CN110563800B - 一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为LPPYLP。本抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用较小，对癌细胞的抑制率可达50％以上，而对正常细胞的抑制率在10％以下。

Description

一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤活性肽技术领域，尤其是一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
在全球范围内，癌症的发病率和死亡率一直居高不下。大多数癌症患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速导致早期诊断困难；并且目前对于癌症的治疗主要是以手术切除为主、辅助化疗、热疗等综合治疗。经治疗后，癌症患者的病情能暂时得到控制，然而手术治疗后肿瘤的耐药、复发和转移等情况经常发生，往往成为患癌人群死亡的主要原因。肝脏是机体内最大的消化腺，同时又是机体物质代谢的中心。原发性肝癌是发病率和死亡率较高的一种疾病，在原发性肝癌中，肝细胞癌所占的比重约为70％-90％。肝癌的防治一直是生命科学和医学尚未攻克的难题，因此，开发出一种安全无毒的适合癌症病人日常食用及手术等治疗后用于保健的功能性食品或针对于肿瘤病人的高效无毒的临床药物能在一定程度上缓解癌症病情和减轻患者痛苦。
现代营养学研究发现，人体对蛋白质的消化吸收主要是以低肽的形式吸收。据报导，肽的吸收机制优于蛋白质和氨基酸。当前关于肽的活性研究主要集中于其抗氧化、抑菌和降血压等发面。抗肿瘤活性肽作为一种新型的治疗癌症的药物，对肿瘤细胞具有选择性、不易引起耐药性，正越来越受到人们的关注。当前关于抗肿瘤多肽的研究，主要来源是海洋生物类，制备成本高，种类少。无论从安全性还是营养保健价值方面考虑，玉米肽作为抗肿瘤功能性食品将具有很大的潜力。从食品安全性上考虑，天然抗肿瘤物质具有合成抗肿瘤剂无法比拟的优势，现已成为当今食品和医学专家追求的目标。
通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
1、抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用(CN108314707A)，所述抗肿瘤活性肽物质包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种。所述的抗肿瘤活性肽物质的制备方法，包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液热变性处理获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述变性豌豆蛋白水溶液获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集不同分子量组分；4)将所述收集到的组分中具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；5)将所述步骤4)中收集的层析峰组分经RP-HPLC进一步分离获得抗肿瘤活性肽物质。所述抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微。
2、一种贻贝来源的ACE抑制及抗肿瘤活性肽(CN201811214661.9)，其氨基酸序列为Arg Tyr ProAsp Pro Leu。本发明先采用高效液相色谱串联质谱进行紫贻贝酶解低聚肽产品进行分析鉴定及高效率的活性筛选，获得具有潜在降压及抗肝癌活性的小分子肽，通过SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱色谱及高效液相色谱分离纯化获得。该新型的小分子活性肽具有很强的ACE抑制活性及抗肝癌活性，属于食源性活性肽，可用于心脑血管疾病及肝癌相关疾病的治疗，尤其是高血压疾病的保健及治疗，可用于食品、保健品及生物医药制品的开发，具有广阔的应用前景。
