CN110577915A - 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株及其应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株及其应用 Download PDF

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CN110577915A CN201910935864.5A CN201910935864A CN110577915A CN 110577915 A CN110577915 A CN 110577915A CN 201910935864 A CN201910935864 A CN 201910935864A CN 110577915 A CN110577915 A CN 110577915A
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    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis

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Abstract

本发明涉及生物领域，尤其涉及地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019310，分类学命名Bacillus licheniformis CZ186。本技术方案的有益效果在于提供了一种产胞外多糖、并可抑制细菌和农作物致病真菌的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，该菌株能抑制金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌等致病菌，且该菌株产生抗菌活性物质具有耐高盐、高温、强碱、以及抗蛋白酶的特性，具有广泛的应用前景。

Description

地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株及其应用。
背景技术
生物防治与化学防治相比，具有高效、安全、无毒等无可比拟的优势，近年来也越来越受关注。在植物病害防治中，许多微生物或其代谢产物对于植物致病菌，包括真菌、细菌、放线菌等，都有良好的拮抗作用。有些微生物虽然能产生具有较强拮抗能力，但是活性物质却不能耐受高盐、高酸、高碱等环境，因此要打破这一限制，最理想的一种情况是，从极端环境中分离出既有拮抗能力、又有较强抗逆能力的菌体。芽抱杆菌是一些动物的肠道正常微生物群，以内生的抱子存在，抗逆性强，能耐酸、碱和高温，在生长繁殖过程中能产生多种有益的酶，包括不常见的纤维素酶、果胶酶、葡聚糖酶等。
地衣芽抱杆菌可作为有效的生防菌控制许多植物病原真菌和细菌的危害，并且还能产生多糖等活性物质。研究表明某些微生物多糖具有复杂的、多方面的生物活性，能够激活各类免疫细胞，具有明显的抗肿瘤、防衰老、抗炎症、降血脂、抗肿瘤、增强免疫、抗氧化、抗病毒等能力。微生物来源的多糖主要来自真菌，细菌多糖主要存在于乳酸菌中，而地衣芽抱杆菌多糖的研究和应用非常少。随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始重视抗生素滥用和食品安全问题。与此同时，同样有抑菌效果的细菌活性物质走进人们的视野。抗菌活性物质是细菌在代谢过程中由核糖体合成基因编码的一类具有生物活性的多肽或蛋白质类物质，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等特点。
因此，筛选具有高耐盐特性、又有良好抑菌能力，并同时能产胞外多糖的菌株，并研究其生物学特性及对不同细菌和真菌的抑制作用，可为微生物源生物活性物质提供优质的资源，对于菌株的广泛应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种产胞外多糖、并可抑制细菌和农作物致病真菌的地衣芽孢杆菌菌株，该菌株具有较高的耐盐能力，能抑制金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌等致病菌。
本发明提供的技术方案为一种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019310，分类学命名Bacilluslicheniformis CZ186。
以及，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。
以及，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株在抑制棉花黄霉菌中的应用。
而且，所述菌株能耐受18％浓度的NaCl。
而且，所述菌株能产生胞外多糖。
而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于-20℃～80℃的温度条件。
而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于5～12的pH条件。
而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0～5％浓度NaCl的条件。
而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0～5mg/ml胰蛋白酶的条件。
与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种产胞外多糖、并可抑制细菌和农作物致病真菌的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，该菌株能抑制金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌等致病菌，且该菌株产生抗菌活性物质具有耐高盐、高温、强碱、以及抗蛋白酶的特性，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明的地衣芽孢杆菌的分离和鉴定方法如下：
