CN110582576B - 在生物学反应中具有改性的表面反应性和抗污性的基板 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备样品槽的表面的方法。在一些方面，制备样品槽表面的方法涉及使该样品槽与嵌段共聚物接触，以在该样品槽的金属氧化物表面上方形成抗污性覆盖。在一些方面，提供了对样品槽表面进行钝化和/或选择性功能化的方法。

Description

在生物学反应中具有改性的表面反应性和抗污性的基板
相关申请
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2017年5月5日递交的美国临时专利申请No.62/502,525的优先权，在此以引用的方式将该申请全文并入。
技术领域
本申请总体上针对经选择性改性的基板表面部分及其制备方法。本文所提供的技术的方面涉及改变样品槽表面的一个或多个所需部分的反应性。在一些方面，本公开提供了对样品槽的一个或多个表面部分进行选择性改性的方法。
背景技术
微阵列被广泛用作单分子分析中的工具，这些分析包括核酸分析、核酸测序、基因表达分析、基因分型、突变分析、肽分析、肽测序和药物筛选。微阵列一般形成在玻璃、金属、塑料或其他基板的表面上，可以包括经选择性改性的表面部分，使得这些部分对所需化学物质具有更高的反应性或更低的反应性。例如，单分子分析可能需要将所关注的分子限制到基板的所需区域以用于检测或观察。在一群非特异性结合的分子处于此类区域内的情况下，在分析期间滤除干扰信号可能具有挑战性，并且可通过促进总体统计分析而减小结果的准确度。
发明内容
本文所公开的技术的方面涉及生成样品槽表面的选择性功能化部分的方法，以及包含其的装置。在一些实施方案中，本文提供了制备样品槽的经钝化的表面部分的方法。在一些实施方案中，本公开提供了制备具有抗污特性的样品槽的经钝化的表面部分的方法。在一些实施方案中，本公开涉及钝化样品槽的金属氧化物表面部分，以促进样品槽的二氧化硅表面部分的选择性功能化。在一些实施方案中，本公开中所提供的技术可用于将所关注的分子限制到样品槽的所需区域。
在一些方面，本发明提供了对样品槽的表面进行选择性功能化的方法，其涉及使具有第一表面和第二表面的样品槽与嵌段共聚物接触，该嵌段共聚物优先与第一表面上的涂层结合。在一些实施方案中，使样品槽与嵌段共聚物接触，该嵌段共聚物的量足以在第一表面上方形成抗污性覆盖。在一些实施方案中，方法进一步涉及使样品槽与功能化剂接触，该功能化剂优先与第二表面结合，以产生功能化的第二表面，其中功能化剂包含偶合部分。在一些实施方案中，在与功能化剂接触之前，使样品槽与嵌段共聚物接触。在一些实施方案中，在与嵌段共聚物接触之前，使样品槽与功能化剂接触。
在一些实施方案中，第一表面是金属或金属氧化物表面。在一些实施方案中，第一表面是塑料表面(例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、或其组合)。在一些实施方案中，第二表面是二氧化硅表面。在一些实施方案中，第一表面是金属氧化物表面且第二表面是二氧化硅表面。在一些实施方案中，涂层包含两亲性试剂。
在一些方面，本公开提供了使样品槽的二氧化硅表面功能化的方法，其涉及使具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样品槽与嵌段共聚物接触，该嵌段共聚物优先与金属氧化物表面上的涂层结合。在一些实施方案中，使样品槽与嵌段共聚物接触，该嵌段共聚物的量足以在金属氧化物表面上方形成抗污性覆盖。在一些实施方案中，方法进一步涉及使样品槽与功能化剂接触，该功能化剂优先与二氧化硅表面结合，以产生功能化的二氧化硅表面。在一些实施方案中，功能化剂包含偶合部分。在一些实施方案中，在与功能化剂接触之前，使样品槽与嵌段共聚物接触。在一些实施方案中，在与嵌段共聚物接触之前，使样品槽与功能化剂接触。
在一些实施方案中，方法进一步包括使样品槽与两亲性试剂接触，该两亲性试剂优先与金属氧化物表面结合，以在金属氧化物表面上形成涂层。在一些实施方案中，两亲性试剂包含被配置为优先与金属氧化物表面结合的亲水性头基和被配置为优先与嵌段共聚物结合的疏水性尾基。
在一些实施方案中，亲水性头基包含硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、羟基、儿茶酚酸盐、异氰酸盐、异羟肟酸盐、或羧基官能团。在一些实施方案中，亲水性头基包含羰基、氨基、硫氢基、醚、酯、磷酸二酯、糖苷或羧酸酰胺官能团。在一些实施方案中，疏水性尾基包含C1-C30烷基链。在一些实施方案中，疏水性尾基选自：经取代或未经取代的亚烷基；经取代或未经取代的亚烯基；经取代或未经取代的亚炔基；经取代或未经取代的亚杂烷基；经取代或未经取代的亚杂烯基；经取代或未经取代的亚杂炔基；经取代或未经取代的亚杂环基；经取代或未经取代的亚碳环基；经取代或未经取代的亚芳基；经取代或未经取代的亚杂芳基；以及其组合。在一些实施方案中，疏水性尾基包含多氟化的碳链。
在一些实施方案中，两亲性试剂包含式CH3(CH2)nPO3H2的烷基膦酸化合物，其中n是值为1-30的整数。在一些实施方案中，两亲性试剂包含己基膦酸、辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、聚乙烯膦酸、12-膦酰基-1-十二烷磺酸、10-十一炔基膦酸或十七氟癸基膦酸。在一些实施方案中，两亲性试剂包含氟表面活性剂。在一些实施方案中，氟表面活性剂是式CF3(CF2)nZ的化合物，其中n是值为1-30的整数且Z是亲水性头基。
在一些实施方案中，两亲性试剂的疏水性尾部包含共价偶合的部分。在此类实施方案中，方法进一步包含使样品槽与聚合化合物接触，该聚合化合物被配置为与共价偶合的部分结合，从而使聚合化合物共价附着至金属氧化物表面上的两亲性试剂。在一些实施方案中，两亲性试剂包含式Y(CH2)nPO3H2的烷基膦酸化合物，其中n是值为1-30的整数，且Y是共价偶合的部分。在一些实施方案中，共价偶合的部分包含氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。
在一些实施方案中，嵌段共聚物是包含A嵌段和B嵌段的A-B-A型嵌段共聚物。在一些实施方案中，涂层优先与A-B-A型嵌段共聚物的B嵌段结合(例如以形成抗污性覆盖)。在一些实施方案中，B嵌段的疏水性高于A嵌段。在一些实施方案中，A嵌段包含第一聚醚嵌段且B嵌段包含第二聚醚嵌段，其中第二聚醚嵌段的疏水性高于第一聚醚嵌段的疏水性。
在一些实施方案中，A-B-A型嵌段共聚物是式I化合物：
(Aa)(Bb)(Aa)(式I)，
其中A是包含A嵌段的聚醚化合物的单体单元；a是值为2-150的整数；B是包含B嵌段的聚醚化合物的单体单元；且b是值为10-100的整数。
在一些实施方案中，A嵌段包含聚环氧乙烷且B嵌段包含聚环氧丙烷。在一些实施方案中，A-B-A型嵌段共聚物是式II化合物：
其中a是值为2-150的整数；且b是值为10-100的整数。
在一些实施方案中，金属氧化物表面是氧化铝、氧化钛、氧化锆、氧化铁、氧化锡或氧化钽。
在一些实施方案中，功能化剂包含硅烷化合物。在一些实施方案中，硅烷化合物包含单乙氧基硅烷、甲氧基硅烷、二乙氧基硅烷、三氯硅烷或二乙氧基、甲氧基硅烷。在一些实施方案中，硅烷化合物包含硅烷-PEG化合物。在一些实施方案中，硅烷化合物包含巯基-硅烷或氨基-硅烷化合物。
在一些实施方案中，功能化剂的偶合部分包含生物素分子、亲和素蛋白质、链霉亲和素蛋白质、凝集素蛋白质或SNAP标签。在一些实施方案中，功能化剂的偶合部分包含氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。
在一些实施方案中，方法进一步包含在适合于允许所关注的分子与偶合部分结合的条件下，使具有功能化的二氧化硅表面的样品槽与所关注的分子接触，该所关注的分子被配置为与偶合部分结合，从而使所关注的分子偶合至功能化的二氧化硅表面。
在一些实施方案中，样品槽与所关注的分子的接触发生在样品槽与功能化剂的接触之后，无中间洗涤步骤。在一些实施方案中，样品槽与所关注的分子的接触发生在样品槽与嵌段共聚物的接触之后，无中间洗涤步骤。在一些实施方案中，使样品槽与嵌段共聚物和功能化剂在独立的接触步骤中接触且无中间洗涤步骤。
在一些实施方案中，所关注的分子包含聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是T4 DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是T7 DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是phi29 DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是M2Y DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是铜绿蝇(Lucilia cuprina)的DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所关注的分子是测序模板复合物，其包含具有杂交的引物/聚合酶复合物的模板核酸分子。在一些实施方案中，模板核酸分子为约1kb至约5kb、约5kb至约10kb、约10kb至约15kb、约15kb至约20kb或约20kb至约25kb。在一些实施方案中，核酸分子为约25kb至约50kb、约50kb至约100kb、约100kb至约250kb、约250kb至约500kb或约500kb至约1000kb。
