CN110547303B - 苏云金芽孢杆菌g033a在防治南美番茄潜叶蛾中的应用 - Google Patents

苏云金芽孢杆菌g033a在防治南美番茄潜叶蛾中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及苏云金芽孢杆菌G033A在防治南美番茄潜叶蛾中的应用。本发明首次发现Bt G033A除了对小菜蛾和马铃薯甲虫具有高毒力，其还对世界性害虫南美番茄潜夜蛾具有优秀的杀虫活性，特别是其对南美番茄潜夜蛾的高龄(3龄和/或4龄)的杀虫活性明显优于低龄(1龄和/或2龄)的杀虫活性。此外，其明显比虫菊‑印楝素、除虫菊素和鱼藤酮等其他生物源农药的见效要快，是一种具有应用前景的农药。因此，本发明提供了苏云金芽孢杆菌G033A(Bt G033A)在防治南美番茄潜叶蛾中的应用。

Description

苏云金芽孢杆菌G033A在防治南美番茄潜叶蛾中的应用
技术领域
本发明涉及苏云金芽孢杆菌G033A在防治南美番茄潜叶蛾中的应用，特别是苏云金芽孢杆菌G033A(Bt G033A)在防治南美番茄潜叶蛾幼虫中的应用。
背景技术
南美番茄潜叶蛾属鳞翅目Lepidoptera麦蛾科Gelechiidae，原发南美洲，是新近传入我国的一种世界毁灭性害虫，主要以幼虫潜食番茄的叶肉，亦可蛀食果实、顶梢，以及嫩芽、嫩茎和侧枝，严重为害时常造成番茄减产80％至100％。南美番茄潜叶蛾为害隐蔽，且已对包括有机磷类、拟除虫菊酯类、阿维菌素、邻甲酰胺基苯甲酰胺类等在内的常用的杀虫剂产生了严重抗性，同时，其对包括多杀菌素、印楝素、几丁质合成抑制剂等在内的多种生物源药剂也产生了抗性。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，简称Bt，是当今国际上应用范围最广的生物杀虫剂之一。Bt的杀虫活性主要源于它能够产生杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystal Proteins,ICPs)，亦即δ-内毒素，其对人畜无毒，且不污染环境。
发明内容
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)G033A属于芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌种，kurstaki亚种。其通过将含有cry3Aa7基因的质粒载体经电击转化导入到野生菌株G03菌株中得到。其对鳞翅目菜蛾科小菜蛾和鞘翅目叶甲科马铃薯甲虫等重要农业害虫具有高毒力，对小菜蛾和马铃薯甲虫低龄幼虫田间防效分别为82.9％至85.2％和85.3％至90.2％。其对昆虫具有胃毒作用，对鱼、鸟和蜜蜂低毒，对家蚕高毒；无生物积累性，对土壤微生物群落结构没有明显影响。
本发明首次发现Bt G033A除了对以上提到的小菜蛾和马铃薯甲虫具有高毒力，其还对世界性害虫南美番茄潜夜蛾具有优秀的杀虫活性，特别是其对南美番茄潜夜蛾的高龄(3龄和/或4龄)的杀虫活性明显优于低龄(1龄和/或2龄)的杀虫活性。此外，其明显比虫菊-印楝素、除虫菊素和鱼藤酮等其他生物源农药的见效要快，是一种具有应用前景的农药。
因此，本发明提供了苏云金芽孢杆菌G033A(Bt G033A)在防治南美番茄潜叶蛾中的应用。
在一个具体实施方式中，所述南美番茄潜叶蛾为幼虫期南美番茄潜叶蛾。
在一个具体实施方式中，所述南美番茄潜叶蛾为1龄、2龄、3龄和4龄中的至少一龄的幼虫期南美番茄潜叶蛾。
在一个具体实施方式中，所述G033A的用量在75至400g/亩。
在一个具体实施方式中，所述G033A的用量在100至150g/亩。
在一个具体实施方式中，所述G033A的剂型为可湿性粉剂。
在一个具体实施方式中，所述应用为将所述G033A施用于番茄植株上防治所述南美番茄潜叶蛾。
附图说明
图1显示了苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种G033A对南美番茄潜叶蛾的室内杀卵活性，柱状图上方小写字母相同(均为a)表示各浓度处理间在P<0.05水平差异不显著(单因素方差分析，最小显著差法检验)。
