CN110585488B - 一种新型复合材料制备的神经修复导管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型复合材料神经修复导管的制备方法，包括以下步骤：获取神经外膜导管；将神经外膜导管进行脱细胞处理，得脱细胞神经外膜导管；将脱细胞神经外膜导管外层裹以高分子材料。通过本发明的方法制备出的神经修复导管，使外膜和神经纤维更好的分离开来，使神经外膜能形成一个良好的管腔结构，在外面裹以一层高分子材料，使导管更加坚韧不易塌陷；供体神经来源更加广泛，根据不同直径要求的神经取材进行制备，适用于修复大间隙神经缺损。

Description

一种新型复合材料制备的神经修复导管及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料和神经修复技术领域，具体涉及一种新型复合材料制备的神经修复导管及其制备方法。

背景技术

外周神经损伤是人体感觉运动障碍和工作效率低下的最常见原因之一。对于简单的外周神经缺损，通过神经残端端端无张力包埋，即可获得良好的功能恢复。然而，大间隙神经缺损的功能重建通常需要使用通过神经移植物(如自体神经移植物)来进行桥接修复。周围神经损伤后，手术的主要内容是恢复其连续性。连续的恢复为向远端生长的芽状再生轴突识别远端神经，并向终末器生长建立了通道。通道的建立才能使远端轴索发生的华勒变性产生大量的雪旺氏细胞,为轴索的再生起到促进作用。为建立通道，目前常用的吻合方法有外膜法,束膜法、少用的有套接法、粘合法、激光法等，但效果大体相同。然而无论用什么吻合方法，都不能在张力下吻合，基于此种情况，目前周围神经损伤最理想的手术方法是自体神经移植，然而由于供体短缺，在临床实践中仍难以广泛应用。经过大量的实验研究，本团队最终研究出联合脱细胞的神经外膜导管和高分子材料（如壳聚糖、PLCL等）制备可供移植修复缺损周围神经的导管的方案，让神经在导管内优良的生长环境进行自然修复，避免了硬性的张力吻合。

专利申请CN106344965A作为最接近的现有技术，公开了制备去细胞神经外膜的制备方法以及运用，该发明制备猪的去细胞神经外膜导管，从孔隙率、溶胀率与体外降解率、细胞毒性试验等方面研究其生物学特性，同时研究其免疫原性；该发明建立大鼠坐骨神经横断伤模型，神经断端行显微外科缝合后，其外裹以去细胞神经外膜，研究其具有促进神经再生、防止神经粘连以及神经瘤形成的作用；该发明提供了一种具有良好的生物学特性和低免疫原性，并能有效地减少周围神经粘连、降低神经瘤发生率的去细胞神经外膜导管，为战创伤性周围神经损伤的修复以及神经损伤后灼性神经痛的治疗提供一种新型修复材料。

然而该发明存在以下不足：

（1）神经外膜导管不规则，不能很好的分离神经外膜和神经束，两者中间有粘连；（2）该专利申请所述去细胞神经外膜很软，机械强度低，仅能做包绕材料，并不能制成供移植修复的神经导管。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供了一种新型复合材料神经修复导管的制备方法，以到达提供具有良好的生物学特性和低免疫原性，有效地减少神经粘连、降低神经瘤发生率，防止导管塌陷的新型异体神经移植修复材料的目的。

本发明采用以下技术方案。

一种新型复合材料神经修复导管的制备方法，包括以下步骤：

（1）获取神经外膜导管；

（2）将神经外膜导管进行脱细胞处理，得脱细胞神经外膜导管；

（3）将脱细胞神经外膜导管外层裹以高分子材料。

所述（1）中，神经外膜导管的获取是将新鲜坐骨神经先冻干，再分离外膜得到的。

所述（2）中，脱细胞处理是先使用4%Triton X-100溶液浸泡10-14h，然后用3%脱氧胆酸钠溶液浸泡20-25h。

所述（3）中，将高分子材料溶于溶剂中配置成5wt%-10wt%纺丝溶液，然后将脱细胞神经外膜导管套在与其直径匹配的金属棒上，然后将金属棒置于静电纺丝装置上，制备外层包绕高分子材料的神经导管。配置成5wt%-10wt%的纺丝溶液，若溶液浓度超过10%，纺丝纤维直径大小不均匀，溶液粘稠不易形成“泰勒椎”；若浓度小于5%，纺丝纤维中会出现液滴，且纤维直径较小。

