CN110564829B - 一种奶牛ncam2基因cnv标记辅助检测泌乳性状的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶牛NCAM2基因CNV标记辅助检测泌乳性状的方法及其专用试剂盒：利用实时定量PCR技术，以中国荷斯坦奶牛基因组DNA为模板，分别用两对引物P1、P2对牛NCAM2基因的CNV标记位点和内参基因BTF3的一段区域进行扩增，最后利用2*2^‑ΔΔCt的方法计算并判定个体的拷贝数变异类型，并将结果分为多拷贝型、缺失型和正常型。本发明可在DNA水平上检测与中国荷斯坦奶牛泌乳性状密切相关的CNV标记，可加快奶牛优良产乳性能的选育进程。该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种奶牛NCAM2基因CNV标记辅助检测泌乳性状的方法及其专 用试剂盒

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于实时定量PCR技术检测中国荷斯坦奶牛NCAM2基因CNV标记的方法。

背景技术

分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection，MAS)可以利用与数量性状相关的分子标记，以标记信息为辅助信息，从分子水平准确快速地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的选择。其能够充分利用遗传标记、系谱和表型信息，与常规育种方法相比，信息量更丰富、选择准确性更高。

DNA分子标记(DNA molecular marker)，是反映每个个体和种群间基因组特异性的DNA片段。分子标记包括限制性片段长度多态性标记(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增基因组DNA多态性标记(Random Amplified PolymorphicDNA，RAPD)、扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、微卫星DNA(Microsatellite，MS)和单核苷酸多态性标记(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)等。

相比之下，拷贝数变异(copy number variations，CNV)是一种新的变异形式，是指长度为1kb至数Mb的有关DNA片段拷贝数突变，包括DNA单一片段的扩增、缺失、***、倒置等，也包括复杂的染色体扩增、缺失和***的各种组合，由于其比SNPs和Indels覆盖范围更广，因此，遗传效应更大。

随着分子育种技术的不断完善，越来越多的变异被人们了解，近年来，SNP研究相对较多，而对CNV的研究相对较少，而其具有片段长度大、普遍存在、且覆盖的基因组范围广等优点，因此可能对畜禽性状造成显著影响，作分子育种标记的应用前景广阔。

目前，奶牛CNVs的研究逐渐增多。这是由于一方面日趋成熟的人类基因组CNVs检测技术对研究奶牛CNVs具有借鉴作用；而另一方面，奶牛基因组测序图谱的逐渐完善对CNVs的发展具有推动作用。CNVs图谱的建立和逐步完善，对奶牛经济性状、功能性状的研究，以及对促进奶牛遗传改良具有重要意义。

NCAM2基因表达产物是神经黏附分子2，其与神经***密切相关，而泌乳的相关过程受神经调控，但目前仅推测NCAM2基因与泌乳相关，而NCAM2基因的拷贝数变异对奶牛(例如，中国荷斯坦奶牛)泌乳性状的影响尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种奶牛NCAM2基因CNV标记辅助检测泌乳性状的方法及其专用试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测奶牛NCAM2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以奶牛(例如，中国荷斯坦)基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增NCAM2基因的CNV区域部分片段以及作为参考的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定奶牛个体NCAM2基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的NCAM2基因的CNV区域位于牛NCAM2基因参考基因组序列AC_000158.1的14873201位到14876400位。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型(Gain)，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型(Loss)，2*2^-ΔΔCt<2；正常型(Median)，2*2^-ΔΔCt＝2。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-TGGGCAATAGGTGATCCATCC-3’

下游引物R1：5’-TCAGCAGGAAAACACAGGCTAT-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’；

基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为130bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

优选的，所述的实时定量PCR的扩增体系包括：10ng/μL模板DNA 1.25μL、10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Mix 6.25μL及ddH₂O 3.75μL。

优选的，所述的实时定量PCR的反应程序为：(1)预变性：94℃，2min；(2)扩增反应：94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

优选的，上述检测奶牛NCAM2基因拷贝数变异的方法在奶牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，具有多拷贝型(Gain)拷贝数变异类型的中国荷斯坦奶牛个体在泌乳性状上较优，并且拷贝数变异位点与乳脂率具有显著的相关性(P<0.05)。