在一些实施方案中，所关注的分子以相对于金属氧化物表面(例如包含嵌段共聚物和/或涂层的金属氧化物表面)约100倍至约1000倍选择性、约200倍至约800倍选择性、约400倍至约600倍选择性、或约1000倍至约2000倍选择性优先与功能化的二氧化硅表面结合。
在一些实施方案中，和不与嵌段共聚物接触的样品槽相比，所关注的分子对功能化的二氧化硅表面相对于对金属氧化物表面(例如包含嵌段共聚物和/或涂层的金属氧化物表面)的选择性高约10倍至约100倍、约50倍至约500倍、约100倍至约1000倍或约200倍至约400倍。
在一些实施方案中，本文中提供的方法进一步包括使所关注的分子进行测序反应。在一些实施方案中，本文中提供的方法进一步包括使所关注的分子(例如测序模板复合物)进行下一代测序技术。
在一些方面，本公开提供了包含基板(例如固体支持物)的集成装置，该基板包含具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样品槽。在一些实施方案中，集成装置进一步包含金属氧化物表面上的涂层，该涂层是由包含亲水性头基和疏水性尾基的两亲性试剂形成的。在一些实施方案中，两亲性试剂通过亲水性头基结合至金属氧化物表面。在一些实施方案中，集成装置进一步包含涂层上的抗污性覆盖，该抗污性覆盖是由包含A嵌段和B嵌段的A-B-A型嵌段共聚物形成的。在一些实施方案中，A-B-A型嵌段共聚物经由B嵌段结合至涂层。在一些实施方案中，集成装置进一步包含结合至二氧化硅表面的功能化剂。在一些实施方案中，功能化剂包含偶合部分。
在一些实施方案中，基板包含样品槽的阵列，每个样品槽具有金属氧化物表面和二氧化硅表面。
在一些实施方案中，样品槽包含形成于基板的表面处的顶部缝隙和远离基板的表面的底表面。在一些实施方案中，底表面由二氧化硅表面构成。
在一些实施方案中，与二氧化硅表面结合的功能化剂的偶合部分包含生物素分子、亲和素蛋白质、链霉亲和素蛋白质、凝集素蛋白质或SNAP标签。在一些实施方案中，与二氧化硅表面结合的功能化剂的偶合部分包含氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。
在一些实施方案中，集成装置被配置为与下一代测序仪器接合。
附图的简要说明
熟练技术人员会理解，本文所描述的附图仅用于说明性目的。应理解，在一些情况下，为辅助理解本发明，本发明的各种方面可能经放大或扩大显示。在附图中，在通篇各幅图中，相似的附图标记一般是指相似的特征、功能上类似和/或结构上类似的单元。附图不一定是按比例的，相反，提供重点描述以说明各种教导的原理。附图不意欲以任何方式限制本教导内容的范围。
从下文给出的详细说明与附图的结合，本发明的特征和优点将变得更显而易见。
当参考附图来描述实施方案时，可使用方向参考(“以上”、“以下”、“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“水平”、“垂直”等)。此类参考仅意欲作为读者在正常方向观看附图的辅助。这些方向参考不意欲描述所实施的装置的优选的或唯一的定向。装置可以其他定向来实施。
从详细的实施方式中显而易见的是，在整个本申请中，在图(例如图1-9)中描绘并出于说明的目的进一步描述的实例描述了非限制性实施方案，且在一些情况下可出于更清楚说明的目的简化某些方法或省略特征或步骤。
图1描绘了样品槽的横截面视图。
图2A和2B说明对样品槽的二氧化硅表面部分进行选择性功能化的方法的工作流程。
图3描绘了其中通过在基板的金属氧化物表面部分上形成抗污性覆盖而对基板的二氧化硅表面部分进行选择性功能化的方法。
图4描绘了通过基板的金属氧化物部分上生成接枝的聚合物钝化层来使金属氧化物表面钝化的方法。
图5描绘了嵌段共聚物的非限制性配置。
图6提供了润湿性实验的成像结果。
图7提供了结合选择性分析的成像结果。
图8描绘了得自荧光分析的结果的读数和图示。
图9描绘了测序反应的结果，该测序反应使用集成装置进行，该集成装置具有根据本文中所描述的一些实施方案选择性功能化的表面。
详细说明
本发明的方面涉及具有经选择性改性的表面部分的样品槽及其制备方法。在一些方面，本发明提供对具有第一表面部分和第二表面部分的样品槽的表面部分进行改性的方法。在一些实施方案中，使样品槽与两亲性试剂接触，该两亲性试剂优先与第一表面部分结合，以在第一表面部分上形成涂层。在一些实施方案中，使样品槽与嵌段共聚物接触，该嵌段共聚物优先与第一表面部分上的涂层结合(例如以在第一表面部分上方形成抗污性覆盖)。在一些实施方案中，使样品槽与功能化剂接触，该功能化剂优先与第二表面部分结合，以产生功能化的第二表面部分。在一些实施方案中，第一表面部分是塑料表面且第二表面部分是二氧化硅表面。在一些实施方案中，第一表面部分是金属氧化物表面且第二表面部分是二氧化硅表面。
在其他方面，本发明提供了制备具有经选择性改性的表面部分的样品槽的方法。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于钝化具有由金属氧化物构成的表面部分以及由二氧化硅构成的表面部分的样品槽的金属氧化物表面。在一些实施方案中，本发明提供了生成具有抗污特性的经钝化的金属氧化物表面的方法。在一些实施方案中，本文中所描述的经钝化的金属氧化物表面可用于促进样品槽的二氧化硅表面部分的选择性功能化。在一些实施方案中，样品槽的经选择性改性的表面部分可用于促进将所关注的分子限制到样品槽的所需区域。
在某些技术中，单分子分析涉及将所关注的分子限制到样品槽的所需区域，在该区域中单分子观测和/或信号检测是最优的。将所关注的分子限制到所需区域内可通过对样品槽的表面部分进行选择性改性来达成。例如，所需区域中的表面部分被功能化以保留所关注的分子，而所需区域外部的表面部分不被功能化。此类选择性功能化可通过钝化所需区域外部的表面部分使其对功能化具有惰性来达成。
表面钝化一般是指其中使表面对环境具有更低反应性的方法。例如，在一些实施方案中，在可能需要相对于第一表面而对基板的第二表面进行选择性功能化的情况下，可钝化第一表面以使其不能功能化或对功能化具有高度抵抗性。常规的表面钝化技术可涉及使用形成自组装单层的组合物，其通常由于单层中的各种缺陷而产生不完美覆盖的表面。在实践中，这些缺陷提供可发生功能化的暴露表面的位点。本发明人已认识到且了解，这些以及其他限制可使用有效隐藏单层缺陷的试剂来解决。本发明人已进一步认识到且进一步了解，这些试剂中的某些在钝化表面上赋予抗污特性，这可有利地应用于生物反应的情形下。
本公开的方面涉及样品槽的表面部分的选择性改性。在一些实施方案中，样品槽包含具有不同化学组合物的至少两个表面部分。例如，根据本申请的一些非限制性实施方案，图1描绘了由集成装置100构成的样品槽180的横截面视图。样品槽180可包含由开口界定的小体积或区域，该开口形成于金属层104处且延伸进入集成装置100的二氧化硅层106中。样品槽180可具有至少部分地被金属氧化物涂层102覆盖的一个或多个侧壁。在一些实施方案中，金属氧化物涂层可根据本文中所描述的技术而被钝化以产生钝化涂层108。在一些实施方案中，钝化涂层108可使金属氧化物涂层102对功能化剂130具有惰性。以此方式，功能化剂130优选与二氧化硅层106结合。在一些实施方案中，功能化剂130包含被配置为与所关注的分子190结合的偶合部分。因此，二氧化硅层106的经选择性功能化的表面允许将所关注的分子190限制到接近于样品槽180的底表面的区域。在一些实施方案中，钝化涂层108包括涂层和/或抗污性覆盖，以降低与侧壁相互作用或粘附至侧壁的所关注的分子190的量。在一些实施方案中，涂层和/或抗污性覆盖降低或消除生物反应中的组分对侧壁的粘附。
在一些实施方案中，可根据图2A中描绘的工作流程来制备具有经选择性改性的表面部分的样品槽。如图所示，具有金属氧化物表面202和二氧化硅表面206的样品槽经受钝化步骤(i)，以在金属氧化物表面上产生涂层210。在一些实施方案中，通过使样品槽与两亲性试剂接触(该两亲性试剂优先与金属氧化物表面结合)来形成涂层210。然后，可以在步骤(ii)中使样品槽暴露于嵌段共聚物，以在金属氧化物表面上方产生抗污性覆盖220。在一些实施方案中，通过使样品槽与嵌段共聚物接触(该嵌段共聚物优先与金属氧化物表面上的涂层结合)来形成抗污性覆盖220。可以使样品槽进一步经受功能化步骤(iii)以产生功能化的二氧化硅表面230。在一些实施方案中，通过使样品槽与功能化剂接触(该功能化剂优先与二氧化硅表面结合)来形成功能化的二氧化硅表面230。
应理解，在一些实施方案中，图2A的方法中的步骤顺序可不同于所示出的步骤顺序。例如，在一些实施方案中，可根据图2B中描绘的工作流程来制备具有经选择性改性的表面部分的样品槽。如图所示，使具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样品槽经受钝化步骤(i)，以在金属氧化物表面上产生涂层。可以使具有涂层的样品槽进一步经受功能化步骤(ii)，以产生功能化的二氧化硅表面。然后可以在步骤(iii)中使样品槽暴露于嵌段共聚物，以在金属氧化物表面上方产生抗污性覆盖。图2A和2B中所示的方法描绘具有特定表面组合物(例如金属氧化物表面和二氧化硅表面)的样品槽的实例。应理解，在一些实施方案中，这些图中所描绘以及本文中其他地方所描述的技术可用于具有不同表面组合物的样品槽。例如，在一些实施方案中，表面202可为塑料表面。塑料表面的实例包括(作为实例而非限制)聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯及其组合。