静电纺丝参数是电压5-15KV，推注速度为0.03-0.5mm/min。

所述高分子材料为合成类材料或天然生物材料。

所述合成类材料优选为聚酯类材料。

所述聚酯类材料为PLCL。

所述天然生物材料为壳聚糖、胶原或海藻酸中的一种或几种。

所述溶剂为三氟乙醇、六氟异丙醇或冰醋酸。

本发明与现有技术相比，其区别和优势在于：（1）本发明制备的是供神经修复的桥接导管，可以用来修复大间隙神经缺损，是一种异体神经移植修复材料；（2）本发明制备神经外膜导管的过程是采用先冻干再分离外膜，这样能使外膜和神经纤维更好的分离开来，使神经外膜能形成一个良好的管腔结构；（3）本发明在完成脱细胞神经外膜导管的制备后，在外面裹以一层高分子材料，可为合成类材料（如聚酯类材料）以及天然生物材料（如壳聚糖、胶原、海藻酸等），从而使导管更加坚韧，并且移植后不易塌陷；（4）供体神经来源更加广泛，根据不同直径要求的神经可以从不同动物或者同一动物的不同部位取材进行制备。

说明书附图。

图1为新鲜猪完整的神经外膜导管图。

图2为新鲜猪神经外膜导管脱细胞后HE染色图。

图3为脱细胞猪神经外膜导管外层裹以PLCL图。

图4为动物实验神经修复图。

具体实施方式

实施例1。

1、制备哺乳动物脱细胞神经外膜导管（以下方法以猪坐骨神经为例说明）。

（1）制备哺乳动物神经外膜导管（采取两种方法来制备导管）。

方法一：将新鲜猪坐骨神经横切为2-3cm小段，置于-80℃冷冻3h后，利用冻干机进行冻干，冻干后的坐骨神经稍浸水后，借助显微镊和显微剪剥离神经外膜和内部的神经纤维结构，最终保留神经外膜，形成完整的神经外膜导管（见图1）。

方法二：获取新鲜坐骨神经之后，直接用显微镊将神经外膜剥离下来，翻转内外面后获得神经外膜导管。

（2）神经外膜导管脱细胞处理。

将得到的神经外膜导管使用4%Triton X-100溶液和3%脱氧胆酸钠溶液分别浸泡12h和24h，最终经HE染色显示，细胞结构基本已被去除，表示脱细胞效果良好（见图2）。

（3）联合应用高分子材料。在已经制备好的脱细胞神经外膜导管外部包绕一层以PLCL为溶剂的静电纺丝材料，旨在支撑神经外膜导管，防止移植后塌陷（以聚酯类材料为例说明）。

配置PLCL溶液：本实验称取0.5g PLCL固体材料，用5ml三氟乙醇、六氟异丙醇或冰醋酸为溶剂，放在磁力搅拌器上搅拌12小时，直至完全溶解，配置成5ml 10%的纺丝溶液，然后将所述（2）制备出来的脱细胞神经外膜导管套在与其直径接近的金属棒上，按说明安装在静电纺丝装置上，纺丝参数是电压5-15KV，推注速度为0.03-0.5mm/min。制成外层包绕plcl的神经导管(图3)。

2、生物学特性研究。

浸提液MTT比色法：将材料用 10％胎牛血清 +DMEM 培养基进行浸泡，培养24h，制成浸提液。将培养的雪旺细胞制成单细胞悬液，在 24孔培养 板上每孔接种100μl后，培养24h ；去掉培养液，于其中12孔中每孔加入100μl 材料浸提液，作为实验组；另外12孔加入新的10％胎牛血清 +DMEM 培养液，作为对照组，于接种 48h 后，每孔再加入 MTT 50μl，继续培养 3h，吸除孔内培养液， 立即加入DMSO(二甲基亚砜)，每孔 150μl，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。根据细胞相对增殖率评定材料的毒性程度。结果显示，复合材料神经修复导管的细胞存活率近似于对照组细胞存活率。

3、移植体内的动物实验（修复神经）。

通过上述步骤1中所述的方法，制备直径约1mm，长度1cm的复合神经导管，建立SD大鼠坐骨神经横断模型，具体实施方法如下：

SD大鼠股外侧行斜形皮肤切口，显露坐骨神经，分为2组。第一组：切除坐骨神经约1cm节段，将制备完成的复合神经导管分别连接到受体大鼠的近端和远端神经残端，从而达到桥接的目的。第二组：直接横断坐骨神经，再通过显微镜下操作缝合神经断端，达到自体神经移植的效果。手术后观察12周，通过肌力测定、步态分析、电生理检测检测坐骨神经修复效果。结果显示：复合材料移植组和自体移植组的神经修复效果没有差异（图4）。

实施例2。

1，制备哺乳动物神经外膜导管（采取两种方法来制备导管）。

方法一：将新鲜猪坐骨神经横切为2-3cm小段，置于-80℃冷冻3h后，利用冻干机进行冻干，冻干后的坐骨神经稍浸水后，借助显微镊和显微剪剥离神经外膜和内部的神经纤维结构，最终保留神经外膜，形成完整的神经外膜导管。

方法二：获取新鲜坐骨神经之后，直接用显微镊将神经外膜剥离下来，翻转内外面后获得神经外膜导管。

2，神经外膜导管脱细胞处理。

将得到的神经外膜导管使用4%Triton X-100溶液和3%脱氧胆酸钠溶液分别浸泡12h和24h，最终经HE染色显示，细胞结构基本已被去除，表示脱细胞效果良好。

