CN110551622A - 快速pcr反应芯片以及快速荧光定量检测仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速PCR反应芯片及快速荧光定量检测仪，PCR芯片包括面板与底膜，面板底表面开设至少一处反应池，反应池不贯通面板，反应池两侧开设有加样孔和排气孔与面板顶面连通，在面板底面附着底膜，面板为透光材质。当PCR芯片置于温控模块上，底膜紧贴温控模块，加样后底膜上方反应池中的PCR反应液与温控模块仅间隔一层底膜，温控模块的制冷量或制热量可以快速穿过底膜传导至PCR反应液，薄膜相比塑料板导热速度更快，导热更均匀，实现PCR反应液快速升温或降温，可以实现快速PCR。快速荧光定量检测仪的加热制冷片水平放置，PCR芯片水平放置在加热制冷片上，底膜紧贴加热制冷片的平面，加热制冷片的制冷量或制热量可以快速均匀传导至PCR反应液。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是一种快速PCR反应芯片以及快速荧光定量检测仪。
背景技术
PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中，可以用于传染病的诊断、亲子鉴定等。基于PCR反应三步骤的原理，PCR扩增仪需要设置变性-退火-延伸3个温度点，在标准反应中，双链DNA在90~95℃变性，再迅速冷却至40~60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70~75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸，因此PCR扩增仪对于反应液温度快速切换以及精确的控制尤为重要。
快速荧光定量检测仪是一种在普通PCR扩增仪的基础上增加荧光信号采集***和计算机分析处理***的PCR扩增仪，利用同位素、荧光素等标记PCR扩增时加入的引物，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增的原理，通过荧光信号采集***实时采集荧光信号。
PCR芯片用于微量PCR反应体系，中国专利CN106661533A公开了一种多重PCR芯片及包含其的多重PCR装置，结合该专利的说明书及图3、图4可知，PCR芯片由从上往下依次设置的第三板、第二板和第三板粘合而成，第二板和第三板之间具有反应区，在第二板两端开设与内部反应区连通的流入部和流出部，第三板盖在反应区上方，第三板底部间隔粘合放置若干探针。这种PCR芯片的反应区域体积大，需要使用大量样液，样液浪费多；光检测部检测反应区和探针位置反射的荧光，反应区的荧光反射分散不集中。加热块需要先加热第一板，第一板传递热量给反应液，加热塑料材质的第一板需要时间，导致加热时间长，难以精确控制温度，PCR整体反应速度较慢。PCR芯片使用第一板、第二板和第三板粘合拼装而成，整体结构复杂，制造成本高。
发明内容
本申请人针对上述现有生产中PCR装置存在的反应液用量大、荧光反射不集中、加热速度慢不精确、结构复杂等缺点，提供一种结构合理的快速PCR反应芯片以及快速荧光定量检测仪，PCR芯片热量传导速度快、结构简单易加工检测仪反应速度快、荧光信号集中易于采集。
本发明所采用的技术方案及有益效果如下：
一种快速PCR反应芯片，所述PCR芯片包括面板与底膜，面板底表面开设至少一处反应池，反应池不贯通面板，反应池两侧开设有加样孔和排气孔与面板顶面连通，在面板底面附着底膜，面板为透光材质。本发明在面板底面附着底膜，当PCR芯片置于温控模块上，底膜紧贴温控模块，加样后底膜上方反应池中的PCR反应液与温控模块仅间隔一层底膜，温控模块的制冷量或制热量可以快速穿过底膜传导至PCR反应液，薄膜相比塑料板导热速度更快，导热更均匀，实现PCR反应液快速升温或降温（可实现8-15℃/秒的升降温速度），大大加快了反应速度，40个循环的反应时间仅需要20分钟左右，可以实现快速PCR。另外，面板底表面开设的反应池不贯通PCR芯片的面板，使反应池为上方遮蔽的容纳空间，防止污染物质从上方落入反应池内；面板本身仅使用一块整体的板材即实现样液存储空间的设置和反应池上方的封闭，整体结构简单，直接采用模具成型即可，容易制造，成本大大降低。
作为上述技术方案的进一步改进：