一种奶牛NCAM2基因CNV标记的检测试剂盒，包括上述引物对P1和P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明公开的检测NCAM2基因拷贝数变异的方法，通过实时定量PCR技术检测奶牛(例如，中国荷斯坦奶牛)的拷贝数变异情况，检测结果可以用于鉴定与提高奶牛泌乳性状相关(与产奶量、乳脂率、乳蛋白率、体细胞评分等重要泌乳性状进行关联)的候选分子遗传标记(CNV标记)。本发明与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数类型，同时为中国荷斯坦奶牛等奶牛品种的分子育种提供分子标记和实践依据，加快奶牛优良产乳性能的选育进程。

附图说明

图1为本发明实施例中进行QPCR绘制的扩增曲线。

图2是本发明实施例中进行QPCR绘制的溶解曲线。

图3是本发明实施例中NCAM2基因拷贝数变异在奶牛群体中的分布。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

基于前期的牛基因组重测序研究，发现牛NCAM2基因组序列AC_000158.1的14873201位到14876400位存在拷贝数变异，本发明基于NCAM2基因的功能以及CNV的调节机制，发现了NCAM2基因的拷贝数变异与泌乳性状的关联性，并为奶牛分子育种、提高产奶量和奶品质提供重要的实践依据。

本发明基于QPCR技术来检测CNV标记，并将数据利用2*2^-ΔΔCt进行处理，拷贝数变异结果分为三类：2*2^-ΔΔCt>2为多拷贝型；2*2^-ΔΔCt<2为缺失型，2*2^-ΔΔCt＝2为正常型。

1.样品的采集及基因组DNA提取

(1)血样采集和数据收集

本发明中从陕西省西安市草滩农场奶牛场共采集血样310个(2015年8月采集)，样本均为成年中国荷斯坦奶牛母牛，血液的采集方法为颈静脉采血，用冰盒带回实验室，于-80℃储存；采样时对相应个体进行基础数据测定(泌乳量、脂肪含量、蛋白含量等)采集和录入，以用于后期的关联分析。

(2)血样DNA的提取

利用酚-氯仿法对样品进行基因组DNA提取。

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取2mL血液于2.0mL离心管中，4℃12000rpm离心10min；弃掉液体，保留沉淀，加入1.5mL的PBS缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮起来，冰上温和摇动15min；4℃12000rpm离心10min，弃掉液体，保留沉淀；

②将沉淀捣碎，呈絮状，在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL和蛋白酶K 6μL，在恒温水浴箱中37℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；

③加入1mL Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌2.0mL离心管。

④加入0.5mL的饱和酚和0.5mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min；，将上层水相转入另一灭菌的2.0mL离心管。

⑤加入1mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃，12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到1.5mL离心管中；

⑥加入1mL预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻扣底摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min；4℃，12000rpm离心10min，弃去乙醇；

⑦加入70％乙醇1mL，温和摇动10min；4℃，12000rpm离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次；室温放置30min，60℃烘箱30s，使乙醇挥发干净；

⑧加入超纯水50μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

2.目的基因及参考基因的扩增

以NCBI所公布的牛NCAM2基因(AC_000158.1)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即NCAM2基因(目的基因)组序列的14873201位到14876400位。利用Prime 5.0软件设计被包含在此区域的引物，并在NCBI_BLAST中进行比对。引物序列如下(引物对P1)，PCR产物片段大小为130bp：

上游引物F1：5’-TGGGCAATAGGTGATCCATCC-3’

下游引物R1：5’-TCAGCAGGAAAACACAGGCTAT-3’；

同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因(BTF3基因)中特定片段(166bp)的引物，其引物序列如下(引物对P2)：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’

以上引物设计完成时间为：2018年5月。

3.实时荧光定量(QPCR)

通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于实时定量PCR分析。扩增曲线平滑，表明QPCR扩增体系和条件合适(图1)；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(图2)。

QPCR扩增体系如表1所示。

表1.QPCR的反应体系

实时定量PCR的反应程序为：

(1)预变性：94℃，2min；

(2)扩增反应：94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

4.CNV类型的计算

每个样品分别用目的基因序列和参考基因序列的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_对照组。实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-ΔΔCt表示的是实验组目的基因序列的拷贝数相对于对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

