CN110545804A - Sarm1 nad酶活性抑制剂及其用途 - Google Patents

Sarm1 nad酶活性抑制剂及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110545804A
CN110545804A CN201780072662.1A CN201780072662A CN110545804A CN 110545804 A CN110545804 A CN 110545804A CN 201780072662 A CN201780072662 A CN 201780072662A CN 110545804 A CN110545804 A CN 110545804A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nad
sarm1
ring
inhibitor
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780072662.1A
Other languages
English (en)
Inventor
J·米尔布兰德特
K·埃塞曼
Y·佐佐木
A·迪安东尼奥
X·毛
R·德夫拉吉
R·E·克劳斯
R·O·休斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dasama Therapy
University of Washington
Original Assignee
Dasama Therapy
University of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dasama Therapy, University of Washington filed Critical Dasama Therapy
Publication of CN110545804A publication Critical patent/CN110545804A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/29—Antimony or bismuth compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/305—Mercury compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/382—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having six-membered rings, e.g. thioxanthenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4535—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom, e.g. pizotifen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/473—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. acridines, phenanthridines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/566—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol having an oxo group in position 17, e.g. estrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/245—Bismuth; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/28—Mercury; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Psychology (AREA)

Abstract

本公开提供了可用作SARM1 NAD酶活性抑制剂的化合物、其组合物以及其使用方法。本公开提供了可用于治疗神经退行性或神经性疾病或病症的化合物、其组合物以及其使用方法。

Description

SARM1 NAD酶活性抑制剂及其用途
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月24日提交的美国临时申请62/399,339、2017年3月20日提交的美国临时申请62/473,805、2017年3月20日提交的美国临时申请62/473,916以及2017 年3月20日提交的美国临时申请62/473,921的权益，其每个均通过引用全文并入本申请。
发明领域
本申请涉及可用于抑制SARM1 NAD酶活性和/或治疗神经退行性或神经性疾病或病症的各种化合物和组合物，以及方法。
背景技术
轴突变性是几个神经性病症(包括外周神经病变、创伤性脑损伤和神经退行性疾病) 的标志(Gerdts等人,SARM1activation triggers axon degeneration locally viaNAD(+) destruction.Science 348 2016，第453-457页，其通过引用全文并入本申请)。例如，在帕金森病和肌萎缩侧索硬化症中，轴突变性是一个先于症状出现和广泛的神经元丢失的早期事件(Kurowska等人，2017；Fischer等人，Axonal degeneration in motorneuron disease Neurodegener.Dis.4 2007第431-442页；二者均通过引用全文并入本申请)。
发明简述
在一些实施方案中，本公开提供了用作许多神经性病症的治疗靶标的酶，所述许多神经性病症涉及轴突变性或轴突病变。
在某些实施方案中，本公开提供了用于鉴定和/或表征SARM1抑制剂的测定法。在一些实施方案中，本公开提供了用于这些测定法的某些载体构建体和多肽，包括其中缺失了 SARM1 N-末端自身抑制结构域的SAM-TIR，以及所述TIR结构域的标记形式。在一些实施方案中，本公开提供了包含多肽和固体支持物的组合物，所述固体支持物用于筛选 SARM1NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，本公开提供了使用SARM1 NAD酶抑制剂治疗、预防或改善轴突变性、轴突病变和涉及轴突变性的神经性疾病和病症的方法。在一些实施方案中，本公开提供了SARM1 NAD酶抑制剂。在一些这样的实施方案中，此类化合物抑制轴突变性，包括由NAD的减少或消耗引起的轴突变性。在一些实施方案中，本公开包括这样的认识：烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(NHD)可用作SARM1 NAD酶活性抑制剂。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗与轴突变性相关的神经病变或轴突病变的方法。在一些这样的实施方案中，与轴突变性相关的神经病变或轴突病变选自遗传性或先天性神经病变或轴突病变。在一些实施方案中，与轴突变性相关的神经病变或轴突病变选自以下或与以下相关：帕金森病、阿尔茨海默病、疱疹感染、糖尿病、肌萎缩侧索硬化症、脱髓鞘疾病、缺血或中风、化学损伤、热损伤和AIDS。在一些实施方案中，与轴突变性相关的神经病变或轴突病变选自帕金森病或非帕金森病和阿尔茨海默病。
现已发现，本公开所述的化合物及其药学上可接受的组合物作为SARM1 NAD酶活性抑制剂是有效的。在一些实施方案中，SARM1 NAD酶活性抑制剂具有通式IA或IB：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文所定义和描述。
在一些实施方案中，SARM1 NAD酶活性抑制剂具有通式IC或ID：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文所定义和描述。
在一些实施方案中，SARM1 NAD酶活性抑制剂选自以下化合物或其药学上可接受的盐：
本公开所述的化合物及其药学上可接受的组合物可用于治疗多种疾病、病症或病状。此类疾病、病症或病状包括本文所描述的那些疾病、病症或病状。
本公开提供的化合物也可用于研究生物学和病理学现象中的SARM1 NAD酶活性；研究脂肪组织中细胞内信号转导通路；以及对新的SARM1 NAD酶活性抑制剂进行体外或体内比较评价。
附图简述
图1显示了SARM1蛋白的结构。
图2A-F显示了天然的SARM1-TIR蛋白复合物在体外测定中裂解NAD+。图2A显示了NAD+合成和降解的选定路径。图2B显示了检测NAD酶活性及其抑制的过程。图2C 显示了Strep标签-hSARM1-TIR的NAD酶活性。图2D显示了野生型SARM1-TIR复合物不会降解NaAD。图2E显示了人SARM1-TIR G601P、TLR4-TIR和MyD88-TIR负载珠在体外NAD酶测定中的NAD+反应时间过程(归一化为0min时的对照)。图2F显示了在测定中使用的SARM1-TIR G601P、TLR4-TIR和MyD88-TIR负载珠的代表性SYPRO Ruby 凝胶。
图3显示了补充有NR的NRK1-HEK293T稳转系在SARM1-TIR表达后维持更高的 NAD+水平。
图4A-E显示了通过包含SARM1 SAM-TIR的细胞裂解物对NAD+的裂解。图4A显示了HPLC迹线，所述迹线显示了ADPR、NAM+和NAD+的水平随时间的变化。图4B 显示了HPLC迹线，所述迹线显示了在对照裂解物中未呈现出NAD酶活性。图4C显示了图4A中HPLC迹线的NAD+和ADPR的定量值。图4D显示了SARM1 SAM-TIR裂解物对NAD+的剂量依赖性裂解。图4E显示了通过SAM-TIR裂解物和对照对NAD+/ADPR比进行定量。
图5A-B显示了对来自NCI多样性IV化合物文库的候选SAM-TIR NAD酶抑制剂进行筛选。图5A显示了对来自NCI多样性IV化合物文库的所有1600种化合物进行初步筛选。图5B显示了对来自初步筛选的20个阳性“命中物(hit)”进行重新测试。
图6A-C显示了抑制SAM TIR NAD酶活性的18种化合物的结构。NSC编号已示出。
图7A-D显示了作为SAM-TIR NAD酶抑制剂的其他筛选测定的NAD+循环测定。图 7A显示了如通过NAD+Glo测定测得的，SAM-TIR裂解物(STL)而非对照(con)裂解物减少了NAD+。图7B显示了该测定的可靠性。图7C显示了在初始HPLC测定(14/18) 中鉴定的大多数命中物在NAD+-Glo测定中显示出对SAM-TIR NAD酶活性的显著抑制。
图7D显示了两种化合物的NAD酶抑制活性。
图8显示了从细菌中表达和纯化出的SARM1 TIR蛋白对NAD+的体外裂解。
图9显示了在野生型轴突中在轴突切断术后NAD+的消耗速率有所增加。
图10A-C显示了候选抑制剂对轴突变性的效果。图10A显示了化合物对轴突变性指数影响的测试。图10B显示了化合物NSC622608对轴突变性的预防效果。图10C显示了化合物NSC622608对轴突变性的剂量依赖性抑制。
图11A-G显示了NAD+裂解酶活性是SARM1-TIR固有的。图11A显示了在用IPTG 诱导人SARM1-TIR后，细菌中内源性NAD+的水平。图11B显示了从细菌中表达和纯化出的人SARM1-TIR蛋白的体外NAD+裂解反应。图11C显示了细菌表达的小鼠和斑马鱼 SARM1-TIR蛋白在体外测定中裂解NAD+。图11D显示了从NAD酶测定所用的细菌中纯化出的SARM1-TIR负载珠的SYPRO Ruby凝胶。图11E显示了使用细菌合成的人 SARM1-TIR的NAD+裂解反应的时程，所述人SARM1-TIR经过了TAP纯化，并在纯化期间用1M和2M NaCl进行了洗涤(归一化为0min时的对照)。图11F显示了使用细菌合成的人SARM1-TIR的NAD+裂解反应的时程，所述人SARM1-TIR经过了TAP纯化，并在纯化期间用0.5％Triton X-100或0.5％Tween-20进行了洗涤(归一化为0min时的对照)。图11G显示了与NAD+和非重组质粒孵育的无细胞蛋白质转录/翻译***的纯化组分的反应时程。
图12A-M显示了对SARM1-TIR NAD+裂解反应的表征。图12A-12E描绘了HPLC色谱图，所述HPLC色谱图显示了人和果蝇SARM1-TIR的NAD+裂解产物。保留时间：Nam t～2.40min；cADPR为t～0.85min；ADPR为t～1.10min。图12F-12G显示了由人(图12F) 和果蝇(图12G)SARM1-TIR产生的代谢物(如图12A-E所示)的定量(归一化为0min NAD+)。图12H显示了HPLC色谱图，所述色谱图显示小鼠和斑马鱼SARM1-TIR的NAD+ 裂解反应产生了主要产物Nam和ADPR，以及次要产物cADPR。图12I显示SARM1-TIR 酶的动力学测定揭示了为饱和动力学。图12J显示了ADPR不会抑制SARM1-TIR的NAD 酶活性。图12K显示了Nam抑制SARM1-TIR的酶活性。图12L显示了Nam对SARM1-TIR 酶活性的剂量应答抑制。图12M显示了SARM1是轴突NAD酶。
图13显示了烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(NHD)抑制SARM1 TIR对NAD+的裂解。
图14显示了烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(NHD)是SARM1 TIR酶的底物。
图15显示了实施例7的表1中所示的候选类似物的化学结构。
图16显示了SARM1-TIR与MilB胞苷5'单磷酸(CMP)水解酶的氨基酸序列比对。 CMP催化性的谷氨酸突出显示于红框中并与SARM1-TIR结构域中第642位的谷氨酸对齐。
图17显示了与CMP结合的CMP水解酶的晶体结构上的SARM1-TIR结构域的模型。E642与CMP水解酶的催化残基对齐。
图18显示了从无细胞蛋白质翻译***纯化出的人SARM1-TIR E642A的NAD+反应时程(归一化为0min时的对照)。
图19显示了从无细胞蛋白质翻译***纯化出的SARM1-TIR E642A的SYPRO Ruby凝胶。
图20显示了在DRG轴突中指定的构建体的Venus表达，Tuj1共染色以评估每个视野下的总轴突面积。
图21显示了DRG细胞体中指定的构建体的Venus表达，与Hoechst共染色以评估每个视野中总的核。
图22显示了在轴突切断术后轴突的NAD+水平(归一化为0hr时的对照)。在SARM1-/- DRG神经元中表达NC载体、SARM1WT和SARM1E642A构建体，并且在轴突切断术后的指定时间点获得NAD+的水平。
图23显示了在轴突切断术后的轴突变性时程，其被量化为变性指数(DI)，其中DI为0.35(由虚线表示)或更高时代表变性的轴突。
图24显示了轴突的明场显微照片，所述轴突表达图23中所示的指定构建体。
图25显示了长春新碱处理后的轴突变性时程，其被量化为DI。量化数据产生于至少三次独立的生物学实验。数据表示为平均值±SEM；误差线：SEM。*P<0.05，
**P<0.01,***P<0.001单因素方差分析。
图26显示了长春新碱处理后轴突的明场显微照片，对应于图25中的选定组。比例尺， 5μm。
图27显示了NAD+合成和降解的选定通路，所述通路包括SARM1作为NAD+消耗酶。
图28显示了质子泵抑制剂家族成员对SARM1-TIR NAD酶的抑制。
图29显示了雷贝拉唑抑制SARM1-TIR NAD酶活性的剂量应答曲线。
图30显示了无细胞蛋白质表达***的示意图。
图31显示了在NAD酶测定中，从无细胞蛋白表达***中纯化出的人SARM1-TIR裂解NAD+。
图32显示了从无细胞转录/翻译***中纯化出的SARM1-TIR负载珠的SYPRO Ruby凝胶。
图33A和33B描绘了化合物IA-2、IA-3、IA-6和IA-8对SARM1 NAD酶活性抑制的剂量曲线，其中图33A显示了NAD消耗相对于对照的％，以及图33B显示了ADPR产量相对于对照的％。
图34描绘了化合物IB-1和IB-2对SARM1 NAD酶活性抑制的剂量曲线。
图35描绘了化合物IB-2在0小时、6小时、12小时和24小时的时间间隔时对轴突变性的预防。
图36A和36B描绘了在暴露于(图36A)和未暴露于(图36B)化合物IB-2的变性条件下，受损轴突的SEM显微照片。
图37A-37D描绘了全长SARM1的体外测定结果。图37A的示意图显示了SARM1的结构域以及损伤后的变化，所述变化包括TIR1结构域的二聚化。AxD＝轴突变性。图37B 显示了HPLC迹线，所述迹线显示了ADPR、NAM和NAD的水平。图37C显示了全长 SARM1相对于具有活性的SARM1突变体(SAM-TIR)的相对NAD酶活性。图37D显示了全长SARM1相对于催化失活的突变体(FL-MTS SARM1(E642A))的相对NAD酶活性。
具体实施方案
Toll/白介素-1受体(TIR)结构域是进化上保守的蛋白结构域，存在于Toll样受体(TLR)和它们的胞质衔接蛋白中，其中作为脚手架结构域，其能促进先天免疫信号来保护宿主抵御入侵的病原体(O'Neill,L.A.等人,Nat.Rev.Immunol.,2013,13,453-460)。包含sterileα和TIR基序的蛋白1(Sterile Alpha and TIR motif-containing 1，SARM1)属于胞质衔接蛋白家族，但在其成员中是比较独特的，因为它是进化上最古老的衔接蛋白，矛盾地抑制TLR信号传导，并且最近被鉴定为是损伤诱导的轴突死亡通路的中央执行者(central executioner)(O'Neill,L.A.&Bowie,A.G.,Nat.Rev.Immunol.,2007,7,353-364；Osterloh, J.M.等人,Science,2012,337,481-484；Gerdts,J.等人,J.Neurosci.33,2013,13569-13580)。由轴突损伤或SARM1-TIR结构域二聚化增强导致的SARM1的活化能促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的快速的灾难性耗尽，紧随其后的是轴突死亡(Gerdts,J.等人,Science, 2015,348,453-457)。以前鉴定该过程背后的NAD+消耗酶的尝试并不成功(Gerdts,J.等人,Science,2015,348,453-457)。此外，来自其他蛋白质的SARM1和TIR结构域都不具有已知的酶活性。
受损的或不健康的轴突经由内在的自毁程序得以消除，该程序不同于传统的细胞死亡通路(如细胞凋亡)(Gerdts,J.等人,Neuron,2016,89,449-460；Whitmore,A.V.等人,Cell Death Differ.,2003,10,260-261)。轴突变性是一些神经性疾病的主要组成部分，例如但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、ALS、多发性硬化、糖尿病周围神经病变、化疗诱导的周围神经病变、遗传性神经病变、创伤性脑损伤和青光眼。在促变性基因中，SARM1是变性程序的中央执行者。SARM1的缺失能在损伤后将轴突变性阻断数周(Osterloh,J.M.等人,Science,2012,337,481-484；Gerdts,J.等人.J.Neurosci.,2013,33,13569-13580)，并且还能改善创伤性脑损伤后小鼠的功能结果(Henninger,N.等人,Brain 139,2016,1094-1105)。 SARM1也是化疗诱导的周围神经病变中轴突变性所必需的；SARM1的缺失能阻碍化疗诱导的周围神经病变的发展，在用化学治疗剂长春新碱治疗后，SARM1的缺失能阻止轴突变性和疼痛敏感性提高的发展(Geisler等人,Brain,2016,139,3092-3108)。另一方面，SARM1的活化足以在没有损伤的情况下诱导轴突变性(Gerdts,J.等人,Science,2015,348,453-457)。SARM1也是化疗诱导的周围神经病变中轴突变性所必需的。
SARM1的活化会导致NAD+的灾难性耗尽(Gerdts,J.等人,Science,2015,348,453-457)，从而正如NMNAT1的研究首先暗示的那样，突出了NAD+的平衡在轴突完整性中的核心作用。
虽然取得了这些进展，但是受损轴突中NAD+分解的酶仍然是未知的。
SARM1含有介导寡聚化和蛋白-蛋白相互作用的多个保守基序，包括SAM结构域、ARM/HEAT基序和TIR结构域(图1)(O'Neill,L.A.&Bowie,A.G.,Nat.Rev.Immunol., 2007,7,353-364；Tewari,R.等人,Trends Cell Biol.,2010,20,470-481；Qiao,F.&Bowie,J.U.,Sci.STKE 2005,re7,2005)。SARM1-TIR结构域的二聚化足以诱导轴突变性并且快速触发NAD+的降解，从而证明了NAD酶的活性与二聚化的SARM1-TIR结构域相关或由其诱导。 TIR结构域在信号蛋白中是常见的，所述信号蛋白在先天免疫途径中发挥作用，其中它们充当蛋白质复合物的支架(O'Neill,L.A.&Bowie,A.G.,Nat.Rev.Immunol.,2007,7, 353-364)。
几个小组此前已经测定了NAD+和代谢物，如ADP核糖(ADPR)(例如，Hasan,M.A. 等人,Korean J.Physiol.Pharmacol.,2014 18,497-502；Breen,L.T.等人,Am.J.Physiol.Renal. Physiol.,2006,290,F486-F495；和Li,P.L.等人,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.,2002,282, H1229-H12236)。然而，这些小组中均没有专门与SARM1活性结合起来这样做。在一些实施方案中，本文提到的ADPR是cADPR，例如，环状ADPR。
SARM1的缺失在损伤后能将轴突变性阻断数周(Gerdts等人,Sarm1-mediatedaxon degeneration requires both SAM and TIR interactions J.Neurosci.332013pp.13569-13580； Osterloh等人,2012，两者均通过引用全文并入本申请)，并且能改善创伤性脑损伤(Henninger等人,2016)和长春新碱诱导的周围神经病变(Geisler等人,2016)后小鼠的功能结果。轴突损伤诱导NAD+的缺失(Wang等人,2005)，并且在体外和体内这种损伤诱导的NAD+耗尽均需要SARM1(Gerdts等人,SARM1activation triggers axondegeneration locally via NAD(+)destruction Science 348 2015pp.453-457；Sasaki等人,2016；两者均通过引用全文并入本申请)。此外，经由SARM1的TIR结构域的二聚化增强而导致的SARM1 信号传导的激活足以在没有损伤的情况下诱导轴突变性，这归因于轴突NAD+的灾难性耗尽(Gerdts等人,SARM1activation triggers axon degenerationlocally via NAD(+)destruction Science 348 2015pp.453-457)。
NAD+是许多氧化还原反应必不可少的二核苷酸，但它也被多种酶(例如，PARP，CD38，Sirtuins)消耗，其中所得的代谢物通过其对钙动员或蛋白质对乙酰化的作用来影响信号传导通路(Cantó等人,2015；Verdin,2015)。虽然此前淘汰了候选物PARP1和CD38(Gerdts等人,2015；Sasaki等人,2009)，但是响应SARM1的活化并介导受损轴突中NAD+ 缺失的NAD酶的特性仍不清楚。此外，尚不知道SARM1具有酶活性，而且也从未将来自任何蛋白质的TIR结构域与酶活性关联起来。TIR结构域因其在Toll样受体信号传导中的支架特性而闻名，在所述Toll样受体信号传导中，它们激活下游酶以调节促炎基因和防御基因(O’Neill等人,2013)。
令人惊讶地发现，SARM1的TIR结构域能作为裂解NAD+的酶，并且SARM1的酶活性能促进创伤性和长春新碱诱导的轴突损伤后轴突NAD+的耗尽和轴突变性。本文的发现将SARM1酶活性鉴定为针对以轴突变性为特征的疾病(包括周围神经病变、创伤性脑损伤和神经退行性疾病)的新型治疗靶标。更广泛地，本文的发现显示TIR结构域可能具有内在的酶活性。
1.本公开所述化合物的一般描述：
在某些实施方案中，本公开提供了式IA所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
XA为-S-、-SO-或-SO2-；
R1A为氢、C1-4脂族基、碱金属、碱土金属、铵或N+(C1–4烷基)4；
环AA选自苯并稠合环和5-6元杂芳族稠合环，所述5-6元杂芳族稠合环具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子；
环BA选自苯基，8-10元双环芳香碳环，具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的 4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
RXA和RYA独立地为氢、任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基、-ORA、-SRA、-N(RA)2、 -N(RA)C(O)RA、-C(O)N(RA)2、-N(RA)C(O)N(RA)2、-N(RA)C(O)ORA、-OC(O)N(RA)2、 -N(RA)S(O)2RA、-S(O)2N(RA)2、-C(O)RA、-C(O)ORA、-OC(O)RA、-S(O)RA、-S(O)2RA、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
每个RA独立地为氢或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
mA和nA独立地为0、1、2或3。
在某些实施方案中，本公开提供了式IB所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
X1B和X2B独立地为-O-、-S-或–NRB-，前提是X1B和X2B中的一个为-O-或-S-，并且 X1B和X2B不同时为–O-；
YB为–N-或–CH-；
每个R1B独立地为氢或任选地被取代的C1-4脂族基；
环AB选自苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
每个RXB独立地为氢、卤素或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
每个RB独立地为氢或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
LB为共价键、C1-6元直链或支链二价烃链、环丙亚基、环丁亚基或氧杂环丁亚基；以及
nB为0、1、2、3或4。
2.化合物及定义