3、一种牡蛎来源的ACE抑制及抗肿瘤活性肽(CN201811214654.9)，所述活性肽其氨基酸序列为Lys Tyr Pro Leu Pro Arg。本发明先采用高效液相色谱串联质谱进行牡蛎酶解低聚肽产品进行分析鉴定及高效率的活性筛选，获得具有潜在降血压及抗癌作用的高活性小分子肽，然后对牡蛎酶解低聚肽产品通过SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱色谱及高效液相色谱分离纯化获得小分子肽并进行活性验证。结果表明该小分子活性肽具有很强的ACE抑制活性及抗乳腺癌活性，属于食源性降压肽，可用于心脑血管疾病及乳腺癌相关疾病的治疗，尤其是高血压疾病的保健及治疗，可用于食品、保健品及生物医药制品的开发，具有广阔的应用前景。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用，该抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用较小，对癌细胞的抑制率可达50％以上，而对正常细胞的抑制率在10％以下。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种抗肿瘤活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
而且，所述抗肿瘤活性肽来源于玉米低聚肽。
而且，所述抗肿瘤活性肽为玉米低聚肽的分离纯化产物；或者，所述抗肿瘤活性肽的纯度大于95％。
如上所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，步骤如下：
⑴离子交换层析分离玉米低聚肽，分别收集所带电荷量不同的组分；
⑵检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；
⑶将步骤⑵中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；
⑷检测步骤⑶中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经LC-MS/MS鉴定；
⑸人工合成可能具有抗肿瘤活性的氨基酸序列，筛选获得抗肿瘤活性肽。
而且，所述步骤⑴中离子交换层析用DEAE-FF，柱体积：1.5cm×10cm；或者，所述步骤⑶中分子筛层析用Sephadex G-15，柱体积：1.0cm×70cm。
而且，所述步骤⑴中离子交换层析的分离流速：4mL/min；上样量：50mg/mL，4mL；洗脱液：0-1.0mol/LNaCl-Tris-Hcl溶液，每40min一个梯度。
而且，所述步骤⑶中分子筛层析分离流速：1mL/min；上样量：50mg/mL，1mL；洗脱液：超纯水。
如上所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，所述方法为化学合成的方法。
如上所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤功能性食品中的应用。
而且，所述抗肿瘤活性肽在使用时的浓度为500～2000μg/mL；或者，所述肿瘤的肿瘤细胞系包括人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株Hep3B。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用较小，对癌细胞的抑制率可达50％以上，而对正常细胞的抑制率在10％以下。
2、本发明抗肿瘤活性肽的制备方法以玉米低聚肽为原料，工艺简单，成本低廉，应用范围广泛；对开发利用含有所述抗肿瘤活性肽的临床药物奠定了理论基础；为开发利用含有所述抗肿瘤活性肽的功能性食品的生产具有指导意义。
附图说明
图1为本发明中抗肿瘤活性肽中LPPYLP的质谱图；
图2为本发明中玉米肽20150727经DEAE-FF阴离子交换柱洗脱曲线图；
图3为本发明中DEAE-1经SephadexG-15分离曲线图；
图4为本发明中DEAE-2经SephadexG-15分离曲线图；
图5为本发明中6种玉米肽组分和5-FU对人肝癌细胞HepG2的抑制率和对人正常肝细胞L-02的毒性作用图；以上抑制率是在样品作用浓度为1mg/mL时作用24h后测定的；
图6为本发明中注释后的MS2谱图；
图7为本发明中验证实施例1、2中四个抗肿瘤活性肽对两株人源肝癌细胞和一株人正常肝细胞作用的抑制率图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种抗肿瘤活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1：LPPYLP。
较优地，所述抗肿瘤活性肽来源于玉米低聚肽。
较优地，所述抗肿瘤活性肽为玉米低聚肽的分离纯化产物；或者，所述抗肿瘤活性肽的纯度大于95％。
如上所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，步骤如下：
⑴离子交换层析分离玉米低聚肽，分别收集所带电荷量不同的组分；
⑵检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；
