CN110551197A - 一种微肽及癌症治疗的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到微肽CORO1C‑47aa在治疗癌症中的应用，从翻译水平circRNA编码的肽角度，研究肽对子宫内膜癌起始阶段血管生成的影响。并通过靶向微肽CORO1C‑47aa的治疗，使微肽CORO1C‑47aa与ARNT PAS‑B结构域竞争性结合，阻断TACC3与其配体PAS‑B的结合，导致HIF1富集至VEGF的HRE启动子附近从而抑制其基因表达。通过体外和体内实验证明，微肽CORO1C‑47aa能明显抑制子宫内膜癌起始阶段新生血管的生成，对子宫内膜癌具有临床应用价值。

Description

一种微肽及癌症治疗的药物

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是指一种微肽CORO1C-47aa在癌症治疗中的药物的应用。

背景技术

子宫内膜癌(EC)是全球女性中第五位最常见的恶性肿瘤，占所有癌症死亡人数的1-2％。发生EC的风险因素包括年龄，社会经济地位，以及与***暴露过多，糖尿病或高血压相关的因素，但对这种疾病的遗传风险因素知之甚少。

非编码RNA(ncRNA)代表细胞中的大多数转录物并且经常参与EC的发展。环状RNA(circRNA)是一类新的广泛的ncRNA，常在哺乳动物体内调节基因的表达。circRNA是封闭的RNA转录物，通过单个前mRNA的反向剪接产生，circRNA的表达通常在物种间高度保守。近年来，报道的大多数circRNA被指出可作为miRNA海绵来调节不同细胞类型的基因表达，或结合和隔离其他RNA结合蛋白。然而，大多数circRNA的生物学功能仍未确定。

最近研究表明，由于其细胞质定位，circRNA可被翻译产生蛋白质。例如，circZNF609和circMBI可被翻译。由内部核糖体进入位点驱动的Circ-FBXW7编码一种新的21kDa蛋白质。circPINTexon2由含有sORF的LncRNAs(LINC-PINT)产生，编码人类细胞中的肿瘤抑制肽。此外，一项研究还表明，circRNA可以由N6-甲基腺苷驱动翻译。

发明内容

本发明的目的是提供一种circ-0000437编码功能性微肽CORO1C-47aa，其在EC中充当肿瘤抑制基因，能有效抑制子宫内膜癌血管内皮细胞。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种微肽，为CORO1C-47aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述CORO1C-47aa是由circ-0000437基因所编码。

进一步的，所述circ-0000437基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

一种癌症治疗的药物，上述任一项微肽或其药学上可接受的盐在癌症治疗的药物方面的应用。

进一步的，所述癌症为子宫内膜癌。

进一步的，癌症治疗的药物包括微肽或其药学上可接受的盐的药物组合物。

进一步的，所述药物为所述微肽或其药学上可接受的盐单独作为活性成分，或者，所述药物为所述微肽或其药学上可接受的盐与额外的药物活性化合物联合应用。

进一步的，所述药物组合物中还含有药学上可接的辅料。

进一步的，所述辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、木糖醇、低聚糖、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋白中的任一种或多种。

进一步的，所述癌症治疗的药物的剂型为药学上可以接受的剂型。

本发明的有益效果是：

从翻译水平circRNA编码的肽角度，研究肽对子宫内膜癌起始阶段血管生成的影响。并通过靶向肽CORO1C-47aa的治疗，使微肽CORO1C-47aa与ARNT PAS-B结构域竞争性结合，阻断TACC3与其配体PAS-B的结合，导致HIF1富集至VEGF的HRE启动子附近从而抑制其基因表达。通过体外和体内实验证明，微肽CORO1C-47aa能明显抑制子宫内膜癌起始阶段新生血管的生成，对子宫内膜癌具有临床药用价值。

附图说明

图1A至图1D为本发明实施例一中微肽CORO1C-47aa异位表达对EC细胞增殖的影响的实验数据图及示意图，具体的：

图1A为circ-0000437OE，circ-0000437IRES突变和对照EC细胞在不同时间点的细胞增殖分析(平均值±SD，n＝5)；

图1B为异种移植小鼠中的肿瘤生长皮下植入用指定构建体转染的EC细胞(平均值±SD，n＝5，*p<0.05)；

图1C为CD31染色在来自circ-0000437OE，circ-0000437IRES突变和对照组的异种移植小鼠肿瘤组织切片上进行。使用ImageJ定量CD31染色。每个值是三次独立实验的平均值±SEM；