本公开所述的化合物包括上文一般性描述的化合物，并且通过本文公开的类、亚类和种属(species)进一步说明。如本文所用，除非另有说明，否则应适用以下定义。出于本公开的目的，根据Handbook of Chemistry and Physics(第75版)的元素周期表(CAS版)鉴定化学元素。另外，有机化学的一般原理描述于“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March’s Advanced OrganicChemistry”,第5版, Ed.:Smith,M.B.and March,J.,John Wiley&Sons,New York:2001中，其全部内容通过引用并入本申请。
本文所用的术语“脂族的”或“脂族基团”是指直链(即，非支链)或支链的、取代或未取代的烃链(其是完全饱和的或者含有一个或多个不饱和单元)，或者是指单环烃或双环烃(其是完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，但不是芳香族的(在本文中也称为“碳环”、“脂环族”或“环烷基”)，并且与分子的其余部分具有单点连接)。除非另有说明，否则脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-5 个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子，并且进一步在其他实施方案中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“脂环族”(或“碳环”或“环烷基”)是指单环的C3-C6烃，其是完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，但不是芳香族的，并且与分子的其余部分具有单点连接。合适的脂族基团包括，但不限于，直链或支链的取代或未取代的烷基、烯基、炔基基团及其杂化物(如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基)。
本文所用的术语“烷基”是指直链(即，非支链)或支链的、取代或未取代的完全饱和的烃链，或完全饱和的单环烃或双环烃(在本文中也称为“环烷基”)，并且所述单环烃或双环烃与分子的其余部分具有单点连接。除非另有说明，否则烷基含有1-6个碳原子。在一些实施方案中，烷基含有1-5个碳原子。在其他实施方案中，烷基含有1-4个碳原子。在其他实施方案中，烷基含有1-3个碳原子，并且进一步在其他实施方案中，烷基含有1-2 个碳原子。在一些实施方案中，“环烷基”是指单环的C3-C6烃，其是完全饱和的并且与分子的其余部分具有单点连接。
术语“低级烷基”是指C1-4直链或支链烷基。示例性的低级烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低级卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子取代的C1-4直链或支链烷基。
术语“杂原子”是指氧、硫、氮、磷或硅中的一种或多种(包括任何氧化形式的氮、硫、磷或硅；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮，例如N(如3,4-二氢-2H-吡咯基中的N)、NH(如吡咯烷基中的NH)或NR+(如N-取代的吡咯烷基中的NR+))。
本文所用的术语“不饱和的”是指部分具有一个或多个不饱和单元。
本文所用的术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和的、直链或支链烃链”是指如本文所定义的直链或支链的二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”为聚亚甲基，即–(CH2)n–，其中n是正整数，优选1至6、1至4、1至3、1至2或2至3。取代的亚烷基链为聚亚甲基，其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基取代。合适的取代基包括下面描述的取代脂族基团的取代基。
术语“亚烯基”是指二价烯基。取代的亚烯基链是含有至少一个双键的聚亚甲基，其中一个或多个氢原子被取代基取代。合适的取代基包括下面描述的取代脂族基团的取代基。
术语“卤素”表示F、Cl、Br或I。
单独使用或作为较大部分的一部分使用(例如在“芳烷基”，“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中)的术语“芳基”是指具有总共五至十四个环成员的单环或双环***，其中所述***中的至少一个环是芳族的，并且其中所述***中的每个环含有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”可互换使用。在一些实施方案中，术语“芳基”是指具有总共五至十个环成员的单环或双环***，其中所述***中的至少一个环是芳香族的，并且所述***中的每个环含有三至七个环成员。在本公开的某些实施方案中，“芳基”是指芳环***，所述芳环***包括，但不限于，苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其可带有一个或多个取代基。本文使用的术语“芳基”的范围内还包括这样的基团：其中芳环与一个或多个非芳族环稠合，例如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚氨基、菲啶基或四氢萘基等。
单独使用或作为较大部分的一部分(例如，“杂芳烷基”和“杂芳烷氧基”)使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指这样的基团：具有5至10个环原子(优选5、6或9个环原子)；具有在环状阵列(cyclic array)中共享的6、10或14个π电子；并且除碳原子外，还具有1-5个选自氮、氧和硫的杂原子。例如，杂芳基可以指具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10 元双环杂芳环。杂芳基包括，但不限于，噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文所用的术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括这样的基团：其中杂芳环与一个或多个芳基、脂环基或杂环基环稠合，其中所述基团或连接点在所述杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3–b]–1,4–恶唑嗪–3(4H)–酮。杂芳基团可以是单环或双环的。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族”互换使用，其中任何术语包括任选地被取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基，其中所述烷基和杂芳基部分独立地任选地被取代。
如上定义，本文所用的术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基(heterocyclic radical)”和“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用，是指饱和的或部分不饱和的稳定的5至7元单环或7–10元双环杂环部分，并且除碳原子外还具有一个或多个(优选地一至四个)杂原子。当用于指代杂环的环原子时，术语“氮”包括取代的氮。例如，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和的环中，所述氮可以是N(如3,4-二氢-2H-吡咯基中的N)、NH(如吡咯烷基中的NH)、或+NR(如N-取代的吡咯烷基中的+NR)。
杂环可以在会产生稳定的结构的任何杂原子或碳原子上与其侧基连接，并且任何环原子都可以任选地被取代。此类饱和或部分不饱和的杂环基的实例包括，但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩基吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、恶唑烷基、哌嗪基、二恶烷基、二氧戊环基、二氮杂环庚烷基(diazepinyl)、氧氮杂环庚烷基(oxazepinyl)、硫氮杂基(thiazepinyl)、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分”和“杂环基团(heterocyclicradical)”在本文中可互换使用，并且还包括这样的基团：其中杂环基环与一个或多个芳基、杂芳基或脂环族环(例如二氢吲哚基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基)稠合，其中所述基团或连接点在所述杂环基环上。杂环基基团可以是单环或双环。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基基团，其中所述烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。
本文所用的术语“可测量地抑制”是指在包含提供的化合物或组合物以及SARM1NAD酶的样品和包含SARM1 NAD酶但不存在提供的化合物或组合物的等效样品之间， SARM1NAD酶活性的可测量的变化。在一些实施方案中，与对照相比，化合物或组合物将SARM1 NAD酶的活性“可测量地抑制”至少2倍、3倍、4倍或更多。在一些实施方案中，与对照相比，化合物或组合物将SARM1 NAD酶的活性“可测量地抑制”至少10％、20％、25％、50％、75％或更多。
本文所用的术语“部分不饱和的”是指包含至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”旨在包括具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
如本文所述，本公开所述化合物可含有“任选被取代的”部分。通常，术语“被取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，都是指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基取代。除非另有说明，否则“任选被取代的”基团可以在所述基团的每个可取代的位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中一个以上的位置可以被选自特定基团的一个以上的取代基取代时，所述取代基可以在每个位置上都相同或不同。本发明所设想的取代基组合优选地是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些取代基组合。本文所用的术语“稳定的”是指这样的化合物：当其经受允许其生产、检测、以及(在某些实施方案中) 其回收、纯化的条件、以及用于本文公开的一个或多个目的时，其基本上不会改变。
“任选地被取代的”基团的可取代碳原子上的合适的单价取代基独立地为卤素；–(CH2)0–4R○；–(CH2)0–4OR○；-O(CH2)0-4R○,–O–(CH2)0–4C(O)OR○；–(CH2)0–4CH(OR○)2；–(CH2)0–4SR○；–(CH2)0–4Ph，其可以被R○取代；–(CH2)0–4O(CH2)0–1Ph，其可以被R○取代；–CH＝CHPh，其可以被R○取代；–(CH2)0–4O(CH2)0–1-吡啶基，其可以被R○取代；–NO2；–CN；–N3；-(CH2)0–4N(R○)2；–(CH2)0–4N(R○)C(O)R○；–N(R○)C(S)R○；–(CH2)0–4N(R○)C(O)NR○ 2；-N(R○)C(S)NR○ 2；–(CH2)0–4N(R○)C(O)OR○；–N(R○)N(R○)C(O)R○；-N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2；-N(R○)N(R○)C(O)OR○；–(CH2)0–4C(O)R○；–C(S)R○；–(CH2)0–4C(O)OR○；–(CH2)0–4C(O)SR○；-(CH2)0–4C(O)OSiR○ 3；–(CH2)0–4OC(O)R○；–OC(O)(CH2)0–4SR○–；–(CH2)0–4SC(O)R○；–(CH2)0–4C(O)NR○ 2；–C(S)NR○ 2；–C(S)SR○；–SC(S)SR○；-(CH2)0–4OC(O)NR○ 2；-C(O)N(OR○)R○；–C(O)C(O)R○；–C(O)CH2C(O)R○；–C(NOR○)R○；-(CH2)0–4SSR○；–(CH2)0–4S(O)2R○；–(CH2)0–4S(O)2OR○；–(CH2)0–4OS(O)2R○；–S(O)2NR○ 2；-(CH2)0–4S(O)R○；-N(R○)S(O)2NR○ 2；–N(R○)S(O)2R○；–N(OR○)R○；–C(NH)NR○ 2；–P(O)2R○；-P(O)R○ 2；-OP(O)R○ 2；–OP(O)(OR○)2；SiR○ 3；–(C1–4直链或支链亚烷基)O–N(R○)2；或–(C1–4直链或支链亚烷基)C(O)O–N(R○)2，其中每个R○可以如下所定义地被取代并且独立地为氢、C1–6脂族基、–CH2Ph、–O(CH2)0–1Ph、-CH2-(5-6元杂芳基环)、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上述定义，两个独立出现的R○与它们的***原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和的、部分不饱和的或芳基单环或双环，其可以如以下所定义地被取代。
R○上合适的单价取代基(或通过将两个独立出现的R○与它们的***原子一起形成的环)独立地为卤素，–(CH2)0–2R●、–(卤代R●)、–(CH2)0–2OH、–(CH2)0–2OR●、–(CH2)0–2CH(OR●)2、-O(卤代R●)、–CN、–N3、–(CH2)0–2C(O)R●、–(CH2)0–2C(O)OH、–(CH2)0–2C(O)OR●、–(CH2)0–2SR●、–(CH2)0–2SH、–(CH2)0–2NH2、–(CH2)0–2NHR●、–(CH2)0–2NR● 2、–NO2、–SiR● 3、–OSiR● 3、-C(O)SR●、–(C1–4直链或支链亚烷基)C(O)OR●、或–SSR●；其中每个R●是未取代的或当其前面为“卤代”时仅被一个或多个卤素取代，并且独立地选自C1–4脂族基，–CH2Ph，–O(CH2)0–1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。R○的饱和碳原子上合适的二价取代基包括＝O和＝S。
“任选被取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、–O(C(R* 2))2–3O–、或–S(C(R* 2))2–3S–，其中每个独立出现的R*选自氢、可以如以下所定义地被取代的C1–6脂族、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。与“任选被取代的”基团的邻位可取代的碳键合的合适的二价取代基包括：–O(CR* 2)2–3O–，其中每个独立出现的R*选自氢、可以如以下所定义地被取代的C1–6脂族、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。
R*的脂族基团上的合适的取代基包括卤素、–R●、-(卤代R●)、-OH、–OR●、–O(卤代 R●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR●、–NH2、–NHR●、–NR● 2、或–NO2，其中每个R●是未被取代的或当其前面为“卤”时仅被一个或多个卤素取代，并且独立地为C1–4脂族基，–CH2Ph，–O(CH2)0–1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。
“任选被取代的”基团的可取代氮上合适的取代基包括 或其中每个独立地为氢、可以如以下所定义地被取代的C1–6脂族、未取代的–OPh，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上述定义，两个独立出现的与它们的***原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3-12元饱和的、部分不饱和的或芳基单环或双环。
的脂族基团上合适的取代基独立地为卤素、–R●、-(卤代R●)、–OH、–OR●、–O(卤代R●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR●、–NH2、–NHR●、–NR● 2、或-NO2，其中每个R●是未取代的或当其前面为“卤代”时仅被一个或多个卤素取代，并且独立地为C1–4脂族基、–CH2Ph、–O(CH2)0–1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指这样的盐：其在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等，并且与合理的利益/风险比相称。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1–19中详细描述了药学上可接受的盐，该文献通过引用并入本文。本公开所述化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的盐。药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的氨基盐，或通过使用本领域中使用的其他方法(如离子交换)形成的氨基盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、 2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。
衍生自适当碱的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1–4烷基)4盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。在适当的时候，其它药学上可接受的盐包括无毒的铵、季铵和使用抗衡离子(如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)形成的胺阳离子。
除非另有说明，否则本文描述的结构还应包括该结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构和几何异构(或构象))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型，Z和E 双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本公开所述化合物的单一立体化学异构体以及对映异构、非对映异构和几何异构(或构象)的混合物都在本公开的范围内。除非另有说明，否则本公开所述化合物的所有互变异构形式都在本公开的范围内。另外，除非另有说明，否则本文描述的结构也应包括仅在存在一个或多个同位素富集原子方面不同的化合物。例如，具有本公开所述结构的化合物都在本公开的范围内，所述结构包括用氘或氚取代氢，或用富含13C或14C的碳取代碳。此类化合物可用作例如分析工具，用作生物测定中的探针，或用作根据本公开所述的治疗剂。
当用于指代SARM1时，本文所用的术语“全长”是指SARM1多肽，所述SARM1 多肽至少包含：(i)N-末端自身抑制结构域或其功能片段，(ii)一个或多个SAM结构域或其功能片段，和(iii)具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽的TIR结构域或其功能片段。在一些实施方案中，全长SARM1缺乏线粒体靶向序列。在一些实施方案中，本公开提供了SARM1多肽，所述SARM1多肽至少包含SARM1 N末端自身抑制结构域的功能片段，至少包含一个或多个SAM结构域的功能片段，和至少包含SARM1 TIR结构域的功能片段，其中所述SARM1多肽缺乏线粒体靶向序列。
3.示例性实施方案的描述
在某些实施方案中，本公开提供了式IA所示的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，式IA所示的化合物是SARM1 NAD酶活性抑制剂。应当理解，某些式IA所示的化合物是质子泵抑制剂。
如上文一般性定义，XA为–S-、-SO-或–SO2-。在一些实施方案中，XA为–S-。在一些实施方案中，XA为–SO-。在一些实施方案中，XA为–SO2-。
如上文一般性定义，R1A为氢、C1-4脂族基、碱金属、碱土金属、铵或N+(C1–4烷基)4。应当理解，当R1A为氢或C1-4脂族基时，R1A与式IA中的氮原子共价连接。还应理解，当R1A是碱金属、碱土金属、铵(即NH4 +)或N+(C1–4烷基)4时，R1A与式IA中的氮原子离子缔合。在一些实施方案中，R1A为氢或C1-4脂族基。在一些实施方案中，R1A选自碱金属、碱土金属、铵(即NH4 +)或N+(C1–4烷基)4。在一些实施方案中，R1A为氢。在一些实施方案中，R1A为C1-4脂族基。在一些实施方案中，R1A为碱金属。在一些这样的实施方案中， R1A为钠(Na+)。在一些实施方案中，R1A为碱土金属。在一些实施方案中，R1A为铵。在一些实施方案中，R1A为N+(C1–4烷基)4。
如上文一般性定义，式IA所示的环AA基团是苯并稠合环或5-6元杂芳族稠合环，所述5-6元杂芳族稠合环具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。在一些实施方案中，环AA是苯并稠合环。在一些实施方案中，环AA是5-6元杂芳族稠合环，所述5-6元杂芳族稠合环具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。在一些实施方案中，环AA是具有 1-2个氮的6元杂芳族稠合环。在一些实施方案中，环AA是吡啶并稠合环、嘧啶并稠合环、哒嗪并或吡嗪并稠合环。在一些实施方案中，环AA是三嗪并稠合环。在一些实施方案中，环AA是含有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5元杂芳族稠合环。在一些实施方案中，环AA是吡咯并稠合环、噻吩并稠合环、呋喃并稠合环、噻唑并稠合环、异噻唑并稠合环、咪唑并稠合环、吡唑并稠合环、恶唑并稠合环或异恶唑并稠合环。
如上文一般性定义，式IA所示的环BA基团选自苯基，8-10元双环芳香碳环，具有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环。在一些实施方案中，环BA为芳基。在一些实施方案中，环BA为苯基、联苯基、萘基或蒽基。在一些实施方案中，环BA为茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基或四氢萘基。在一些实施方案中，环BA为杂芳基。在一些实施方案中，环BA为噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基或蝶啶基。
如上文一般定义，RXA和RYA独立地为氢，任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基， -ORA、-SRA、-N(RA)2、-N(RA)C(O)RA、-C(O)N(RA)2、-N(RA)C(O)N(RA)2、 -N(RA)C(O)ORA、-OC(O)N(RA)2、-N(RA)S(O)2RA、-S(O)2N(RA)2、-C(O)RA、-C(O)ORA、 -OC(O)RA、-S(O)RA、-S(O)2RA、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环。
在一些实施方案中，RXA和RYA是相同的。在一些实施方案中，RXA和RYA都是氢。在一些实施方案中，RXA和RYA都是任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，RXA和RYA都为-ORA。在一些实施方案中，RXA和RYA都是芳基。在一些实施方案中，RXA和RYA都是杂芳基。
在一些实施方案中，RXA和RYA是不同的。在一些实施方案中，RXA是氢，并且RYA是任选地被1-4个卤素和/或-ORA取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，RXA是-ORA，并且RYA是任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，RXA是芳基，并且 RYA是–ORA和/或任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，RXA是杂芳基，并且RYA是–ORA和/或任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基。
如上文一般性定义，mA和nA独立地为0、1、2或3。在一些实施方案中，mA和nA是相同的。在一些实施方案中，mA和nA均为0。在一些实施方案中，mA和nA均为1。在一些实施方案中，mA和nA均为2。在一些实施方案中，mA和nA均为3。
在一些实施方案中，mA和nA是不同的。在一些实施方案中，mA为0并且nA为1、2 或3。在一些实施方案中，mA为1并且nA为0、2或3。在一些实施方案中，mA为2并且 nA为0、1或3。在一些实施方案中，mA为3并且nA为0、1或2。在一些实施方案中， mA为1、2或3，并且nA为0。在一些实施方案中，mA为0、2或3并且nA为1。在一些实施方案中，mA为0、1或3并且nA为2。在一些实施方案中，mA为0、1或2并且nA为3。在一些实施方案中，mA为1并且nA为2或3。
在一些实施方案中，nA是1并且RXA是–OCH3。在一些实施方案中，nA是1并且RXA是–OCHF2。在一些实施方案中，nA是1并且RXA是5元杂芳基环。在一些这样的实施方案中，nA是1并且RXA是吡咯基。在一些实施方案中，nA是1并且RXA是-ORA。在一些这样的实施方案中，RA是任选被取代的C1-6脂族基。在一些实施方案中，nA是1并且RXA是-ORA，其中RA是被苯基取代的C1-6脂族基。
在一些实施方案中，mA为2，并且每个RYA独立地选自–ORA和任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基。在这样的实施方案中，一个RYA为–CH3，另一个RYA为–OCH3。在一些实施方案中，一个RYA为–CH3，另一个RYA为–OCH2CF3。在一些实施方案中，mA为2，且每个RYA为–OCH3。在一些实施方案中，mA为2，并且每个RYA选自–ORA和任选地被 1-4个卤素取代的C1-4脂族基，其中RA是被–(CH2)0-4OR○取代的C1-6脂族基。在一些这样的实施方案中，一个RYA是–CH3，另一个RYA是–OCH2CH2CH2OCH3。
在一些实施方案中，mA为3，且每个RYA独立地选自–ORA和任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，一个RYA为–OCH3并且两个RYA为–CH3。在一些实施方案中，一个RYA为–OCH2CF3且两个RYA为–CH3。
在一些实施方案中，环AA选自以下表1A中所示的化合物中的环AA基团。在一些实施方案中，环BA选自以下表1A中所示的化合物中的环BA基团。在一些实施方案中，RXA选自以下表1A中所示的化合物中的RXA基团。在一些实施方案中，RYA选自以下表1A中所示的化合物中的RYA基团。在一些实施方案中，XA选自以下表1A中所示的化合物中的 XA基团。在一些实施方案中，式IA所示的化合物选自以下表1A中所所示的化合物。在一些实施方案中，式IA所示的化合物选自表1A中所示的化合物：
表1A.
