CN110559334A - 五月茶叶和果提取物及在防治乳腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种山地五月茶(Antidesma montanum)叶和果的提取物在抑制MCF‑7和MDA‑MB‑231乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的应用,属于生物医药技术领域。五月茶是大戟科五月茶属的植物,其成熟果实和叶的乙醇提取物都具有抑制MCF‑7及MDA‑MB‑231乳腺癌细胞增殖的能力。五月茶叶的抑癌活性成分主要集中乙酸乙酯萃取相,含有穗花杉双黄酮活性成分,能够阻止MDA‑MB‑231细胞迁移和侵袭。五月茶的果和叶具有抗癌潜力,有望开发为茶及果的相关保健产品。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种植物提取物,具体涉及一种五月茶叶和果的提取物及在乳腺癌预防及治疗中的应用。
背景技术
当今社会,癌症和心脑血管疾病等慢性病已成为威胁人类生存的主要疾病,每天摄入高比例的水果可明显降低癌症和心脑血管疾病等慢性疾病的发病率。乳腺癌是女性恶性肿瘤发病率最高的疾病,占所有新发女性恶性肿瘤的30%。全世界每年约有50万妇女死于乳腺癌,而且乳腺癌发病人数还在逐年增加。
MCF-7是一种研究乳腺癌的经典细胞模型,MDA-MB-231是一种三阴性(triple-negative breast cancer,TNBC)乳腺癌细胞。TNBC是指***受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)均为阴性的乳腺癌,约占乳腺癌患者整体的15%。TNBC具有侵袭性高、局部复发早、全身转移快、整体预后差等特点,化疗是TNBC患者目前唯一有效药物治疗手段,急需寻找新的治疗药物及有效的治疗方法。从植物中发掘***的活性药物一直是全世界医药科研工作者研究的方向。
五月茶的果实、叶和根是传统医药成分。嫩叶可以泡茶,果具有药食两用性,可以制作果酱、果酒。通过对多种热带野生水果乙醇提取物的活性筛选发现:五月茶叶和果的提取物具有较好抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的活性,进一步研究发现五月茶叶的提取物能有效抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭。五月茶果和叶提取物有望成为一种潜在的乳腺癌预防和治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供了一种能抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的五月茶叶和果的提取物,该提取物可作为中药成分用于乳腺癌的预防和治疗。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:提供一种五月茶叶和果提取物具体制备过程如下:
(1)采集山地五月茶(Antidesma montanum)的叶或果,室内自然干燥或或35~45℃烘箱干燥,粉碎;
(2)用浓度60%~80%的乙醇浸泡提取,超声波辅助提取,过滤提取液,用减压旋转蒸发仪去除溶剂,获得浓缩的提取物浸膏;
(3)上述提取物浸膏用蒸馏水溶解,依次分别加入2~5倍体积的石油醚及乙酸乙酯进行萃取,将乙酸乙酯萃取相进行减压旋转蒸发获得该相提取物。
该相提取物为穗花杉双黄酮活性成分。
本发明的另一目的在于提供五月茶叶和果在防治乳腺癌中的应用,包括:
五月茶叶和果应用在抑制乳腺癌细胞增殖;
五月茶叶和果应用在抑制乳腺癌细胞迁移;
五月茶叶和果应用在抑制乳腺癌细胞侵袭。
将上述提取物溶于进行MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖影响实验。
将上述五月茶叶提取物溶于进行MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移、侵袭、流式细胞周期影响实验。
经HPLC-MS/MS检测五月茶叶中含有穗花杉双黄酮活性成分。
本发明所涉及五月茶叶和果的提取物能明显抑制乳腺癌细胞的增殖,且五月茶叶的提取物能抑制高迁移能力MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭。上述结果表明,本发明所述五月茶叶和果的提取物具备较好的抗乳腺癌活性,在乳腺癌的预防及治疗方面具备潜在的应用价值。
所述五月茶叶和果的提取物用于乳腺癌治疗以及制备抗癌药物。
本发明获得具有抑制乳腺癌细胞增殖活性的叶和果的活性提取物,可作为抗癌药物。
附图说明
图1为本发明山地五月茶(A.montanum)叶乙醇提取物对MCF-7及MDA-MB-231细胞增殖活力的影响。
图2为本发明山地五月茶(A.montanum)果乙醇提取物对MCF-7及MDA-MB-231细胞增殖活力的影响。
图3为本发明山地五月茶(A.montanum)叶乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞迁移的影响。
图4为本发明山地五月茶(A.montanum)叶乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞侵袭的影响。
图5为本发明山地五月茶(A.montanum)叶乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞周期的影响。
图6为本发明山地五月茶(A.montanum)叶乙酸乙酯萃取相HPLC总离子流图。
图7为活性成分穗花杉双黄酮的质谱图。
图8为穗花杉双黄酮对MCF-7及MDA-MB-231细胞增殖活力的影响。
具体实施方式
实施例1、五月茶叶和果的活性成分提取
实验材料:山地五月茶(A.montanum)的鲜叶及果采自海南省万宁市兴隆。