图2显示了苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种G033A对南美番茄潜叶蛾幼虫的室内杀虫活性。其中，A为对1至2龄幼虫的处理；B为对3龄幼虫的处理；C为对4龄幼虫的处理。浓度之后的小写字母(a、b和c中的至少一种)表示不同浓度间在P<0.05水平差异性结果(成对数据t测验)。
图3显示了苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种G033A和3种其他常用生物杀虫剂对南美番茄潜叶蛾的田间杀卵活性。柱状图上方小写字母表示各药剂处理间在P<0.05水平差异性分析结果(单因素方差分析，最小显著差法检验)。
图4显示了苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种G033A和3种其他常用生物杀虫剂对南美番茄潜叶蛾低龄幼虫的田间杀虫活性。其中，A为对1龄幼虫的处理；B为对2龄幼虫的处理。图4A和4B中同一天(第5和第7天)调查数据(mean±SE，n＝4)上方的小写字母不同表示处理间在P<0.05水平差异性分析结果(单因素方差分析，最小显著差法检验)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
Bt G033A可湿性粉剂由武汉科诺生物科技股份有限公司赠送，有效成分含量为32000IU/mg。
实施例1
室内卵的生物活性测定
实验于4月下旬开始，5月底结束。
将32000IU/mG Bt G033A可湿性粉剂用水稀释至40g/L、30g/L、20g/L、10g/L、5g/L5个浓度，以清水作为空白对照(CK)，共计6个处理。其中，浓度单位中的g指的是可湿性粉剂的质量。
生测方法采用浸叶法：将采集的新鲜番茄叶片完全展开(最长和最宽处约8cm和5cm)，用裁纸刀斜向快速切削叶柄后以吸水脱脂棉，并用保鲜膜包裹吸水脱脂棉，以进行保鲜，然后手持包裹有吸水脱脂棉的叶柄将叶片完全浸渍于上述浓度下10s后自然晾干，放入圆形塑料养虫盒(直径9cm，高3cm)中。
卵的生物测定：自种植毛粉番茄品种的连动温棚中采集带有初产淡黄绿色卵的番茄叶片，用裁纸刀斜向快速切削叶柄后以吸水脱脂棉，并用保鲜膜包裹吸水脱脂棉，以进行保鲜，手持包裹有吸水脱脂棉的叶柄将带有初产卵的叶片完全浸渍于上述浓度下10s后自然晾干，放入圆形塑料养虫盒(直径9cm，高3cm)中，并放入在相同浓度下浸渍的新鲜的无卵番茄叶片。每种浓度处理10粒卵，重复5批次。环境温度为20至25℃，湿度为40％至70％，自然光照。每天观察1次卵孵化为幼虫的数量，定时连续观察7d，直至不再孵化或全部孵化为止。计算7d时的卵孵化抑制率，以及7d时的校正卵孵化抑制率。数据经Excel2007整理后，以SPSS 24.0对室内生物活性测定获得的校正孵化抑制率数据进行统计分析。采用单因素方差分析法比较不同浓度间的校正孵化抑制率，以LSD最小显著差法进行差异显著性检验(One-way ANOVA,LSD test)，显著性水平P<0.05。结果见图1。
卵孵化抑制率＝(未孵化的卵数/总卵数)×100％ (1)
校正卵孵化抑制率＝((Bt G033A处理卵孵化抑制率-空白对照卵孵化抑制率)/(1-空白对照卵孵化抑制率))×100％ (2)
从图1可知，处理后7d，Bt G033A在各浓度下对南美番茄潜叶蛾的杀卵活性虽略有区别，但差异不明显(F4,20＝1.188,P＝0.346；One-way ANOVA,LSD test)，且均低于25％，因而据此判断杀卵活性较低。
实施例2
室内幼虫的生物活性测定
实验于4月下旬开始，5月底结束。
南美番茄潜叶蛾1至4龄幼虫采自种植有品种为毛粉番茄的连动温棚，室内用番茄叶片饲养24h后，饥饿4h。
Bt G033A药液配制：将32000IU/mG Bt G033A可湿性粉剂以水稀释至40g/L、30g/L、20g/L、10g/L、5g/L计5个浓度，以清水对照(CK)。