图1D为使用来自HEC-1-B和Ishikawa细胞的HUVEC和条件培养基进行内皮管形成测定，其稳定表达circ-0000437OE，circ-0000437IRES突变(平均值±SD，n＝3，*p<0.05)。

图2A至图2J为本发明实施例二中微肽CORO1C-47aa对HUVEC细胞增殖、迁移和分化的影响的实验数据图及示意图，具体的：

图2A为CORO1C-47aa抑制HUVEC细胞的增殖；

图2B为使用HUVEC和来自HEC-1-B和Ishikawa细胞的条件培养基进行伤口愈合测定，其稳定表达circ-0000437OE，circ-0000437IRES突变(平均值±SD，n＝3，*p<0.05)；

图2C为使用HUVEC和来自HEC-1-B和Ishikawa细胞的条件培养基进行内皮迁移测定，其稳定表达circ-0000437OE，circ-0000437IRES突变(平均值±SD，n＝3，*p<0.05)；

图2D为微丝的Phalloidine-FITC染色和HUVEC细胞的免疫荧光染色和来自HEC-1-B和Ishikawa细胞的稳定表达circ-0000437OE，circ-0000437IRES突变的条件培养基。细胞核用DAPI复染；

图2E为在所示实验条件下的电子显微镜的代表性照片；

图2F为用CORO1C-47aa孵育的球状体的代表性显微照片；

图2G为收获基质胶塞并加工用于qRT-PCR。将鼠CD31的mRNA表达水平标准化为人GAPDH的水平，并表达为鼠CD31/人GAPDH mRNA比率；

图2H为在所示实验条件下HE染色的代表性照片；

图2I为Matrigel的代表性照片在指定的实验条件下***；

图2J为将包埋在纤维蛋白凝胶中的HUVEC球状体与指定的培养基一起温育，然后，计数径向生长的细胞芽；

图3为本发明实施例三中circ-0000437在子宫内膜癌与癌旁表达有显着差异的实验数据图及示意图；具体的：

为与匹配的相邻正常组织相比，circ-0000437以低水平表达EC组织。通过qRT-PCR分析circ-0000437的表达水平并标准化为GAPDH，数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM。

具体实施方式

为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明，以下通过实施仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

针对目前对子宫内膜癌治疗手段有限的情况，从翻译水平circRNA所编码的肽的角度，研究探索微肽CORO1C-47aa(人源全长重组蛋白-47aa)对子宫内膜癌的治疗价值。本技术方案首先鉴定了编码微肽CORO1C-47aa为环状RNA circ-0000437，其编码框为sORF。接着验证了微肽CORO1C-47aa在EC中表达下调。微肽CORO1C-47aa与ARNT PAS-B结构域竞争性结合，阻断TACC3与其配体PAS-B的结合，导致HIF1富集至VEGF的HRE启动子附近从而抑制其基因表达。总之，实验发现在子宫内膜癌中，微肽CORO1C-47aa通过抑制癌症起始阶段新生血管的生成来达到治疗的效果。

在一些实施例中，可采用含有微肽CORO1C-47aa或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物可任选地还包含一种或多种额外的药物活性化合物。

含有微肽CORO1C-47aa或药学上可接受的盐的药物具有以下至少一种功能：

1)降低化学物诱导的子宫内膜癌的发生率；

2)减缓或停止已建立的子宫内膜癌肿瘤灶的生长；

3)减缓或停止已建立的子宫内膜癌肿瘤灶的转移；

4)诱导产生子宫内膜癌特异性并对子宫内膜癌细胞具有杀伤的CTL细胞。

本技术方案的药用辅料可经酶、酸碱或组织液水解或降解。药用辅料选自生物可容性的高分子多聚物、高分子多聚物的混合物或共聚物中的任一种或多种。具体地，药用辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种，例如：

a)分子量为5000-15000、10000-20000、20000-35000或30000-50000的聚乳酸。

b)分子量为5000-15000、10000-20000、25000-35000或30000-50000的聚乳酸和羟基乙酸的共聚物。

c)乙烯-乙酸乙烯酯共聚物。

d)对羧苯基丙烷与癸二酸的共聚物，其中，对羧苯基丙烷∶癸二酸质量比为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40。

e)木糖醇、低聚糖、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋白中的一种或多种。

本技术方案的药物组合物可以用于制备治疗人及动物的各种抗肿瘤药物，具体为抗子宫内膜癌药物。

本技术方案的药物可制成多种药学可以接受的药物制剂，如，但不限于，浑悬液、软膏、胶囊、丸剂、片剂或注射剂等；呈各种形状，如，但不限于，颗粒样、片状、球形、块状、针状、棒状及膜状。上述剂型和形状适用于含或不含添加剂的组合物，且所述药物制剂采用本领域常规的制备方法进行制备，如，但不限于，(i)把载体支持物粉末与药物混合然后压制成植入剂，即所谓的混合法；(ii)把载体支持物熔化，与待包装的药物相混合，然后固体冷却，即所谓的熔融法；(iii)把载体支持物溶解于溶剂中，把待包装的药物溶解或分散于聚合物溶液中，然后蒸发溶剂，乾燥，即所谓的溶解法；(iv)喷雾干燥法；及(v)冷冻干燥法等。其中溶解法可用于微球的制造，抗癌药物组合物也可包装脂质体中。