⑶将步骤⑵中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；
⑷检测步骤⑶中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经LC-MS/MS鉴定；
⑸人工合成可能具有抗肿瘤活性的氨基酸序列，筛选获得抗肿瘤活性肽。
较优地，所述步骤⑴中离子交换层析用DEAE-FF，柱体积：1.5cm×10cm；或者，所述步骤⑶中分子筛层析用Sephadex G-15，柱体积：1.0cm×70cm。
较优地，所述步骤⑴中离子交换层析的分离流速：4mL/min；上样量：50mg/mL，4mL；洗脱液：0-1.0mol/LNaCl-Tris-Hcl溶液，每40min一个梯度。
较优地，所述步骤⑶中分子筛层析分离流速：1mL/min；上样量：50mg/mL，1mL；洗脱液：超纯水。
如上所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，所述方法为化学合成的方法。
如上所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤功能性食品中的应用。
较优地，所述抗肿瘤活性肽在使用时的浓度为500～2000μg/mL；或者，所述肿瘤的肿瘤细胞系包括人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株Hep3B。
本发明提供了一种抗肿瘤活性肽，包括氨基酸序列如Seq ID No.1所示的活性肽。在本发明中所述抗肿瘤活性肽中活性肽的氨基酸序列为Seq ID No.1：LPPYLP。在本发明中所述抗肿瘤活性肽优选来源于玉米低聚肽，所述抗肿瘤活性肽优选的为玉米低聚肽分离纯化产物。在本发明中所述抗肿瘤活性肽中具体的氨基酸序列如Seq ID No.1所示的活性肽的纯度优选的大于95％。本发明中所述活性肽可以通过玉米低聚肽分离纯化获得，也可以采用化学合成的方法获得；所述化学合成优选的委托生物公司进行，在本发明具体实施过程中优选的委托苏州强耀生物科技有限公司。
本发明还提供了所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，为酶解玉米低聚肽的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：1)离子交换层析分离市售玉米肽，按峰收集各层析峰组分；2)检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；3)将所述收集到的组分中具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；4)检测步骤3)中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经LC-MS/MS鉴定；5)人工合成可能具有抗肿瘤活性的氨基酸序列，获得抗肿瘤活性肽。
在本发明中，所述玉米低聚肽优选的为玉米低聚肽粉；所述玉米低聚肽粉优选的为市售玉米低聚肽粉产品；在本发明具体实施过程中，所述玉米低聚肽粉由新生肽生物科技有限公司提供。
本发明在获得所述玉米低聚肽粉后，离子交换层析分离所述玉米低聚肽，按峰收集各层析峰组分。在本发明中所述离子交换筛层析优选的为琼脂糖凝胶层析；所述琼脂糖凝胶层析的填料优选的为DEAE-FF。在本发明具体实施过程中，所述琼脂糖凝胶层析的柱体积优选的为20mL，上样量优选的为200mg(4mL)，流动相优选的为0-1.0mol/LNaCl-Tris-Hcl溶液，每40min一个梯度，流速优选的为4mL/min，检测波长优选的为280nm；所述检测器为紫外检测器。
本发明优选将收集到所带电荷量不同组分的滤过液并经旋转蒸发仪浓缩后冻干成肽粉，优选的在55℃～60℃之间进行旋转蒸发；检测所述肽粉的抑癌活性。在本发明中，检测不同分子量的组分对癌细胞生长的抑制作用为将所述不同分子量的组分加到细胞培养液DMEM中，检测细胞生长情况，本发明中优选的采用MTT法检测本发明中所述肽粉的抑癌活性。
本发明在获得抗肿瘤活性组分，将步骤3)所述抗肿瘤活性组分经分子筛层，按峰收集各层析峰组分。在本发明中所述分子筛层析优选的为葡聚糖凝胶层析；所述葡聚糖凝胶层析的填料优选的为Sephadex G-15。在本发明具体实施过程中，所述葡聚糖凝胶层析的柱体积优选的为85mL，上样量优选的为50mg(1mL)，流动相优选的为超纯水，流速优选的为1mL/min，检测波长优选的为214nm；所述检测器为紫外检测器。
本发明在所述的葡聚糖凝胶层析后，按峰收集各层析液，将所述收集到的各层析峰组分冷冻干燥获得各层析峰干粉，保存备用。
本发明将各层析峰干粉加到细胞培养液DMEM中，检测各个峰的层析液对癌细胞的抑制作用。本发明中优选的采用MTT法检测各个峰的抑癌活性。