在一些实施方案中，功能化剂能够与样品槽上的多种表面组合物结合，例如功能化剂能够与金属氧化物或二氧化硅表面组合物中的每一种结合。在此类实施方案中，本文中所描述的技术可有利地用于将功能化剂的结合限制于样品槽的所需区域或指定表面组合物。例如，在一些实施方案中，样品槽的金属氧化物表面可被钝化，以防止或限制金属氧化物表面上的功能化的程度-随后将功能化限制于样品槽的不同表面(例如二氧化硅表面)。在一些实施方案中，钝化涂层的缺陷可产生暴露的金属氧化物表面的位点，其可导致金属氧化物表面的不期望的功能化。在一些实施方案中，本文中所描述的技术能够隐藏钝化涂层中的暴露的金属氧化物表面的位点，以高选择性地促进二氧化硅表面的功能化。
在一些方面，本文中所描述的方法涉及使具有金属氧化物表面部分和二氧化硅表面部分的样品槽与嵌段共聚物接触，该嵌段共聚物优先与金属氧化物表面上的涂层结合，以形成抗污性覆盖。在一些实施方案中，抗污性覆盖弥补涂层中的缺陷。在一些实施方案中，涂层包含单层。如本文所用，“单层”指代具有单分子厚度的层。在一些实施方案中，术语“单层”与“自组装单层”(self-assembled monolayer；“SAM”)互换使用，后者指代其中分子通过吸附(例如化学吸附、物理吸附)在表面上自发形成组件的自组装过程。在该分子组装过程中，可能由于各种内部因素(例如形成物的热动力学、被吸附物的化学特性)或外部因素(例如表面上的缺陷、杂质)而在单层中出现缺陷。在一些实施方案中，单层中的缺陷产生暴露的表面的位点。在一些实施方案中，本公开提供了使用抗污性覆盖隐藏此类缺陷位点的方法。
例如，图3描绘了其中抗污性覆盖形成为经钝化的金属氧化物表面部分的一部分以使功能化剂与二氧化硅表面部分选择性结合的方法。在一些实施方案中，具有金属氧化物表面302和二氧化硅表面304的基板(例如样品槽)包括金属氧化物表面302上的涂层310。在一些实施方案中，金属氧化物表面302由氧化铝、氧化钛、氧化锆、氧化铁、氧化锡或氧化钽构成。在一些实施方案中，涂层310是使用两亲性试剂形成的，该两亲性试剂具有疏水性尾部314以及优先与金属氧化物表面302结合的亲水性头基316。在一些实施方案中，两亲性试剂在金属氧化物表面302上形成分子组装。如图所示，在一些实施方案中，可在由两亲性试剂形成的涂层310的自组装期间在单层中形成一个或多个缺陷318。在一些实施方案中，使基板(例如样品槽)经受钝化步骤(i)，该钝化步骤(i)涉及使基板与嵌段共聚物322接触，该嵌段共聚物优先与金属氧化物表面302上的涂层310结合，以在金属氧化物表面302上方形成抗污性覆盖320。在一些实施方案中，如图3中所说明的，形成于嵌段共聚物与涂层之间的相互作用的性质和/或程度有效地覆盖缺陷位点。
在一些实施方案中，嵌段共聚物322是具有A嵌段324和B嵌段326的A-B-A型嵌段共聚物。在一些实施方案中，涂层310优先与A-B-A型嵌段共聚物的B嵌段326结合。在一些实施方案中，B嵌段326相对于A嵌段324是疏水的。在此类实施方案中，B嵌段326可基于疏水性作用形成与涂层310的疏水性尾基314的相互作用。疏水性作用一般是指非极性分子聚集于水溶液中且排斥水分子的倾向。因此，在涂层310的疏水性尾基314以其他方式暴露于水溶剂时，涂层310优先与嵌段共聚物322在疏水性更高的B嵌段326处缔合。在一些实施方案中，B嵌段的疏水性高于A嵌段，且A和B分别具有适合的聚合度，使得在水溶液中在25℃下存在0.01wt％至10wt％之间或等于0.01wt％和10wt％(例如0.01wt％至1wt％之间或等于0.01wt％和1wt％)的临界胶束浓度。术语“临界胶束浓度”具有其在本领域中的一般含义且可指代一种浓度，在等于或高于该浓度下，对于(A嵌段的聚合度)与(B嵌段的聚合度)的某些比值形成稳定胶束(例如持久胶束)。临界胶束浓度可通过本领域技术人员已知的方法测量且包括但不限于表面张力测量或动态光散射测量。在一些实施方案中，由抗污层320提供的暴露的金属氧化物表面302的额外覆盖促进二氧化硅表面304的选择性功能化。
如图3所示，在一些实施方案中，本文中所描述的方法可包括使具有抗污性覆盖320的基板(例如样品槽)与优先与二氧化硅表面304结合的功能化剂332接触的步骤。在一些实施方案中，功能化剂332能够与金属氧化物表面302或二氧化硅表面304结合。然而，在一些实施方案中，金属氧化物表面302被制备成具有钝化层330，该钝化层防止功能化剂332与金属氧化物表面302结合，总是促进其与二氧化硅表面304的选择性结合以产生功能化的二氧化硅表面。在一些实施方案中，功能化剂332包含能够与二氧化硅表面304结合的硅烷化合物。在一些实施方案中，硅烷化合物包含单乙氧基硅烷、甲氧基硅烷、二乙氧基硅烷、三氯硅烷或二乙氧基、甲氧基硅烷。
在一些实施方案中，功能化剂332包含偶合部分334。在一些实施方案中，偶合部分334可用于将所关注的分子连接至二氧化硅表面304。在一些实施方案中，偶合部分334可为非共价结合对的第一搭配物。以此方式，在一些实施方案中，包含非共价结合对的第二搭配物的所关注的分子可经由非共价连接而连接至二氧化硅表面304。在一些实施方案中，功能化剂332的偶合部分334可为生物素分子、亲和素蛋白质、链霉亲和素蛋白质、凝集素蛋白质、或SNAP标签。在一些实施方案中，偶合部分334可为共价结合对(例如反应性化学基团)的第一搭配物。以此方式，在一些实施方案中，包含共价结合对的第二搭配物的所关注的分子可经由共价连接而连接至二氧化硅表面304。在一些实施方案中，功能化剂332的偶合部分334可为氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。在一些实施方案中，偶合部分334与点击化学共轭技术兼容。能够在点击化学中共轭的反应性化学基团是本领域中已知的，例如New,K.,等人(2009)Cancer Biother.Radiopharm.24(3):289-302；Thirumurugan,P.,等人(2013)Chem.Rev.113(7):4905-4979，其内容以引用的方式全文并入本文中。在一些实施方案中，图3中描绘的方法进一步包含使样品槽与两亲性试剂接触以在金属氧化物表面302上形成涂层310的步骤。
两亲性试剂&涂层
如本文所用，“两亲性试剂”指代可用于在金属氧化物表面上产生涂层的试剂。在一些实施方案中，两亲性试剂是被视为两亲性的分子，因为该分子含有相对于第二部分为亲水性的第一部分，后者因此相对于第一部分为疏水性。在一些实施方案中，亲水性部分相对于疏水性部分为水溶性的。在一些实施方案中，疏水性部分相对于亲水性部分为不溶于水的。在一些实施方案中，两亲性试剂含有亲水性头基和疏水性尾基。
可基于所需特性(例如极性、疏水性、亲水性、尺寸、结构刚性等)选择适当的两亲性试剂以促进单层自组装。例如，在一些实施方案中，可通过改变疏水性尾基的疏水性而将两亲性试剂设计为用于特定的溶剂***。在一些实施方案中，两亲性试剂包含式CH3(CH2)nPO3H2的烷基膦酸化合物，其中n是值为1-30的整数。在一些实施方案中，两亲性试剂包含己基膦酸、辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、聚乙烯膦酸、12-膦酰基-1-十二烷磺酸、10-十一炔基膦酸或十七氟癸基膦酸。
在一些实施方案中，两亲性试剂包含氟表面活性剂。在一些实施方案中，氟表面活性剂是式CF3(CF2)nZ的化合物，其中n是值为1-30的整数且Z是亲水性头基。氟表面活性剂有时也被称作氟化的表面活性剂或全氟烷基化物质，其是具有多个氟原子的合成有机氟化合物。在一些实施方案中，氟表面活性剂可为具有-CF2-、-CF2CF3或-CF3基团中的至少一种的任何化合物。可根据本文所描述的方法中所使用的表面组成以及其他实验条件来选择适合的氟表面活性剂。例如，氟表面活性剂及其特性描述于共同未决的美国公开第US20060234901号中，其内容以引用的方式全文并入本文中。氟表面活性剂及其合成方法的额外实例描述于美国申请第US 09/570,853号中，其内容以引用的方式全文并入本文中。
在一些实施方案中，两亲性试剂的亲水性头基是能够与金属氧化物表面缔合的化学基团(例如官能团)。在一些实施方案中，亲水性头基能够与金属或金属氧化物表面组合物螯合。可根据存在于基板(例如样品槽)上的表面组合物来选择适当的亲水性头基。例如，两亲性试剂的亲水性头基可被设计为使得头基优先与待钝化的所需表面结合。因此，在一些实施方案中，亲水性头基被设计为相对于二氧化硅表面优先与金属氧化物表面结合。在一些实施方案中，亲水性头基能够与水分子形成氢键供体相互作用或氢键受体相互作用。亲水性头基的实例包括但不限于硫酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、硫基、磷酸盐、膦酸盐、羟基、儿茶酚酸盐、异氰酸盐、异羟肟酸盐、羧基、氨基、酰氨基、羧基和羟基。应理解，本文所公开的化学基团并非意欲受限于特定的质子化状态或氧化态。因此，例如，如本文所用的“羧基”尤其指代羧酸基团(R-COOH)和羧酸盐基团(R-COO-)。