在PCR芯片面板的上表面附着有封口避光膜，封口避光膜遮蔽所述加样孔和排气孔，露出反应池区域。本发明在快速PCR反应芯片的上表面附着有封口避光膜，封口避光膜用于防止反应池中的反应液在加热与反应期间挥发进入外界空气中，既影响了检测结果，也会使外界空气存在核酸，污染下一次反应的反应体系，造成实验室污染。
面板底表面的反应池两侧设置长条形流道，流道不贯通面板，流道两端设置加样孔和排气孔。本发明在面板上设置流道，流道不贯通面板，具有较好的密闭性，防止污染物质从上方落入流道内，流道本身也可以实现PCR反应液经毛细作用自动进入反应池的目的，进样更便捷。
面板底表面的流道平行排列，相邻流道上的反应池错开布置。若干长条形流道平行排列，相邻流道上的反应池错开布置，一方面使单位面积内可以布置更多的反应池，充分利用面板的有限空间，另一方面，相邻反应池间隔距离较远，防止荧光检测时相邻反应池的荧光相互干涉导致的检测误差。
加样孔与反应池之间的加样流道长度小于排气孔与反应池之间的排气流道长度，加样流道宽度d1大于排气流道宽度d2。本发明加样孔离反应池较近且加样流道宽度较宽，使得PCR反应液进入加样孔后可以快速通过毛细作用流入反应池进行反应。
所述加样孔孔口为漏斗形；所述反应池为圆形沉孔。本发明的面板上表面的加样孔孔口处的直径大于排气孔孔口处的直径，加样孔孔口处的直径较大，加样孔孔口为漏斗形，方便进样。本发明的反应池采用圆形沉孔，被测样品集中在圆形反应池中，荧光信号最为集中，可以高效收集荧光信号。
所述底膜的厚度为0.02～0.3mm。底膜厚度薄，导热速度更快，导热更均匀。
面板的材质选自硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、环烯烃共聚物或环氧树脂中的一种或几种相组合。本发明的快速PCR反应芯片的面板采用硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯或环烯烃共聚物和环氧树脂等高通透性高分子聚合物，可批量生产，具有成本低廉，易于加工，成型工艺要求低的优势。
底膜为透光材质，选自PVC、PE、PP或PS中的一种或几种相组合。本发明快速PCR反应芯片的底膜采用透光材质，可以是PVC、PE、PP和PS等，透光材质不会对光路产生干扰，其他颜色的膜如黑色膜可能存在杂色，杂色会干扰光路，影响荧光检测数值。
封口避光膜采用紫外胶、环氧树脂胶、酚醛树脂胶或硅橡胶粘合在面板的凹槽内。本发明的封口避光膜置于面板的凹槽内，可以防止实验过程中被剐蹭脱落，失去密封效果。
一种使用上述快速PCR反应芯片的快速荧光定量检测仪，外壳内部依次设置荧光采集模块、PCR芯片和温控模块，PCR芯片置于温控模块的加热制冷片上，底膜与加热制冷片接触；荧光采集模块的光源和采光部件位于PCR芯片的反应池的上方。本发明快速荧光定量检测仪在快速PCR反应芯片的反应池上方设置光源和采光部件，采用顶部直接采集荧光的方式，采集荧光速度快、避免荧光衰弱造成信号减弱的问题。
作为上述技术方案的进一步改进：
加热制冷片水平放置，PCR芯片水平放置在加热制冷片上，底膜紧贴加热制冷片的平面。底膜紧贴加热制冷片，加热制冷片的制冷量或制热量可以快速均匀传导至PCR反应液。
附图说明
图1为本发明的PCR扩增仪的内部结构示意图。
图2为图1中A部的放大图。
图3为本发明的PCR芯片的仰视图（未贴附底膜）。
图4为图3中B-B处的剖视图（增加底膜13的位置示意）。
图5为PCR芯片附着封口避光膜14的俯视图。
图6为实施例二中不设置流道的PCR芯片示意图。
图中：1、荧光采集模块；2、PCR芯片；3、温控模块；4、凹槽；5、显示屏；6、面板；7、排气孔；8、加样流道；9、反应池；10、加样孔；11、采光部件；12、光源；13、底膜；14、封口避光膜；15、加热制冷片；16、散热片底座；17、排气流道。
具体实施方式
下面结合附图，说明本发明的具体实施方式。
如图1所示，本发明快速荧光定量检测仪的外壳内部从上到下依次设置荧光采集模块1、PCR芯片2和温控模块3，外壳上表面朝外设有显示屏5，显示屏5能够显示PCR反应的进程、实时温度。
如图1、图2所示，荧光采集模块1位于温控模块3上方，其底面设置与电源连接的采光部件11和光源12，光源12通过光路投射到PCR芯片2的被测样品上并能够激发出荧光，采光部件11用于采集被测样品被激发的荧光。采光部件11和被测样品之间设置有能够对被测样品激发的荧光进行滤光的滤光片（图中未示出），滤光片用于实现单通道、双通道或多通道的荧光检测。光源12为卤素灯、氙灯、发光二极管或不同固定波长的LED光，数量为一个或多个；采光部件11为CCD（电荷耦合器件）、CMOS（互补金属氧化物半导体）或PD（光电二极管）。