本技术方案的药物可经各种途径给药，如经脉、动脉、皮下、肌肉、皮内、腔内、瘤内、瘤周等。给药途径取决于多种因素，为于肿瘤所在部位获有效浓度，药物可经其它多种途径给予，如选择性地动脉灌注，腔内灌注(intracavitary)，腹腔(intraperitoneal)或胸腔(intrapleural)及椎管内给药。

所述抗肿瘤药物的给药剂量可根据具体给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

以下实施例，如未特别说明，所采用的实验方法均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。6-8周龄雌性裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心(中国上海)。所有细胞系均购自Procell生命科技有限公司。这些细胞系均经DNA指纹图谱分析，传代不到6个月。DMEM、MEM和胎牛血清(FBS)购自Invitgen公司。HEC-1-B细胞在含10％胎牛血清的MEM培养基中生长，Ishikawa细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长。所有细胞株均在含青霉素/链霉素的培养基中生长，温度37℃，空气湿度为5％CO₂。

实施例一

请参见图1A至图1D，微肽CORO1C-47aa异位表达对EC细胞增殖的影响。

构建circ-0000437OE载体和IRES突变载体克隆的EC细胞：发明人将全长或突变的circ-0000437IRES序列克隆在Rluc和Luc报道基因之间，形成两组Luc/Rluc高低活性对比的载体。接着将circ-0000437OE载体和IRES突变载体转染到EC细胞(HEC-1-B，Ishikawa)中，形成可过表达circ-0000437载体与IRES突变的EC细胞。发明人为确定CORO1C-47aa的框内ATG密码子是否可以促进翻译的启动，构建了ORF突变表达载体(其中起始密码子ATGGTG已突变为ATTGTT)和FLAG标记至CORO1C-47aa的C末端。使用抗FLAG蛋白质印迹在转染circ-0000437OE载体的细胞中可检测到CORO1C-47aa-FLAG，而在转染IRES突变载体的细胞中则无法检测。证明circ-0000437OE载体过表达可以提高CORO1C-47aa表达，而circ-0000437-IRES突变载体不能。发明人为检测CORO1C-47aa的细胞定位，通过免疫荧光测定，发现CORO1C-47aa集中在EC细胞的细胞核中。

如图1A所示，发明人分别对CORO1C-47aa稳定上调以及转染IRES突变载体的HEC-1-B和Ishikawa细胞进行CCK-8测定，然而结果表明，与对照细胞相比，无论是CORO1C-47aaOE组或IRES突变组的EC细胞增殖均不显着。发明人为探究CORO1C在肿瘤生长中的生物学意义，将每组5只小鼠分别进行皮下注射CORO1C-47aa过表达和IRES突变的EC细胞。如图1B所示，与对照异种移植物相比，CORO1C-47aa OE组的异种移植物的生长受到显着抑制。而IRES突变组与对照组的异种移植物没有显着差异。为探究CORO1C-47aa的抑制作用是否可归因于血管生成破坏，进行肿瘤组织的免疫组织化分析以检测CD31的表达。如图1C所示，与IRES突变组和对照组相比，在CORO1C-47aa OE组中CD31被显着抑制。如图1D所示，发明人还进行了内皮管形成测定以探究CORO1C-47aa如何影响基质胶上的内皮网络形成。结果显示，与对照组相比，CORO1C-47aa有显着破坏HUVEC细胞形成毛细管的能力。