在一些实施方案中，XA是–SO-。在一些实施方案中，nA为0或1且mA为2或3。在一些实施方案中，R1A为氢、C1-4脂族基或碱金属。在一些实施方案中，R1A是氢、甲基或钠。在一些实施方案中，RYA是氢、任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基、或–ORA；并且RA是被任选地取代的C1-6脂族基。在一些实施方案中，RYA是氢、-CH3、-OCH3、-OCH2CF3或-O(CH2)3OCH3。在一些实施方案中，RXA是氢、–ORA或杂芳基；并且RA是被任选地取代的C1-6脂族基或苄基。在一些实施方案中，RXA是氢、-OCH3、-OCHCF2、吡咯基或-OCH2- 苯基。
在一些实施方案中，环AA为芳基并稠合环，且环BA为杂芳基环。在一些实施方案中，环AA为苯并稠合环，且环BA为吡啶环。在一些实施方案中，环AA为杂芳族稠合环，且环BA为杂芳基环。
在一些实施方案中，环AA选自下组：吡啶并稠合环、嘧啶并稠合环、哒嗪并稠合环、吡嗪并稠合环、三嗪并稠合环、吡咯并稠合环、噻吩并稠合环、呋喃并稠合环、噻唑并稠合环、异噻唑并稠合环、咪唑并稠合环、吡唑并稠合环、恶唑并稠合环和异恶唑并稠合环。
在一些实施方案中，环BA选自下组：苯基、联苯基、萘基、蒽基、茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基、四氢萘基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。
在某些实施方案中，本公开提供了式IB所示的化合物：
或其药学上可接受的盐。
如上文一般性定义，X1B和X2B独立地为-O-、-S-或–NRB-，前提是X1B和X2B中的一个为-O-或-S-，并且X1B和X2B不同时为–O-。在一些实施方案中，X1B和X2B是相同的。在一些实施方案中，X1B和X2B是不同的。在一些实施方案中，X1B和X2B为-S-。在一些实施方案中，X1B为-S-并且X2B为-O-。在一些实施方案中，X1B为-O-并且X2B为-S-。在一些实施方案中，X1B和X2B选自以下表1B中所示的化合物中的X1B和X2B基团。
如上文一般性定义，YB为-N-或-CH-。在一些实施方案中，YB为-N-。在一些实施方案中，YB为-CH-。在一些实施方案中，YB选自以下表1B中所示的化合物中的YB基团。
如上文一般性定义，R1B为氢或任选地被取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，每个R1B是相同的。在一些实施方案中，每个R1B是不同的。在一些实施方案中，每个R1B是氢。在一些实施方案中，每个R1B是任选地被取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，一个R1B是氢并且另一个是任选地被取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，R1B选自以下表1B中所示的化合物中的R1B基团。
如上文一般性定义，环AB为苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环。在一些实施方案中，环AB为芳基。在一些实施方案中，环AB为苯基、联苯基、萘基或蒽基。在一些实施方案中，环AB为茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基或四氢萘基。在一些实施方案中，环AB为杂芳基。在一些实施方案中，环AB为噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基或蝶啶基。在一些实施方案中，环AB选自以下表1B中所示的化合物中的环AB基团。
如上文一般性定义，每个RXB独立地为氢、卤素或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环。
在一些实施方案中，每个RXB是相同的。在一些实施方案中，每个RXB是不同的。在一些实施方案中，RXB是氢。在一些实施方案中，RXB是卤素。在一些实施方案中，RXB是任选地被取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，RXB是芳基。在一些实施方案中，RXB是苯基、联苯基、萘基或蒽基。在一些实施方案中，RXB是茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基或四氢萘基。在一些实施方案中，RXB是杂芳基。在一些实施方案中， RXB是噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基或蝶啶基。在一些实施方案中，RXB选自以下表1B中所示的化合物中的 RXB基团。
如上文一般定义，LB为共价键、C1-6元直链或支链二价烃链、环丙亚基、环丁亚基或氧杂环丁亚基。在一些实施方案中，LB是共价键。在一些实施方案中，LB是C1-6元直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，LB是环丙亚基。在一些实施方案中，LB是环丁亚基。在一些实施方案中，LB是氧杂环丁亚基。在一些实施方案中，LB是–C(CH3)2-。在一些实施方案中，LB是–CH2-。在一些实施方案中，LB是–CH(CH3)-。在一些实施方案中，LB是–CH(CH3)-，其在手性中心具有(S)构型。在一些实施方案中，LB是–CH(CH3)-，其在手性中心具有(R)构型。在一些实施方案中，LB选自以下表1B中所示的化合物中的LB基团。
如上文一般定义，nB为0-4。在一些实施方案中，nB为0。在一些实施方案中，nB为1。在一些实施方案中，nB为2。在一些实施方案中，nB为3。在一些实施方案中，nB为4。
在一些实施方案中，式IB所示的化合物选自表1B中的化合物：
表1B.
在一些实施方案中，X1B和X2B为-S-，且YB为–N-。在一些实施方案中，R1B为氢或任选地被取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，R1B为氢或甲基。在一些实施方案中， LB为共价键或C1-6元直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，LB为共价键或亚甲基。在一些实施方案中，RXB为氢、卤素或任选地被取代的C1-4脂族基。在一些实施方案中，RXB为氢或-Cl。
在一些实施方案中，环AB是芳基或杂芳基。在一些实施方案中，环AB选自下组：苯基、联苯基、萘基和蒽基。在一些实施方案中，环AB选自下组：茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基、四氢萘基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。
在一些实施方案中，本公开提供了式IC所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
XC为N或C；
R1C为H、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基或C1-C5卤代烷氧基；
R2C为C1-C5烷基或C1-C5烷氧基；
R3C为C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或醚；以及
R4C为H、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。
在一些实施方案中，XC为N。在一些实施方案中，XC为C。
在一些实施方案中，R1C为H。在一些实施方案中，R1C为C1-C5烷基、C1-C5烷氧基或C1-C5卤代烷氧基。
在一些实施方案中，R1C为C1-C5烷基。在一些这样的实施方案中，R1C为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在一些实施方案中，R1C为C1-C5烷氧基。在一些这样的实施方案中，R1C为–OCH3、 -OCH2CH3、-OCH2CH2CH3或-OCH(CH3)2。
在一些实施方案中，R1C为C1-C5卤代烷氧基。在一些实施方案中，R1C为C1-C5氟代烷氧基。在一些这样的实施方案中，R1C为氟代甲氧基、二氟代甲氧基、三氟代甲氧基、氟代乙氧基、二氟代乙氧基或三氟代甲氧基。在一些实施方案中，R1C为–OCH2F、-OCHF2、 -OCF3、-OCH2CH2F、-OCH2CHF2或–OCH2CF3。
在一些实施方案中，R2C为C1-C5烷基。在一些这样的实施方案中，R2C为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在一些实施方案中，R2C为C1-C5烷氧基。在一些这样的实施方案中，R2C为–OCH3、 -OCH2CH3、-OCH2CH2CH3或-OCH(CH3)2。
在一些实施方案中，R3C为C1-C10烷基。在一些这样的实施方案中，R3C为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在一些实施方案中，R3C为C1-C10卤代烷基。在一些实施方案中，R3C为氟代烷基。在一些这样的实施方案中，R3C为氟代甲基、二氟代甲基、三氟代甲基、氟代乙基、二氟代乙基或三氟代乙基。在一些实施方案中，R3C为–CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CH2F、-CH2CHF2或–CH2CF3。
在一些实施方案中，R3C为醚。在一些这样的实施方案中，R3C为甲氧基丙基(即-CH2CH2CH2OCH3)。
在一些实施方案中，R4C为H。在一些实施方案中，R4C为C1-C5烷基。在一些这样的实施方案中，R4C为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在一些实施方案中，R4C为C1-C5烷氧基。在一些这样的实施方案中，R4C为–OCH3、 -OCH2CH3、-OCH2CH2CH3或-OCH(CH3)2。
在一些实施方案中，式IC所示的化合物选自表1C中的化合物：
表1C.
在一些实施方案中，泮托拉唑为钠盐形式：
在一些实施方案中，雷贝拉唑为钠盐形式：
在一些实施方案中，艾索美拉唑是镁水合物的形式：
在一些实施方案中，本公开提供了式ID所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1D和R2D各自独立地选自H、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5卤代烷基或C1-C5卤代烷氧基；以及
nD是1至5的整数。
在一些实施方案中，R1D和R2D是相同的。在一些实施方案中，R1D和R2D中的每个都是氢。
在一些实施方案中，R1D和R2D是不同的。在一些实施方案中，R1D是氢，且R2D是 C1-C5烷基。
在一些实施方案中，R1D选自甲基、乙基、正丙基或异丙基。在一些实施方案中，R1D选自-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3或–OCH(CH3)2。在一些实施方案中，R1D选自氟代甲基、二氟代甲基、三氟代甲基、氟代乙基、二氟代乙基或三氟代乙基。在一些这样的实施方案中，R1D选自-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CH2F、-CH2CHF2或-CH2CF3。在一些实施方案中，R1D选自氟代甲氧基、二氟代甲氧基、三氟代甲氧基、氟代乙氧基、二氟代乙氧基或三氟代乙氧基。在一些这样的实施方案中，R1D选自-OCH2F、-OCHF2、-OCF3、 -OCH2CH2F、-OCH2CHF2、或-OCH2CF3。
在一些实施方案中，R2D选自甲基、乙基、正丙基或异丙基。在一些实施方案中，R2D选自-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3或–OCH(CH3)2。在一些实施方案中，R2D选自氟代甲基、二氟代甲基、三氟代甲基、氟代乙基、二氟代乙基或三氟代乙基。在一些这样的实施方案中，R2D选自-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CH2F、-CH2CHF2或-CH2CF3。在一些实施方案中，R2D选自氟代甲氧基、二氟代甲氧基、三氟代甲氧基、氟代乙氧基、二氟代乙氧基或三氟代乙氧基。在一些这样的实施方案中，R2D选自-OCH2F、-OCHF2、-OCF3、 -OCH2CH2F、-OCH2CHF2或-OCH2CF3。
在一些实施方案中，nD为1-2。在一些实施方案中，nD为1。在一些实施方案中，nD为2。在一些实施方案中，nD为3。在一些实施方案中，nD为4。在一些实施方案中，nD为5。
在一些实施方案中，SARM1 NAD酶抑制剂选自表2中的化合物：
表2.
在一些实施方案中，SARM1 NAD酶抑制剂选自表3中的化合物组：
表3.
在一些实施方案中，将式IA、式IB、式IC和式ID中的任一个所示的化合物作为药学上可接受的组合物的一部分进行施用。在一些实施方案中，将式IA、式IB、式IC和式ID中的任一个所示的化合物进行口服施用。在一些实施方案中，式IA、式IB、式IC和式ID中的任一个所示的化合物以0.01-100mg/kg患者体重的范围进行施用。
在一些实施方案中，所述神经退行性或神经性疾病或病症与轴突变性、轴突损伤、轴突病变、脱髓鞘疾病、脑桥中央髓鞘溶解症、神经损伤疾病或病症、代谢疾病、线粒体疾病、代谢轴突变性、由白质脑病或脑白质营养不良导致的轴突损伤相关。在一些实施方案中，所述神经退行性或神经性疾病或病症选自下组：脊髓损伤、中风、多发性硬化、进行性多灶性白质脑病、先天性髓鞘发育不良、脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、脑桥中央髓细胞溶解症、渗透性低钠血症、缺氧性脱髓鞘、缺血性脱髓鞘、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PelizaeusMerzbacher disease)、脑室周围白质软化病、球形细胞脑白质营养不良(Krabbe病)、华勒变性(Wallerian degeneration)、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS、 LouGehrig病)、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、泰-萨克斯病(Tay-Sacks disease)、高歇氏病(Gaucher's disease)、Hurler综合征、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗引起的神经***并发症(化疗引起的神经病变；chemotherapy induced neuropathy、CIPN)、神经病变、急性缺血性视神经病变、维生素B12缺乏症、孤立性维生素E缺乏综合征、巴-科综合征(Bassen-Kornzweig syndrome)、青光眼、莱伯氏(Leber's)遗传性视神经萎缩(神经病变)、莱伯(Leber)先天性黑朦、视神经脊髓炎、异染性脑白质营养不良、急性出血性脑白质炎、三叉神经痛、贝尔麻痹(Bell's palsy)、脑缺血、多***萎缩、外伤性青光眼、热带痉挛性下肢瘫痪、人T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)相关性脊髓病、西尼罗河病毒性脑病、拉克罗斯病毒性脑炎、布尼亚病毒性脑炎、小儿病毒性脑炎、特发性震颤、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、运动神经元疾病、脊髓性肌萎缩症(SMA)、遗传性感觉和自主神经病变(HSAN)、肾上腺髓鞘病、进行性核上麻痹(progressive supra nuclear palsy、PSP)、弗里德里希共济失调、遗传性共济失调、噪音引起的听力丧失、先天性听力丧失、路易体痴呆、额颞叶痴呆、淀粉样变性、糖尿病神经病变、HIV神经病变、肠神经病和轴突病、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)和严重急性运动轴突神经病变(AMAN)。
在某些实施方案中，本公开提供了选自以上表1A中所示的化合物中的任意化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制SARM1 NAD酶的活性。表1A中所示的化合物是已知的质子泵抑制剂，例如：奥美拉唑(化合物IA-1)；兰索拉唑(化合物IA-2)；右兰索拉唑(化合物IA-3)；埃索美拉唑(化合物IA-4)；泮托拉唑(化合物IA-5)；雷贝拉唑(化合物 IA-6)；艾普拉唑(化合物IA-7)；泰妥拉唑(化合物IA-8)；兰索拉唑硫化物(化合物 IA-9)；兰索拉唑砜(化合物IA-10)；N-甲基奥美拉唑(化合物IA-11)；5-苄氧基奥美拉唑(化合物IA-12)和埃索美拉唑钠(化合物IA-13)。
在某些实施方案中，本公开提供了选自以上表1B中所示的化合物中的任意化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制SARM1 NAD酶的活性。
在某些实施方案中，本公开提供了选自以上表1C中所示的化合物中的任意化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制SARM1 NAD酶的活性。
在某些实施方案中，本公开提供了选自以上表2中所示的化合物中的任意化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制SARM1 NAD酶的活性。
在某些实施方案中，本公开提供了选自以上表3中所示的化合物中的任意化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制SARM1 NAD酶的活性。
在某些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含选自表1A、1B、IC、2或3中任一个的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的运载体。
4.用于提供本公开所述化合物的一般方法
应当理解，式IA所示的某些化合物是质子泵抑制剂，并且可从各种来源商购获得。
本公开所述的并且由式IA描述的化合物也可以根据已知的方法合成。例如，1989年 12月28日提交并于1991年9月3日授权的美国专利号5,045,552(“'552专利”，其全部内容通过引用并入本申请)描述了式IA所示的化合物及其合成。1987年11月13日提交并于1988年6月1日公开的EP 268956(“EP‘256”，其全部内容通过引用并入本申请) 也描述了式IA所示的化合物及其合成。
式IA所示化合物的一般制备：
式IA所示化合物可根据下文以及'552专利和EP‘256中描述的步骤和中间体(例如，方案1A)制得。在某些实施方案中，式IA所示的本公开所述化合物通常根据以下所示的方案1A制得：
方案1A
本文中由式IB描述的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的类似化合物的合成和/或半合成方法以及通过本文实施例中详细描述的方法制得或分离。例如，本文中由式IB描述的化合物可以根据2006年2月8日提交并于2006年8月17日公开的WO 2006/084854合成("WO'854,"，其全部内容通过引用并入本申请)，其描述了式IB所示的化合物及其合成。其他描述了式IB所示化合物的合成的有Oliver等人,J.Org.Chem.,第39卷,第15 期,1974,第2225-2228页和Pandeya等人,Pharmaceutical Research,第4卷,第4期,1987, 第321-326页(两者的全部内容都通过引用并入本申请)。
式IB所示化合物的一般制备：
式IB所示的化合物可根据下文以及WO'854中描述的步骤和中间体(例如，方案1B)制得。在某些实施方案中，式IB所示的本公开所述化合物通常根据以下所示的方案1B制得：
方案1B
5.用途、制剂和施用以及药学上可接受的组合物
根据另一个实施方案，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含式IA、式IB、式IC或式ID所示的化合物，或选自表1A、1B、1C、2和3的任意化合物，或其药学上可接受的盐、酯或酯盐，以及药学上可接受的运载体、佐剂或媒介物。在一些实施方案中，本公开所述组合物中化合物的量是这样的量：其能有效地可测量地抑制生物样品或患者中SARM1 NAD酶的活性和/或治疗神经退行性或神经性疾病或病症。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含和/或递送一定量的式IA、式IB、式IC或式ID所示的化合物，或选自表1A、 1B、1C、2和3的任意化合物，所述量能有效地可测量地抑制生物样品中SARM1 NAD酶的活性。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含和/或递送一定量的式IA、式IB、式 IC或式ID所示的化合物，或选自表1A、1B、1C、2和3的任意化合物，所述量当以适当的给药方案向患者施用时，能有效地可测量地抑制所述患者中SARM1 NAD酶的活性和/或治疗神经退行性或神经性疾病或病症。在某些实施方案中，将本公开所述组合物进行配制用于向需要此组合物的患者施用。在一些实施方案中，将本公开所述组合物进行配制用于向患者口服施用。
本文所用的术语“患者”是指动物，优选地指哺乳动物，以及最优选地指人。
术语“药学上可接受的运载体、佐剂或媒介物”是指不破坏用其进行配制的化合物的药理学活性的无毒运载体、佐剂或媒介物。可用于本公开所述组合物的药学上可接受的运载体、佐剂或媒介物包括，但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
“药学上可接受的衍生物”是指本公开所述化合物的任何无毒的盐、酯、酯盐或其他衍生物，其在施用给接受者后能够直接或间接地提供本公开所述的化合物或其抑制性的活性代谢物或残余物。
本文所用的术语“其抑制性的活性代谢物或残余物”是指其代谢物或残余物也是SARM1 NAD酶活性的抑制剂。
在一些实施方案中，本公开所述的组合物可以口服施用、胃肠外施用、通过吸入喷雾施用、局部施用、直肠施用、鼻腔施用、口腔施用、***施用或通过植入的储库施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，所述组合物以口服、腹膜内或静脉内的方式进行施用。在一些实施方案中，本公开所述组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性混悬液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制这些混悬液。在一些实施方案中，所述无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在所述可接受的媒介物和溶剂中，可以使用的有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油(fixed oils)通常用作溶剂或混悬介质。
为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍生物(尤其是它们的聚氧乙基化形式))就像天然的药学上可接受的油 (如橄榄油或蓖麻油)那样，可用于制备注射剂。这些油溶液或混悬液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)的类似的分散剂。其它常用的表面活性剂(如Tweens，Spans)和常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。
在一些实施方案中，本公开所述的药学上可接受的组合物可以以任何口服可接受的剂型进行口服施用，所述剂型包括，但不限于，胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。在一些实施方案中，在使用片剂用于口服施用的情况下，常用的运载体包括乳糖和玉米淀粉。在一些实施方案中，通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。在一些实施方案中，对于胶囊形式的口服施用，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。在一些实施方案中，当口服使用需要水性混悬液时，将活性成分与乳化剂和混悬剂结合使用。在一些实施方案中，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
在一些实施方案中，本公开所述的药学上可接受的组合物可以以栓剂的形式用于直肠施用。这些栓剂可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制得，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，因此会在直肠中融化以释放药物。在一些实施方案中，此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
在一些实施方案中，尤其是当治疗靶标(包括眼、皮肤或下肠道的疾病)包括局部施用易于接近的区域或器官时，本公开所述的药学上可接受的组合物还可以进行局部施用。可以容易地针对这些区域或器官中的每一个制备合适的局部制剂。
在一些实施方案中，可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠剂制剂实现用于下肠道的局部施用。在一些实施方案中，还可以使用局部透皮贴剂。
对于局部应用，可以将提供的药学上可接受的组合物配制在合适的软膏中，所述软膏含有悬浮或溶解在一种或多种运载体中的活性组分。在一些实施方案中，用于局部施用本公开所述化合物的运载体包括，但不限于，矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。在一些实施方案中，可以将提供的药学上可接受的组合物配制在合适的洗剂或乳膏中，所述洗剂或乳膏含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的运载体中的活性组分。合适的运载体包括，但不限于，矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科用途，可以将提供的药学上可接受的组合物配制成等渗的、pH调节的无菌盐水中的微粉化混悬液，或优选地，配制成等渗的、pH调节的无菌盐水中的溶液，可以有或没有防腐剂，如苄基氯化铵(benzylalkonium chloride)。或者，对于眼科用途，可以将药学上可接受的组合物配制在软膏(如凡士林)中。
在一些实施方案中，本公开所述的药学上可接受的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入剂进行施用。此类组合物可根据药物制剂领域熟知的技术制得，并且可以制备成盐水溶液，使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂(用于提高生物利用度)、碳氟化合物和/ 或其他常规增溶剂或分散剂。
最优选地，将本公开所述的药学上可接受的组合物进行配制用于口服施用。这些制剂可以与食物或不与食物一起施用。在一些实施方案中，本公开所述药学上可接受的组合物不与食物一起施用。在其他实施方案中，本公开所述的药学上可接受的组合物与食物一起施用。
在一些实施方案中，可以与所述运载体材料组合产生单一剂型的组合物的本公开所述化合物的量应根据所治疗的宿主、特定的施用方式而变化。优选地，应该配制所提供的组合物，使得可以向接受这些组合物的患者施用0.01-100mg/kg体重/天的抑制剂剂量。
还应当理解，针对任何特定患者的具体剂量和治疗方案可取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、***率、药物组合、治疗医师的判断和所治疗的特定疾病的严重程度。在一些实施方案中，在所述组合物中本公开所述化合物的量还应取决于所述组合物中的特定化合物。
在一些实施方案中，本公开提供了鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法。这些方法包括： a)提供混合物，所述混合物包含i)SARM1的突变体或片段，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性；b)孵育所述混合物；和c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+、ADPR(和/或cADPR)、烟酰胺或其任何组合。在一些实施方案中，提供的方法可以还包括d)测定NAD+/ADPR(和/或NAD+/cADPR)的摩尔比；和e)如果所述NAD+/ADPR(和/或NAD+/ADPR)的摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。在一些实施方案中，NAD+、ADPR(和/或cADPR)、烟酰胺或其任何组合中的一个或多个通过任何可用的分析方法进行定量，例如，如进行HPLC分析、化学发光测定、质谱分析、液相色谱-质谱分析、或其组合。在一些实施方案中，所述混合物包含含有所述SARM1的突变体或片段的细胞裂解物。在一些实施方案中，所述细胞裂解物是NRK1-HEK293T细胞的裂解物，其包含具有NAD酶活性的SARM1突变体或片段，由其组成，或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述混合物可包含纯化的SAM-TIR多肽。在一些实施方案中，用烟酰胺核苷(NR)处理所述NRK1-HEK293T细胞，其可用于在存在组成型活性SARM1 分子的条件下维持高NAD+水平和提升细胞活力。在一些实施方案中，如果NAD+与ADPR (或cADPR)的摩尔比大于4:1，则将抑制剂鉴定为NAD酶抑制剂。在一些实施方案中，如果NAD+与ADPR(或cADPR)的摩尔比大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、 9:1或10:1，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段是具有组成型NAD酶活性的 SAM-TIR片段。
具有组成型NAD酶活性的SARM1的片段包括，例如但不限于，缺失自身抑制结构域的SARM1；使所述自身抑制结构域失活的SARM1的至少一个点突变；由所述TIR结构域组成的SARM1片段；或由SAM和TIR结构域组成的SARM1片段。本教导所述的多肽可以进一步包括一个或多个可以作为标签的其他氨基酸序列，例如His标签、链霉亲和素标签、或其组合。多肽可包括在氨基末端的标签、在羧基末端的标签、或其组合。
在一些实施方案中，SAM-TIR结构域可包括人SAM-TIR： VPSWKEAEVQTWLQQIGFSKYCESFREQQVDGDLLLRLTEEELQTDLGMKSGITRKR FFRELTELKTFANYSTCDRSNLADWLGSLDPRFRQYTYGLVSCGLDRSLLHRVSEQQ LLEDCGIHLGVHRARILTAAREMLHSPLPCTGGKPSGDTPDVFISYRRNSGSQLASLLKV HLQLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVMGARNFVLVLSPGALDKCMQDHDCKDWVH KEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQVLPEDMQAVLTFNGIKWSHEYQEATIEK IIRFLQGRSSRDSSAGSDTSLEGAAPMGPT(SEQID NO:1)。
本教导还提供了分离的TIR结构域构建体的用途。
这些包括这样的构建体：其包括所述人SARM1-TIR结构域： TPDVFISYRRNSGSQLASLLKVHLQLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVMGARNFV LVLSPGALDKCMQDHDCKDWVHKEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQVLPEDMQA VLTFNGIKWSHEYQEATIEKIIRFLQGRSSRDSSAGSDTSLEGAAPMGPT(SEQID NO:2)；
小鼠SARM1-TIR：
TPDVFISYRRNSGSQLASLLKVHLQLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVIAARNFVL VLSAGALDKCMQDHDCKDWVHKEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQALPEDMQAV LTFNGIKWSHEYQEATIEKIIRFLQGRPSQDSSAGSDTSLEGATPMGLP(SEQ ID NO:3)
和斑马鱼SARM1-TIR：
PDVFISYRRTTGSQLASLLKVHLQLRGFSVFIDVEKLEAGRFEEKLITSVQRARNFILV LSANALDKCMGDVAMKDWVHKEIVTALNGKKNIVPVTDNFVWPDPTSLPEDMSTI LKFNGIKWSHEYQEATIEKILRFLEGCPSQEKPDGAKTDKKEPQKK(SEQ ID NO:4)。技术人员应当能够鉴定缺乏NAD酶活性的突变体或片段。
在一些实施方案中，SARM1蛋白的活性突变体或片段为hSARM1-TIR(561-724)、mSARM1-TIR(561-724)、zfSARM1-TIR(554-713)、MyD88-TIR(148-296)、或TLR4-TIR (670-839)。
在一些实施方案中，SARM1蛋白的活性突变体或片段为hSARM1-TIR(561-724)、mSARM1-TIR(561-724)、zfSARM1-TIR(554-713)、MyD88-TIR(148-296)、或TLR4-TIR (670-839)。
为了便于纯化，可以用各种蛋白质标签工程改造SARM1-TIR结构域。这些标签包括，例如但不限于，FLAG、His、Strep-tag和VENUS标签。
如本文所用的，链霉亲和素标签是对生物工程改造的链霉亲和素蛋白具有亲和力的蛋白质结构域。它可以具有，例如但不限于，Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:5) 的序列。表达载体和树脂以诸如和(IBA，哥廷根，德国)等商品名出售。