当扩增的目的基因序列为正常型序列时，2*2^-ΔΔCt＝2；当扩增的目的基因序列为缺失型序列时，2*2^-ΔΔCt<2；当扩增的目的基因序列为多拷贝型序列时，2*2^-ΔΔCt>2。

5.数据分析

统计检测群体中各种拷贝数变异类型的个体数，并统计各种类型的频率。计算公式如下：

PC＝NC/N

其中，PC代表某种拷贝数类型的频率；NC代表群体中具有C(Gain、Median或Loss)这种CNV类型的个体数；N代表检测群体的总数量。

利用SPSS(18.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响泌乳性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数类型；E_ijk为随机误差。

数据处理的结果如表2所示。

表2.NCAM2基因与奶牛不同泌乳性状关联分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05。

根据基因型的统计结果(图3，及表2中的N1、N2、N3)，确定了牛NCAM2基因(AC_000158.1)组序列的14873201位到14876400位内的拷贝数变异位点在采样的中国荷斯坦奶牛中的分布，符合多态性。

关联分析结果表明(见表2)：该位点奶牛的多拷贝型(Gain)相比于其他两种类型，对牛乳中脂肪含量有显著增加的作用，且对牛乳中蛋白质含量及对牛奶的产量具有一定的正面作用。

以上结果表明，以上结果表明NCAM2基因上的该CNV位点可以作为一个提高中国荷斯坦奶牛泌乳性状的候选分子遗传标记位点，加快奶牛优良产乳性能的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种奶牛NCAM2基因CNV标记辅助检测泌乳性状的方法及其专用试剂盒

<160> 4

<210>1

<211>21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

tgggcaatag gtgatccatc c 21

<210>2

<211>22

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

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<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

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<210>4

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (4)

1.一种检测奶牛NCAM2基因CNV标记的方法，包括以下步骤：

以奶牛基因组DNA为模板，分别通过实时定量PCR扩增NCAM2基因的CNV区域部分片段以及作为参考的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定奶牛NCAM2基因的拷贝数变异类型；

所述的NCAM2基因的CNV区域位于牛NCAM2基因参考基因组序列AC_000158.1的14873201位到14876400位；

所述的拷贝数变异类型是根据2*2^−ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^−ΔΔCt >2；缺失型，2*2^−ΔΔCt<2；正常型，2*2^−ΔΔCt=2；

所述的NCAM2基因的CNV区域部分片段的扩增引物对为：

上游引物F1：5’- TGGGCAATAGGTGATCCATCC -3’

下游引物R1：5’- TCAGCAGGAAAACACAGGCTAT -3’ ；

所述的BTF3基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’ ；

所述的奶牛选自中国荷斯坦奶牛个体；

具有多拷贝型拷贝数变异类型的中国荷斯坦奶牛个体在泌乳性状乳脂率上较优。

2.如权利要求1所述一种检测奶牛NCAM2基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时定量PCR的扩增体系包括10 ng/μL模板DNA 1.25 μL，及10 μmol/L的扩增引物对所对应的上、下游引物各0.5 μL。

3.如权利要求1所述一种检测奶牛NCAM2基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时定量PCR的反应程序为：预变性：94 ℃，2 min；扩增反应：94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

4.一种奶牛NCAM2基因拷贝数变异标记的检测试剂盒，其特征在于：包括用于实时定量PCR中扩增NCAM2基因的拷贝数变异标记位点的引物对，所述的拷贝数变异标记位点位于牛NCAM2基因参考基因组序列AC_000158.1的14873201位到14876400位内；

NCAM2基因的拷贝数变异区域部分片段的扩增引物对为：

上游引物F1：5’- TGGGCAATAGGTGATCCATCC -3’

下游引物R1：5’- TCAGCAGGAAAACACAGGCTAT -3’ ；

BTF3基因的部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’ ；

拷贝数变异类型是根据2*2^−ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2^−ΔΔCt >2；缺失型，2*2^−ΔΔCt<2；正常型，2*2^−ΔΔCt=2；

所述的奶牛选自中国荷斯坦奶牛个体；

具有多拷贝型拷贝数变异类型的中国荷斯坦奶牛个体在泌乳性状乳脂率上较优。

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