生测方法采用浸叶法：将采集的新鲜番茄叶片完全展开(最长和最宽处约8cm和5cm)，用裁纸刀斜向快速切削叶柄后以吸水脱脂棉，并用保鲜膜包裹吸水脱脂棉，以进行保鲜，然后手持包裹有吸水脱脂棉的叶柄将叶片完全浸渍于上述不同浓度下药液中10s后自然晾干，放入圆形塑料养虫盒(直径9cm，高3cm)中。将饥饿4h的1至2龄幼虫、3龄幼虫和4龄幼虫分别接入各养虫盒中的番茄叶片上，每种浓度、每个龄期处理10头，重复5批次。环境温度为20至25℃，湿度为40％至70％，自然光照。每天(24h)观察1次幼虫的存活状态，定时连续观察7d，以软毛毛笔轻触虫体无反应且无光泽，判定为死亡。记录死亡幼虫数量和存活的幼虫数量，并据此计算幼虫死亡率和校正幼虫死亡率。采用单因素方差分析法比较不同浓度间的校正幼虫死亡率是否存在显著性差异，以LSD最小显著差法进行差异显著性检验(One-way ANOVA,LSD test)，显著性水平P<0.05。结果见图2。
幼虫死亡率＝(死亡的幼虫虫数/总的幼虫虫数)×100％ (3)
校正幼虫死亡率＝((Bt G033A处理幼虫死亡率-空白对照幼虫死亡率)/(1-空白对照幼虫死亡率))×100％ (4)
图2的结果显示，不同浓度的Bt G033A处理过的番茄叶片对南美番茄潜叶蛾各龄期幼虫均具有较好的毒杀活性。
从图2A可以看出，以5至40g/L的Bt G033A对1至2龄幼虫处理96h(4d)后，除低浓度的5g/L除外，其余处理的校正幼虫死亡率均达95％以上；处理144h(6d)后包括低浓度的5g/L在内幼虫全部死亡。浓度为10g/L(t＝2.800,df＝4,P＝0.049；成对数据t测验)、20g/L(t＝2.841,df＝4,P＝0.047)、30g/L(t＝2.979,df＝4,P＝0.041)和40g/L(t＝3.178,df＝4,P＝0.034)的Bt G033A的杀虫效果间差异不显著；且该四种浓度下的杀虫效果明显优于5g/L浓度下的杀虫效果。
从图2B可以看出，以5至40g/L的Bt G033A对3龄幼虫处理120h(5d)后，幼虫全部死亡。浓度为10g/L(t＝3.709,df＝4,P＝0.034)、20g/L(t＝2.663,df＝4,P＝0.076)、30g/L(t＝3.163,df＝4,P＝0.050)和40g/L(t＝4.019,df＝4,P＝0.028)的Bt G033A的杀虫效果间差异不显著；且10g/L、30g/L和40g/L三种浓度下的杀虫效果明显优于5g/L浓度下的杀虫效果；但5g/L与20g/L浓度间差异不显著。
从图2C可以看出，以5至40g/L的Bt G033A对4龄幼虫处理96h(4d)后，除低浓度的5g/L除外，其余处理的校正幼虫死亡率均达90％以上；处理120h(5d)后包括低浓度的5g/L在内校正幼虫死亡率均达90％以上。浓度为5g/L和10g/L的Bt G033A的杀虫效果间差异不显著；浓度为20g/L、30g/L和40g/L的Bt G033A的杀虫效果间差异不显著；但10g/L、30g/L和40g/L三种浓度下的杀虫效果明显优于5g/L浓度下的杀虫效果；且5g/L(20g/L vs.5g/L:t＝3.303,df＝4,P＝0.030；30g/L vs.5g/L:t＝2.964,df＝4,P＝0.041；40g/L vs.5g/L:t＝3.114,df＝4,P＝0.036)和10g/L(20g/L vs.10g/L:t＝4.982,df＝4,P＝0.008；30g/Lvs.10g/L:t＝3.575,df＝4,P＝0.023；40g/L vs.10g/L:t＝3.067,df＝4,P＝0.037)的浓度与20g/L、30g/L和40g/L的浓度间存在显著性差异。
数据经Excel 2007整理后，由SPSS 24.0软件对室内生物活性测定获得的校正幼虫死亡率数据进行统计分析，各龄期幼虫48h的校正幼虫死亡率范围为10％至90％，基于此，由SPSS 24.0软件计算出Bt G033A对南美番茄潜叶蛾幼虫48h的致死中浓度(LC50)、95％置信区间(CI)和相关系数(r2)。结果见表1。
表1苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种G033A对南美番茄潜叶蛾不同龄期幼虫的室内毒力