在一些实施方案中，疏水性尾基可根据实验依赖性条件例如溶剂温度、pH值和离子强度来设计。一般优选的是，两亲性试剂的疏水性尾基对基板的金属或金属氧化物表面的亲和力低于两亲性试剂的亲水性头基。在一些实施方案中，疏水性尾基被配置为优先与嵌段共聚物的所需嵌段相互作用。在一些实施方案中，可能需要设计疏水性尾基使得其在给定的一组实验条件下不完全可溶。例如，在一些实施方案中，限制疏水性尾基的水溶性促进两亲性试剂在形成单层涂层中的自组装。在一些实施方案中，疏水性尾基是饱和或不饱和、经取代或未经取代的环状、支链或直链脂肪族链。在一些实施方案中，脂肪族链包含4至28个碳原子。在一些实施方案中，疏水性尾基包含C1-C30烷基链。
在一些实施方案中，两亲性试剂的疏水性尾部包含共价偶合部分。在此类实施方案中，方法进一步包括使样品槽与聚合化合物接触，该聚合化合物被配置为与共价偶合部分结合，从而使聚合化合物共价连接至金属氧化物表面上的两亲性试剂。例如，图4描绘了用于钝化金属氧化物表面的非限制性方法。如图所示，使具有金属氧化物表面402和二氧化硅表面404的基板(例如样品槽)经受第一钝化步骤(i)，该第一钝化步骤(i)涉及使基板与包含共价偶合部分444的两亲性试剂442接触。在一些实施方案中，两亲性试剂包含式Y(CH2)nPO3H2的烷基膦酸化合物，其中n是值为1-30的整数，且Y是共价偶合部分。在一些实施方案中，共价偶合部分包含氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。两亲性试剂442经由亲水性头基在金属氧化物表面402上自组装，该亲水性头基相对于二氧化硅表面404优先与金属氧化物表面402结合。在一些实施方案中，金属氧化物表面402相对于两亲性试剂的共价偶合部分优先与亲水性头基结合。
在一些实施方案中，如图4所示，使基板(例如样品槽)进一步经受额外的钝化步骤(ii)，该钝化步骤(ii)涉及使基板与被配置为与两亲性试剂442的共价偶合部分444结合的聚合化合物452接触。以此方式，聚合化合物452被接枝到金属氧化物表面402上的两亲性试剂442，以在单层形成物中提供更加致密的表面覆盖，这使暴露的金属氧化物表面的位点减到最少。在一些实施方案中，聚合化合物452包含聚醚化合物。本文中描述了聚合化合物和聚醚化合物。在一些实施方案中，选择聚合化合物452，以赋予经钝化的金属氧化物表面402抗污特性。在一些实施方案中，聚合化合物452被选择为优先与如本文所述的嵌段共聚物缔合。在一些实施方案中，聚合化合物452包括将聚合化合物452配置为与共价偶合部分444结合的部分454。在一些实施方案中，部分454包含氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。
在一些方面，本文中所描述的方法可用于通过在金属氧化物表面上形成涂层来钝化金属氧化物表面。如本文所用，“涂层”指代直接在金属氧化物表面上形成的单层。在一些实施方案中，涂层通过单层自组装形成于金属氧化物表面上。在一些实施方案中，涂层是有序或无序的单层。在一些实施方案中，涂层可为有序且紧密填充的单层。在一些实施方案中，涂层可为均质或非均质的单层。在一些实施方案中，使用于形成涂层的组分在金属氧化物表面上自组装。不希望受理论束缚，但相信金属氧化物表面上的单层自组装经由自由能最小化而出现。例如，两亲性试剂的亲水性头基可以被优先吸引至金属氧化物表面，这促进头基在金属氧化物表面上的聚集，以实现单层的有序组装。金属氧化物表面也可被视为一种模板，两亲性试剂的头基围绕该模板聚集，这使两亲性试剂的疏水性尾基从金属氧化物表面延伸。因此，在一些实施方案中，尾基在涂层的情形下与嵌段共聚物自由缔合以产生抗污性覆盖。
抗污性覆盖&嵌段共聚物
如本文所用，“抗污性覆盖”指代一种组合物，其提供或提高组合物所连接的物品的表面对生物分子的抗性。例如，在一些实施方案中，相对于粘附至参考基板(亦即不具有抗污性覆盖的相同或以其他方式在功能上等效的基板)的量，样品槽表面(例如金属氧化物)上方的抗污性覆盖可抵抗生物分子的粘附，所述生物分子包括蛋白质、核酸、核苷酸、经标记的核苷酸、细胞、组织和/或其他生物物质。在一些实施方案中，样品槽表面(例如金属氧化物)上方的抗污性覆盖可抵抗疏水性分子的粘附，所述疏水性分子例如生物反应中所用的疏水性组分(例如染料分子、经染料标记的核苷酸、核苷酸、核酸等)。在一些实施方案中，相对于参考基板，粘附量将降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更高，例如85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或更高。在一些实施方案中，抗污性覆盖对聚合酶和/或核酸具有实质上的抵抗性。在一些实施方案中，抗污性覆盖对血液样品中存在的生物分子具有实质上的抵抗性。
在一些实施方案中，抗污性覆盖形成于金属氧化物表面上方。在一些实施方案中，抗污性覆盖可通过与金属氧化物表面的直接相互作用(例如与金属氧化物组合物螯合)而形成于金属氧化物表面上方。在一些实施方案中，抗污性覆盖可经由与一个或多个介入层的相互作用而形成于金属氧化物表面上方。例如，在一些实施方案中，抗污性覆盖经由与金属氧化物表面上的涂层(例如单层)的相互作用而形成于金属氧化物表面上方。在一些实施方案中，抗污性覆盖由于疏水性作用与涂层相互作用。疏水性作用是指疏水性分子聚集于水溶液中且排斥水分子的倾向。在一些实施方案中，通过使具有涂层的金属氧化物表面与优先与涂层结合的嵌段共聚物接触，在金属氧化物表面上赋予抗污特性。
如本文所用，“嵌段共聚物”指代具有超过一种聚合嵌段的聚合物，每个嵌段具有与相邻嵌段不同的结构。包涵全部嵌段的完整结构形成嵌段共聚物。具有两种或三种不同嵌段的嵌段共聚物分别称为二嵌段或三嵌段共聚物。在一些实施方案中，共聚物的每个嵌段由字母表示(例如“A”嵌段、“B”嵌段、“C”嵌段等)，其中每个字母表示具有不同的结构组成的共聚物的嵌段，该不同的结构组成产生该共聚物的嵌段的不同特性。在一些实施方案中，每个嵌段由一种或多种类型的单体或结构单元组成，其可基于待相对于嵌段共聚物内的另一嵌段向该嵌段所赋予的所需特性(例如疏水性或亲水性)来选择。例如，在一些实施方案中，如本文所述的嵌段共聚物是具有A嵌段和B嵌段的A-B-A型三嵌段共聚物，其中B嵌段相对于A嵌段是疏水性的。在一些实施方案中，如本文所述的嵌段共聚物是具有A嵌段和B嵌段的A-B型二嵌段共聚物，其中B嵌段相对于A嵌段是疏水性的。
在一些实施方案中，三嵌段共聚物具有三种不同的嵌段，其可以是交替的亲水性(A)和疏水性(B)嵌段。图5一般性地描绘了嵌段共聚物及其部分的非限制性配置。如图所示，A-B-A型三嵌段共聚物502可包括由第一组单体单元(阴影圆)组成的B嵌段，这些单体单元在每一侧有由第二组单体单元(空心圆)组成的A嵌段。在一些实施方案中，A-B-A型嵌段共聚物可由式I表示：(Aa)(Bb)(Aa)，其中A是包含A嵌段的聚合结构的单体单元，a是A嵌段的聚合度且是值为2-150的整数，B是包含B嵌段的聚合结构的单体单元，且b是A嵌段的聚合度且是值为10-100的整数。
在一些实施方案中，A或B嵌段中的任一者本身可以是共聚物。例如，在一些实施方案中，嵌段共聚物的A嵌段和/或B嵌段可包括两种或更多种类型的单体单元。在一些实施方案中，单体单元可作为交替单体504存在于A嵌段和/或B嵌段内。在一些实施方案中，单体单元可以随机配置506存在于A嵌段和/或B嵌段内。在一些实施方案中，共聚物接合点处的化学界面可以是逐渐缩小的。例如，在一些实施方案中，A嵌段和B嵌段可由逐渐缩小的界面508分离，使得A嵌段的单体单元逐渐过渡到B嵌段的单体单元。因此，应理解，如本文所用的术语“A嵌段”和“B嵌段”可一般指代具有不同相对疏水性/亲水性特性的嵌段共聚物的嵌段，且不应被视为将任何嵌段限制为特定的单体单元。
在一些实施方案中，三嵌段共聚物的示意性一般化可由式[AaBbCc...]a[XxYyZz...]b[AaBbCc...]a表示，其中每个字母表示单体单元，单体单元的每个下标表示特定嵌段中该单元的摩尔分数，三个圆点表明在每个嵌段中可能存在更多或更少的单体单元，且a和b分别表明A和B嵌段的聚合度。如示意图所表明的，在一些实施方案中，每个结构单元的数目和性质对于每个嵌段而言可以被分别控制。示意图不意图且不应被理解为意指每个嵌段中的结构单元的数目或不同类型的结构单元的数目之间的任何关系，示意图也不意图描述特定嵌段内的结构单元的任何特定数目或设置。在每个嵌段中，除非以其他方式明确地陈述，否则结构单元可以纯粹随机、交替随机、规则交替、规则嵌段或随机嵌段的配置来安置。
在一些实施方案中，嵌段共聚物可包括支链配置。例如，图5描绘了嵌段共聚物的支链嵌段510的实例，其中给定嵌段内的一个或多个单体单元可连接至超过两个相邻的单体单元。在一些实施方案中，如本文所述的嵌段共聚物可被配置为刷状共聚物512。以此方式，第一聚合物嵌段(阴影圆)可被设计为优先与涂层相互作用而第二聚合物嵌段(空心圆)向外延伸且可被设计以提供抗污特性。
在一些实施方案中，嵌段共聚物的至少一种嵌段(例如A嵌段和/或B嵌段)包含具有抗污特性的组成。在一些实施方案中，嵌段共聚物的至少一种嵌段(例如A嵌段和/或B嵌段)具有电中性组成、亲水性组成和/或包含氢键供体但不包含氢键受体的组成。在一些实施方案中，嵌段共聚物的至少一种嵌段(例如A嵌段和/或B嵌段)包含聚丙烯酸酯(例如包含氨基甲酸酯连接的侧链的聚丙烯酸酯)、低聚糖、聚氨基甲酸酯(例如热塑性节段的聚氨基甲酸酯)或聚醚(例如聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丁二醇))或其组合。在一些实施方案中，嵌段共聚物的每个嵌段(例如A嵌段和B嵌段)包含各自的聚丙烯酸酯(例如包含氨基甲酸酯连接的侧链的聚丙烯酸酯)、低聚糖、聚氨基甲酸酯(例如热塑性节段的聚氨基甲酸酯)或聚醚(例如聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丁二醇))或其组合。