采集的鲜叶和鲜果干燥后粉碎,过40目筛,按1:2~1:5体积比加入浓度60~80%乙醇浸泡,超声波提取3次,每次30min。提取液经过减压旋转蒸发浓缩近干,以超纯水溶解后,依次用石油醚(60~90℃沸程)、乙酸乙酯、正丁醇萃取,各个萃取相经过减压旋转蒸发浓缩近干,以DMSO溶解配制成相应浓度进行细胞活性测试,使培养基中DMSO含量小于0.1%。
实施例2、CCK-8方法测定抑制乳腺癌细胞增殖活性
96孔板,按每孔接种4000个MCF-7细胞和2000个MDA-MB-231细胞,待细胞贴壁后加入不同浓度提取物的培养液(含0.25%HEPES),以0.1%DMSO培养基为阴性对照。在处理72h后加入CCK-8,放入CO2培养箱1h后用酶标仪读取450nm吸光度,细胞活力=(A空白组-A处理组)/A空白组。
实验结果表明,山地五月茶的叶和果的提取物均具有抑制两种乳腺癌细胞增殖的活性。山地五月茶叶乙醇提取物对两种乳腺癌细胞增殖的抑制IC50分别为282.2μg/mL(MCF-7),137.6μg/mL(MDA-MB-231)(图1);山地五月茶果的乙醇提取物的抑制IC50分别为302.2μg/mL(MCF-7),483.3μg/mL(MDA-MB-231)(图2);山地五月茶叶乙醇提取物经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后抑制细胞增殖活性以乙酸乙酯相活性最好。
实施例3、划痕方法测定抑制乳腺癌细胞迁移活性
24孔板按每孔2×105个细胞量接种对数生长期MDA-MB-231细胞,24h待细胞贴壁后用枪头划痕,PBS洗去漂浮细胞,加入不同浓度提取物,24h后用结晶紫染色细胞,在显微镜下拍照,统计处理前后划痕面积变化,计算抑制迁移率。
实验结果表明:100μg/mL五月茶叶乙酸乙酯萃取相具有抑制MDA-MB-231细胞迁移的活性,与对照相比平均抑制率为86%(图3)。
实施例4、Transwell方法测定抑制乳腺癌细胞侵袭活性
用不同浓度五月茶叶乙酸乙酯萃取相培养基处理MDA-MB-231细胞24h后,胰酶消化使细胞脱壁,用不含牛血清的培养基制备成4×104/mL的细胞悬液加入Transwell(置于24孔板中),在Transwell的下层加入完全培养基,37℃培养箱培养24h,75%乙醇固定,结晶紫染色,在显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数细胞个数,取5个视野的平均数表示肿瘤细胞的体外迁移和侵袭数。
实验结果表明:25、50、100μg/mL五月茶叶乙酸乙酯相提取物处理MDA-MB-231细胞24,与对照相比穿过transwell膜的细胞量分别为:69.9%、37.6%和34.3%,五月茶叶乙酸乙酯相提取物具有抑制细胞侵袭的活性(图4)。
实施例5、流式细胞测定诱导细胞凋亡活性
用6孔板每孔接种5×105对数生长期MDA-MB-231细胞,培养24h至细胞贴壁,分别设置空白对照组和提取物处理组,处理24h后以不含EDTA的胰蛋白酶使细胞脱壁,1500rpm离心5min,弃上清并用预冷的PBS洗2遍,用预冷70%乙醇固定,-20℃冰箱过夜。检测前用预冷的PBS洗2遍,离心弃上清,加入2μL浓度为1mg/mL的核糖核酸酶(RNaseA),加入400μl PI暗处反应30min后,用流式细胞仪检测提取物对细胞周期的影响。
实验结果表明:五月茶叶能使细胞S周期由对照的25.6%增加到32.0%延长,G2期细胞数量由14.5%减少到6.5%,从而抑制其增殖(图5)。
实施例6、HPLC-MS/MS分析活性成分
HPLC-MS/MS分析,DAD检测器,流动相为A(甲醇),B(0.5%甲酸水溶液),程序为0min-40%A,10min-60%A,15min-80%A,保持10min,25min-40%A。流速0.4mL/min,柱温28℃,进样体积10μL。质谱检测条件:电喷雾离子源(ESI),正负离子模式,扫描范围m/z 100~1 500。
经检测穗花杉双黄酮标准品HPLC出峰时间与五月茶叶乙酸乙酯萃取相的一成分相同(图6)。根据质谱信息确认其为同一种化合物。穗花杉双黄酮分子量为538.4579,分子式:C30H18O10,实际质谱检测其分子离子峰m/z 539.2为[M+H]+(图7)。
实施例7、穗花杉双黄酮制乳腺癌细胞增殖活性
同实施例2方法,用CCK-8法检测穗花杉双黄酮对MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞的增殖影响,结果表明其处理细胞72h的抑制IC50分别为628.5μg/mL(MCF-7),192.6μg/mL(MDA-MB-231),穗花杉双黄酮是五月茶叶中活性成分之一(图8)。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种五月茶叶和果提取物,其特征在于,通过以下的制备步骤获得:
(1)采集山地五月茶的叶或果,室内自然干燥或35~45℃烘箱干燥,粉碎;
(2)用浓度60%~80%的乙醇浸泡提取,超声波辅助提取,过滤提取液,用减压旋转蒸发仪去除溶剂,获得浓缩的提取物浸膏;
(3)上述提取物浸膏用蒸馏水溶解,依次分别加入2~5倍体积的石油醚及乙酸乙酯进行萃取,将乙酸乙酯萃取相进行减压旋转蒸发获得该相提取物。
2.根据权利要求1所述的五月茶叶和果提取物,其特征在于:该相提取物活性成分为穗花杉双黄酮。
3.根据权利要求1和2所述的五月茶叶和果提取物,其特征在于:五月茶叶和果在防治乳腺癌中的应用。
4.根据权利要求3所述的五月茶叶和果提取物,其特征在于:五月茶叶和果应用在抑制乳腺癌细胞增殖。
5.根据权利要求3所述的五月茶叶和果提取物,其特征在于:五月茶叶和果应用在抑制乳腺癌细胞迁移。
6.根据权利要求3所述的五月茶叶和果提取物,其特征在于:五月茶叶和果应用在抑制乳腺癌细胞侵袭。
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