如本文所用的，NRK1-HEK293T细胞是指表达烟酰胺核苷激酶1(NRK1)的HEK293 细胞系。NRK1具有序列 MKRFVIGIGGVTNGGKTTLAKSLQKHLPNCSVISQDDFFKPESEIDIDENGFLQYDVLEALNMEKMMSAVSCWMENPGSSAGPAALESAQGVPILIIEGFLLFNYKPLDTIWNRS YFLTVPYEECKRRRSTRVYEPPDPPGYFDGHVWPMYLKHRQEMSSITWDIVYLDGTRSE EDLFSQVYEDVKQELEKQNGL(SEQ ID NO:6)。这些细胞可用NRK1稳定转化或转染，或用NRK1瞬时转化或转染。在一些配置中，NRK1可以从表达载体被转化或转染，所述表达载体例如但不限于FCIV表达载体(Araki,T.等人,Science 305:1010-1013,2004)。在一些配置中，NRK1-HEK293T细胞可包含已被表达人烟酰胺核苷激酶1(NRK1)的FCIV 表达载体稳定转染的多克隆细胞系。
在一些实施方案中，所述混合物可包含纯化的SAM-TIR多肽。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段可以由或基本上由人SARM1的第410至721位残基(SEQ ID NO:8)组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段可以由或基本上由人 SARM1的第560-724位残基组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段可以由或基本上由人SARM1的第560-723位残基组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段可以由或基本上由人SARM1的第560-722位残基组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段可以由或基本上由人SARM1的第560-721位残基组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段可以由或基本上由来自具有与人SARM1 同源的多肽的任何种属的SARM1的突变体或片段组成，如，例如但不限于，与人的第410 至721位残基同源的鼠SARM1多肽片段。在一些实施方案中，所述SARM1突变体或 SARM1片段是人SARM1突变体或片段、小鼠SARM1突变体或片段、斑马鱼SARM1突变体或片段、黑猩猩SARM1突变体或片段、恒河猴SARM1突变体或片段、犬SARM1 突变体或片段、大鼠SARM1突变体或片段、鸡SARM1突变体或片段、果蝇SARM1突变体或片段、蚊子SARM1突变体或片段、秀丽隐杆线虫(C.elegans)SARM1突变体或片段、或青蛙SARM1突变体或片段。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽的长度为约150至约300个氨基酸残基。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽的长度为约160至约310个氨基酸残基。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽的长度为约160至约320个氨基酸残基。
在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽具有序列，所述序列与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽具有序列，所述序列与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，具有组成型NAD 酶活性的SARM1多肽具有序列，所述序列与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽具有序列，所述序列与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性且与具有组成型NAD酶活性的人 SARM1多肽具有至少70％序列同一性的SARM1多肽具有保守的氨基酸取代、***、缺失、或其组合。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性且与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少80％序列同一性的SARM1多肽具有保守的氨基酸取代、***、缺失、或其组合。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性且与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少90％序列同一性的SARM1多肽具有保守的氨基酸取代、***、缺失、或其组合。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性且与具有组成型NAD酶活性的人SARM1多肽具有至少95％序列同一性的SARM1多肽具有保守的氨基酸取代、***、缺失、或其组合。在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性且与具有组成型NAD 酶活性的人SARM1多肽具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的序列的SARM1多肽具有人造序列，或具有与来自非人种属的SARM1的同源或直系同源序列相同的序列。
在一些实施方案中，具有组成型NAD酶活性的SARM1多肽是全长SARM1多肽。
在一些实施方案中，本教导包括宿主细胞，例如细菌(如大肠杆菌)，其携带编码具有组成型NAD酶活性的真核起源的SARM1的突变体或片段的核酸。在一些实施方案中，本教导包括细菌如大肠杆菌，其携带具有组成型NAD酶活性的真核起源的突变的SARM1 多肽。
在一些实施方案中，鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法包括：a)提供混合物，所述混合物包含i)SARM1的突变体或片段，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性；b)孵育所述混合物；c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+；和d)如果所述NAD+的量大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的量，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，提供了鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：a)提供混合物，所述混合物包含i)全长SARM1，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述全长SARM1具有组成型NAD酶活性；b)孵育所述混合物；c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+和ADPR(或cADPR)；d)测定NAD+:ADPR(或cADPR)的摩尔比；和e)如果所述摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，提供了鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：a)提供混合物，所述混合物包含结合了以下物质的固体支持物：i)全长SARM1和至少一个标签，ii)NAD+，和iii)候选抑制剂；b)孵育所述混合物；c)在所述孵育后定量所述NAD+；和d)如果NAD+的浓度大于对照的浓度，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，提供了鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：a)提供混合物，所述混合物包含i)全长SARM1，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述全长SARM1具有组成型NAD酶活性；b)孵育所述混合物；c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+；和d)如果NAD+的量大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的量，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，提供了鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：a)提供混合物，所述混合物包含i)具有组成型NAD酶活性的全长SARM1，ii)NAD+和iii) 候选抑制剂，其中所述全长SARM1具有组成型NAD酶活性；b)孵育所述混合物；c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+和至少一种NAD酶裂解产物；和d)如果NAD+ 与所述至少一种NAD酶裂解产物的摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述定量所述混合物中的NAD+包括进行化学发光测定、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述定量所述混合物中的NAD+包括进行HPLC分析、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述混合物可包含纯化的SAM-TIR片段。在一些实施方案中，所述混合物包含含有所述SARM1的突变体或片段的细胞裂解物。在一些实施方案中，所述细胞裂解物是包含所述SARM1的突变体或片段的NRK1-HEK293T细胞的裂解物。在一些实施方案中，用NR处理包含所述SARM1的突变体或片段的NRK1-HEK293T细胞。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段是 SAM-TIR片段。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段包含人SARM1的第410 至721位残基(SEQ ID NO:8)、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段包含与人SARM1的残基同源的鼠SARM1残基、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。
在一些实施方案中，一种多肽包含以下、由以下组成、或基本上由以下组成：a)SARM1 的突变体或片段，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性；和b)至少一个标签。在一些实施方案中，所述至少一个标签选自下组：链霉亲和素标签、His标签、及其组合。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段是SAM-TIR片段。在一些实施方案中，突变体或片段包含以下、由以下组成、或基本上由以下组成：SAM-TIR片段、His标签和链霉亲和素标签。在一些实施方案中，所述链霉亲和素标签是串联的链霉亲和素标签。在一些实施方案中，一种多肽包含以下、由以下组成、或基本上由以下组成：氨基末端串联的链霉亲和素、SAM-TIR片段和C-末端His标签。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。在一些实施方案中，所述 SARM1的突变体或片段包含人SARM1的第410至721位残基(SEQ ID NO:8)、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段包含与人SARM1 的第410至721位残基(SEQ ID NO:8)同源的鼠SARM1残基、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述SARM1的突变体或片段包含人SARM1的第410至721 位残基、由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方案中，将所述多肽固定在固体支持物上。在一些实施方案中，所述固体支持物是珠粒。在一些实施方案中，载体包括含有编码本文所述多肽的序列的质粒或病毒。
在一些实施方案中，本公开提供了鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括： a)提供混合物，所述混合物包含NAD+和与多肽结合的珠粒，所述多肽由具有组成型NAD酶活性的SARM1的突变体或片段组成；b)向所述混合物中加入候选抑制剂；c)孵育所述混合物；d)定量所述混合物中的NAD+；和e)如果所述NAD+的浓度大于对照的浓度，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为SARM1的抑制剂。在一些实施方案中，提供的方法包括在所述孵育后停止所述混合物中的NAD酶活性(如果有的话)。在一些实施方案中，所述多肽还包括至少一个标签，例如N-末端标签。在一些实施方案中，所述N-末端标签为链霉亲和素标签。在一些实施方案中，所述N-末端标签是串联的链霉亲和素标签。在一些实施方案中，所述至少一个标签是C-末端标签。在一些实施方案中，所述C-末端标签是多组氨酸标签。在一些实施方案中，所述珠粒是组氨酸标签纯化珠粒。在一些实施例中，所述至少一个标签是至少两个标签。在一些实施方案中，所述至少两个标签为N-末端标签和C-末端标签。在一些实施方案中，所述N-末端标签是串联的链霉亲和素标签，并且所述C-末端标签是多组氨酸标签。在一些实施方案中，所述定量NAD+包括进行基于HPLC 的分析。在一些实施方案中，所述定量NAD+和ADPR(或cADPR)包括进行基于LC/MS 的分析。在一些实施方案中，如果所述NAD与ADPR(或cADPR)的摩尔比大于4:1，则将候选抑制剂化合物鉴定为SARM1抑制剂。在一些实施方案中，如果所述NAD与ADPR (或cADPR)的摩尔比大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，则将候选抑制剂化合物鉴定为SARM1抑制剂。
在一些实施方案中，本公开提供了SARM1多肽突变体或片段。在一些实施方案中，SARM1多肽突变体或片段可以与固体支持物如珠粒结合。在一些实施方案中，所述与固体支持物结合的SARM1多肽突变体或片段包含SAM-TIR、TIR结构域或缺失自身抑制结构域的SARM1多肽，由其组成，或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述SARM1 多肽突变体或片段选自下组：人SARM1多肽突变体或片段、小鼠SARM1多肽突变体或片段和斑马鱼SARM1多肽突变体或片段。在一些实施方案中，所述SARM1多肽突变体或片段还包含标签、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，具有NAD酶活性的SARM1多肽突变体或片段包含经由蛋白质标签与固体支持物结合的SARM1突变体或片段，由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：a)提供混合物，所述混合物包含至少一种培养的神经元，所述培养的神经元包含轴突；b)向所述混合物中加入候选SARM1 NAD酶抑制剂；c)向所述混合物中加入标记的NAM并横向切断所述轴突；d)孵育所述混合物；和e)定量所述混合物中标记的和未标记的NAD+ 的量。在一些实施方案中，提供的方法还可以包括f)计算NAD+消耗的净速率，例如通过计算未标记的NAD+相对于总NAD+(例如，轻NAD相对于总(轻+重)NAD+)随时间的减少％。在一些实施方案中，将所述计算表示为，例如，％/小时。在一些实施方案中，当损伤后NAD+的消耗速率与不含所述候选抑制剂的对照混合物的消耗速率相比降低时，鉴定出SARM1的抑制剂。在一些实施方案中，所述标记的NAM是氘标记的(“重”) NAM。在一些实施方案中，所述标记的NAM是d4-NAM。在一些实施方案中，使用诸如 LC-MS/MS的分析方法对标记的和未标记的NAD+进行定量。在一些实施方案中，所述至少一种培养的神经元是至少一种培养的背根神经节神经元。
在一些实施方案中，一种鉴定轴突变性抑制剂的方法，所述方法包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成：a)提供包含至少一种培养的神经元的混合物，所述培养的神经元包含轴突；b)向所述混合物中加入候选抑制剂；c)破坏所述神经元；d)使用至少一个显微镜图像计算变性指数(Sasaki,Y.等人,Journal of Neuroscience 2009 29(17): 5525-5535)；和f)当与没有抑制剂的对照相比，变性指数具有显著的降低时，鉴定出轴突变性抑制剂。在一些实施方案中，破坏所述神经元包括横向切断所述轴突。在一些实施方案中，破坏所述神经元包括向所述混合物中加入长春新碱。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含用烟酰胺核苷激酶1(NRK1)转化的HEK293T细胞的NRK1-HEK293细胞系。在一些实施方案中，用编码烟酰胺核苷激酶1 (NRK1)的DNA序列转化或转染所述的NRK1-HEK293细胞。在一些实施方案中，所述编码NRK1的DNA可以是基因组或cDNA。在一些实施方案中，用编码NRK1的DNA从外源到宿主细胞稳定或瞬时转化或转染NRK1-HEK293细胞。在一些实施方案中，用编码 NRK1的DNA稳定或瞬时转化或转染NRK1-HEK293细胞，使得所述细胞与对照细胞相比以升高的水平表达NRK1。在一些实施方案中，所述编码NRK1的DNA处于一种或多种外源调控序列(例如启动子、增强子或其组合)的控制下。在一些实施方案中，编码NRK1 的DNA序列和调控序列的组合是非天然存在的组合。在一些实施方案中，编码NRK1的 DNA(基因组或cDNA)包含表达载体，如FCIV表达载体。在一些实施方案中，编码NRK1 的DNA源自基因组DNA或cDNA，并且可以来自脊椎动物或无脊椎动物种属，例如但不限于人、小鼠、斑马鱼或果蝇。在一些配置中，所述NRK1DNA是人NRK1DNA。
制药用途
在一些实施方案中，本公开提供了SARM1 NAD酶活性抑制剂，用于治疗涉及轴突变性或轴突病变的神经退行性或神经性疾病或病症。本公开还提供了使用SARM1 NAD酶活性抑制剂来治疗、预防或改善轴突变性、轴突病变和涉及轴突变性的神经退行性或神经性疾病或病症的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗神经退行性或神经性疾病或病症的方法，所述神经退行性或神经性疾病或病症与轴突变性、轴突损伤、轴突病变、脱髓鞘疾病、脑桥中央髓鞘溶解症、神经损伤疾病或病症、代谢疾病、线粒体疾病、代谢轴突变性、由白质脑病或脑白质营养不良导致的轴突损伤相关。
这种神经退行性或神经性疾病或病症可以包括脊髓损伤、中风、多发性硬化、进行性多灶性白质脑病、先天性髓鞘发育不良、脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、脑桥中央髓细胞溶解症、渗透性低钠血症、缺氧性脱髓鞘、缺血性脱髓鞘、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PelizaeusMerzbacher disease)、脑室周围白质软化病、球形细胞脑白质营养不良(Krabbe病)、华勒变性(Wallerian degeneration)、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS、 LouGehrig病)、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、泰-萨克斯病(Tay-Sacks disease)、高歇氏病(Gaucher's disease)、Hurler综合征、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗引起的神经***并发症(化疗引起的神经病变；chemotherapy induced neuropathy、CIPN)、神经病变、急性缺血性视神经病变、维生素B12缺乏症、孤立性维生素E缺乏综合征、巴-科综合征(Bassen-Kornzweig syndrome)、青光眼、莱伯氏(Leber's)遗传性视神经萎缩、莱伯(Leber)先天性黑朦、视神经脊髓炎、异染性脑白质营养不良、急性出血性脑白质炎、三叉神经痛、贝尔麻痹(Bell's palsy)、脑缺血、多***萎缩、外伤性青光眼、热带痉挛性下肢瘫痪、人T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)相关性脊髓病、西尼罗河病毒性脑病、拉克罗斯病毒性脑炎、布尼亚病毒性脑炎、小儿病毒性脑炎、特发性震颤、腓骨肌萎缩症 (Charcot-Marie-Tooth disease)、运动神经元疾病、脊髓性肌萎缩症(SMA)、遗传性感觉和自主神经病变(HSAN)、肾上腺髓鞘病、进行性核上麻痹(progressive supra nuclear palsy，PSP)、弗里德里希共济失调、遗传性共济失调、噪音引起的听力丧失、先天性听力丧失。
在一些实施方案中，与轴突变性相关的神经病变或轴突病变可以是许多神经病变或轴突病变中的任一种，例如，遗传性或先天性或与以下相关的神经病变或轴突病变：帕金森病、阿尔茨海默病、疱疹感染、糖尿病、肌萎缩侧索硬化症、脱髓鞘疾病、缺血或中风、化学损伤、热损伤和AIDS。此外，还可以用本公开的方法治疗上文未提及的神经退行性疾病以及上述疾病的亚类。这些疾病的亚类可包括帕金森病或非帕金森病，或阿尔茨海默病。
神经病变和轴突病变可包括涉及神经元和/或支持细胞(如，例如胶质细胞、肌细胞或成纤维细胞)的任何疾病或病症，特别是包括涉及轴突损伤的疾病或病症。轴突损伤可由创伤性损伤或由于疾病、病症或暴露于有毒分子或药物引起的非机械性损伤引起。这种损伤的结果可能是轴突的变性或功能障碍以及功能性神经元活动的丧失。在大量的神经病变性疾病和病症中存在产生这种轴突损伤或与这种轴突损伤相关的疾病和病症。此类神经病变可包括周围神经病变、中枢神经病变、及其组合。此外，周围神经病变表现可以通过主要集中在中枢神经***的疾病产生，并且中枢神经***表现可以基本上通过外周或全身性疾病产生。
周围神经病变可以涉及对周围神经的损伤，并且可以由神经疾病引起或由全身性疾病导致。一些此类疾病可包括糖尿病、***、传染性疾病(如AID或麻风病)、营养缺乏、血管或胶原紊乱(如动脉粥样硬化)，以及自身免疫疾病(如***性红斑狼疮、硬皮病、结节病、类风湿性关节炎和结节性多动脉炎)。周围神经变性也可由神经的创伤(机械) 性损伤以及神经的化学或热损伤导致。这种损伤周围神经的病症包括压迫或挤压伤，例如青光眼、腕管综合症、直接创伤、穿透性损伤、挫伤、骨折或骨脱位；涉及浅表神经(尺骨、桡骨或腓骨)的压力，其可能是由于长时间使用拐杖或长时间保持一个姿势造成的或由肿瘤造成的；神经内出血；缺血；暴露于寒冷或辐射或某些药物或有毒物质如除草剂或杀虫剂。特别地，神经损伤可以由细胞毒性抗癌剂(例如，紫杉醇、顺铂、蛋白酶体抑制剂、或长春花生物碱如长春新碱)导致的化学损伤引起。这种周围神经病变的典型症状包括虚弱、麻木、感觉异常(异常感觉，如灼热、搔痒、刺感或刺痛感)以及手臂、手、腿和/或脚的疼痛。神经病变也可能与线粒体功能障碍有关。这种神经病变可表现出降低的能量水平，即降低的NAD和ATP水平。
周围神经病变也可以是代谢性和内分泌性神经病变，其包括与代谢起源的全身性疾病相关的广谱周围神经病症。这些疾病包括，例如，糖尿病、低血糖、***、甲状腺功能减退、肝衰竭、红细胞增多症、淀粉样变性、肢端肥大症、卟啉症、脂质/糖脂代谢紊乱、营养/维生素缺乏和线粒体紊乱等。这些疾病的共同标志是由于代谢通路失调导致髓鞘和轴突的结构或功能发生改变，从而导致周围神经受损。
神经病变也可包括视神经病变，例如青光眼；视网膜神经节变性，如与色素性视网膜炎和视网膜外神经病变相关的视网膜神经节变性；视神经神经炎和/或变性，包括与多发性硬化症相关的视神经神经炎和/或变性；视神经的创伤性损伤，包括例如，肿瘤切除期间的损伤；遗传性视神经病变，如Kjer病和莱伯氏(Leber's)遗传性视神经病变；缺血性视神经病变，如继发于巨细胞动脉炎的缺血性视神经病变；代谢性视神经病变，如神经退行性疾病(包括前面提到的莱伯氏神经病变)，营养缺乏症(如维生素B12或叶酸缺乏)，以及乙胺丁醇或氰化物引发的毒性；由药物不良反应引起的神经病变和由维生素缺乏引起的神经病变。缺血性视神经病变还包括非动脉前部缺血性视神经病变。
与中枢神经***中的神经病变或轴突病变相关的神经退行性疾病包括多种疾病。这些疾病包括涉及进行性痴呆的疾病，例如，阿尔茨海默病、老年性痴呆、皮克病和亨廷顿病；影响肌肉功能的中枢神经***疾病，例如，帕金森病、运动神经元疾病和进行性共济失调如肌萎缩侧索硬化症；脱髓鞘疾病如，例如多发性硬化症；病毒性脑炎如，例如，由肠道病毒、虫媒病毒和单纯疱疹病毒引起的病毒性脑炎；和朊病毒病。机械性损伤(如青光眼或头部和脊柱的创伤性损伤)也可引起神经损伤以及大脑和脊髓的退化。此外，缺血和中风以及诸如营养缺乏和化学毒性(例如化学治疗剂的化学毒性)的病症可引起中枢神经***神经病变。
如本文所述，本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、缓解、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作，或抑制疾病或病症或其一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，可以在发展出一种或多种症状后进行治疗。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下进行治疗。例如，可以在症状发作之前(例如，根据症状史和/或根据遗传或其他易感因素)对易感个体进行治疗。症状消退后也可继续治疗，例如用于预防或延缓其复发。
所需的确切量将因受试者而异，取决于受试者的种属、年龄和一般状况，感染的严重程度，特定试剂，其施用方式等。本公开提供的化合物或组合物优选以剂量单位形式进行配制，以便于施用和剂量的均匀性。本文所用的表述“剂量单位形式”是指适合于待治疗患者的物理上离散的试剂单位。然而，应当理解，本公开提供的化合物或组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。针对任何特定患者或生物体的特定有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间，施用途径和所用特定化合物的***速率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或正巧同时使用的药物以及医学领域中熟知的因素。
本公开所述的药学上可接受的组合物可以以口服、直肠、静脉内、肠胃外、脑池内、***内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏或滴剂)、含服、口或鼻喷雾剂等的形式施用给人和其他动物，具体取决于所治疗感染的严重程度。在某些实施方案中，本公开提供的化合物可以以每天约0.01mg/kg至约50mg/kg，以及优选地约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重的剂量水平进行口服或肠胃外施用，每天一次或多次，以获得所需的治疗效果。
用于口服施用的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬液。所述无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中(例如在1,3-丁二醇中的溶液)的无菌可注射溶液、混悬液或乳液。可接受的媒介物和溶剂中可以使用的有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或混悬介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
可注射制剂可以，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌，所述无菌固体组合物形式的灭菌剂可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长所提供的化合物的作用，通常需要减缓对皮下或肌内注射的化合物的吸收。这可以通过使用具有较差的水溶性的结晶或无定形材料的液体混悬液来实现。然后，所述化合物的吸收速率取决于其溶出速率，而溶出速率又取决于晶体大小和晶型。或者，通过将化合物溶解或悬浮在油媒介物中来实现对胃肠外施用的化合物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成化合物的微囊基质来制备可注射的储库形式。根据化合物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库型可注射制剂。
用于直肠或***施用的组合物优选为栓剂，其可以通过将本公开所述化合物与合适的无刺激性赋形剂或运载体(如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制得，所述赋形剂或运载体在环境温度下是固体但在体温下是液体，因此在直肠或***腔中融化并释放出活性化合物。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，所述活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或运载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂如，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***树胶，c)保湿剂，如甘油，d)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液缓凝剂，如石蜡，f)吸收促进剂，如季铵化合物， g)润湿剂如，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸附剂，如高岭土和膨润土，和i) 润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。在为胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。
通过使用诸如乳糖或奶糖的赋形剂以及高分子量的聚乙二醇等，也可以将类似类型的固体组合物用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂。可以用包衣和外壳(如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其它包衣)制备片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂等固体剂型。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在或优选地在肠道的某一部分任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。通过使用诸如乳糖或奶糖的赋形剂以及高分子量的聚乙二醇等，也可以将类似类型的固体组合物用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
所提供的化合物还可以是具有一种或多种上述赋形剂的微囊化形式。可以用包衣和外壳(如肠溶包衣、释放控制包衣和药物配制领域中熟知的其它包衣)制备片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。在这种固体剂型中，所述活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。在正常情况下，这些剂型还可包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如，压片润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在为胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在或优选地在肠道的某一部分任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于局部或透皮施用本公开所述化合物的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉末剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。如有需要，可在无菌条件下将活性成分与药学上可接受的运载体和任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也包括在本公开的范围内。另外，本公开考虑使用透皮贴剂，其具有向身体受控递送化合物的附加优点。这种剂型可以通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制得。吸收促进剂也可用于提升化合物跨过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。
根据一个实施方案，本公开涉及抑制生物样品中SARM1 NAD酶活性的方法，所述方法包括使所述生物样品与提供的化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
在某些实施方案中，本公开涉及治疗生物样品中的轴突变性的方法，所述方法包括使所述生物样品与提供的化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
本文所用的术语“生物样品”包括，但不限于，细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的活检材料或其提取物；以及血液、唾液、尿液、粪便、***、眼泪或其他体液或其提取物。
抑制生物样品中的酶可用于本领域技术人员已知的各种目的。此类目的的实例包括，但不限于，生物学测定、基因表达研究和生物学靶标鉴定。
本公开的另一个实施方案涉及抑制患者中SARM1 NAD酶活性的方法，所述方法包括向所述患者施用所提供的化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。
作为多剂量方案的一部分，可以将这些其他试剂与提供的化合物或其组合物分开施用。或者，这些试剂可以是单一剂型的一部分，在单一组合物中与提供的化合物混合在一起。如果作为多剂量方案的一部分进行施用，则两种活性剂可以同时、依次或在一段时间内(通常五小时内)先后施用。