在一些实施方案中，嵌段共聚物的至少一种嵌段是包含聚醚的聚合结构。在一些实施方案中，嵌段共聚物的每个嵌段是包含聚醚的聚合结构。在一些实施方案中，至少一种嵌段是由环氧乙烷(-CH2CH2O-)重复单元组成的单体单元的寡聚结构或聚合结构。在一些实施方案中，A嵌段包含第一聚醚嵌段且B嵌段包含第二聚醚嵌段，其中第二聚醚嵌段的疏水性高于第一聚醚嵌段的疏水性。在一些实施方案中，A嵌段包含聚环氧乙烷且B嵌段包含聚环氧丙烷。在一些实施方案中，A嵌段和/或B嵌段包含聚环氧乙烷与聚环氧丙烷的混合物，其中该混合物不改变B嵌段相比于A嵌段的相对疏水性。在一些实施方案中，A-B-A型嵌段共聚物是式II化合物：
其中a是值为2-150的整数；且b是值为10-100的整数。在一些实施方案中，a为10-30(包括端点)的值，且b为40-100(包括端点)的值。在一些实施方案中，a为约20的值，且b为约70的值。在一些实施方案中，a为80-120(包括端点)的值，且b为35-95(包括端点)的值。在一些实施方案中，a为约100的值，且b为约65的值。
在一些实施方案中，诸如三嵌段共聚物的嵌段共聚物可具有结构限制以提供特定的功能需求。例如，嵌段共聚物的总分子量(例如重均分子量或数均分子量)可足够低，以使得聚合物在25℃下为液体或在25℃下具有指定的最大粘度。在一些实施方案中，嵌段共聚物的总分子量(例如重均分子量)可使用测角计测定表面功能化然后使用飞行时间次级离子质谱分析进行分析来测定。在一些实施方案中，嵌段共聚物的总分子量(例如重均分子量)可为例如约7,000g/mol或更小、或约6,500g/mol或更小、或约6,000g/mol或更小、或约5,500g/mol或更小、或约5,000g/mol或更小、或约、或约4,500g/mol或更小、或约4,000g/mol或更小、或约3,500g/mol或更小、或约3,000g/mol、或约2,500g/mol或更小、或约2,000g/mol或更小、或约1,500g/mol或更小、或约1,000g/mol或更小。在一些实施方案中，嵌段共聚物的总分子量在600g/mol与1,500g/mol之间。
在一些实施方案中，聚合物内的特定嵌段的分子量可被指定，以赋予嵌段共聚物的特定特征。例如，A-B-A型嵌段共聚物中的B嵌段的分子量可相对于嵌段共聚物的总分子量变化，以改变B嵌段与涂层相互作用的程度。A：44.05(881)，B：58.08(4065)。在一些实施方案中，B嵌段的分子量可占A-B-A型嵌段共聚物的总分子量的约30％至约40％之间、约40％至约50％之间、约50％至约60％之间、约60％至约70％之间、约70％至约80％之间或更高。
功能化
在某些实施方案中，本文中所描述的技术可用于将所关注的分子限制到样品槽的所需区域。在一些实施方案中，所需区域可称为“目标体积”或“反应体积”。在一些实施方案中，样品槽占据由开口界定的体积或空间，该开口形成于集成装置的表面处，其延伸穿过第一层且进入集成装置的第二层直至远离开口的底表面。在一些实施方案中，安置在样品槽的开口与底表面之间的第一层和第二层的暴露表面可称为侧壁，其进一步限定样品槽所占据的体积或空间。
在一些实施方案中，第一层是金属包覆层。在一些实施方案中，金属包覆层包含一种或多种类型的金属(例如铝、钛、锆、铁、锡、钽等)。在一些实施方案中，第一层的暴露表面部分包含金属氧化物。在一些实施方案中，第二层是透明材料或玻璃。在一些实施方案中，第二层的暴露表面部分包含熔凝硅石或二氧化硅。在一些实施方案中，样品槽的侧壁由第一和第二层的暴露表面部分中的每一者的至少一部分构成。在一些实施方案中，样品槽的底表面包含二氧化硅。在一些实施方案中，与底表面相邻的侧壁的至少一部分包含二氧化硅。
在实施方案中，在将一种或多种分子或复合物(例如测序模板)固定于底表面上时，可能需要使底表面功能化，以允许一种或多种分子或复合物的附着。在某些实施方案中，底表面包含透明玻璃。在某些实施方案中，底表面包含熔凝硅石或二氧化硅。在一些实施方案中，底表面用硅烷功能化。在一些实施方案中，底表面用带离子电荷的聚合物功能化。在一些实施方案中，带离子电荷的聚合物包含聚(赖氨酸)。在一些实施方案中，底表面用聚(赖氨酸)-接枝-聚(乙二醇)功能化。在一些实施方案中，底表面用生物素标记的牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)功能化。
在一些实施方案中，底表面用包含烷基链的硅烷功能化。在一些实施方案中，底表面用包含被任选地取代的烷基链的硅烷功能化。在一些实施方案中，底表面用包含聚(乙二醇)链的硅烷功能化。在一些实施方案中，底表面用包含偶合基团的硅烷功能化。例如，偶合基团可包含化学部分，如氨基、羧基、羟基、巯基、金属、螯合剂等等。或者，其可包括特定的结合要素，如生物素、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、凝集素、SNAP-标签TM或其底物、缔合或结合肽或蛋白质、抗体或抗体片段、核酸或核酸类似物等等。另外或可替代地，偶合基团可用于偶合额外基团，该额外基团用于偶合所关注的分子或与所关注的分子结合，该额外基团可在某些情况下包括化学官能团和特定的结合要素两者。作为实例，偶合基团，例如生物素，可在基板表面上沉积且选择性地在给定区域中活化。中间体结合剂，例如链霉亲和素，可随后偶合于第一偶合基团。随后将所关注的分子(其在该特定实例中是生物素标记的)与链霉亲和素偶合。
在一些实施方案中，底表面用包含生物素或其类似物的硅烷功能化。在一些实施方案中，底表面用包含聚(乙二醇)链的硅烷功能化，其中聚(乙二醇)链包含生物素。在某些实施方案中，底表面用硅烷的混合物功能化，其中至少一种类型的硅烷包含生物素且至少一种类型的硅烷不包含生物素。在一些实施方案中，混合物所包含的生物素标记的硅烷比不包含生物素的硅烷少约10倍、少约25倍、少约50倍、少约100倍、少约250倍、少约500倍、或少约1000倍。
所关注的分子
在一些方面，本公开提供了用于将所关注的分子限制到样品槽的所需区域的技术。在一些实施方案中，本文中所描述的方法涉及使具有经功能化的表面的样品槽与被配置为与经功能化的表面结合的所关注的分子接触。
在一些实施方案中，所关注的分子是聚合酶。如本文中所使用，术语“聚合酶(polymerase)”和“聚合酶(polymerizing enzyme)”一般是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的实例包括但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶可为聚合反应酶。针对单分子核酸延伸(例如用于核酸测序)的实施方案可使用能够合成与靶核酸分子互补的核酸的任何聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可为DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和/或其一种或多种的突变体或改变形式。在一些实施方案中，聚合酶可为选自2016年12月19日递交的共同未决的美国临时申请第62/436,410号的任何聚合酶，该申请的内容以引用的方式全文并入本文中。
在一些实施方案中，所关注的分子是测序模板。如本文所用，“测序模板”是作为分析(例如测序分析)的主题的分子。在一些实施方案中，测序模板包含核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子被称为“靶”或“模板”核酸。在一些实施方案中，核酸分子包含至少一种杂交的引物/聚合酶复合物。例如，在一些实施方案中，使核酸分子与测序引物(该测序引物与核酸分子的一部分互补)接触，使得测序引物退火至核酸分子。此引发位置产生其中聚合酶(例如DNA或RNA聚合酶)可偶合至核酸分子以形成杂交的引物/聚合酶复合物的位点。因此，在一些实施方案中，所关注的分子是测序模板复合物，其包含具有杂交的引物/聚合酶复合物的模板核酸分子。
在一些实施方案中，样品槽与所关注的分子的接触发生在样品槽与功能化剂的接触之后，无中间洗涤步骤。
在一些实施方案中，所关注的分子相对于钝化的金属氧化物表面优先以约100倍至约1000倍选择性、约200倍至约800倍选择性、约400倍至约600倍选择性、或约1000倍至约2000倍选择性与功能化的二氧化硅表面结合。例如，在一些实施方案中，所关注的分子优先以约80倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、或约2000倍或更高的选择性与功能化的二氧化硅表面结合。
在一些实施方案中，与不与嵌段共聚物接触的样品槽相比，所关注的分子对功能化的二氧化硅表面相对于对钝化的金属氧化物表面的选择性高约10倍至约100倍、约50倍至约500倍、约100倍至约1000倍、或约200倍至约400倍。例如，在一些实施方案中，与不与嵌段共聚物接触的样品槽相比，所关注的分子对功能化的二氧化硅表面相对于对钝化的金属氧化物表面的选择性高约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或约1000倍或更高。