本发明在所述分子筛层析分离后，优选的将收集到的分离后的组分分别进行多肽氨基酸结构鉴定。在本发明中所述氨基酸结构鉴定优选的采用高效液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS。在本发明中所述分离后组分的氨基酸序列为LPPYLP。
本发明还提供了一种所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤功能性食品中的应用。在本发明中所述肿瘤细胞株优选的包括人肝癌细胞株HepG2和人肝癌细胞株Hep3B。在本发明中所述抗肿瘤活性肽在应用过程中各个活性肽的纯度优选的大于95％。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
一、本发明抗肿瘤活性肽的制备实施例：
碱性蛋白酶酶解玉米低聚肽制备抗肿瘤活性肽，步骤如下：
(1)采用离子交换层析DEAE-FF分离玉米低聚肽；根据实验结果选择DEAE-FF为填料，柱体积为20mL，上样量为200mg(4mL)，流动相为超纯水，流速为4mL/min，每2min收集一管，共收集100管，检测波长为280nm。按峰收集各组分冷冻干燥，保存备用；
(2)将水解后得到的玉米低聚肽水解液进行冷冻干燥，将干燥粉溶解在细胞培养液DMEM中，制备成含玉米肽的细胞培养液用于测定对癌细胞生长的抑制作用；
(3)采用分子筛层析Sephadex G-15分离抗肿瘤活性高的活性肽组分；
将经离子交换层析分离得到的抑制癌细胞生长活性最强的组分通过葡聚糖凝胶色谱继续分离纯化，根据实验结果选择Sephadex G-15(分离范围：分子量<1KDa)为填料，柱体积为85mL，上样量为50mg(1mL)，流动相为超纯水，流速为1mL/min，每2min收集一管，共收集100管，检测波长为214nm。按峰收集各组分冷冻干燥，保存备用。
(4)将抗肿瘤活性高的活性肽组分经LC-ESI-MS/MS鉴定得到抗肿瘤活性肽序列。
对液相分离得到的活性较高的两个组分中活性肽的结构进行鉴定，将需要鉴定的样品使用Stagetip C18进行脱盐。将样品用液相的洗脱液A(0.1％甲酸/水)重新溶解，取10μL样品通过超高效液相色谱(UPLC，Waters NanoACQUITY)的进样阀上样到C18柱(3μm,
Figure BDA0002178680440000061
75μm x 15cm)进行梯度洗脱。A液(0.1％甲酸/水)；B液(0.1％甲酸/乙腈)；流速：400nL/min。梯度洗脱程序(120min)如下表所示。
表1 梯度洗脱程序(120min)
Figure BDA0002178680440000071
超高效液相色谱通过纳升级电喷雾离子源(nESI)连接到四级杆-轨道阱质谱(Quadrupole-Orbitrap)，质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive喷雾电压：2.0kV毛细管温度：320℃。S-lens RF Level:55分辨率设置：一级70,000@m/z 200，二级17,500@m/z200；母离子扫描范围：m/z 300-1800；子离子扫描范围：start from m/z100；MS1 AGC:3e6，离子注入时间：60ms；MS2 AGC:1e6，离子注入时间：50ms；离子筛选窗口：2.2m/z；碎裂模式：HCD，能量NCE 27；Data-dependent MS/MS：Top 20；动态排除时间：60s。
鉴定获得抗肿瘤活性肽的氨基酸序列为LPPYLP。
具体地，相关的材料与方法可以如下：
2.1主要仪器与试剂恒流泵：上海市青浦沪西仪器厂；收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；Sephadex G-15：美国Sigma-Aldrich公司；NaOH(浓度0.5mol/mL)：上海迈瑞尔化学技术有限公司；纯净水：哇哈哈集团有限公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；-20℃冰箱：中科美菱；冷冻干燥机：德国CHRIST公司。
2.2实验原理离子交换层析是发展最早的层析技术之一，阴离子和阳离子交换树脂都可用来分离生物活性肽，其分离效果主要取决于阴离子和阳离子的电荷强弱。
分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在540nm或490nm波长测定其吸光度值，可直接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
2.3实验方法
2.3.1离子交换层析