本文所用的术语“组合”、“组合的”和相关术语是指同时或依次施用本公开所述的治疗剂。例如，可以将提供的化合物与另一种治疗剂同时或依次以分开的单位剂型施用或者以单一单位剂型一起施用。因此，本公开提供了一种单一单位剂型，其包含所提供的化合物、其他的治疗剂和药学上可接受的运载体、佐剂或媒介物。
可以与运载体材料组合以产生单一剂型的所提供的化合物和其他的治疗剂(在包含如上所述的其他治疗剂的组合物中)的量都应当根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。优选地，应该配制本公开所述的组合物，使得以0.01-100mg/kg体重/天的剂量施用所提供的化合物。
在包含其他治疗剂的组合物中，所述其他治疗剂和提供的化合物可以协同作用。因此，在此类组合物中其他治疗剂的量应小于仅使用该治疗剂的单一疗法所需的量。在这样的组合物中，以0.01-100μg/kg体重/天的剂量施用所述其他治疗剂。
存在于包含所提供的化合物的组合物中的其他治疗剂的量应不超过通常在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中施用的量。优选地，在所提供的组合物中的所述其他治疗剂的量的范围为通常存在于包含该治疗剂作为唯一治疗活性剂的组合物中的量的约50％至 100％。
实施例
本教导包括实施例中提供的描述，其不旨在限制任何权利要求的范围。除非特地以过去时态呈现，否则实施例中包含的信息并不意味着实际上进行了实验。提供以下非限制性实施例以进一步说明本教导。根据本公开，本领域技术人员将理解，在不脱离本教导的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然能获得相同或相似的结果。
实施例1-10的材料和方法
NRK1-HEK293T细胞系
开发了表达烟酰胺核苷激酶1(NRK1)的克隆的HEK293T细胞系(NRK1-HEK293T)，使得在蛋白质表达期间补充NR能显著增加细胞NAD+的水平并维持足以进行蛋白质纯化的细胞活力(图3)。图3说明补充有NR的NRK1-HEK293T稳定系在SARM1-TIR表达时维持更高的NAD+水平。数据生成于三次独立转染实验的三个独立的NAD+测量值，并归一化至同时进行的非转染实验的数据。数据表示为平均值±SEM；误差线：SEM；***P <0.001双尾学生t检验。
方法
本文描述的一些方法和组合物利用技术人员熟知的实验室技术，并且可以在实验室手册中找到，例如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版.Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001；Methods InMolecular Biology,ed.Richard,Humana出版社,NJ,1995；Spector,D.L.等人,Cells:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998；和Harlow,E., Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999。药物施用方法和剂量方案可以根据药理学的标准原则，使用标准参考文献提供的方法进行确定，所述参考文献例如Remington:the Science and Practice of Pharmacy(Alfonso R.Gennaro ed.第19版.1995)；Hardman,J.G.等人,Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第9版,McGraw-Hill,1996；和Rowe,R.C.等人, Handbook ofPharmaceutical Excipients,第四版,Pharmaceutical出版社,2003。
试剂
MagStrep(Strep-Tactin)3型XT珠粒(IBA-Lifesciences，2-4090-002)。Dynabeads HisTag Isolation and Pulldown(ThermoFisher，10103D)。生物素(Sigma，B4501)。β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sigma)，烟酸腺嘌呤二核苷酸(Sigma)，SYPRO Ruby蛋白凝胶染色 (ThermoFisher，S12000)，X-tremeGENE 9DNA转染试剂(Roche)，ShuffleT7Express 感受态大肠杆菌(New England BioLabs)
细胞培养
将HEK293T和NRK1-HEK293T细胞维持在补充有青霉素/链霉素和谷氨酰胺的 10％FBS的DMEM中，并通过悬浮于0.05％胰蛋白酶中进行传代。持续监测细胞系的污染情况。测试一批HEK293T的支原体污染情况。HEK293T获自ATCC。NRK1-HEK293T是开发出的稳定表达烟酰胺核苷激酶1(NRK1)的细胞系，因此在蛋白质表达过程中补充烟酰胺核苷(NR)(NAD+生物合成前体)将显著增加细胞NAD+的水平并维持足以进行蛋白质纯化的细胞活力。
重组DNA
将哺乳动物表达构建体克隆到FCIV慢病毒载体中：StrepTag-hSARM1-TIR-Venus，StrepTag-hSARM1-TIR(E596K)-Venus，StrepTag-GST-MyD88-TIR， StrepTag-GST-TLR4-TIR，StrepTag-hSARM1-TIR-Venus-HisTag， StrepTag-hSARM1-TIR(E596K)-Venus-HisTag。
将细菌表达构建体克隆到pET30a+中：StrepTag-hSARM1-TIR-HisTag， StrepTag-mSARM1-TIR-HisTag，StrepTag-zfSARM1TIR-HisTag。
TIR结构域残基：
hSARM1-TIR(561-724)，mSARM1-TIR(561-724)，zfSARM1-TIR(554-713)， MyD88-TIR(148-296)，TLR4-TIR(670-839)。
小鼠胚胎背根神经节(DRG)神经元培养。
如前所述(Gerdts等人,2015,Science 348,453-457)从SARM1-/-E13.5小鼠胚胎中分离出DRG神经元，并将其接种在预包被有聚-D-赖氨酸(Sigma-Aldrich)和层粘连蛋白(Life Technologies)的平板上。将DRG神经元维持在补充有L-谷氨酰胺、2％B27(Gibco)、50ng/mL神经生长因子(Envigo Bioproducts)和1μM 5-氟-2'-脱氧尿苷加1μM尿苷(Sigma-Aldrich)的神经基础培养基中。在DIV 1时，如前所述(Sasaki等人,2009,J.Neurosci.,29,5525-5535)用HEK293T细胞产生的慢病毒颗粒转导神经元，其单独表达Venus或表达在C-末端处与Venus融合的所示SARM1构建体。在DIV 7时，用刀片切断来自表达所示构建体的SARM1-/-DRG的轴突，或用40nM长春新碱对其进行处理。在圣路易斯华盛顿大学的机构动物研究指南的指导下饲养(12小时的黑暗/光照周期且每笼少于5只小鼠)和使用SARM1-/-小鼠(C57/BL6)。
从NRK1-HEK293T稳定系表达和纯化蛋白质
将大约1000万个细胞进行铺板，并于第二天使用X-tremeGENETM 9试剂 (Sigma-Aldrich,St.Louis MO)用15μg的StrepTag SARM1-TIR构建体DNA进行转染。加入烟酰胺核苷(NR)至终浓度为1mM，以改善细胞活力。2天后，收获细胞并在结合缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 8、300mM氯化钠、0.01％吐温-20、蛋白酶抑制剂片剂) 中超声处理进行裂解。对于单步亲和纯化，将全细胞裂解物与20μL MagStrep(Strep-Tactin) 3型XT珠粒悬浮液(IBALifesciences)一起孵育30分钟。然后用结合缓冲液将珠粒洗涤三次，并重悬于100μL的结合缓冲液中用于酶测定和其他下游应用。
从NRK1-HEK293T稳定系进行的串联亲和纯化(TAP)
首先如上所述通过Strep Tag亲和方法纯化双标记的(Strep-标签和His标签SARM1-TIR)蛋白。对于串联亲和纯化，随后用22.5mM生物素将蛋白质从MagStrep 3 型XT珠粒洗脱25分钟。将含有洗脱蛋白质的上清液与MagStrep珠粒分离，然后与10μL Co2+Dynabead混悬液一起孵育30分钟，使得经由His标签结合SARM1-TIR蛋白质。然后用结合缓冲液将珠粒洗涤至少两次，并重悬于100μL结合缓冲液中用于下游应用。
细菌蛋白质表达和串联亲和纯化(TAP)
将合适的双重标签(Strep标签和His标签)的SARM1-TIR克隆到pET30a+质粒中。将这些构建体以及非重组pET30a+转导入Shuffle T7Express感受态大肠杆菌(New EnglandBioLabs)中。使单菌落生长过夜，并且在第二天，将培养物在LB培养基中稀释，在30℃下生长直至它们达到A600＝0.4-0.8，此时加入IPTG(0.5mM的终浓度)。使细菌再生长4小时，离心沉淀，用PBS洗涤并在-80℃下储存。对于蛋白质纯化，将冷冻的细菌沉淀在冰上解冻，重悬于结合缓冲液(不含蛋白酶抑制剂)中并与100μg/mL溶菌酶在冰上一起孵育15分钟。
然后加入蛋白酶抑制剂混合物并通过超声处理裂解细胞。如上所述进行串联亲和纯化。
用于LC-MS的肽的制备
通过将钴磁性珠粒在含有4％SDS和二硫苏糖醇(100mM)的Tris-HCl缓冲液(pH7.6， 100mM)(40μL)中煮沸15分钟来洗脱纯化的TAP复合物。将珠粒以16,000×g旋转5 分钟，并将洗脱的蛋白质与300μL含有8M尿素的Tris-HCl缓冲液(pH8.5，100mM)混合。使用过滤辅助样品制备(FASP)方法(Wisniewski等人,Nat.Methods,2009,6,359-362.) 除去SDS。缓冲液交换后，将100μL缓冲液(碳酸氢铵，pH 7.8，50mM)移液到过滤单元(YM-30)中，并加入胰蛋白酶(1μg于1μL中)。将消化物在37℃下孵育4 小时，然后在加入另一等份胰蛋白酶后在潮湿室中过夜。将消化物酸化(5μL纯甲酸)，并通过离心到下部室中回收肽。如前所述(Erde等人,J.Proteome Res.,2014,13,1885-1895) 用乙酸乙酯处理酸化的肽。通过固相提取在具有C4和多孔石墨碳Nutips(Glygen)的 Beckman BioMek NxP机器人上使肽脱盐(Chen等人,Mol.Cell.Proteomics,2012,11, M111.011445)。将用乙腈(60％于1％甲酸中)洗脱的肽合并，在真空离心机中干燥，溶解在乙腈/甲酸(1％/0.1％)(16μL)中。取等分试样(2μL)采用荧光测定法(ThermoFisher Scientific)进行分析，将剩余物移液到自动进样器小瓶(SUN-SRi)中，通过真空离心浓缩并溶于TFA水溶液(0.1％)(0.6/μg)中用于LC-MS分析(见下文)。
NAD酶测定和代谢物提取
将与指定细胞裂解物一起孵育的10微升珠粒与5μM NAD+在反应缓冲液(92.4mMNaCl和0.64X PBS)中一起孵育。在25℃下反应指定的时间，并通过加入1M的高氯酸(HClO4)以及将试管置于冰上来终止反应。使用HClO4/K2CO3方法提取NAD+代谢物，并通过HPLC进行定量(参见HPLC用于代谢物测定)。对于LC-MS/MS分析，使用含50％甲醇的蒸馏水和氯仿进行提取(更多细节参见LC-MS/MS代谢物测定)。
HPLC代谢物测定
通过用1M HClO4提取将代谢物从酶反应混合物中分离，然后用3M K2CO3进行中和，之后通过离心进行分离。将含有提取的代谢物的上清液(90μL)与0.5M磷酸钾缓冲液(10μL)混合，并通过HPLC(Nexera X2)用Kinetex(100x 3mm，2.6μm；Phenomenex)) 柱分析代谢物。使用NAD+、烟酰胺(Nam)，烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)、ADP核糖(ADPR)或cADPR的内标来产生用于定量各化合物的标准曲线。将每个实验样品中每种化合物的水平归一化为同时分析的0min时间点。
LC-MS/MS代谢物测定
通过将反应物与含50％甲醇的蒸馏水混合来制备样品。将样品置于冰上，并离心。
用氯仿提取上清液中的可溶性代谢物，并将水相冻干并储存在-20℃直至进行LC-MS/MS分析。
对于LC-MS/MS，用5mM甲酸铵重构代谢物样品，以12,000x g离心10分钟，并将澄清的上清液应用于LC-MS/MS用于代谢物的鉴定和定量。使用带有Synergi Fusion-RP (4.6×150mm，4μm；Phenomenex)柱的HPLC***(1290；Agilent)进行液相色谱分析。注入样品(10μl)，流速为0.55ml/min，流动相A为5mM甲酸铵溶液，流动相B为100％甲醇。用0–7min，0–70％B；7-8min，70％B；9-12min，0％B的梯度洗脱代谢物。在正 ESI多反应监测(MRM)下用三重四级杆质谱仪(6460MassHunter；Agilent)检测代谢物。借助MassHunter定量分析工具(Agilent)用标准曲线对代谢物进行定量。通过分析在5mM 甲酸铵中重构的NAD+、ADPR和Nam产生每种化合物的标准曲线。将每个实验样品中每种化合物的水平归一化为同时分析的0分钟时间点。进行实验的个体不知道样品信息 (sample identity)。
内源性细菌和哺乳动物细胞NAD+的定量
将含有SARM1-TIR构建体的大肠杆菌过夜培养物进行稀释，并在30℃下生长直至它们达到A600＝0.4-0.8。加入IPTG(终浓度0.1mM)以诱导蛋白质表达，并在60分钟后收集培养物。将培养物归一化至A600＝0.5±0.05，并通过添加0.5M HClO4裂解来自500μl 培养物悬浮液的沉淀。使用HClO4/K2CO3方法提取NAD+代谢物，并通过HPLC进行测定。用1μgSARM1-TIR表达构建体转染在NR存在的条件下生长的20万个NRK1-HEK293T 细胞。两天后，用0.5M HClO4和3M K2CO3提取NAD+代谢物，并通过HPLC进行测定。
SYPRO Ruby凝胶染色
将纯化的珠粒-SARM1-TIR蛋白质复合物在Laemmli缓冲液中煮沸10分钟，并在10％ Bis-Tris Plus凝胶上分离。电泳后，将该凝胶在50％甲醇/7％乙酸中固定30分钟×2次，然后在SYPRO Ruby蛋白凝胶染液(Thermo Fisher)中孵育过夜。第二天，用10％甲醇/7％乙酸溶液将凝胶洗涤30分钟，在蒸馏水中漂洗5分钟×2次，并用UV透射仪观察被染色的蛋白质。
酶动力学研究
由反应的前60秒中NAD+消耗的反应速度来确定Vmax、Km、kcat，用于升高底物(NAD+)浓度，并使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)中的非线性曲线拟合将数据拟合至Michaelis-Menten方程。计算每个纯化hSARM1-TIR的二聚体的kcat。数据表示为平均值±SEM，来自三个独立生物样品和反应测量值。通过在纯化蛋白质的SYPRO Ruby凝胶上的光密度分析测定酶浓度，以碳酸酐酶作为标准。
酶抑制研究
在NAD酶测定中测试纯化的细菌hSARM1-TIR，其中在反应混合物中加入1mM Nam或1mM ADPR。对于剂量-应答抑制实验，将不同浓度的Nam(1、10、102、103、104μM) 加入到反应混合物中。5分钟后停止反应，用高氯酸法提取NAD+代谢物，并且如上所述用HPLC进行测定。
轴突NAD+的测定
如上所述用慢病毒转导SARM1-/-DRG。每2天向细胞补充新鲜培养基。在DIV 7时，用刀片切断轴突。在指定的时间点，除去细胞体，然后使用高氯酸/碳酸钠法提取轴突NAD+，并如前所述用高效液相色谱法进行分离(Sasaki等人,J.Neurosci.,2009,29, 5525-5535)。
对SARM1-TIR结构域建模
使用HHpred(J.等人,Nucleic Acids Res.,2005,33,W244-248)和PHYRE2
(Kelley,L.A.等人,Nat.Protoc.,2015,10,845-858.)分析人SARM1 TIR结构域(aa559-724) 在蛋白质数据库(PDB)中的结构同源物。由HHpred产生蛋白质序列比对并用JalView格式化。E值大于0.1且得分低于40的命中物具有降低的准确预测概率并被排除掉。通过使用MilB CMP-糖苷酶作为模板(PDB：4JEM)或核苷2-脱氧核糖基转移酶(PDB：1F8Y)，用PHYRE2和SWISS-MODEL(Arnold,K.等人,Bioinformatics,2006,22,195-201)生成 SARM1TIR结构域的3D结构模型。将这些结构可视化并与Chimera叠加(Pettersen,E.F. 等人,J.Comput.Chem.,2004,25,(1605-12)
统计分析
统计方法并未被用于预先确定样本大小。在每个图例或适当的方法部分指出n的数值和描述。对多组进行单向方差分析(ANOVA)比较，并且使用非配对t检验或非配对双尾t检验用于个体比较。数据符合所有统计检验的假设，各组之间的差异相似。所有误差线代表SEM，并且为样品组内变异的估值。来自比最初的5、10分钟反应和动力学测定更晚进行的NAD酶迷你时程(1-4分钟)实验的样品被排除在分析之外，所述样品具有的酶活性由于增加的细菌沉淀储存量或其他技术/生物现象而部分减少。随后制备新鲜的细菌制剂。为了定量Venus的表达，将DRG固定在多聚甲醛中，并通过显微镜从每个实验的多个轴突视野观察Venus的荧光。
对DRG进行了β微管蛋白的共染色(小鼠抗-β3微管蛋白(TUJ1)；来自Biolegend)以评估每个视野下的总轴突面积。使用ImageJ macro(Sasaki,Y等人,J.Neurosci.,2009,29, 5525-5535)在明场图像的远端轴突中量化轴突变性，其测定片段化轴突区域与总轴突面积的比例。对于单个实验，分析每种条件下2-3个孔的六个视野。其他数据分析使用GraphPad Prism 7，Image J macro，Microsoft Excel，Adobe Illustrator和Photoshop完成。
数据和软件可用性
重组DNA序列已经以登录号：KY584388-KY584401保藏在BankIt中。
实施例1
该实施例说明了针对NAD酶活性的SAM-TIR测定以及该测定用于鉴定和/或表征阻断SARM1介导的NAD+裂解(消除受损或不健康的轴突的关键步骤)的化合物的用途。该测定可用于例如鉴定和/或表征抑制TIR结构域催化的NAD+裂解的化合物和可能鉴定和 /或表征破坏SAM介导的多聚化的化合物。该测定利用包含SAM和TIR结构域的SARM1 分子的片段。如本文所证实的，没有自身抑制N-末端结构域的该片段的表达能产生裂解 NAD+的活性酶。
SARM1 SAM-TIR裂解物(STL)的制备
NRK1-HEK293T细胞代表已经稳定转染了FCIV表达载体的细胞系，所述FCIV表达载体表达人烟酰胺核苷激酶1(NRK1)，NRK1是一种将NAD+生物合成前体烟酰胺核苷 (NR)转化为NMN的酶，而NMN是NAD+的直接前体。该表达载体具有以下DNA序列：
gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgct tgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagg gttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcatt agttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtc aataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatggga ctttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgac tcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactc cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagacc agatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccg tctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaag cgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtga gtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgat gggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagt taatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatc attatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagca aaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattat ataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgg gaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaatta ttgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcag ctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccact gctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaatt acacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagttt gtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtact ttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaat agaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatgg cagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacataca aactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttaattaagggtgcag cggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcaggagcg ttcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttag gacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggag ggatctccgtggggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgc ggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggtgagttgcgggctgctgggctggccggggctttcgtggccgccgggccgctcggtgg gacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgggtccgcgagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcaca aaatggcggctgttcccgagtcttgaatggaagacgcttgtaaggcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggc aagaacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcgggaaagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatctggggaccctgacgtga agtttgtcactgactggagaactcgggtttgtcgtctggttgcgggggcggcagttatgcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttggg agcgcgcgcctcgtcgtgtcgtgacgtcacccgttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttct ccgtcgcaggacgcagggttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggataagtgaggc gtcagtttctttggtcggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttgaactatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaag ttttttaggcaccttttgaaatgtaatcatttgggtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaagcttctgcaggtcgactctagaaaattgtccg ctaaattctggccgtttttggcttttttgttagacgaagcttgggctgcaggtcgactctagaggatcatgaagagatttgtcattggaattggtggt gtgacaaacggagggaagacgacactggctaagagcttgcagaagcaccttcccaactgcagcgtcatatctcaggatgacttcttcaagcc agagtctgagatagacatagatgaaaatggttttttgcagtatgatgtgcttgaagcgctaaatatggaaaaaatgatgtcagcagtttcctgttg gatggaaaacccaggaagctctgcgggaccagcagccttggaaagtgctcaaggggttcccattttaattattgaaggtttccttctctttaatta taagcctctggacaccatatggaacagaagttacttcctgaccgttccatatgaagaatgtaagaggagaaggagtaccagagtatatgagcc tccagaccctccagggtacttcgatggccacgtgtggcccatgtacctaaagcacagacaggaaatgagctccatcacctgggacattgttta cctggatggaacaaggtctgaagaggacctcttctctcaggtgtatgaagatgtcaagcaggaactagagaagcaaaatggtttgGACT ATAAAGATGATGATGATAAGTAAgctagctaccggtgatccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccg aagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccc tgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaag cttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgt attcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcg aggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccATGGatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccggg acttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaaca ccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggc cggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccga ggagcaggactgagaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctg tctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgcca ccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacagg ggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcg cgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgagacctagaaaaacatggagcaat cacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcag gtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaac gaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatc cactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttaca ccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgag agctgcatccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctca ataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaa atctctagcagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttcctt gaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtg gggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcgga aagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgac cgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcg ggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccct gatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctat tcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtg tcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagt ccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcc cctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattc cagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgtt gacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtg ctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggt gtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagc agccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctacg agatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctc atgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcattttt ttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtc atagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatga gtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcg cggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcag ctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagg aaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcg aaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacct gtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggct gtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccac tggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacact agaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgct ggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgct cagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaat caatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccata gttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctc accggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtcta ttaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgt cgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggt cctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagat gcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataat accgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatcca gttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgcc gcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatga gcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgac(SEQ ID NO:7)。当这些表达NRK1的细胞补充有NR时，NAD+的水平提高并且细胞活力增强，从而能够有效产生和纯化组成型活性人SARM1 SAM-TIR(SEQ ID NO:1)蛋白片段。