样品装载
在一些方面，本公开涉及用于制备样品槽的一个或多个表面的技术。例如，在一些实施方案中，本公开提供了用于使样品槽的表面功能化的方法和组合物。可通过任何数目的适当方法将包含本文中所描述的一种或多种组合物的样品添加至包含样品槽的基板。在一些实施方案中，样品由医师例如经由移液管、分配器或任何适当的流体传送装置/***装载。在一些实施方案中，样品通过自动化装置(例如机器人装置/***)装载。在一些实施方案中，样品经由一个或多个微流体通道装载。
在一些实施方案中，可通过一般用于将分子递送至分析仪器的方法将样品递送至基板(例如包含样品槽的集成装置、阵列)。例如，递送方法可包括将一种或多种本文中所描述的组合物悬浮于流体中并使所得悬浮液在基板上流动。这可包括仅将相关悬浮液移液于基板的一个或多个区域上，或者可包括更活跃的流动方法，例如电引导或基于压力的流体流动。在一些实施方案中，使样品流入基板的所选区域中，例如其中所需表面待于基板的特定区域中功能化的区域。基板的区域也可以是简单地通过将相关悬浮液移液至基板的正确区域中的递送的选择性目标。在一些实施方案中，根据2016年12月19日递交的共同未决的美国临时申请第62/436,407号中所描述的技术将本文中所描述的试剂、共聚物、分子、化学品、组合物和/或物质装载于样品槽中，该申请的内容以引用的方式全文并入本文中。
如本文中所描述，本公开的方面提供了使用两亲性试剂、嵌段共聚物、功能化剂和所关注的分子中的一种或多种来制备样品槽的方法。在一些实施方案中，可以使样品槽在大约同一时间暴露于这些组分中的两种或更多种。在一些实施方案中，使样品槽以分步方式暴露于这些组分中的每一种。在一些实施方案中，使样品槽以大约同一时间暴露于两亲性试剂和嵌段共聚物以产生钝化的表面。在一些实施方案中，使样品槽在其他组分之前暴露于两亲性试剂以产生涂层。在一些实施方案中，使样品槽暴露于两亲性试剂的时间段超过使样品槽暴露于嵌段共聚物的时间段。例如，在一些实施方案中，两亲性试剂经由分子自组装的过程产生涂层，该过程可能需要与具有金属氧化物表面的样品槽的较长孵育期。
在一些实施方案中，在使样品槽暴露于嵌段共聚物之前，使样品槽暴露于两亲性试剂历经约24小时的时间段以形成涂层。在一些实施方案中，在使样品槽暴露于嵌段共聚物之前，使样品槽暴露于两亲性试剂历经约4至8小时、约8至12小时、约12至16小时、约16至20小时、约20至24小时、约24至28小时、约28至32小时、约32至36小时、约36至40小时、约40至44小时、约44至48小时或更长的时间段，以形成涂层。在一些实施方案中，在使样品槽暴露于功能化剂之前，使具有涂层的样品槽暴露于嵌段共聚物历经约2小时的时间段。在一些实施方案中，使具有涂层的样品槽暴露于嵌段共聚物历经约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更长的时间段以在金属氧化物表面上方形成抗污层。
在一些实施方案中，使具有抗污层的样品槽暴露于功能化剂历经约1至2小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于功能化剂历经约30分钟。在一些实施方案中，使样品槽暴露于功能化剂历经约1小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于功能化剂历经约2小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于功能化剂历经约30至90分钟。在一些实施方案中，使样品槽暴露于功能化剂历经约3小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于功能化剂历经超过3小时。
在一些实施方案中，使具有功能化的二氧化硅表面的样品槽暴露于所关注的分子历经约1至2小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于所关注的分子历经约30分钟。在一些实施方案中，使样品槽暴露于所关注的分子历经约1小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于所关注的分子历经约2小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于所关注的分子历经约30至90分钟。在一些实施方案中，使样品槽暴露于所关注的分子历经约3小时。在一些实施方案中，使样品槽暴露于所关注的分子历经超过3小时。
样品制备
在一些实施方案中，可以从获自个体(例如人类或其他个体)的生物样品中提取包含靶核酸的样品。在一些实施方案中，个体可为患者。在一些实施方案中，靶核酸可被检测和/或测序用于诊断、预后和/或治疗目的。在一些实施方案中，用于测序分析的信息可用于帮助疾病或病状的诊断、预后和/或治疗。在一些实施方案中，个体可疑似患有健康状况，诸如疾病(如癌症)。在一些实施方案中，个体可经历疾病治疗。
在一些实施方案中，可以从个体的体液或组织(例如呼气、唾液、尿液、血液(例如全血或血浆)、大便或其他体液或活检样品)提取生物样品。在一些实例中，从个体的体液或组织提取一种或多种核酸分子。可以从获自个体的一个或多个细胞(例如个体的组织的一部分)或获自个体的无细胞体液(例如全血)提取一种或多种核酸。
可在用于检测(例如测序)的制剂中处理生物样品。此类处理可包括来自生物样品的生物分子(例如核酸分子)的分离和/或纯化，以及生物分子的更多复本的产生。在一些实例中，将一种或多种核酸分子从个体的体液或组织中分离和纯化，且经由诸如聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR)的核酸扩增来扩增。随后，可鉴别一种或多种核酸分子或其子单元，例如通过测序。然而，在一些实施方案中，核酸样品可在不需要扩增下评估(例如测序)。
如本申请中所描述的，测序可包括通过合成与模板互补或类似于模板的另一生物分子，例如通过合成与模板核酸分子互补的核酸分子以及鉴别随时间推移核苷酸的并入(例如通过合成测序)来测定模板生物分子(如核酸分子)的个体子单元。作为替代方案，测序可包括生物分子的个体子单元的直接鉴别。
测序
在一些方面，本文中所描述的方法和装置可用于允许检测样品中的个体分子或颗粒的分析技术。个体分子可为(作为实例而非限制)氨基酸、多肽、核苷酸、核酸、或其包含可检测部分的变体。例如，在一些实施方案中，本公开中所提供的方法和组合物可与单分子核酸测序技术结合使用。单分子核酸测序允许通过实时监测与模板核酸互补的核酸分子的延长来测定单核酸分子的序列。
在一些实施方案中，本申请的方面可用于与生物样品分析相关的方法中。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于用于测定样品中的一种或多种核酸或多肽的序列和/或测定样品中的一种或多种核酸或多肽变体(例如受关注的基因中的一种或多种突变)的存在或不存在的技术中。在一些实施方案中，可针对患者样品(例如人类患者样品)进行测试以提供核酸序列信息或测定所关注的一种或多种核酸的存在或不存在，用于诊断、预后和/或治疗目的。在一些实例中，诊断性测试可包括例如通过对个体的生物样品中的无细胞DNA分子和/或表达产物(例如RNA)进行测序来对个体的生物样品中的核酸分子进行测序。例如，本公开提供了可有利地用于以下共同未决的美国专利申请中所描述的技术中的方法和组合物：第14/543,865号、第14/543,867号、第14/543,888号、第14/821,656号、第14/821,686号、第14/821,688号、第15/161,067号、第15/161,088号、第15/161,125号、第15/255,245号、第15/255,303号、第15/255,624号、第15/261,697号、第15/261,724号、第15/600,979号、第15/846,967号、第15/847,001号、第62/289,019号、第62/296,546号、第62/310,398号、第62/339,790号、第62/343,997号、第62/344,123号、第62/426,144号、第62/436,407号、和第62/436,410号，其各自内容以引用的方式并入本文中。
本申请的一些方面可用于能够对生物聚合物例如核酸和蛋白质进行测序的技术。在一些实施方案中，本申请中所描述的方法和组合物可用于鉴别并入到核酸或蛋白质中的一系列核苷酸或氨基酸单体的技术中(例如通过检测一系列经标记的核苷酸或氨基酸单体的并入时程)。在一些实施方案中，本申请中所描述的方法和组合物可被并入到鉴别一系列核苷酸的技术中，这些核苷酸被并入到通过样品槽中的聚合酶合成的模板依赖性核酸测序反应产物中。在一些实施方案中，可使用本文中所描述的高选择性表面功能化技术将聚合酶连接至样品槽的所需区域。
在一些实施方案中，在溶液中形成包含聚合酶、靶核酸和引物的复合物且将该复合物固定于固体支持物(例如经由聚合酶、引物和/或靶核酸的固定)。
样品槽
在一些方面，本公开提供包含基板的集成装置，该基板包含具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样品槽。在一些实施方案中，集成装置进一步包含通过包含亲水性头基和疏水性尾基的两亲性试剂在金属氧化物表面上形成的涂层。在一些实施方案中，两亲性试剂经由亲水性头基结合至金属氧化物表面。在一些实施方案中，集成装置进一步包含通过包含A嵌段和B嵌段的A-B-A型嵌段共聚物在涂层上形成的抗污性覆盖。在一些实施方案中，A-B-A型嵌段共聚物经由B嵌段结合至涂层。在一些实施方案中，集成装置进一步包含结合至二氧化硅表面的功能化剂，其中功能化剂包含偶合部分。