实施例二

请参见图2A至图2J，本实施例研究了微肽CORO1C-47aa对HUVEC细胞增殖、迁移和分化的影响。发明人在转染了CORO1C-47aa过表达和IRES突变的HEC-1-B和Ishikawa细胞的条件培养基中培养HUVEC细胞。如图2A所示，HUVEC细胞增殖试验结果表明，CORO1C-47aa OE组的HUVEC细胞增殖显着降低。为探究CORO1C-47aa的过表达对HUVEC细胞迁移的影响，发明人使用条件培养基培养的HUVEC细胞进行伤口愈合测定和Transwell。如图2B和图2C所示，伤口愈合测定和Transwell均证明HUVEC细胞的迁移能力因CORO1C-47aa的过表达而受到显着抑制，而IRES突变组与空载体转染组相比没有显着差异。发明人对CORO1C-47aa对内皮细胞骨架的影响进行进一步探究，如图2D所示，CORO1C-47aa OE组中的F-肌动蛋白无法重排成为细胞骨架，不利于细胞的迁移。如图2E所示，发明人还通过电子显微镜检测HUVEC细胞的胞间连接，结果显示对照组和IRES突变组的细胞间连结紧密，而CORO1C-47aa OE组中，HUVEC细胞的胞间连结被显着诱导，细胞间距缩小。为进一步证明CORO1C-47aa可抑制血管生成的可能性，发明人进行了小鼠的Matigel栓测定。如图2F、2G和2H所示，在CORO1C-47aaOE组中，用Matigel皮下注射的小鼠体内的新生血管生成被显着抑制。最后，发明人在体外血管生成三维模型中评估了CORO1C-47aa的作用，HUVEC球状体侵入三维纤维蛋白基质，由于细胞外基质的局部分解与HUVEC迁移与生长共同作用产生内皮芽。如图2I和2J所示，CORO1C-47aa导致HUVEC发芽减少。这些结果表明CORO1C-47aa能够通过抑制内皮细胞增殖，迁移和分化来抑制起始阶段的血管生成。

实施例三

请参见图3，circ-0000437在子宫内膜癌与癌旁表达有显着差异，发明人运用RT-qPCR测定来在中国东部(苏州)及中国北部中心(北京)的共198个配对的EC样品和匹配的非癌组织中circ-0000437的水平。与匹配的癌症组织相比，circ-0000437在癌旁组织中以更高水平表达。

综上所述：本发明从翻译水平circRNA编码的肽角度，研究肽对子宫内膜癌起始阶段新生血管的影响，证明了肽在子宫内膜癌中的重要作用。鉴于微肽CORO1C-47aa与ARNTPAS-B结构域竞争性结合，阻断TACC3与其配体PAS-B的结合，导致HIF1富集至VEGF的HRE启动子附近从而抑制其基因表达，以此达到治疗子宫内膜癌的效果。并且，通过微肽CORO1C-47aa进行的靶向治疗，上调微肽CORO1C-47aa的表达，对子宫内膜癌具有临床药用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种微肽及癌症治疗的药物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> PRT

<213> 微肽CORO1C-47aa(人工合成)

<400> 1

Met Asn Pro Arg Thr Ser Thr Thr Ser Thr His Ser Ala Ala Arg Ser

1 5 10 15

Leu Arg Glu Gly Trp Val Thr Cys Pro Pro Gly Asp Leu Met Leu Thr

20 25 30

Asn Val Arg Pro Glu Lys Tyr Ala Gly Thr Asn Cys Ser Ser Ser

35 40 45

<210> 2

<211> 144

<212> RNA

<213> 基因circ-0000437(人工合成)

<400> 2

augaaucccc guacguccac uaccucaaca cauucagcag caaggagccu cagagaggga 60

uggguuacau gcccaagagg ggacuugaug uuaacaaaug ugagauugcc agaaaaauau 120

gcaggaacca auugcucuuc auga 144

Claims (10)

1.一种微肽，其特征在于，为CORO1C-47aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的微肽，其特征在于，所述CORO1C-47aa是由circ-0000437基因所编码。

3.根据权利要求2所述的微肽，其特征在于，所述circ-0000437基因的序列如SEQ IDNO.2所示。

4.一种癌症治疗的药物，其特征在于，上述权利要求1至3中任一项微肽或其药学上可接受的盐在癌症治疗的药物方面的应用。

5.根据权利要求4所述的癌症治疗的药物，其特征在于，所述癌症为子宫内膜癌。

6.根据权利要求4所述的癌症治疗的药物，其特征在于，所述药物包括微肽或其药学上可接受的盐的药物组合物。

7.根据权利要求4所述的癌症治疗的药物，其特征在于，所述药物为所述微肽或其药学上可接受的盐单独作为活性成分，或者，所述药物为所述微肽或其药学上可接受的盐与额外的药物活性化合物联合应用。

8.根据权利要求4或6或7所述的癌症治疗的药物，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接的辅料。

9.根据权利要求8所述的癌症治疗的药物，其特征在于，所述辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、木糖醇、低聚糖、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋白中的任一种或多种。

10.根据权利要求4所述的癌症治疗的药物，其特征在于，所述癌症治疗的药物的剂型为药学上可以接受的剂型。