实施例一：
如图3所示，PCR芯片2包括扁平长方体形的面板6和覆盖整个面板6底部的底膜13，本实施例在面板6的中部底表面沿长方形短边方向平行开设若干长度相当的长条形流道，在流道中部开设圆形沉孔反应池9，流道和反应池9不贯通面板6的整个厚度。如图4所示，底膜13粘合在面板6底部，使流道和反应池9形成封闭的容纳空间。相邻流道上的反应池9错开布置，一方面使单位面积内可以布置更多的反应池9，充分利用面板6的有限空间，另一方面，相邻反应池9间隔距离较远，防止荧光检测时相邻反应池9的荧光相互干涉导致的检测误差。在流道的两端部分别设置与面板6顶面连通的竖向加样孔10和排气孔7，加样孔10离反应池9较近，排气孔7离反应池9较远，加样孔10与反应池9之间的加样流道8的宽度d1大于排气孔7与反应池9之间的排气流道17的宽度d2，反应池9的直径大于加样流道8的宽度d1。加样孔10离反应池9较近且加样孔10与反应池9之间的加样流道8宽度较宽，使得PCR反应液进入加样孔10后可以快速通过毛细作用流入反应池9进行填充。如图3所示，面板6上表面的加样孔10孔口处的直径大于排气孔7孔口处的直径，如图4所示，加样孔10孔口为漏斗形，方便进样。
反应池9容量为1-20µL，有效节省待用样品量，避免样品浪费，待用样品容积小，升降温速度快，因此大大减少了反应时间，也便于精确进行温度控制。面板6由透明、导热且透光的材料制成，材质为硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯或环烯烃共聚物和环氧树脂等。底膜13的厚度为0.02~0.3mm。底膜13同样由透光材质制成，底膜13的材质为高分子聚合材料，包括PVC（聚氯乙烯）、PE（聚乙烯）、PP（聚丙烯）和PS（聚苯乙烯）等，透光材质不会对光路产生干扰，其他颜色的膜如黑色膜可能存在杂色，杂色会干扰光路，影响荧光检测数值。底膜13可使用紫外胶、环氧树脂胶、酚醛树脂胶或硅橡胶等粘结胶粘合在面板6底面，从而封闭面板6底面，形成各自独立的反应池9。
如图5所示，封口避光膜14为长方形的不透光材质的薄膜，厚度为30-300µm，如图4所示，在面板6的正面开设有大于反应区域的长方形凹槽4，封口避光膜14的外周尺寸与凹槽4相匹配，完成PCR反应液进样后，封口避光膜14通过背胶在常温下贴合于凹槽4内，此时，如图5所示，封口避光膜14遮蔽并密封两侧全部的加样孔10和排气孔7，露出中部反应池9区域。封口避光膜14用于防止反应池9中的反应液在加热与反应期间挥发进入外界空气中，既影响了检测结果，也会使外界空气存在核酸，污染下一次反应的反应体系，造成实验室污染。封口避光膜14的材质为聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚萘二甲酸乙二醇酯等；封口避光膜14采用常温或非常温的粘合方式粘合，粘结胶为紫外胶、环氧树脂胶、酚醛树脂胶或硅橡胶等。
如图1、图2所示，温控模块3的扁平长方体形的加热制冷片15水平固定在散热片底座16上，散热片底座16下部具有若干散热筋条，PCR芯片2水平放置在加热制冷片15上，底膜13紧贴加热制冷片15的平面，加热制冷片15通过发热或制冷功能调节PCR芯片2反应池9内部的温度。温控模块3连接能够设置温度参数的温控软件***。底膜13紧贴加热制冷片15的平面，加样后底膜13上方的PCR反应液与温控模块3仅相隔一层底膜13，温控模块3的制冷量或制热量可以快速穿过底膜13传导至PCR反应液，薄膜相比塑料板导热速度更快，实现PCR反应液快速升温或降温（可实现8-15℃/秒的升降温速度），大大加快了反应速度，提高了温控精度，40个循环的反应时间仅需要20分钟左右，可以实现快速PCR。
本发明使用时，进行如下步骤：
（1）用移液枪在PCR芯片2的加样孔10加入PCR反应液，反应液包括模板DNA、引物、Taq酶、缓冲液等，由于排气孔7的存在，PCR反应液经毛细作用流至反应池9中，然后将封口避光膜14粘合在PCR芯片2的凹槽4内；
（2）将加完样品的PCR芯片2置于加热制冷片15的散热片底座16上；
（3）开启温控软件***，设置PCR芯片2需要的反应温度；