在一些实施方案中，基板包含样品槽的阵列，每个样品槽具有金属氧化物表面和二氧化硅表面。在一些实施方案中，样品槽包含形成于基板表面处的顶部缝隙以及远离基板表面的底表面。在一些实施方案中，底表面由二氧化硅表面构成。在一些实施方案中，集成装置被配置为与下一代测序仪器接合。
如本文所用，“集成装置”是能够与基本仪器接合的装置。在一些实施方案中，集成装置可包含一个或多个样品槽和/或传感器。在一些实施方案中，集成装置能够与发射或检测光线的基本仪器接合。在此类实施方案中，集成装置可包含一个或多个样品槽，其中每个样品槽包括波导。
本文中所描述的类型的集成装置可包含一个或多个被配置为在其中接受所关注的分子的样品槽。在一些实施方案中，样品槽接受可置于样品槽的表面例如底表面上的所关注的分子。在一些实施方案中，样品槽在集成装置内形成，其中样品槽的底表面位于集成装置(该样品槽形成于其中)的表面的远端。在一些实施方案中，放置所关注的分子的底表面可以与被配置为用所需要程度的激发能量激发所关注的分子的波导具有一定距离。在一些实施方案中，样品槽可相对于波导定位，使得沿着波导传播的光模的消逝场与所关注的分子重叠。
样品槽可在集成装置的表面处具有顶部开口，经由该顶部开口可将所关注的分子置于样品槽中。顶部开口的尺寸可取决于不同的因素，例如所装载的样品中的所关注的分子(例如测序模板、聚合酶)的尺寸。在一些实施方案中，顶部开口的尺寸可取决于其中利用包含样品槽的集成装置的仪器或设备。例如，在从样品槽内检测光的装置中，背景信号可由杂散光产生。在将所关注的分子置于样品槽中并用激发能量激发时，背景信号可造成发射能量的不期望的波动，因此产生测量噪声。为限制这种波动，顶部开口的尺寸可被配置为阻断背景信号的至少一部分。
在一些实施中，样品槽的体积可在约10-21升与约10-15升之间。因为样品槽具有小体积，所以单样品事件(例如单分子事件)的检测可为可能的，即使所关注的分子可以类似于发现于天然环境中的浓度浓缩于检测试样中。例如，微摩尔浓度的所关注的分子可存在于被放置为与集成装置接触的试样中，但在像素级别下，仅约一个所关注的分子(或单分子事件)可在任何给定时间位于样品槽内。
统计学上，一些样品槽可不含所关注的分子且一些可含有超过一个所关注的分子。然而，可观数目的样品槽可含有单个所关注的分子(例如在一些实施方案中至少30％)，使得对于大量样品槽可平行地进行单分子分析。因为单分子或单样品事件可在每个样品槽处分析，所以集成装置使得有可能检测可能以其他方式在总体均值中未被察觉的个体事件。
实施例
实施例1.使用嵌段共聚物的金属氧化物表面上的改善的润湿性
通过润湿性实验评估用于钝化金属氧化物表面的方法。具有由TiO2和SiO2构成的表面区域的试样经受两步骤方法，该方法涉及涂层的形成以及随后抗污性覆盖的形成。为了这些实验的目的，使用己基膦酸(HPA)产生涂层，且使用Pluronic P123三嵌段共聚物(HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH)产生抗污层。
使TiO2/SiO2试样暴露于HPA历经24小时的时段以允许HPA单层在TiO2表面上自组装。在HPA钝化之后，通过接触角测量来评估表面润湿性，其中试样的TiO2侧上的液滴测量值为约85°且SiO2侧上的液滴测量值为约15°。接触角随时间变化的曲线表明，液滴接触角在两小时之后在HPA钝化的TiO2表面上保持稳定。
在用HPA钝化之后，使TiO2/SiO2试样暴露于三嵌段共聚物历经两小时。再次对试样的每一侧获得接触角测量值。SiO2侧上的润湿性看起来不受三嵌段共聚物步骤的影响，其中接触角维持在约15°。这将表明SiO2的亲水性未被嵌段共聚物的添加所改变。相比之下，试样的TiO2侧出现润湿性的可测量的提高，其中接触角降低至约45°。在初始HPA钝化之后(图6，顶部)和使HPA钝化表面暴露于嵌段共聚物之后(图6，底部)获得TiO2上的液滴的成像。此处润湿性的变化将表明，HPA钝化的TiO2的亲水性在添加嵌段共聚物之后显著提高。另外，这些观测结果将与通过嵌段共聚物形成的抗污性覆盖的形成一致。
实施例2.用于评估表面功能化的结合选择性分析
在TiO2/SiO2试样上，使用生物素共轭的硅烷通过量子点(QD)-链霉亲和素分析来评估硅烷化的表面选择性。在这些实验中，对于仅用HPA钝化的涂层制备的试样，或者通过HPA钝化然后用三嵌段共聚物的抗污性覆盖制备的试样，检测硅烷化合物的表面选择性。所分析的不同条件的荧光成像结果示于图7中。
使用未经受表面化学反应改性步骤的TiO2/SiO2试样获得背景荧光测量值(图7，顶部)。对于对照实验，通过用HPA的钝化然后用硅烷-PEG-生物素的表面功能化来制备TiO2/SiO2试样。使用QD-链霉亲和素结合分析获得荧光测量值，其表明对于SiO2侧，试样的硅烷化以接近2倍的选择性发生(图7，中间)。选择性通过从对照强度测量值中减去背景荧光强度测量值来确定。例如，使用图7(顶部，中间)中报告的测量值来估算SiO2:TiO2的对照选择性，其中通过以下获得选择性：(Si对照-Si空白)/(Ti对照-Ti空白)＝(53000-3400)/(25000-2000)＝(49600)/(23000)＝～2.2，或约2倍选择性。
接着，如实施例1中所述地制备具有HPA钝化和三嵌段共聚物覆盖的TiO2/SiO2试样。在共聚物改性的试样的硅烷化之后，荧光测量表明硅烷化合物相对于TiO2侧以>500:1的选择性结合至SiO2侧(图7，底部)。如图所示，对共聚物试样的TiO2侧所检测的荧光信号接近空白实验中的TiO2侧。因此，如先前计算选择性，并估算以表明对SiO2侧的超过500倍的偏好。
实施例3.生物反应中的抗污效果
通过观察来自用HPA或HPA/三嵌段共聚物处理的芯片上的染料标记的核苷酸的荧光发射，评估测序芯片上的抗污性覆盖的效果。如图8所示，在经HPA/三嵌段共聚物处理的芯片中观测到最小的荧光信号。相比之下，仅用HPA处理的芯片展示从溶液中的经标记的核苷酸检测到的高得多的发射(图8(续))。这些结果表明，经HPA处理的芯片比经HPA/三嵌段共聚物处理的芯片更易受保留在样品槽的消逝体积(evanescent volume)内的经染料标记的核苷酸的影响。另外，这将表明，三嵌段共聚物赋予抗污特性，以将粘附至消逝体积内的表面的染料的易感性降至最低或消除。使用经HPA/三嵌段共聚物处理的芯片进一步进行测序反应，以证实与三嵌段共聚物表面钝化方法的兼容性(图9)。
等同物或范围
在本文中已经描述并说明了数种创造性实施方案的同时，本领域技术人员将易于设想用于进行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的多种其他装置和/或结构，并将这些变化和/或修改的每一种视为在本文所述的创造性实施方案的范围内。更一般而言，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、物质和配置意欲为示例性的，且实际参数、尺寸、物质和/或配置将取决于使用创造性教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或使用不多于常规实验就能够确定本文中所描述的特定创造性实施方案的许多等同物。因此应理解，前述实施方案仅通过实例呈现且在随附的权利要求及其等同物的范围内，创造性实施方案可以不同于具体描述和主张的其他方式来实施。本发明的创造性实施方案涉及本文所描述的每个单独的特征、***、物品、物质、组件和/或方法。另外，若这样的特征、***、物品、物质、组件和/或方法相互间没有不一致，则两种或更多种这样的特征、***、物品、物质、组件和/或方法的任何组合包括于本公开的创造性范围内。
如本文中所定义和使用的所有定义应理解为控制在辞典定义、以引用的方式并入的文献中的定义和/或所定义的术语的普通含义内。
本文中所公开的所有参考文献、专利和专利申请以引用的方式相关于各自经引用的主题并入，其在一些情况下可涵盖文献的全部内容。
除非明确相反指示，否则如在本文说明书和权利要求中使用的不定冠词“一(a/an)”应理解为意谓“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求中使用的词组“和/或”应理解为意谓如此连接的要素的“任一种或两种”，即，在一些情况下结合地存在且在其他情况下未结合地存在的要素。使用“和/或”列出的多个要素应以相同方式解释，即，如此连接的要素的“一个或多个”。除了通过“和/或”短语所确切地识别的要素以外，可任选地存在其他要素，无论其与确切地识别的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，提及“A和/或B”在与诸如“包含”等开放式措辞结合使用时，在一个实施方案中，可仅指A(任选地包括除了B以外的要素)；在另一实施方案中，可仅指B(任选地包括除了A以外的要素)；在另一实施方案中，可指A和B两者(任选地包括其他要素)；等。