Figure GDA0002787881920000051
从表1可知，Bt G033A对南美番茄潜叶蛾48h的LC50分别为4龄幼虫14.63g/L、3龄幼虫15.59g/L和1至2龄幼虫23.17g/L，毒力效果依次为4龄幼虫>3龄幼虫>1至2龄幼虫。该结果表明Bt G033A对南美番茄潜叶蛾3龄和4龄幼虫的室内毒力高于对1至2龄幼虫的毒力。
综上，以Bt G033A防治南美番茄潜叶蛾幼虫时，建议田间优选施用浓度为10g/L，亦即，100倍稀释液。
实施例3
田间药效试验
试验地为云南玉溪。玉溪位于云南省中部，年平均气温16.4至24.6℃，冬无严寒，夏无酷暑。
试验场地为有机蔬菜种植基地，种植的番茄作物主要包括两个变种——毛粉和樱桃番茄。其中，该田间药效试验以毛粉为供试寄主。黑色地膜覆盖畦面，温棚内种植，株距约50cm，行距约70cm；温棚坐北向南，南北向宽度约为16m，东西向长度约50m，高度约6m。
番茄种植与栽培管理过程执行国家标准GBT1963.1-4-2005有机蔬菜生产技术标准，期间不施用任何化学药剂和化学肥料；定期滴灌浇水。果实成熟后，主要用于采摘。
供试寄主：栽培番茄，品种为毛粉。栽培方式为长方形塑料钵(长、宽、深约为55×30×25cm)营养土种植，5月上旬定植，每钵2株，4至5片真叶期。试验前和试验期间未施用任何杀虫药剂和化学肥料，植株长势基本一致。
小区设计：在连动温棚内，面积约10m2/小区，共计20个小区，每种处理设4个重复小区，小区间及试验地周边均设保护行(约1.2m)。番茄处于苗期，试验前南美番茄潜叶蛾发生较为严重(单株虫量约20头/粒)，处于卵和低龄幼虫(1至2龄)发生期。
供试药剂：Bt G033A可湿性粉剂，有效成分含量32000IU/mg，厂商推荐防治小菜蛾或马铃薯甲虫等害虫的防治剂量范围为75至400g/亩。在该试验中，使用浓度为150g/亩，亦即稀释100倍以每亩15L的用量喷雾。现配现用。
虫菊-印楝素(英文简写Pa，购自云南南宝生物科技有限责任公司的2％虫菊-印楝素可溶液剂，(1.9:0.1)除虫菊素-印楝素2％SL)，使用浓度以厂商推荐害虫防治剂量范围的高值，即180g/亩，亦即稀释83倍以每亩15L的用量喷雾。现配现用。
除虫菊素(英文简写Pc，购自云南南宝生物科技有限责任公司的1.5％除虫菊素水乳剂)，使用浓度以厂商推荐害虫防治剂量范围的高值，即180g/亩，亦即稀释83倍以每亩15L的用量喷雾。现配现用。
鱼藤酮(英文简写Rt，购自云南南宝生物科技有限责任公司的5％鱼藤酮可溶液剂)，使用浓度以厂商推荐害虫防治剂量范围的高值，即180g/亩，亦即稀释83倍以每亩15L的用量喷雾。现配现用。
喷雾器械为气压式喷雾器，型号为：绿泰Max 2.0L，购自浙江省台州市临海市南叶家居有限公司。
试验时间与方法：田间试验用药时间为6月15日下午，多云。以茎叶一次性均匀喷雾施药。施药前1d以及施药后1、2、3、5、7d，分别采用五点取样法，每点1株，调查每株番茄上南美番茄潜叶蛾卵和幼虫(1至2龄)数量及其存活状态(以超亮强光变焦头灯打底光观察确定)。7d内没有孵化为幼虫且没有光泽的卵，记为不能孵化；虫体受强光刺激无反应的幼虫，记为死亡；并根据公式(1)计算卵孵化抑制率，根据公式(2)校正卵孵化抑制率，根据公式(3)幼虫死亡率，以及根据公式(4)校正幼虫死亡率。对南美番茄潜叶蛾卵的田间活性见图3，对南美番茄潜叶蛾低龄幼虫的田间活性见图4。
从图3可以看出，喷雾处理后7d，4种药剂对南美番茄潜叶蛾卵的校正孵化抑制率虽均不足40％，但其间却差异明显(F3,12＝17.358,P<0.001)。其中，鱼藤酮(Rt)杀卵活性最高(Rt vs.Pa:p＝0.004；Rt vs.Pc:P＝0.019；Rt vs.Bt:P<0.001)，平均为36.7％；其次为虫菊-印楝素(Pa)和除虫菊素(Pc)(Pa vs.Bt:P＝0.004；Pc vs.Bt:P<0.001)，分别为13.3％和17.6％；Bt G033A的杀卵活性较低，仅为1.7％(One-way ANOVA,LSD test)。