为了表达SARM1 SAM-TIR，删除了SARM1 N-末端自身抑制结构域，仅保留起始物(initiator)Met。
从该起始物Met开始的下游，所得蛋白质具有N-末端并且由人SARM1 的第410至721位残基组成： MSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGGSSGGGGGGSSGGGASVPSWKEAE VQTWLQQIGFSKYCESFREQQVDGDLLLRLTEEELQTDLGMKSGITRKRFFRELTELKTF ANYSTCDRSNLADWLGSLDPRFRQYTYGLVSCGLDRSLLHRVSEQQLLEDCGIHLGVHR ARILTAAREMLHSPLPCTGGKPSGDTPDVFISYRRNSGSQLASLLKVHLQLHGFSVFIDVE KLEAGKFEDKLIQSVMGARNFVLVLSPGALDKCMQDHDCKDWVHKEIVTALSCGKNIV PIIDGFEWPEPQVLPEDMQAVLTFNGIKWSHEYQEATIEKIIRFLQGRSSRDSSAGSDTSLE GAAPMGPT(SEQ ID NO:8)。通过标准方法将编码SARM1 SAM-TIR蛋白的片段克隆到FCIV表达构建体中以产生FCIV-SST载体。所得到的载体具有以下序列： gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgct tgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagg gttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcatt agttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtc aataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatggga ctttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgac tcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactc cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagacc agatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccg tctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaag cgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtga gtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgat gggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagt taatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatc attatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagca aaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattat ataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgg gaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaatta ttgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcag ctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccact gctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaatt acacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagttt gtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtact ttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaat agaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatgg cagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacataca aactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttaattaagggtgcag cggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcaggagcg ttcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttag gacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggag ggatctccgtggggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgc ggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggtgagttgcgggctgctgggctggccggggctttcgtggccgccgggccgctcggtgg gacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgggtccgcgagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcaca aaatggcggctgttcccgagtcttgaatggaagacgcttgtaaggcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggc aagaacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcgggaaagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatctggggaccctgacgtga agtttgtcactgactggagaactcgggtttgtcgtctggttgcgggggcggcagttatgcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttggg agcgcgcgcctcgtcgtgtcgtgacgtcacccgttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttct ccgtcgcaggacgcagggttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggataagtgaggc gtcagtttctttggtcggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttgaactatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaag ttttttaggcaccttttgaaatgtaatcatttgggtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaagcttctgcaggtcgactctagaaaattgtccg ctaaattctggccgtttttggcttttttgttagacgaagcttgggctgcaggtcgactctagaggatccGGATCCGCCACCATGT CAgctTGGAGCCACCCACAATTCGAAAAAGGCGGTGGCTCAGGCGGTGGCTCAGGTG GCTCAGCTTGGAGCCACCCACAATTCGAAAAAGGCGGTGGCTCATCTGGCGGAGGT GGCGGTGGCTCATCTGGCGGAGGTGCTAGCgtgcccagctggaaggaggccgaggttcagacgtggctgca gcagatcggtttctccaagtactgcgagagcttccgggagcagcaggtggatggcgacctgcttctgcggctcacggaggaggaactccag accgacctgggcatgaaatcgggcatcacccgcaagaggttctttagggagctcacggagctcaagaccttcgccaactattctacgtgcga ccgcagcaacctggcggactggctgggcagcctggacccgcgcttccgccagtacacctacggcctggtcagctgcggcctggaccgctc cctgctgcaccgcgtgtctgagcagcagctgctggaagactgcggcatccacctgggcgtgcaccgcgcccgcatcctcacggcggccag agaaatgctacactccccgctgccctgtactggtggcaaacccagtggggacactccagatgtcttcatcagctaccgccggaactcaggttc ccagctggccagtctcctgaaggtgcacctgcagctgcatggcttcagtgtcttcattgatgtggagaagctggaagcaggcaagttcgagg acaaactcatccagagtgtcatgggtgcccgcaactttgtgttggtgctatcacctggagcactggacaagtgcatgcaagaccatgactgca aggattgggtgcataaggagattgtgactgctttaagctgcggcaagaacattgtgcccatcattgatggcttcgagtggcctgagccccagg tcctgcctgaggacatgcaggctgtgcttactttcaacggtatcaagtggtcccacgaataccaggaggccaccattgagaagatcatccgct tcctgcagggccgctcctcccgggactcatctgcaggctctgacaccagtttggagggtgctgcacccatgggtccaacctaaactctagaat tcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggata cgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtg gcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttcc gggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcact gacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctac gtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacga gtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagca gctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgat ctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatggga tggatgacccggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcatccggactgtact gggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgc ttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgttt aaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccact cccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagca agggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctcta gggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccc tagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcccttt gacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagt ccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcag gcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccg cccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggct tttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatag tatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgc cggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgac cctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccga gtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcg ccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgcctt ctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccc caacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttg tccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgt tatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcg ttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtatt gggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacg gttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgc tggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaag ataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaa gcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttca gcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaaca ggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgc aagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgt taagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaa acttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgta gataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaa taaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctaga gtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagct ccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaa gttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtact caaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactt taaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgca cccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcg acacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtattta gaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgac(SEQ ID NO:9)。
将NRK1-HEK293T细胞以20x 106个细胞/板接种到150cm2平板上。第二天，使用 X-TREMEGENETM9DNA转染试剂(Roche产品#06365787001)，用15μg FCIV-SST (SAM-TIR表达质粒，SEQ ID NO:9)转染细胞。在转染时向培养物补充1mM NR以使来自SAM-TIR过表达的毒性最小化。转染后48小时，收集细胞，通过1,000rpm离心进行沉淀(Sorvall ST 16R离心机，Thermo Fisher)，并用冷PBS(0.01M磷酸盐缓冲盐水 NaCl 0.138M；KCl 0.0027M；pH 7.4)洗涤一次。将细胞重悬于含有蛋白酶抑制剂的PBS 中(cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物，Roche产品#11873580001)，并通过超声处理制备细胞裂解物(Branson Sonifer 450，输出＝3，超声(stroke)20次)。将裂解物离心(12,000×g， 4℃下10分钟)以除去细胞碎片，将上清液(含有SARM1 SAM-TIR蛋白)储存在-80℃下用于之后的体外SARM1 SAM-TIR NAD酶测定(见下文)。通过二奎啉甲酸(BCA) 法测定蛋白质浓度，并用于将裂解物浓度归一化。
化合物文库
筛选NCI多样性IV化合物文库和Pharmacon 1600化合物文库，以寻找SARM1 SAM-TIR抑制剂。每种化合物的储备液浓度为10mM(在DMSO中)。首先将化合物稀释10倍以产生1mM储备液(在DMSO中)。将该储备液进一步稀释20倍到20％ DMSO/80％水中，以产生每种化合物的50μM工作储备液。
体外SARM1 SAM-TIR NAD酶测定和抑制剂筛选
基于HPLC的测定1
通过将SARM1 SAM-TIR细胞裂解物(0.14μg总蛋白)、化合物储备液(5μM终浓度)和PBS(pH 7.4)混合至终体积12μl，在冰上制备反应混合物。然后加入NAD+(5μM 终浓度)，使最终反应体积为20μl。将混合物在37℃下孵育60分钟；然后通过加入180 μl 0.55M高氯酸(HClO4)终止反应。然后将反应物置于冰上10分钟，并将反应板以4,000 rpm离心10分钟(Sorvall ST 16R离心机)。将上清液(120μl)转移至新板中，加入10μl 的3M K2CO3以中和溶液。通过以4,000rpm离心10分钟(Sorvall ST 16R离心机)除去沉淀的盐。转移上清液，并通过HPLC(Shimadzu Nexera X2)用(100x 3mm, 2.6μm；)柱进行分析，并以254nm的吸光度监测代谢物。
结果。
SARM1 SAM-TIR裂解物裂解NAD+。
通过使用基于HPLC的测定1发现，SARM1 SAM-TIR裂解物以剂量和时间依赖性的方式裂解NAD+(图4A、C、D)，而从未转染的NRK1-HEK293T细胞制得的对照裂解物显示没有NAD+的裂解(图4B)。NAD+的缺失伴随有烟酰胺(Nam)和ADP核糖(ADPR) 的增加，这表明对NAD+的烟酰胺-核糖基键的裂解(图4A)。将SARM1 SAM-TIR裂解物与NAD+(5μM)一起孵育指定的时间。如图4A所示，NAD+水平随时间降低(HPLC 迹线中峰值位于2.52分钟处)，并且ADPR水平随时间增加(峰值位于1.15分钟处)。迹线颜色：黑色-仅NAD；绿色-裂解物；蓝色-珠粒上，绿色-洗脱液中。
对于图4A，通过Strep Tag亲和方法纯化SARM1 Sam-TIR蛋白。将HEK-NRK1裂解物(100μl)与20μL MagStrep(Strep-Tactin)3型XT珠粒悬浮液(IBA Lifesciences)一起孵育30分钟(在缓冲液W中：100mM Tris/HCl，pH 8.0；150mM NaCl；1mM EDTA)。然后用缓冲液W将珠粒洗涤三次，并用含25mM生物素的缓冲液W从MagStrep 3型XT 珠粒洗脱结合的蛋白质30分钟。含有洗脱蛋白质的上清液可用于NAD酶活性的测定。将 Pierce蛋白酶抑制剂(ThermoFisher货号#88266)加入到所有缓冲液中。图4A显示了起始底物、NAD和裂解产物ADPR和烟酰胺(NAM)的HPLC迹线，所述裂解产物由具有活性的SARM1 TIR NAD酶产生。黑色迹线显示没有添加酶的NAD。红色迹线显示含有 SAM-TIR的裂解物具有有效的NAD酶活性(NAD缺失并且产物ADPR和NAM产生)。蓝色迹线显示可以如上所述在珠粒上纯化SAM-TIR酶，并且该酶是具有活性的(同样， NAD缺失并且ADPR和NAM产生)。最后，绿色迹线显示具有活性的SAM-TIR酶可以从珠粒上洗脱下来并保持活性(NAD缺失，ADPR和NAM产生)。图4B显示在相同的孵育期后对照裂解物不消耗NAD+。图4C显示图4A中HPLC迹线的NAD+和ADPR的定量值。图4D显示SARM1 SAM-TIR裂解物对NAD+的裂解是剂量依赖性的。将指定量的SARM1 SAM-TIR裂解物与NAD+(5μM)在37℃下孵育60分钟，并监测NAD+向 ADPR的转化。图4E显示使用0.14μg对照蛋白和SAM-TIR裂解物蛋白在反应60分钟后对NAD+/ADPR比例进行定量。这些结果与使用TIR测定观察到的NAD酶活性是一致的 (参见图8)。
总之，本实施例证明含有SARM1-TIR结构域的裂解物含有NAD酶活性。
SARM1 SAM-TIR NAD酶抑制剂的鉴定和/或表征
为了鉴定SARM1 NAD酶活性的抑制剂，通过HPLC定量了反应中NAD+和酶裂解产物ADPR的水平。根据这些值，计算每种化合物的NAD+/ADPR比例，并将该比例用作 NAD+裂解活性的量度(注意：在来自HEK293裂解物的对照样品中存在少量残留的但可检测到的ADPR信号)。将该比例与不存在化合物抑制剂条件下产生的比例进行比较。NAD 酶活性的显著降低(定义为NAD+/ADPR比例>4)用于鉴定抑制SAM-TIR催化的NAD+ 裂解的化合物(图5A-B)。图5A示出了对来自文库的所有1600种化合物的初次筛选(5 μM化合物，具有5μM NAD+)。在图5B中，对来自顶部图的20个阳性命中物 (NAD+/ADPR>4)进行了重新测试。20个最初‘阳性命中物’中有18个在二次筛选中再次被鉴定为抑制剂(对照：方形，无反应时间；三角形：DMSO对照)。
对抑制SARM1 SAM-TIR NAD酶活性的化合物的鉴定和表征
使用基于HPLC的测定1，用NAD+/ADPR比例来确定SARM1 SAM-TIR裂解物的 NAD+裂解活性。应当理解，可以使用任何精确的、定量的测定NAD+水平的方法检测 SARM1 NAD酶的活性。建立NAD+/ADPR比＝～1作为基线对照(无抑制剂)。该测定法是可靠的(Z'＝0.537，对照裂解物(n＝14)NAD+/ADPR＝19.52±2.25；SAM-TIR裂解物 (n＝14)NAD+/ADPR＝1.186±0.607(平均值±SD)。在对照条件下，通过HPLC检测到了少量ADPR(图4A-B)。使用经验产生的(NAD+/ADPR)截止值4：1，其中NAD+/ADPR>4 代表显著抑制了SARM1 SAM-TIR裂解物的NAD酶活性。
来自NCI多样性IV化合物文库的1600个化合物中有20个化合物在初次筛选中被鉴定为抑制剂(图5A)。其中有18个在二次筛选中被鉴定为阳性'命中物'，其中10个显示出对SARM1 SAM-TIR活性的强烈抑制(即，NAD+/ADPR>10(图5B；图6A-C)。
然后在NAD+Glo测定(参见下文)中测试了初始筛选中鉴定的抑制剂，所述NAD+Glo测定使用酶促循环反应来测定NAD+的浓度。该测定本身具有高度可重复性(图7A-B)。图7A显示了如NAD+Glo测定法所测定的，SAM-TIR裂解物(STL)而非对照(con)裂解物降低了NAD+。在高剂量裂解物条件下升高的NAD+水平很可能来自裂解物本身。图7B说明该测定非常可靠(对照2h反应时间对比SAM-TIR 1h反应时间Z'＝0.66；对照2h 反应时间对比SAM-TIR 2h反应时间Z'＝0.71)。对照2h NAD+＝196.20±15.66nM；SAM-TIR 1h NAD+＝22.48±3.98nM；SAM-TIR 2h NAD+＝8.18±2.79nM。在初始HPLC测定中鉴定的大多数命中物(14/18)在NAD+-Glo测定中显示出对SAM-TIR NAD酶活性的显著抑制(图7C)。循环测定与HPLC测定高度相关。来自HPLC的18个命中物中有14个也显著阻断了NAD酶活性(发光强度增加2倍)。对于HPLC测定1相对比例代表 NAD+/ADPR比例，而对于循环测定，它代表IC50≈150nM的比例(图7D)。两个化合物在NAD+Glo测定中显示出了最佳抑制。NSC622608的IC50≈150nM。
基于发光的测定。该测定可以补充由HPLC获得的结果，并且与HPLC方法相比可以允许更高的化合物文库筛选通量。该测定是对NAD+/NADH-GLOTM测定(Promega G9071，Promega Corporation，Madison，WI)的调整。在该测定中，NAD+循环酶将NAD+转化为 NADH。在NADH存在条件下，还原酶以酶促的方式将前荧光素还原酶底物转化为荧光素。使用ULTRA-GLOTM rLuciferase检测荧光素，并且化学发光强度与样品中NAD+和NADH 的量成比例。在本测定条件下，用该测定检测不到裂解物中存在的NAD+和NADH的量，排除了对检测到的最终NAD+的任何内源性贡献。如下设置测定：2μl候选抑制剂(终浓度1μM，2％DMSO)，0.07μg裂解物(2μl)和2μl 400nM NAD+。将反应物在37℃下孵育60分钟，然后加入6μl NAD+/NADH-GLOTM检测试剂。在室温下30分钟后，使用 CYTATIONTM5成像读数器定量发光信号。SARM1 SAM-TIR裂解物催化 NAD+的剂量依赖性耗尽，而当用从对照NRK1-HEK293T细胞制得的裂解物进行反应时， NAD+水平没有下降(图7A-D)。
实施例2
本实施例描述了基于SARM1 TIR的测定。该测定类似于实施例1中描述的测定，但允许鉴定和/或表征直接与TIR结构域相互作用的化合物，而实施例1中描述的测定还可鉴定破坏SAM结构域相互作用的化合物。该测定利用可以亲和纯化的标记形式的SARM1 TIR片段的细菌表达。在固体表面(即亲和珠粒)上展示该人造SARM1 TIR结构域能产生活性NAD+裂解酶。
材料和方法
标记的蛋白质包括以下：StrepTag-人SARM1-TIR-6xHisTag
MSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGGSSGGGASTPDVFISYRRNSGSQ LASLLKVHLQLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVMGARNFVLVLSPGALDKCMQ DHDCKDWVHKEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQVLPEDMQAVLTFNGIKWSHEYQ EATIEKIIRFLQGRSSRDSSAGSDTSLEGAAPMGPTHHHHHH(SEQ IDNO:10)
StrepTag-小鼠SARM1-TIR-6xHisTag
MSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGGSSGGGASTPDVFISYRRNSGSQ LASLLKVHLQLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVIAARNFVLVLSAGALDKCMQD HDCKDWVHKEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQALPEDMQAVLTFNGIKWSHEYQE ATIEKIIRFLQGRPSQDSSAGSDTSLEGATPMGLPHHHHHH(SEQ IDNO:11)
StrepTag-斑马鱼SARM1-TIR-6xHisTag
MSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGGSSGGGASPDVFISYRRTTGSQL ASLLKVHLQLRGFSVFIDVEKLEAGRFEEKLITSVQRARNFILVLSANALDKCMGDV AMKDWVHKEIVTALNGKKNIVPVTDNFVWPDPTSLPEDMSTILKFNGIKWSHEYQE ATIEKILRFLEGCPSQEKPDGAKTDKKEPQKKHHHHHH(SEQ ID NO:12)
细菌蛋白质表达和串联亲和纯化(TAP)
将SARM1的TIR结构域在N-末端用串联标记，在C-末端用多组氨酸标签标记，并克隆到pET30a+质粒中。然后将构建体转化到T7Express感受态大肠杆菌(New England BioLabs，Ipswich，MA)中，并使单菌落生长过夜。第二天，将培养物在LB培养基中稀释，在30℃下生长直至它们达到A600＝0.4-0.8，此时加入IPTG(0.5 mM终浓度)。使细菌再生长4小时，离心沉淀，用PBS洗涤并在-80℃下储存。对于蛋白质纯化，将冷冻的细菌沉淀在冰上解冻，重悬于结合缓冲液(不含蛋白酶抑制剂)中并与100μg/mL溶菌酶在冰上一起孵育15分钟。然后加入蛋白酶抑制剂混合物，并通过超声处理裂解细胞。
首先通过Strep Tag亲和方法纯化SARM1 TIR蛋白，在该方法中将细菌裂解物与20μL MagStrep(IBA GmBH,德国)3型XT珠粒悬浮液(IBALifesciences)一起孵育30分钟。然后用结合缓冲液将珠粒洗涤三次，并用22.5mM生物素从MagStrep 3型XT珠粒洗脱结合的蛋白质25分钟。将含有洗脱蛋白质的上清液与 MagStrep珠粒分离，并与10μL (ThermoFisher Scientific，Waltham， MA)混悬液一起孵育30分钟，使得经由His标签结合SARM1-TIR蛋白质。然后用结合缓冲液将珠粒洗涤至少两次，并重悬于100μL结合缓冲液中用于NAD酶测定。
将10微升纯化的载有SARM1-TIR的珠粒与5μM NAD+在反应缓冲液(92.4mM NaCl和0.64X PBS)中一起孵育。在25℃下反应指定的时间，并通过加入1M的高氯酸(HClO4) 以及将试管置于冰上来终止反应。使用HClO4/K2CO3方法提取NAD+代谢物，并通过 HPLC进行定量(参见下面的代谢物测定)。对于LC-MS/MS分析，使用含50％甲醇的蒸馏水和氯仿进行提取(参见下面的LC-MS/MS代谢物测定)。图8显示在SARM1 SAM-TIR 测定中鉴定为抑制剂的一些化合物还能在体外测定中抑制纯化的SARM1 TIR的NAD酶活性。将从SARM1 SAM-TIR裂解物筛选中鉴定出的有效抑制剂(622608、622689)以5μM 加入到反应物中。将NAD归一化为0min时的对照。
HPLC代谢物测定。
通过用1M HClO4提取将代谢物从酶反应混合物中分离，然后用3M K2CO3进行中和，然后通过离心进行分离。将含有提取的代谢物的上清液(90μL)与0.5M磷酸钾缓冲液(10μL)混合，并通过HPLC(Nexera X2)用(100x 3mm，2.6μm；) 柱分析代谢物，并用254nm的吸光度监测代谢物。使用NAD+、烟酰胺(Nam)、ADP 核糖(ADPR)的内标产生用于定量各化合物的标准曲线。将每个实验样品中每种化合物的水平归一化为同时分析的0分钟时间点。
LC-MS/MS代谢物测定