如在本说明书和权利要求中所使用，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即，包括多个或一系列要素中的至少一个，还包括多于一个，以及任选的另外的未列出的项目。只有清楚地相反指示的术语(例如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或当用于权利要求中时的“由……组成”)将指包括多个或一系列要素中的恰好一个要素。一般而言，当置于排他性术语如“任一个”、“……中的一个”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”之前时，本文所使用的术语“或”应仅解释为表明排他性替代方式(即“一个或另一个但非二者”)。当用于权利要求中时，“主要由……组成”应具有如其在专利法律领域中所使用的普通含义。
在本说明书和权利要求中提及一个或多个要素的列表时所使用的词组“至少一个”应被理解为意指选自要素的列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一种，且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许可任选地存在除词组“至少一个”所指的要素列表内具体识别的要素以外的要素，而无论其与具体识别的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地“A或B中的至少一个”或，等效地“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个(任选地包括超过一个)A而不存在B(且任选地包括除B以外的要素)；在另一实施方案中，指至少一个(任选地包括超过一个)B而不存在A(且任选地包括除A以外的要素)；在又一实施方案中，指至少一个(任选地包括超过一个)A和至少一个(任选地包括超过一个)B(且任选地包括其他要素)；等。
还应理解，除非清楚地相反地指示，否则在本文中所主张的包括超过一个步骤或操作的任何方法中，方法的步骤或操作的顺序不一定限于列举该方法的步骤或操作的顺序。
在权利要求中以及在上述说明书中，诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“拥有”、“由……组成”等等的所有过渡性词组应理解为开放的，即，意谓包括但不限于。仅过渡词组“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭或半封闭过渡词组，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所阐述。应理解，在本文中使用开放式过渡词组(例如“包含”)所描述的实施方案，在其他实施方案中还被考虑为“由开放式过渡词组所描述的特征组成”和“基本上由开放式过渡词组所描述的特征组成”。例如，若本公开描述“包含A和B的组合物”，则本公开还考虑替代实施方案“由A和B组成的组合物”以及“基本上由A和B组成的组合物”。

Claims (27)

1.一种对样品槽的二氧化硅表面进行功能化的方法，该方法包括：
使具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样品槽与嵌段共聚物接触，所述嵌段共聚物优先与所述金属氧化物表面上的涂层结合，其中所述涂层由包含亲水性头基和疏水性尾基的两亲性试剂形成，其中所述两亲性试剂包含式CH3(CH2)nPO3H2的烷基膦酸化合物，其中n是值为1-30的整数，并且其中所述嵌段共聚物是包含A嵌段和B嵌段的A-B-A型嵌段共聚物并且是式II化合物：
其中：
a是值为2-150的整数；且
b是值为10-100的整数；及
使所述样品槽与功能化剂接触，所述功能化剂优先与所述二氧化硅表面结合，以产生功能化的二氧化硅表面，其中所述功能化剂包含偶合部分。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述样品槽与所述两亲性试剂接触，其中所述两亲性试剂优先与所述金属氧化物表面结合，以在所述金属氧化物表面上形成所述涂层。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述亲水性头基被配置为优先与所述金属氧化物表面结合，且所述疏水性尾基被配置为优先与所述嵌段共聚物结合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述亲水性头基包含硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、羟基、儿茶酚酸盐、异氰酸盐、异羟肟酸盐或羧基官能团。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述疏水性尾基包含C1-C30烷基链。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述两亲性试剂包含己基膦酸、辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、聚乙烯膦酸、12-膦酰基-1-十二烷磺酸、10-十一炔基膦酸或十七氟癸基膦酸。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中B嵌段的疏水性高于A嵌段的疏水性。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述金属氧化物表面包含氧化铝、氧化钛、氧化锆、氧化铁、氧化锡或氧化钽。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述金属氧化物表面包含氧化钛。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述功能化剂包含硅烷化合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述硅烷化合物包含单乙氧基硅烷、甲氧基硅烷、二乙氧基硅烷、三氯硅烷或二乙氧基、甲氧基硅烷。
12.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述金属氧化物表面包含氧化钛且所述功能化剂包含硅烷化合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述硅烷化合物包含单乙氧基硅烷、甲氧基硅烷、二乙氧基硅烷、三氯硅烷或二乙氧基、甲氧基硅烷。
14.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述功能化剂的偶合部分包含生物素分子、亲和素蛋白质、链霉亲和素蛋白质、凝集素蛋白质或SNAP标签。
15.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述功能化剂的偶合部分包含氨基、叠氮基、羧基、羟基、烷基、炔基或硫氢基。
16.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其进一步包含在适合于允许所关注的分子与所述偶合部分结合的条件下，使具有功能化的二氧化硅表面的样品槽与被配置为与所述偶合部分结合的所关注的分子接触，从而使所关注的分子偶合至所述功能化的二氧化硅表面。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述样品槽与所关注的分子的接触发生在所述样品槽与所述功能化剂的接触之后，无中间洗涤步骤。
18.如权利要求16所述的方法，其中所关注的分子是聚合酶。
19.如权利要求16所述的方法，其中所关注的分子是测序模板复合物，所述测序模板复合物包含具有杂交的引物/聚合酶复合物的模板核酸分子。
20.如权利要求16所述的方法，其中所关注的分子以相对于所述金属氧化物表面100倍至1000倍选择性、200倍至800倍选择性、400倍至600倍选择性、或1000倍至2000倍选择性优选与所述功能化的二氧化硅表面结合。
21.如权利要求16所述的方法，其中和不与所述嵌段共聚物接触的样品槽相比，所关注的分子对所述功能化的二氧化硅表面相对于对所述金属氧化物表面的选择性高10倍至100倍、50倍至500倍、100倍至1000倍、或200倍至400倍。
22.一种集成装置，其包含：
基板，所述基板包含具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样品槽；
由包含亲水性头基和疏水性尾基的两亲性试剂在所述金属氧化物表面上形成的涂层，其中所述两亲性试剂通过所述亲水性头基结合至所述金属氧化物表面；
由嵌段共聚物在所述涂层上形成的抗污性覆盖，其中所述两亲性试剂包含式CH3(CH2)nPO3H2的烷基膦酸化合物，其中n是值为1-30的整数，并且其中所述嵌段共聚物是包含A嵌段和B嵌段的A-B-A型嵌段共聚物并且是式II化合物：
其中：
a是值为2-150的整数；且
b是值为10-100的整数；及
结合至所述二氧化硅表面的功能化剂，其中所述功能化剂包含偶合部分。
23.如权利要求22所述的集成装置，其中所述基板包含样品槽的阵列，每个样品槽具有金属氧化物表面和二氧化硅表面。
24.如权利要求23所述的集成装置，其中所述金属氧化物表面包含氧化钛。
25.如权利要求22至24中任一项所述的集成装置，其中所述样品槽包含形成于所述基板的表面处的顶部缝隙和远离所述基板的表面的底表面。
26.如权利要求25所述的集成装置，其中所述底表面由该二氧化硅表面构成。
27.如权利要求22至24中任一项所述的集成装置，其中所述集成装置被配置为与下一代测序仪器接合。
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