地衣芽孢杆菌CZ186从新疆维吾尔自治区阿克苏地区盐碱地土样中分离得到。具体分离步骤为：称取新疆阿克苏地区盐碱地土样1g加入含有99mL无菌蒸馏水并带有玻璃珠的三角瓶中，放置于28℃摇床内振荡30min,取样做梯度稀释后，涂布于含有 20μg/mL氨苄霉素和5％的NaCl的牛肉膏蛋白胨平板中，置于37℃生化培养箱中培养 48h，从中筛选出菌株。以金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌为检测菌，采用牛津杯法，对分离的菌株产抗菌活性物质验证试验，筛选出对金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌具有较强抑菌能力，并且能产生较多胞外多糖的菌株CZ186。
采用16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列分析法，对菌株CZ186进行分子鉴定。将菌株接种到5ml LB培养液(蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g,NaCl 10.0g，H2O 1000mL)， 37℃、2000rpm/min培养24小时，8000rpm/min离心3min，收集菌体于1.5ml离心管中，采用CTAB法抽提细菌基因组。分别使用16S rDNA、gyrA和gyrB等引物，进行 PCR扩增，扩增产物经测序后与GenBank已登录的相关序列进行核苷酸序列同源性比对分析，与地衣芽孢杆菌相比，其16S rDNA、gyrA和gyrB序列相似性都达到99％,将其鉴定为这个种。
以下给出本发明的地衣芽孢杆菌CZ186的一些性能研宄结果：
实验1地衣芽孢杆菌CZ186耐盐能力测定
对地衣芽孢杆菌CZ186进行盐浓度耐受分析。倒置含有NaCl质量浓度为3％、5％、10％、15％、18％、20％的LB固体培养基平板，接种CZ186菌株后，置于37℃恒温培养箱倒置培养2d，每个处理做三个平行，观察生长状况。结果显示在NaCl质量浓度为 18％的条件下，菌体生长良好，表明CZ186菌株能耐受18％NaCl。
实验2菌株CZ186产生的活性物质对金黄色葡萄球菌和棉花黄霉菌的抑制作用
对分离的耐盐菌地衣芽孢杆菌CZ186进行抑菌性能测定，选取金黄色葡萄球菌作为指示细菌，取其活化后菌液均匀涂布好到LB培养基上。CZ186菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取菌株上清发酵液。将牛津杯置于涂布好金黄色葡萄球菌的LB培养基中。加入100μL CZ186菌株发酵液于牛津杯中，正置于37℃恒温培养箱中培养14h，每个处理做三个平行。结果显示CZ186菌株产生的活性物质对金黄色葡萄球菌有很强的抑制能力，其抑菌圈直径为2.87±0.05cm。
蘸取病原真菌棉花黄霉菌的孢子，涂抹到PDA培养基平板上，涂抹均匀。用镊子夹取已灭菌的牛津杯于涂布棉花黄霉菌的PDA培养基在固体平板中，向牛津杯中加入 100μLCZ186菌株发酵液，将平板置于30℃恒温培养箱中培养4d，每个处理做三个平行，观察抑菌效果。结果表明：CZ186菌株产生的发酵液活性物质对棉花黄霉菌有很强的抑制能力，其抑菌圈直径达到3.4±0.1cm。
实验3地衣芽孢杆菌CZ186产胞外多糖产酸能力
将活化的地衣芽孢杆菌菌液按5％的接种量接入到LB培养液，37℃摇床培养过夜。取10mL菌液，5000rpm离心15min，收集上清。上清中加入2倍10mL预冷的无色乙醇，4℃静置过夜。5000rpm离心15min，将沉淀转移至透析袋，于蒸馏水中透析过夜。将透析后的胞外多糖样品溶于双蒸水中，定溶。用葡萄糖作标准曲线，将获得的胞外多糖样品用硫酸-苯酚法测定。结果表明：CZ186菌液中胞外多糖含量为1.17±0.45 g/L，表明CZ186菌株具有很强的产胞外多糖能力。
实验4不同温度对菌株CZ186产生的活性物质抑菌能力的影响
菌株CZ186用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。上清发酵液分别经-20℃、20℃、37℃、60℃、80℃等不同温度处理，处理时间为2h，处理之后恢复室温。经不同温度处理的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ186菌株发酵液活性物质能耐受-20℃～80℃的温度条件，在此范围内，菌株发酵液活性物质都有很强的抗菌活性，其中在-20℃处理2h，其抑菌圈最高，达到3.47±0.06cm，而经80℃高温处理2h,菌株发酵液活性物质的抑菌圈为所有温度最低，但其活性仍达到-20℃处理处理时80％以上(表1)。表明CZ182菌株产生的活性物质具有很广的温度适应范围，可用于高温条件下抑制农作物致病真菌。
表1 CZ186菌株发酵液热稳定性检测结果
x±SD：表示抑菌圈大小(cm)的平均值±标准偏差。
实验5不同pH对菌株CZ186产生的活性物质抑菌能力的影响
取CZ186上清发酵液分别在pH 5、6、8、10、12等不同处理4h，处理之后恢复 pH至7。经不同pH处理的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ186菌株发酵液活性物质能耐受5-10的酸碱度环境，在此条件下，其发酵液活性物质都能保持较高的抗菌活性，在pH12时其发酵液活性物质仍然保持70％以上的活性(表2)。表明CZ186菌株产生的活性物质具有很广的碱度适应范围，可用于弱酸或强碱条件下抑制农作物致病真菌。
表2 CZ186菌株发酵液pH稳定性检测结果
x±SD：表示抑菌圈大小(cm)的平均值±标准偏差。
实验6盐对菌株CZ186产生的活性物质抑菌能力的影响