（4）反应完成后，开启荧光采集模块1，光源12激发出荧光并投射到PCR芯片2的反应池9上，反应液被激发的荧光投射在采光部件11，形成光谱成像被采光部件11进行采集，采集后的荧光经过软件分析定位得出光强度值。
实施例二：
如图6所示，本实施例中不设置流道，直接在反应池9相对的两端部开设加样孔10和排气孔7，同样可以实现反应液进样和排气的目的，进样后，在面板6上表面附着封口避光膜14遮蔽加样孔10和排气孔7。
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，在不违背本发明精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。当本发明的反应池9采用圆形沉孔时，被测样品集中在圆形反应池9中，荧光信号最为集中，可以高效收集荧光信号，反应池9当然也可以采用横截面为三角形、长方形、正方形等任何其他形状的沉孔反应池9，反应池9中的被测样品同样可以发射荧光信号。光源12也可以设于反应池9的侧边。流道也可以仅设置单条。
加样孔10和排气孔7也可以为从面板6上表面往下开设的不贯通面板6的盲孔，孔口与面板6顶面连通，孔底与反应池9连通，同样可以实现反应液进液的目的。
Claims (10)
1.一种快速PCR反应芯片，其特征在于：所述PCR芯片（2）包括面板（6）与底膜（13），面板（6）底表面开设至少一处反应池（9），反应池（9）不贯通面板（6），反应池（9）两侧开设有加样孔（10）和排气孔（7）与面板（6）顶面连通，在面板（6）底面附着底膜（13），面板（6）为透光材质。
2.按照权利要求1所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：在PCR芯片（2）面板（6）的上表面附着有封口避光膜（14），封口避光膜（14）遮蔽所述加样孔（10）和排气孔（7），露出反应池（9）区域。
3.按照权利要求1所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：面板（6）底表面的反应池（9）两侧设置长条形流道，流道不贯通面板（6），流道两端设置加样孔（10）和排气孔（7）。
4.按照权利要求3所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：面板（6）底表面的流道平行排列，相邻流道上的反应池（9）错开布置。
5.按照权利要求3所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：加样孔（10）与反应池（9）之间的加样流道（8）长度小于排气孔（7）与反应池（9）之间的排气流道（17）长度，加样流道（8）宽度d1大于排气流道（17）宽度d2。
6.按照权利要求1所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：所述加样孔（10）孔口为漏斗形；所述反应池（9）为圆形沉孔。
7.按照权利要求1所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：所述底膜（13）的厚度为0.02~0.3mm。
8.按照权利要求1所述的快速PCR反应芯片，其特征在于：面板（6）的材质选自硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、环烯烃共聚物或环氧树脂中的一种或几种相组合；底膜（13）为透光材质，选自PVC、PE、PP或PS中的一种或几种相组合；封口避光膜（14）采用紫外胶、环氧树脂胶、酚醛树脂胶或硅橡胶粘合在面板（6）的凹槽（4）内。
9.一种使用权利要求1所述快速PCR反应芯片的快速荧光定量检测仪，其特征在于：外壳内部依次设置荧光采集模块（1）、PCR芯片（2）和温控模块（3），PCR芯片（2）置于温控模块（3）的加热制冷片（15）上，底膜（13）与加热制冷片（15）接触；荧光采集模块（1）的光源（12）和采光部件（11）位于PCR芯片（2）的反应池（9）的上方。
10.按照权利要求9所述的荧光定量检测仪，其特征在于：加热制冷片（15）水平放置，PCR芯片（2）水平放置在加热制冷片（15）上，底膜（13）紧贴加热制冷片（15）的平面。
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