3，联合应用高分子材料。在已经制备好的脱细胞神经外膜导管外部包绕一层以壳聚糖溶液，用以增强神经外膜导管的韧性。具体以壳聚糖溶液包绕的神经外膜导管的制备方法如下：

本实验采用脱乙酰度≥90%的壳聚糖用以溶解，因为脱乙酰度越大，溶解度越高。称取10g壳聚糖将其溶于1000ml 0.2M的乙酸溶液中，使其充分溶解，最终制备成为1%浓度的壳聚糖溶液。将制备完成的脱细胞神经外膜套在与其直径相仿的金属棒上，在神经外膜上均匀的沾上壳聚糖溶液，然后立即放入1%浓度的NaOH溶液中，静置3分钟，取出后，再重复两次，最后晾干，即可制成壳聚糖包裹的神经外膜导管。

对比实施例1和例2：经静电纺丝制备出来的神经外膜导管比较有韧性，弹性较大，而壳聚糖包裹的神经外膜导管比较脆，但是制作简单，耗时较短。两者移植体内效果相似，均能为神经外膜提供良好的支撑作用，从而修复神经缺损。

对比例1。

（1）制备哺乳动物神经外膜导管（采取两种方法来制备导管）

方法一：将新鲜猪坐骨神经横切为2-3cm小段，置于-80℃冷冻3h后，利用冻干机进行冻干，冻干后的坐骨神经稍浸水后，借助显微镊和显微剪剥离神经外膜和内部的神经纤维结构，最终保留神经外膜，形成完整的神经外膜导管。

方法二：获取新鲜坐骨神经之后，直接用显微镊将神经外膜剥离下来，翻转内外面后获得神经外膜导管。

（2）神经外膜导管脱细胞处理。

将得到的神经外膜导管使用4%Triton X-100溶液和3%脱氧胆酸钠溶液分别浸泡12h和24h，最终经HE染色显示，细胞结构基本已被去除，表示脱细胞效果良好。

（3）移植体内的动物实验（修复神经）。

通过上述步骤所述的方法，制备直径约1mm，长度1.5cm的脱细胞神经导管，建立SD大鼠坐骨神经横断模型，具体实施方法如下：

SD大鼠股外侧行斜形皮肤切口，显露坐骨神经，分为2组。第一组：切除坐骨神经约1cm节段，将制备完成的脱细胞神经导管分别连接到受体大鼠的近端和远端神经残端，从而达到桥接的目的。第二组：直接横断坐骨神经，再通过显微镜下操作缝合神经断端，达到自体神经移植的效果。手术后观察12周，通过肌力测定、步态分析、电生理检测检测坐骨神经修复效果。结果显示：自体移植组的神经修复效果明显，而脱细胞神经导管组因导管塌陷导致坐骨神经无法完成再生。

从上述实验中可以得到本发明的新型复合材料神经修复导管在周围神经修复中具有优越性。

（1）供体来源广泛，可以使用多种哺乳动物的各种部位的神经组织制备导管。

（2）采用改良脱细胞方法，脱细胞时间减少，但去除了细胞结构，清除了抗原成分，保留了导管的三维结构，使其能够完整的作为轴突再生的支架结构。

（3）通过与高分子材料生物材料的联合应用，使得导管的结构更为坚韧，移植入体内后，不易塌陷，为神经轴突的再生和延申提供了良好的空间结构。

Claims (9)

1.一种新型复合材料神经修复导管的制备方法，包括以下步骤：

（1）获取神经外膜导管：将新鲜猪坐骨神经横切为2-3cm小段，置于-80℃冷冻3h后，利用冻干机进行冻干，冻干后的坐骨神经稍浸水后，借助显微镊和显微剪剥离神经外膜和内部的神经纤维结构，最终保留神经外膜，形成完整的神经外膜导管；

（2）将神经外膜导管进行脱细胞处理，得脱细胞神经外膜导管；

（3）将脱细胞神经外膜导管外层裹以高分子材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述（2）中，脱细胞处理是先使用4%Triton X-100溶液浸泡10-14h，然后用3%脱氧胆酸钠溶液浸泡20-25h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述（3）包括以下步骤：

将高分子材料溶于溶剂中配置成5wt%-10wt%纺丝溶液，然后将脱细胞神经外膜导管套在与其直径匹配的金属棒上，然后将金属棒置于静电纺丝装置上，制备外层包绕高分子材料的神经导管。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为三氟乙醇、六氟异丙醇或冰醋酸。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，纺丝参数是电压5-15kV，推注速度为0.03-0.5mm/min。

6.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述高分子材料为合成类材料或天然生物材料。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述合成类材料为聚酯类材料。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述聚酯类材料为PLCL。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述天然生物材料为壳聚糖、胶原或海藻酸中的一种或几种。

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