从图4可以看出，在田间条件下，4种生物源药剂在施药后的前2天对南美番茄潜叶蛾1至2龄幼虫基本没有防效，特别是虫菊-印楝素、除虫菊素和鱼藤酮在施药后的第3天仍然基本没有防效效果，而此时的Bt G033A显示出了一定的杀虫效果。随时间的延长，4种生物源药剂防治效果有明显提高。
具体来讲，从针对1龄幼虫的图4A可以看出，全株喷雾处理后5d，Bt G033A的田间防效最高，校正死亡率为89.1％(Bt vs.Rt:P＝0.003；Bt vs.Pa:P<0.001；Bt vs.Pc:P<0.001)；其次为鱼藤酮(Rt)，防效为60.2％(Rt vs.Pa:P＝0.006；Rt vs.Pc:P<0.001)；再次为虫菊-印楝素(Pa)，防效为39.2％(Pa vs.Pc:P<0.001)；而除虫菊素(Pc)的防效最差，只有14.9％；且4种药剂间差异明显(F3,12＝53.580,P<0.001)(One-way ANOVA,LSD test)。全株喷雾处理后7d，Bt和Rt对1龄幼虫的防效最好，分别为100％和90.4％(Bt vs.Pa:P<0.001；Bt vs.Pc:P<0.001；Rt vs.Pa:P<0.001；Rt vs.Pc:P<0.001)，且二者间差异不明显(Bt vs.Rt:P＝0.119)；其次为Pa，防效为62.5％(Pa vs.Pc:P<0.001)；而Pc的防效最差，仅为40.9％；并且Bt和Rt与Pa、Pc之间存在显著差异(F3,12＝62.758,P<0.001)(One-wayANOVA,LSD test)。
从针对2龄幼虫的图4B可以看出，全株喷雾处理后5d，Bt G033A的田间防效最高，达98.0％(Bt vs.Pa:P<0.001；Bt vs.Pc:P<0.001)；其次为Rt，防效为59.9％(Rt vs.Pc:P＝0.002)，但二者间差异不明显(Bt vs.Rt:P＝0.098)；再次为Pa，防效为38.9％(Pavs.Pc:P＝0.018)，且与Rt间没有明显差异(Rt vs.Pa:P＝0.231)；而Pc的防效最差，只有16.5％。全株喷雾处理后7d，4种药剂对2龄幼虫的田间防效差异明显(F3,12＝11.805,P＝0.001)(One-way ANOVA,LSD test)。其中，Bt、Rt和Pa的防效分别为100％、94.6％和78.0％，虽有区别，但差异并非显著(Bt vs.Rt:P＝0.695；Bt vs.Pa:P＝0.120；Rt vs.Pa:P＝0.227)；而Pc的防效较差，只有41.5％，且与其他3种药剂间差异显著(Bt vs.Pc:P<0.001；Rt vs.Pc:P<0.001；Pa vs.Pc:P＝0.003)(One-way ANOVA,LSD test)。
综上，Bt G033A比虫菊-印楝素、除虫菊素和鱼藤酮对1至2龄南美番茄潜叶蛾幼虫的田间杀虫活性见效更快，且总起来杀虫活性也更好。
虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。

Claims (6)

1.苏云金芽孢杆菌G033A在防治南美番茄潜叶蛾中的应用，所述南美番茄潜叶蛾为幼虫期南美番茄潜叶蛾。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述南美番茄潜叶蛾为1龄、2龄、3龄和4龄中的至少一龄的幼虫期南美番茄潜叶蛾。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述G033A的用量在75至400g/亩。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述G033A的用量在100至150g/亩。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述G033A的剂型为可湿性粉剂。
6.根据权利要求1至4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用为将所述G033A施用于番茄植株上防治所述南美番茄潜叶蛾。
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