柱体积：1.5cm×10cm；流速：4mL/min；上样量：50mg/mL，4mL；收集：8mL/管；洗脱液：0-1.0mol/LNacl-Tris-Hcl溶液，每40min一个梯度。
96孔板每孔100μL，检测波长为214nm、220nm、280nm。按峰收集各组分。
收集的组分旋蒸浓缩，60℃，转速40
将旋蒸浓缩的样品倒入平皿中，覆上有孔的保鲜膜，在-80℃的冰箱中预冻。预冻完成后，放入冻干机冻干15小时。
2.3.2分子筛层析
柱体积：1.0cm×70cm；流速：1mL/min；上样量：50mg/mL，1mL；收集：3mL/管；洗脱液：超纯水。
96孔板每孔100μL，检测波长为214nm、220nm、280nm。按峰收集各组分。
收集的组分旋蒸浓缩，60℃，转速40
将旋蒸浓缩的样品倒入平皿中，覆上有孔的保鲜膜，在-80℃的冰箱中预冻。预冻完成后，放入冻干机冻干15小时。
2.3.3细胞培养
2.3.3.1接种细胞
用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞成单细胞悬液，细胞计数法调整细胞密度为5×104个/mL，以5×104个/孔接种到96孔板中，每孔100μL。
2.3.3.2培养细胞
在37℃，5％CO2条件下培养过夜，待细胞贴壁后，向实验组每孔分别加入200uL 6种玉米肽组分终浓度为1mg/mL的细胞培养液DMEM(L-02细胞培养液为1640培养液)中，对照组中只加200uL培养液，每孔6个平行，37℃，5％CO2条件下继续培养24h。
2.3.3.3加样，再培养及呈色
细胞培养24h后，弃去旧培养液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL和180μL培养液，37℃再培养4h后，终止培养，小心吸去孔内培养液上清，每孔加入150μLDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。
2.3.3.4比色
以空白孔调零，在490nm处测定各孔吸光度值，记录结果。
2.3.3.5抑制率计算公式
Figure BDA0002178680440000091
2.3.4LC-MS/MS鉴定多肽序列
将需要鉴定的样品使Stagetip C18进行脱盐。将样品用液相的洗脱液A(0.1％甲酸/水)重新溶解，取10μL样品通过超高效液相色谱(UPLC，Waters NanoACQUITY)的进样阀上样到C18柱(3μm,
Figure BDA0002178680440000092
75μm x 15cm)进行梯度洗脱。A液(0.1％甲酸/水)；B液(0.1％甲酸/乙腈)；流速：400μL/min。梯度洗脱程序(120min)如表1所示。
超高效液相色谱通过纳升级电喷雾离子源(nESI)连接到四级杆-轨道阱质谱(Quadrupole-Orbitrap)，质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive喷雾电压：2.0kV毛细管温度：320℃。S-lens RF Level:55分辨率设置：一级70,000@m/z 200，二级17,500@m/z200；母离子扫描范围：m/z 300-1800；子离子扫描范围：start from m/z100；MS1 AGC:3e6，离子注入时间：60ms；MS2 AGC:1e6，离子注入时间：50ms；离子筛选窗口：2.2m/z；碎裂模式：HCD，能量NCE 27；Data-dependent MS/MS：Top 20；动态排除时间：60s。
结果与讨论：
1、离子交换层析分离结果
玉米肽20150727经DEAE-FF阴离子交换柱分离后得到两个组分D-1和D-2。结果如图2所示。
2、分子筛层析分离结果
DEAE-1分离出两个组分D-1-1和D-1-2，结果如图3所示。
以DEAE-2为分离样品，Sephadex G-15分子筛层析分离，检测波长为214nm，分离出两个组分D-2-1和D-2-2，结果如图4所示。
3、分子筛层析分离结果
终浓度为1mg/ml的6种玉米肽不同组分对人肝癌细胞HepG2细胞均有抑制作用，其中D-2-2对人肝癌细胞HepG2抑制率为49.86％，接近于抗癌药物五氟尿嘧啶的抑制率；终浓度为1mg/ml的6种玉米肽不同组分对人正常肝细胞L-02细胞的毒性作用均低于抗癌药物五氟尿嘧啶。结果如图5所示。
4、LC-MS/MS鉴定
将采集到的原始数据首先使用De Novo软件进行从头测序分析。样本鉴定到的多肽数目为3827条，可根据多肽打分进一步对鉴定到的多肽进行筛选。研究表明，活性肽的活性大小与分子量大小和氨基酸组成、排列息息相关。由于精氨酸可通过一氧化氮(NO)诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的多胺合成等抑制肿瘤细胞的生长，含有精氨酸的肽段由于可作为精氨酸的补充剂也具有一定的抗肿瘤活性。另有研究表明，富含脯氨酸的多肽有辅助抗氧化和抗肿瘤的功能。除此之外，抗肿瘤活性肽还具有分子量较小、疏水性值较高等特点。综上，在鉴定出的肽段中选择出了LPPYLP为可能的活性肽段。结果如表4和图6所示。
