

图3(c)采用1-丙硫醇作为气体调节剂，糖肽的补偿电压增加量小于1V。由于对于差向异构体糖肽，两者的变化值一致，难以实现分离。而采用乙腈和丙硫醇时，EIDYIT(Gal)PAR只存在一个峰。

从图2和图3可得，对于采用1-丁醇、乙腈和1-丙硫醇作为气体调节剂，三种糖肽的补偿电压的变化几乎完全相同，难以实现差向异构体的分离。仅采用1-丙醇作为气体调节剂时，可以实现差向异构体的分离。

图4为添加气体调节剂1-丙醇浓度为0.45％时的糖肽差向异构体的叠加电离图。如图4所示，当无气体调节剂添加时(0％)，糖肽差向异构体不能够实现分离；当1-丙醇的浓度为0.45v/v％时，由于补偿电压的变化差异较大，对于糖肽的混合物，可以分别实现差向异构体的准基线分离。

实施例3

本公开同样验证了关于O-乙酰氨基葡萄糖化的差向异构体肽段的分离和鉴定，试验结果表明，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇等为气体调节剂，尤其是正丙醇等，可以有效分离互为差向异构体的O-糖基化肽段(O-乙酰氨基葡萄糖化肽段、O-乙酰氨基半乳糖化肽段、O-乙酰氨基甘露糖化肽段等)，分离效果显著。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种O-糖基化肽段差向异构体的分离方法，其特征是，该方法包括：

以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱技术进行分离；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，O-糖基化肽段为一个单糖和一段多肽通过O-糖肽键形成的包含单个差向异构单糖的非对映复合糖异构体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述单糖为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基甘露糖、乙酰氨基半乳糖或者乙酰氨基阿洛糖；

进一步的，所述多肽的长度为2～100个氨基酸分子；

更进一步的，所述多肽的长度为2～50个氨基酸分子。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述差分离子迁移谱技术中，采用电喷雾离子源、正离子模式；

进一步的，电喷雾电压为3.0～3.5kV。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述差分离子迁移谱技术的参数为：平板型电极，平板间距为1.4mm，长度为80mm，宽度为20mm，补偿电压的扫描范围为-50V～+100V，色散场常数设置为127Td；

进一步的，进样量为20μL；

进一步的，待分析样品的进样速度为0.4～0.6μL/min；

进一步的，气体调节剂的浓度为0.2～0.5％；更进一步选择为0.45％；

进一步的，当待分析样品为包含葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖的O-糖基蛋白质或肽段时，气体调节剂选择为正丙醇。

6.一种O-糖基化肽段差向异构体的检测分析方法，其特征是，该方法包括：

7.如权利要求6所述的检测分析方法，其特征是，质谱的参数为：电喷雾电压为3.0～3.5kV，选择离子模式选择糖肽的质子化母离子[M+H]⁺：1238.62，采集其质谱信号，离子源的进样流速为：0.5μL/min，加热氮气的温度为220℃，离子在六极杆中的累积时间为0.5s。

8.一种判断是否含有O-糖基化肽段差向异构体的方法，其特征是，该方法包括：

以怀疑含有O-糖基化肽段差向异构体的分析物为待分析样品，采用差分离子迁移谱进行判断；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。

9.一种O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定方法，其特征是：该方法包括：

以含有至少两种互为O-糖基化蛋白质差向异构体的混合物为待分析样品，对待分析样品进行预处理，产生含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的多种肽段混合液；然后采用权利要求1～5中任一项所述的O-糖基化肽段差向异构体的分离方法或权利要求6或7所述的检测分析方法进行操作，即可实现O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定。

10.一种判断是否含有O-糖基化蛋白质差向异构体的方法，其特征是，该方法包括：

以怀疑含有O-糖基化蛋白质差向异构体的混合物为待分析样品，对待分析样品进行预处理，产生含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的多种肽段混合液；采用差分离子迁移谱进行判断；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。