CZ186菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。上清发酵液分别添加灭菌的NaCl，使其终浓度分别为5％。将5％NaCl的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：在5％盐浓度下，CZ186菌株发酵液的抑菌圈达到1.82±0.2cm，表明CZ186菌株产生的活性物质具有较强的盐浓度适应范围，可用于5％高盐条件下抑制农作物致病真菌。
实验7胰蛋白酶对对菌株CZ186产生的活性物质抑菌能力的影响
进一步研究了CZ186菌株产生的活性物质对胰蛋白酶的抗性。在CZ186菌株发酵液中加入5mg/ml胰蛋白酶。反应3小时后，终止胰蛋白酶活性。将经胰蛋白酶处理的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ186菌株发酵液活性物质能耐受5mg/ml胰蛋白酶。经蛋白酶处理，其抑菌圈直径达到3.22±0.19cm，与没有胰蛋白酶处理的对照组相比，其活性物质还保持95％以上抑菌活力，说明菌株 CZ186产生的抗菌活性物质对蛋白酶具有很强的耐受性。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 801
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
gcaagtcgag cggaccgacg ggagcttgct cccttaggtc agcggcggac gggtgagtaa 60
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tgcttgattg aaccgcatgg ttcaatcata aaaggcggct tcggctgccg tttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420
ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
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gtccgggata agaaaatcga aggaatcaca gatctccgcg atgaatcaga ccgaaacgga 900
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cagccgaaag tattgagctt aaagcaatgt cttgagtatt acctcgatca ccagaaagtg 1080
gtaatcaaaa gacgtacggc tttcgaactt cgaaaagcgg aagcgagagc tcacattctt 1140
gagggcttga gggtcgctct ggaccacctt gatgaagtta tttccttaat cagaaactcg 1200
caaacggctg aaattgcgaa aaatgggtta atcgagaaat tttcattgac tgaaaaacaa 1260
gcacaagcca tcttagacat gcgtcttcag cggttaacag gtctcgaacg cgaaaaaatc 1320
gaagaagaat acaaaggctt ggttgagctg atcgcagagt taaaagcgat tttagcagac 1380
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<211> 1920
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gagccgcggc gaaacttcat cgaagaaaat gcccgctatg taaagaacct agatatttaa 1920

Claims (9)

1.一种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019310，分类学命名Bacillus licheniformis CZ186。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。
3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株在抑制棉花黄霉菌中的应用。
4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，其特征在于：所述菌株能耐受18％浓度的NaCl。
5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，其特征在于：所述菌株能产生胞外多糖。
6.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，其特征在于：所述菌株的发酵液活性物质至少适用于-20℃～80℃的温度条件。
7.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，其特征在于：所述菌株的发酵液活性物质至少适用于5～12的pH条件。
8.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，其特征在于：所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0～5％浓度NaCl的条件。
9.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CZ186菌株，其特征在于：所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0～5mg/ml胰蛋白酶的条件。
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