表4 可能的活性肽段
Figure BDA0002178680440000101
二、本发明抗肿瘤活性肽的相关验证实施例如下：
验证实施例1
MTT法检测抗肿瘤活性肽对人源癌细胞的抑制率，步骤如下：
将抗肿瘤活性肽以一定浓度(500～2000μg/mL)加到细胞培养液DMEM中，用于检测抗肿瘤活性肽对癌细胞体外生长的抑制作用，操作步骤如下：
a.将处于对数期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液，计数后，调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔100mL接种到96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时；
b.向实验组细胞中每孔加200μL含相应浓度抗肿瘤活性肽的细胞培养液，空白对照组加200μLDMEM培养液，以含相同浓度玉米低聚肽粉的培养液为阴性对照和含相同浓度5-FU的培养液为阳性对照，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养24小时；
c.吸出旧培养液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL和细胞培养液180μL，37℃再培养4小时后，小心吸出培养上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡15分钟，使紫色结晶物充分溶解；
d.用酶标仪在490nm或570nm处测定每孔的吸光度值(A值)，以空白孔调零，按公式计算抑制率。
验证实施例2
MTT法检测抗肿瘤活性肽对人正常细胞的抑制率，步骤如下：
将抗肿瘤活性肽以一定浓度(500～2000μg/mL)加到细胞培养液1640中，用于检测抗肿瘤活性肽对人正常细胞体外生长的抑制作用，操作步骤如下：
a.将处于对数期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液，计数后，调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔100mL接种到96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时；
b.向实验组细胞中每孔加200μL含相应浓度抗肿瘤活性肽的细胞培养液，空白对照组加200μL1640培养液，以含相同浓度玉米低聚肽粉的培养液为阴性对照和含相同浓度5-FU的培养液为阳性对照，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养24小时；
c.吸出旧培养液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL和细胞培养液180μL，37℃再培养4小时后，小心吸出培养上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡15分钟，使紫色结晶物充分溶解；
d.用酶标仪在490nm或570nm处测定每孔的吸光度值(A值)，以空白孔调零，按公式计算抑制率。
结果与讨论：
抗肿瘤活性验证：
作用时间为24h时，合成肽对人肝癌细胞HepG2、Hep3B均较好的抑制作用，抑制率均在50％，接近阳性药物5F。合成肽对人正常肝细胞L02的毒性不高于10％，显著低于阳性药物5F。如果如图7所示。
综上，本发明提供的抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用较小，对癌细胞的抑制率可达50％以上，而对正常细胞的抑制率在10％以下。本发明提供的抗肿瘤活性肽的制备方法以玉米低聚肽为原料，工艺简单，成本低廉，应用范围广泛。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 活性肽的氨基酸序列(Unknown)
<400> 1
Leu Pro Pro Tyr Leu Pro
1 5

Claims (1)

1.一种抗肿瘤活性肽，其特征在于：所述活性肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
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