通过将反应物与含50％甲醇的蒸馏水混合来制备样品。将样品置于冰上，离心，用氯仿提取上清液中的可溶性代谢物，并将水相冻干并储存在-20℃直至进行LC-MS/MS分析。对于LC-MS/MS，用5mM甲酸铵重构代谢物样品，以12,000×g离心10分钟，并将澄清的上清液应用于LC-MS/MS进行代谢物的鉴定和定量。使用带有SYNERGITMFusion-RP (4.6x 150mm，4μm；Phenomenex，Torance，CA)柱的HPLC***(1290；Agilent)进行液相色谱分析。注入样品(10μl)，流速为0.55ml/min，流动相A 为5mM甲酸铵溶液，流动相B为100％甲醇，并且用0–7min,0–70％B；7-8min,70％B； 9-12min,0％B的梯度洗脱代谢物。在正ESI多反应监测(NAD+:664>428，160V(碎片化), 22V(碰撞),7V(加速后))下，用三重四级杆质谱仪(6460MassHunter；)检测代谢物。借助MassHunter定量分析工具用标准曲线对代谢物进行定量。通过分析在5mM甲酸铵中重构的NAD+、ADPR和Nam产生每种化合物的标准曲线。将每个实验样品中每种化合物的水平归一化为同时分析的0min时间点。进行实验的个体不知道样品信息(sample identity)。
实施例3
该实施例说明了允许鉴定和/或表征化合物的NAD通量测定，所述化合物能抑制培养的神经元的轴突中SARM1介导的NAD消耗。该测定使用了由神经元中神经元损伤激活的全长SARM1蛋白。该测定法测定轴突中损伤激活的SARM1依赖性的NAD+降解。该方法允许独立地评估NAD+的合成和NAD+的消耗。
DRG神经元培养
从胚胎第13.5天的CD1小鼠胚胎(每个胚胎～50个神经节)中解剖小鼠背根神经节(DRG)，并与含有0.02％EDTA(Gibco)的0.05％胰蛋白酶溶液在37℃下孵育15分钟。然后通过温和吹打粉碎细胞悬浮液，并用DRG生长培养基(神经基础培养基(Gibco)，其含有2％B27(Invitrogen)、100ng/ml 2.5S NGF(Harlan Bioproduts)、1μM尿苷(Sigma)、 1μM 5-氟-2'-脱氧尿苷(Sigma)、青霉素和链霉素)洗涤3次。将细胞以100μl培养基/50 个DRG的比例悬浮于DRG生长培养基中。这些悬浮液的细胞密度为～7x106个细胞/ml。使用包被有聚-D-赖氨酸(0.1mg/ml；Sigma)和层粘连蛋白(3μg/ml；Invitrogen)的24 孔组织培养板(Corning)将细胞悬浮液(10μl)置于孔的中心。在潮湿的组织培养箱(5％ CO2)中使细胞贴壁15分钟，然后温和地加入DRG生长培养基(500μl)。
轴突代谢物收集
在DIV6时，在代谢物收集之前的0(用于对照的NAD+消耗)或4(用于轴突切断的轴突NAD+消耗)小时，使用显微外科刀片在显微镜下分离神经元细胞体和轴突。然后将 DRG培养物置于冰上，用冰冷的0.9％NaCl溶液(0.5μl)替换培养基，并使用移液管移除 DRG细胞体。除去0.9％NaCl溶液，通过在冰上与冰冷的MeOH和水(每孔150μl)的1:1 混合物孵育10分钟来提取轴突代谢物。将含有代谢物的溶液转移到测试试管中并用氯仿 (每个样品用100μl)萃取两次。将水相(120μl)冻干并用50μl的5mM甲酸铵重构，并在12,000×g离心10分钟后将澄清的上清液转移到样品瓶中并测定。
使用LC-MS/MS进行NAD+测定
使用NAD+在5mM甲酸铵中的系列稀释液(25μM至320pM，Sigma)进行校准。按以下条件进行液相色谱分析：每个样品注入10μl，流速为0.55ml/min，流动相A为5mM 甲酸铵溶液，流动相B为100％甲醇(HPLC:1290；Agilent with Synergi Fusion-RP(4.6x 150mm,4μm；Phenomenex))。用0–7min，0–70％B；7-8min，70％B；9-12min，0％B 的梯度洗脱代谢物。在正ESI多反应监测(MRM)(D4-NAD+：668>428，D3-NAD+： 667>428，NAD+：664>428，160V(碎片化)，22V(碰撞)，7V(加速后))下用三重四级杆质谱仪(6460MassHunter；Agilent)检测代谢物。借助MassHunter定量分析工具(Agilent) 用标准曲线对代谢物进行定量。
NAD+消耗测定
对于NAD+消耗的测定，将DRG神经元与D4-Nam(300μM：2,3,4,5氘代Nam；C/D/NIsotopes Inc.，D-3457)一起孵育4小时，并且如上所述收集轴突代谢物。对于轴突损伤后的NAD+通量测定，在轴突切断术的同时添加D4-Nam。通过LC-MS/MS定量标记的(重) 或非标记的(轻)NAD+。对于重标记的NAD+，除了D4-NAD+还观察到了D3-NAD+。这是由于在NAD+-NADH循环期间未标记的质子取代了C4位置上的氘。将D3-NAD+和 D4-NAD+的值加和，并将该组合值用作重NAD+的量。通过在施用D4-Nam后4小时轻 NAD+相对于总NAD+(重和轻NAD+的总和)的减少％来计算NAD+消耗的净速率，并表示为％/hr。轴突NAD+的消耗在没有轴突切断术时为-8.5±3.8％/hr，在切断的轴突中增加至 -21.7±1.6％/hr。在SARM1KO轴突中，NAD+消耗的加速被完全阻断(未受损的为-6.3±2.4 ％/hr，而在轴突切断术后为-7.9±3.7％/hr)，并且可用于读出损伤后SARM1的激活(图9)。图9显示SARM1的耗尽完全阻断了NAD+消耗的增加。因此，增加的NAD+消耗可以用作读出受损神经元中SARM1的激活。单因素ANOVA F(3,32)＝50.6，p＝3x 10-12，*p< 0.005表示用Holm-Bonferroni多重比较(n＝9)，与对照未切割组具有显著差异。
NAD+消耗测定用于评估SARM1抑制剂在神经元中的功效
将选定的化学化合物(在添加D4-Nam之前30分钟的终浓度为5μM)以及300μM D4-Nam加入到DRG培养基中，并立即横向切断轴突(3个孔)或保持轴突完整(3个孔)。在添加D4-Nam后4小时收集轴突代谢物，并且可以如上所述分析代谢物。可以计算出在轴突切断术之前和之后的NAD+消耗速率。这里显示的是在没有SARM1(SARM1敲除， KO)的情况下，没有发生轴突切断诱导的NAD+消耗率的增加(图9)。因此，可以通过损伤后NAD+消耗率的降低来评估化合物对SARM1活化的抑制效果。该测定法测试 SARM1抑制剂在培养的神经元的轴突中的功效。
实施例4
该实施例描述了体外轴突变性测定和应用该测定来表征化合物。在该实施例中，该测定用于测试SARM1 NAD酶活性的抑制剂是否可以抑制在损伤后轴突NAD+缺失后快速发生的轴突变性。
在DIV 6时，在96孔中使用DRG液滴培养物通过轴突切断术或通过添加长春新碱(0.04μM)诱导轴突变性。通过在显微镜下使用微手术刀片分离细胞体和轴突来进行轴突切断术。使用具有20x物镜的高含量成像仪(Operetta；Perkin-Elmer)在轴突切断术后0-72小时拍摄轴突的明场图像(每孔6个视野)。使用ImageJ(NIH,Sasaki等人,2009,J.Neurosci., 19(17):5525-5535)计算得到的变性指数(DI)来量化轴突变性。获得了每孔6个视野的平均DI，并对每个独立的孔进行平均。在轴突切断术之前(0小时)和之后(9-72小时)，从来自相同视野的轴突图像计算DI。对于来自实施例1-3中测定法的能显著阻断SARM1NAD酶活性的化合物(图10A中)，如上所述测试了它们在DRG神经元培养物中对轴突变性的作用。测试了来自HPLC筛选的所有18个阳性命中物(在5μM下)抑制轴突变性的能力。在轴突切断术前30分钟，将候选化合物以0.05至5μM的浓度加入培养基中。通过在损伤前以及在轴突切断术后的各个时间点对轴突进行成像来监测轴突变性。
结果
图10A显示了损伤前和损伤(轴突切断术)后24小时的轴突变性指数。较高的变性指数表明更多的轴突变性(即较少的抑制)。图10B示出了显示出显著保护作用的代表性化合物(NSC622608)。显示了在轴突切断术之前和之后的代表性图像。图10C显示了化合物NSC622608对轴突变性的剂量依赖性抑制。
因此，本实施例证明成功开发出了用于表征化合物的轴突变性测定法。此外，本实施例还证明，在本公开中被鉴定为SARM1-TIR NAD酶活性抑制剂的化合物也以剂量依赖性的方式抑制轴突变性。
实施例5
本实施例证明从哺乳动物细胞纯化出的SARM1-TIR复合物能裂解NAD+。
该实施例还示出了NAD+耗尽测定法的应用。
用串联StrepTag II在N-末端，用Venus荧光标签在C-末端工程改造人SARM1-TIR结构域，并使其在补充有NR的NRK1-HEK293T细胞中瞬时表达。随后通过超声处理在天然条件下裂解细胞来制备细胞裂解物，并使用MagStrep(Strep-Tactin)磁性珠粒亲和纯化重组的SARM1-TIR蛋白复合物。将带有SARM1-TIR复合物的珠粒与NAD+(5μM)一起孵育长达30分钟，提取代谢物，然后使用HPLC测定NAD+的水平(图2B)。当测试载有SARM1-TIR复合物的珠粒时，NAD+水平在5分钟内急剧下降(图2C)。相反，如果将珠粒与从未转染的NRK1-HEK293T细胞或表达缺乏StrepTag II的SARM1-TIR的 NRK1-HEK293T细胞制得的裂解物接触时，没有观察到NAD+的降低(图2C)。还测试了不能支持损伤诱导的轴突NAD+耗尽和变性的TIR结构域突变体[SARM1(E596K)]。在该体外测定中，载有组装在该SARM1(E596K)突变体上的复合物的磁性珠粒没有降解 NAD+(图2C)。
检验了SARM1-TIR体外NAD酶反应的底物特异性。
Gerdts，J等人(Science,2015,348,453-457)此前表明，烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD) (一种NAD+密切相关的类似物)在SARM1活化后未被裂解。使用该体外测定发现，野生型SARM1-TIR复合物不降解NaAD(图2D)。总之，这些结果表明，纯化的SARM1-TIR 复合物以与先前轴突变性过程表征一致的方式主动降解NAD+。
然后研究了酶活性是否对于与SARM1-TIR结构域相关的复合物来说是独特存在的，或者是否来自其他蛋白质的TIR结构域也可以组装出呈现NAD酶活性的复合物。从NRK1-HEK293T细胞中表达并纯化TLR4(一种Toll样受体)和MyD88(TIR衔接蛋白家族的另一成员)的TIR结构域，并在体外NAD+耗尽测定中对其进行测试。含有TLR4和 MyD88TIR的复合物均未显示出NAD酶活性(图2E和2F)。这些结果支持了此前报道的TIR衔接蛋白中SARM1在促进轴突变性和神经元NAD+耗尽方面的独特作用(Gerdts,J 等人,Science,2015,348,453-457；O’Neill,L.A.等人,Nat.Rev.Immunol.,2013,13,453-460, Summers,D.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2016,113,E6271-E6280)。
实施例6
本实施例证明，在本文所述的其他实验中观察到的NAD+裂解活性不能归因于与SARM1-TIR共纯化出的其他蛋白质，因此SARM1-TIR结构域具有内在的NAD+裂解活性。此外，本实施例描述了该NAD+裂解活性的表征，以及SARM1-TIR酶促反应物包括环化酶和糖水解酶的活性。
在大肠杆菌中表达人SARM1-TIR，使得具有NAD酶活性的蛋白质不会被共纯化。通过添加IPTG诱导大肠杆菌中的SARM1-TIR表达，提取内源性代谢物，并通过HPLC评估NAD+水平。与携带非重组载体的细菌相比，产生野生型SARM1-TIR的细菌在添加IPTG 后60分钟内具有显著低(几乎检测不到)水平的内源性NAD+。此外，携带突变体 SARM1-TIR(E596K)的细菌具有与携带非重组载体的细菌或与未诱导野生型SARM1的细菌相当的NAD+水平(图11A)。图11A显示了IPTG诱导人SARM1-TIR后细菌中的内源性NAD+水平。使用TAP纯化细菌表达的SARM1-TIR并测试其NAD酶活性。与使用实施例5中从哺乳动物细胞分离的SARM1-TIR复合物的结果一致的是，NAD+被细菌产生的SARM1-TIR蛋白快速消耗(图11B)。图11B显示了从细菌表达和纯化的人 SARM1-TIR蛋白的体外NAD+裂解反应。虽然人SARM1-TIR极不可能与大肠杆菌NAD 酶结合，但是通过用高盐或去污剂严格洗涤SARM1 TIR纯化的复合物以去除潜在的结合蛋白质的方式测试了SARM1 NAD酶活性的内在性质。通过使用这些洗涤过的SARM1TIR 珠粒，他们发现NAD+裂解活性没有降低，这表明SARM1本身具有NAD酶活性(图11E 和11F)。
在大肠杆菌中表达并纯化了小鼠、斑马鱼和果蝇SARM1-TIR结构域。然后测试了纯化蛋白质裂解NAD+的能力。与人SARM1-TIR结构域类似，细菌表达的小鼠、斑马鱼和果蝇SARM1-TIR结构域也在体外快速降解NAD+(图11C-D)。图11C显示了细菌表达的小鼠、斑马鱼和果蝇SARM1-TIR蛋白在体外NAD酶测定中裂解NAD+。图11D显示了从NAD酶测定所用的细菌中纯化出的SARM1-TIR负载珠的SYPRO Ruby凝胶；代表三个独立的实验。这些细菌表达的蛋白质缺乏Venus荧光标签，因此以不同于 NRK1-HEK293T细胞中表达的蛋白质的尺寸跑胶。使用来自至少三个独立的细菌克隆的纯化蛋白质，从至少三次独立的反应实验产生数据。数据表示为平均值±SEM；误差线：SEM； ***P<0.001未配对双尾学生t检验。
为了明确证明SARM1-TIR本身具有酶活性，在无细胞蛋白质表达***中合成了人SARM1-TIR，所述表达***利用纯化的大肠杆菌组分进行转录和翻译。纯化的大肠杆菌转录/翻译组分都不是已知的NAD酶(Shimizu等人,Nat.Biotechnol.,2001,19,751-755)，并且这些实验证明这些纯化的组分不表现出NAD酶活性(图11G)。为了测试从该体外翻译***纯化的SARM1-TIR是否可以裂解NAD+，首先将人SARM1-TIR质粒DNA与纯化的转录和翻译试剂以及RNA酶抑制剂在37℃孵育2.5小时。接下来，他们通过TAP从反应物中纯化新合成的蛋白质，并在测定中测试NAD酶活性(图30)。来自这种无细胞蛋白质翻译***的纯化的SARM1-TIR快速裂解了NAD+，这与从哺乳动物细胞和细菌中纯化的SARM1-TIR上的先前发现一致(图31和32)。在不受理论限制的条件下，有关 SARM1-TIR结构域耗尽细菌中的NAD+以及细菌合成的来自多个种属的SARM1-TIR在体外裂解NAD+的发现证明，SARM1-TIR结构域具有内在的NAD酶活性，并且显示SARM1 本身是轴突损伤后观察到的NAD+耗尽的原因。此外，这些发现首次揭示了，先前被证明功能为蛋白质相互作用结构域的TIR结构域也具有酶活性。
为了进一步表征SARM1-TIR NAD酶的活性，鉴定了该酶促反应的NAD+裂解产物，并且建立了反应参数。对由人SARM1-TIR产生的代谢物进行了HPLC和LC-MS/MS分析；将Nam和ADP核糖(ADPR)鉴定为主要产物，并将环状ADPR(cADPR)鉴定为次要产物(图12A-G)。虽然小鼠和斑马鱼的直系同源物产生了与人的酶类似的反应产物比例 (图12H)，但是从细菌或NRK1-293T细胞纯化出的果蝇SARM1-TIR产生的cADPR比 ADPR更多(图12A-G)。该发现与用NAD酶的ADP核糖基环化酶家族得到的结果类似(Liu等人,J.Biol.Chem.,2009,284,27637-27645)，其中哺乳动物ADP核糖基环化酶CD38 裂解NAD+以产生ADPR作为主要产物，以及少量的cADPR；而从海洋软体动物海兔 (Aplysia californica)分离出的ADP核糖基环化酶将NAD+裂解成cADPR(Liu等人,J.Biol. Chem.,2009,284,27637-27645)。果蝇和脊椎动物SARM1-TIR NAD酶之间在反应产物上的这种差异提供了ADP核糖基环化酶家族中酶活性不同的洞见。
此外，SARM1-TIR酶的动力学测定显示为饱和动力学(图12I)，所述饱和动力学是酶催化剂的区别特征，其估算的米氏常数(Km)为24μM，最大速度(Vmax)为3.6μM/min 以及转换数(kcat)为10.3min-1(图12I)。SARM1-TIR裂解反应的动力学参数Vmax、 Km、kcat是通过将数据拟合到Michaelis-Menten方程而测定的，并且表示为针对三个独立的生物学样品和实验的平均值±SEM。虽然估算的kcat低于其他ADP-核糖基循环酶和 NAD+糖水解酶的报道值(Ghosh等人,J.Biol.Chem.,2010,285,5683-5694)，但是估算的 Km值是相似的(Cantó等人,Cell Metab.,2015,22,31-53)。
测试反应产物以确定它们是否可以抑制SARM1-TIR的酶活性。虽然ADPR不抑制SARM1-TIR NAD酶活性(图12J；将活性归一化至5分钟时产生的Nam)，但是Nam可以抑制酶活性，并且IC50为43.8μM，这比起始反应的NAD+浓度高出约9倍(图12K-L)。图12K显示了Nam能抑制SARM1-TIR的酶活性(归一化至5分钟时产生的ADPR)。图 12L显示了Nam对SARM1-TIR酶活性的剂量响应性抑制。以烟酰胺为模型的SARM1-TIR 结构域的抑制剂可用于预防轴突变性的早期阶段(Gerdts,J等人,Neuron,2016,89,449-460； Fliegert,R.等人,Biochem.Soc.Trans.,2007,35,109-114)。
这些数据证明，SARM1的TIR结构域将NAD+裂解成Nam和ADPR。SARM1-TIR 似乎在这方面是独特的，因为其他测试的TIR结构域不具有这种活性。SARM1-TIR结构域的晶体结构在鉴定NAD+结合口袋以及其他涉及NAD+裂解的关键残基方面可能是很重要的。
总之，这些结果描述了TIR结构域固有的首个酶活性。这些数据证明NAD酶活性是保守的轴突死亡程序的组成部分。现在，关于SARM1是轴突NAD酶(图12J)的这一发现为设计抑制剂提供了明确的靶标，所述抑制剂可作为新型的治疗候选物用于治疗神经退行性疾病。
实施例7
本实施例描述了对烟酰胺(一种已知的SARM1 NAD酶抑制剂)类似物和NAD+类似物在用作SARM1酶活性抑制剂和/或用作裂解反应的底物时的活性方面的表征。如实施例 2中所述，使用利用细菌表达的标记形式的SARM1 TIR片段的测定法测试了这些类似物。在固体表面(即亲和珠粒)上展示该人造SARM1 TIR结构域能产生具有活性的NAD+裂解酶。
表4：通过测定法测定的SARM1 TIR NAD裂解活性的底物和抑制剂，所述测定法使用细菌表达的、标记形式的SARM1 TIR片段。烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(NHD)既是底物又是抑制剂。
实施例8
本实施例说明第642位谷氨酸是SARM1-TIR酶活性位点中的催化残基。
由于还没有报道过SARM1-TIR结构域的晶体结构，因此使用了基于模板的无偏预测 (J.等人,Nucleic Acids Res.,2005,33,W244-248)来鉴定SARM1-TIR的蛋白质同源物。最近的生物信息学研究表明，一些TIR结构域与核苷酸/核苷水解酶具有很强的结构相似性(Burroughs,A.M.等人,Nucleic Acids Res.,2015,43,10633-10654)。通过使用SARM1-TIR的结构域预测分析，按预期鉴定了其他TIR结构域。然而，除了这些TIR结构域外，还检测了许多核苷酸水解酶/转移酶。对于这些酶中的一些，已经确立了有助于催化活性的残基(Sikowitz,M.D.等人,Biochemistry,2013,52,4037-4047；Armstrong,S.R.等人,Structure,1995,4,97-107)。使用了结构建模和序列比对来鉴定可能有助于酶活性的SARM1-TIR结构域中的推定残基(图16和图17)。使用从预测中鉴定的两种酶的晶体结构模拟了SARM1-TIR结构域：MilB胞苷5'单磷酸(CMP)水解酶(PDB：4JEM)(图 17)和核苷2-脱氧核糖基转移酶(PDB：1F8Y)。SARM1-TIR结构域中的谷氨酸E642 与CMP水解酶中的关键催化性谷氨酸残基(Sikowitz,M.D.等人,Biochemistry,2013,52, 4037-4047)和提出的核苷2-脱氧核糖基转移酶的活性位点中的亲核性谷氨酸是一致的 (Armstrong,S.R.等人Structure,1995,4,97-107)(图16和图17)。此外，谷氨酸残基也是其他NAD酶中已知的催化残基(Ghosh,J.等人,J.Biol.Chem.,2010,285,5683-5694)。为了测试SARM1 TIR E642是否具有相似的催化性质，在SARM1-TIR中将该残基突变为丙氨酸(E642A)，从无细胞蛋白质翻译***中纯化蛋白质，并测试其NAD+裂解活性。纯化的SARM1-TIR E642A在NAD酶测定中没有裂解NAD+(图18和图19)。SARM1-TIR 结构域中的E642是负责NAD+裂解的活性位点内的关键性催化残基。
实施例9
本实施例说明SARM1的酶活性在轴突中起到促进病理性轴突变性的作用。
在已经证明了SARM1 TIR结构域是酶并且已经鉴定了其催化残基的条件下，研究了 SARM1-TIR结构域的酶活性和(特别地)所鉴定的谷氨酸，以确定它们是否是神经元中全长SARM1的促变性功能所需的。在野生型神经元中，轴突切断术引起轴突NAD+的快速耗尽和轴突变性，而在SARM1缺陷型神经元中，轴突变性被阻断，并且NAD+的水平保持为显著高于受损的野生型轴突中的水平(Gerdts等人,Science,2015,348,453-457)。首先，测试了SARM1 NAD酶的活性以确定这种活性是否是损伤诱导的轴突NAD+耗尽和随后的轴突变性所必需的。在这些实验中，在培养的SARM1缺陷型DRG神经元中表达了野生型(具有酶活性的)全长SARM1或突变的(丧失酶活性的)SARM1(E642A)。图 20和图21说明两者都在轴突中良好表达。在轴突切断术后，测定了轴突NAD+水平和轴突变性。
在SARM1缺陷型DRG神经元中具有酶活性的野生型SARM1的表达能促进轴突切断术后的轴突NAD+耗尽和轴突变性。
与野生型SARM1相反，当在这些神经元中表达丧失酶活性的SARM1(E642A)突变体时，轴突切断术不诱导轴突变性或快速的NAD+耗尽(图22-24)。
还在另一种损伤模型-长春新碱诱导的神经毒性中测试了对SARM1酶活性的需求。保护培养的SARM1缺陷型DRG轴突免于长春新碱诱导的轴突变性(Gerdts,J.等人,J.Neurosci.,2013,33,13569-13580)。此外，在小鼠中发展出长春新碱诱导的周围神经病变需要SARM1(Geisler等人,2016,Brain,139,3092-3108)。与轴突切断术一样，在培养的SARM1缺陷型DRG神经元中表达了野生型(具有酶活性的)全长SARM1或突变的(丧失酶活性的)SARM1(E642A)。具有酶活性的SARM1介导响应化疗性长春新碱产生的轴突缺失，而丧失酶活性的SARM1在施用长春新碱后不促进轴突缺失(图25和图26)。总之，这些发现证明，SARM1的内在NAD酶活性(图27)对于促进创伤性和神经毒性损伤后的轴突变性是必需的，并且启示SARM1 NAD酶的抑制剂可以阻断病理性轴突变性。
实施例10
本实施例示出了对有效抑制SARM1 NAD酶活性的小分子家族的鉴定和表征。
使用本教导的方法进行的初始筛选将右兰索拉唑和泰妥拉唑鉴定为SARM1 NAD酶抑制剂。这些分子都是被称为蛋白质泵抑制剂的一类分子的成员。用5μM NAD，使用实施例1中详细描述的基于HPLC的SARM1 SAM-TIR NAD酶测定法筛选了剩余的药物类别。图28示出了在5μM(系列1)、15μM(系列2)和50μM(系列3)下测试：奥美拉唑(1)、兰索拉唑(2)、埃索美拉唑镁水合物(3)、泮托拉唑钠倍半水合物(pantoprazole sodium sesquihydrate)(4)、雷贝拉唑钠(5)、右兰索拉唑(6)和泰妥拉唑(7)。该家族的每个成员表现出了至少一些抑制活性(图28)。基于这些结果，进行了雷贝拉唑的剂量-应答分析(图29)。该分子在10μM时显示了95％的抑制，在30μM时显示了98.8％的抑制。这些结果表明该分子家族具有SARM1 NAD酶活性。
GenBankSend:
含有蛋白1同种型a(SARM1)mRNA的智人无菌α和TIR基序，完全cds
GenBank:AY444166.1
LOCUS AY444166 2193bp mRNA linear PRI 16-JAN-2004
定义含有蛋白1的智人无菌α和TIR基序
同种型a(SARM1)mRNA，完全cds，ACCESSION AY444166
VERSION AY444166.1GI:38326778
来源智人(人)种属智人
文献1(碱基1-2193)
作者Bousson,J.-C.,Casteran,C.和Tiraby,G.题目SARM1isoforms
nucleotide sequence
期刊未发表文献2(碱基1-2193)
作者Bousson,J.-C.,Casteran,C.和Tiraby,G.题目直接投稿
期刊投稿(2003年10月21日)CAYLA,BP4437,5rue Jean
Rodier,Toulouse
cedex 4 31405,France FEATURES Location/Qualifiers
source 1..2193
/organism＝"Homo sapiens"
/mol_type＝"mRNA"
/db_xref＝"taxon:9606"
/chromosome＝"17"
/map＝"17q11"gene 1..2193
/gene＝"SARM1"
/gene_synonym＝"KIAA0524"
/gene_synonym＝"SAMD2"
/gene_synonym＝"SARM"CDS 1..2175
/gene＝"SARM1"
/gene_synonym＝"KIAA0524"
/gene_synonym＝"SAMD2"
/gene_synonym＝"SARM"
/note＝"SARM1a；receptor"
/codon_start＝1
/product＝"sterile alpha and TIR motif containing protein 1isoform a"
/protein_id＝"AAR17520.1"
/db_xref＝"GI:38326779"
/translation＝"MVLTLLLSAYKLCRFFAMSGPRPGAERLAVPGPDGGGGTGPWWAAGGRGP REVSPGAGTEVQDALERALPELQQALSALKQAGGARAVGAGLAEVFQLVEEAWLLPAVGREVAQ GLCDAIRLDGGLDLLLRLLQAPELETRVQAARLLEQILVAENRDRVARIGLGVILNLAKEREPV ELARSVAGILEHMFKHSEETCQRLVAAGGLDAVLYWCRRTDPALLRHCALALGNCALHGGQAVQ RRMVEKRAAEWLFPLAFSKEDELLRLHACLAVAVLATNKEVEREVERSGTLALVEPLVASLDPG RFARCLVDASDTSQGRGPDDLQRLVPLLDSNRLEAQCIGAFYLCAEAAIKSLQGKTKVFSDIGA IQSLKRLVSYSTNGTKSALAKRALRLLGEEVPRPILPSVPSWKEAEVQTWLQQIGFSKYCESFR EQQVDGDLLLRLTEEELQTDLGMKSGITRKRFFRELTELKTFANYSTCDRSNLADWLGSLDPRF RQYTYGLVSCGLDRSLLHRVSEQQLLEDCGIHLGVHRARILTAAREMLHSPLPCTGGKPSGDTP DVFISYRRNSGSQLASLLKVHLQLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVMGARNFVLVLSPGAL DKCMQDHDCKDWVHKEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQVLPEDMQAVLTFNGIKWSHEYQEA TIEKIIRFLQGRSSRDSSAGSDTSLEGAAPMGPT"ORIGIN
SARM1基因在黑猩猩、恒河猴、狗、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、蚊子、秀丽隐杆线虫和青蛙中是保守的。
实施例11-16
如以下实施例中所述，在某些示例性实施方案中，根据以下一般步骤制备化合物。应当理解，虽然一般方法描述了本公开的某些化合物的合成，但是如本文所述，以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其他方法可以应用于所有化合物以及这些化合物中每一种的亚类和种类。
一般步骤
以下描述了用于确定式IA和式IB所示化合物的SARM1 NAD酶活性的测定。
测定1.SARM1 SAM-TIR裂解物(STL)的制备
NRK1-HEK293T细胞代表已经稳定转染了FCIV表达载体的多克隆细胞系，所述FCIV表达载体表达人烟酰胺核苷激酶1(NRK1)，NRK1是一种将NAD+生物合成前体烟酰胺核苷(NR)转化为NMN的酶，而NMN是NAD+的直接前体。该表达载体具有以下DNA序列：
gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgct ccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaa gaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaata gtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtg gagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgg tgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgg gagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgt acggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggcta actagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaacca gaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaa aaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatggg aaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgc agttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaag aacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaa gatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagg gacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagt ggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagc gtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgc aacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaa cagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctgga acagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatc gcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattg gctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagtta ggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaag gtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtat tcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacataca aactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttaattaagg gtgcagcggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagg gcgcaggagcgttcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtat cagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagt agtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcaca gctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgcggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggtgagttgcgggctgctgggct ggccggggctttcgtggccgccgggccgctcggtgggacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgggtccgc gagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcacaaaatggcggctgttcccgagtcttgaatggaagacgcttgtaag gcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggcaagaacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcggga aagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatctggggaccctgacgtgaagtttgtcactgactggagaactcgggtttgtc gtctggttgcgggggcggcagttatgcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttgggagcgcgcgcctcgtcgtgtcgtgac gtcacccgttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttctccgtcgcaggacgcaggg ttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggataagtgaggcgtcagtttctttggt cggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttgaactatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaagttttttag gcaccttttgaaatgtaatcatttgggtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaagcttctgcaggtcgactctagaaaattgtcc gctaaattctggccgtttttggcttttttgttagacgaagcttgggctgcaggtcgactctagaggatcatgaagagatttgtcattggaattggtggtgtgacaaacggagggaagacgacactggctaagagcttgcagaagcaccttcccaactgcagcgtcatatctcagg atgacttcttcaagccagagtctgagatagacatagatgaaaatggttttttgcagtatgatgtgcttgaagcgctaaatatggaaaaa atgatgtcagcagtttcctgttggatggaaaacccaggaagctctgcgggaccagcagccttggaaagtgctcaaggggttcccat tttaattattgaaggtttccttctctttaattataagcctctggacaccatatggaacagaagttacttcctgaccgttccatatgaagaat gtaagaggagaaggagtaccagagtatatgagcctccagaccctccagggtacttcgatggccacgtgtggcccatgtacctaaa gcacagacaggaaatgagctccatcacctgggacattgtttacctggatggaacaaggtctgaagaggacctcttctctcaggtgta tgaagatgtcaagcaggaactagagaagcaaaatggtttgGACTATAAAGATGATGATGATAAGTAAgct agctaccggtgatccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtct atatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtc tttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtc tgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacct gcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaa ggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgag gttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccATGG atggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcggg ttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccagg tggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacga acttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggc cggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgagaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaat ttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcc cgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggt gtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctcc ctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtg ttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcg gccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagt cggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatac agcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaa gaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacga agacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcag atatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacc cgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcattt catcacatggcccgagagctgcatccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaacta gggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagag atccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgc cagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaatt gcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaata gcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgc cctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctc ctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagt gctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcccttt gacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataag ggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagtta gggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagt ccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatc ccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcg gatctgatcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggc caagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcc cgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtg ccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttc cgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggc aactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttggg cttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgttt attgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtc caaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtga aattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactc acattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggg agaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaag gccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaa gtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgacc ctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggt gtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttga gtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgct acagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcg gaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgca gaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggt catgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggt ctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgta gataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttat cagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgc cgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtt tggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttc ggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgcca tccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggc gtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaag gatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctggg tgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttca atattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgc acatttccccgaaaagtgccacctgac(SEQ IDNO:7)。当这些表达NRK1的细胞补充有NR时， NAD+水平提高并且细胞活力增强，从而能够有效产生和纯化组成型活性人SARM1 SAM-TIR蛋白片段。为了表达SARM1 SAM-TIR，删除了SARM1 N-末端自身抑制结构域，仅保留了起始物(initiator)Met。从该起始物Met开始的下游，所得蛋白质由人SARM1 的第410至721位残基组成：
MSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGGSSGGGGGGSSGGGASVPSWK EAEVQTWLQQIGFSKYCESFREQQVDGDLLLRLTEEELQTDLGMKSGITRKRFFREL TELKTFANYSTCDRSNLADWLGSLDPRFRQYTYGLVSCGLDRSLLHRVSEQQLLED CGIHLGVHRARILTAAREMLHSPLPCTGGKPSGDTPDVFISYRRNSGSQLASLLKVHL QLHGFSVFIDVEKLEAGKFEDKLIQSVMGARNFVLVLSPGALDKCMQDHDCKDWV HKEIVTALSCGKNIVPIIDGFEWPEPQVLPEDMQAVLTFNGIKWSHEYQEATIEKIIRF LQGRSSRDSSAGSDTSLEGAAPMGPT(SEQ ID NO:8)。通过标准方法将编码SARM1 SAM-TIR蛋白的片段克隆到FCIV表达构建体中以产生FCIV-SST载体。所得到的载体具有以下序列：
gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgct ccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaa gaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaata gtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtg gagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgg tgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgg gagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgt acggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggcta actagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaacca gaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaa aaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatggg aaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgc agttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaag aacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaa gatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagg gacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagt ggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagc gtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgc aacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaa cagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctgga acagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatc gcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattg gctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagtta ggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaag gtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtat tcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacataca aactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttaattaagg gtgcagcggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagg gcgcaggagcgttcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtat cagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagt agtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcaca gctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgcggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggtgagttgcgggctgctgggct ggccggggctttcgtggccgccgggccgctcggtgggacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgggtccgc gagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcacaaaatggcggctgttcccgagtcttgaatggaagacgcttgtaag gcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggcaagaacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcggga aagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatctggggaccctgacgtgaagtttgtcactgactggagaactcgggtttgtc gtctggttgcgggggcggcagttatgcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttgggagcgcgcgcctcgtcgtgtcgtgac gtcacccgttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttctccgtcgcaggacgcaggg ttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggataagtgaggcgtcagtttctttggt cggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttgaactatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaagttttttag gcaccttttgaaatgtaatcatttgggtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaagcttctgcaggtcgactctagaaaattgtcc gctaaattctggccgtttttggcttttttgttagacgaagcttgggctgcaggtcgactctagaggatccGGATCCGCCACC ATGTCAgctTGGAGCCACCCACAATTCGAAAAAGGCGGTGGCTCAGGCGGTGGCT CAGGTGGCTCAGCTTGGAGCCACCCACAATTCGAAAAAGGCGGTGGCTCATCTG GCGGAGGTGGCGGTGGCTCATCTGGCGGAGGTGCTAGCgtgcccagctggaaggaggccgag gttcagacgtggctgcagcagatcggtttctccaagtactgcgagagcttccgggagcagcaggtggatggcgacctgcttctgcg gctcacggaggaggaactccagaccgacctgggcatgaaatcgggcatcacccgcaagaggttctttagggagctcacggagct caagaccttcgccaactattctacgtgcgaccgcagcaacctggcggactggctgggcagcctggacccgcgcttccgccagtac acctacggcctggtcagctgcggcctggaccgctccctgctgcaccgcgtgtctgagcagcagctgctggaagactgcggcatcc acctgggcgtgcaccgcgcccgcatcctcacggcggccagagaaatgctacactccccgctgccctgtactggtggcaaaccca gtggggacactccagatgtcttcatcagctaccgccggaactcaggttcccagctggccagtctcctgaaggtgcacctgcagctg catggcttcagtgtcttcattgatgtggagaagctggaagcaggcaagttcgaggacaaactcatccagagtgtcatgggtgcccg caactttgtgttggtgctatcacctggagcactggacaagtgcatgcaagaccatgactgcaaggattgggtgcataaggagattgt gactgctttaagctgcggcaagaacattgtgcccatcattgatggcttcgagtggcctgagccccaggtcctgcctgaggacatgca ggctgtgcttactttcaacggtatcaagtggtcccacgaataccaggaggccaccattgagaagatcatccgcttcctgcagggcc gctcctcccgggactcatctgcaggctctgacaccagtttggagggtgctgcacccatgggtccaacctaaactctagaattcgata tcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggat acgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgag gagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacc tgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacag gggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctgg attctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcgg cctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgagac ctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggag gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaa ggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctg attggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagag aaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaa gtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcatccggactgtactgggtctctctggttag accagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagt gtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgtttaa acccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgc cactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggc aggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaaga accagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtg accgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagct ctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtag tgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaac actcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatt taacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcat gcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgacta attttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggctttt gcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatag tataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagc ggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgacc ctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtac gccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctacgagattt cgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatct catgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataa agcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagctt ggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgta aagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgcc agctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc gctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcagg aaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgccc ccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccct ggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgcttt ctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccg accgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaaca ggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttg gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtg gtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt ggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtttta aatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccg cgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaact ttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccatt gctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatccc ccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatg gcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatag tgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcatt ggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactga tcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgac acggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatg tatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgac(SEQ ID NO:9)。
将NRK1-HEK293T细胞以20x 106个细胞/板接种到含25mL生长培养基的150cm2的平板上，所述培养基包含90％DMEM(Gibco 11965-084)和10％FBS(Sigma F0926)。第二天，通过首先将15μg FCIV-SST SST(来自华盛顿大学的SAM-TIR表达质粒)与45μl X-tremeGENE9DNA转染试剂(Roche产品#06365787001)和750μl OptiMEM(Gibco 31985062)预混合，然后将该混合物直接加入到细胞中来转染细胞。在转染时，向培养物补充1mM烟酰胺核苷(Thorne Research THR-00467)，以使来自SAM-TIR过表达的毒性最小化。转染后48小时，收集细胞，通过1,000rpm离心进行沉淀(Eppendorf离心机5804R， 15Amp型)，并用冷PBS(0.01M磷酸盐缓冲盐水NaCl 0.138M；KCl 0.0027M；pH 7.4) 洗涤一次。将细胞重悬于含有蛋白酶抑制剂的0.5ml PBS中(Complete蛋白酶抑制剂混合物，Roche产品#11873580001)。通过超声处理制备细胞裂解物(Misonix Microson Ultrasonic Cell Disruptor，输出＝3，超声(stroke)20次)。将裂解物在4℃下以12,000×g离心10 分钟(Eppendorf离心机5415C)以除去细胞碎片，并将上清液的等分试样(含有SARM1 SAM-TIR蛋白)储存在-80℃下备用。通过二奎啉甲酸(BCA)法测定蛋白质浓度，并用于归一化裂解物浓度。
测定2.基于发光的测定(NAD GLo)
该测定是对NAD+/NADH Glo测定(Promega G9071)的调整。在该测定中，NAD+ 循环酶将NAD+转化为NADH。在NADH存在条件下，还原酶以酶促的方式将前荧光素还原酶底物转化为荧光素。使用Ultra-GloTM rLuciferase检测荧光素，并且化学发光强度与样品中NAD+和NADH的量成比例。在我们的测定条件下，用该测定检测不到裂解物中存在的NAD+和NADH的量，从而排除了对检测到的最终NAD+的任何内源性贡献。如下设置了测定：2μl抑制剂(终浓度1μM，2％DMSO)，0.07μg裂解物(2μl)和2μl的400 nM NAD+。将反应物在37℃下孵育60分钟，然后加入6μl NAD+/NADH Glo检测试剂。在室温下30分钟后，使用Analyst HT读数器(LJL Biosystems)定量发光信号。SARM1 SAM-TIR裂解物催化NAD+的剂量依赖性耗尽，而当用从对照NRK1-HEK293T细胞制得的裂解物进行反应时，NAD+水平没有下降。
测定3.基于HPLC的测定2
通过将10μl SARM1 SAM-TIR细胞裂解物(裂解物11-3-2016的320倍稀释液，或80倍裂解物稀释液用于评估时间依赖性)的PBS溶液(pH 7.4)与5μl化合物贮备液混合在冰上制备反应混合物。首先将化合物以10mM(最终贮备液浓度)溶解于DMSO中。首先用20μl至40μl的DMSO连续稀释液，然后用PBS的10倍稀释液(12μl+108μl)制备10点化合物稀释曲线。测定中化合物的最高浓度为250μM。然后将化合物和裂解物一式两份以不同的时间进行预孵育(0或120分钟，用于时间依赖性分析)。然后加入5μl的 20μM NAD+(5μM终浓度)，使最终反应体积为20μl。将反应物在37℃下孵育60(或在室温下孵育10分钟用于时间依赖性评估)，然后通过加入180μl的0.55M高氯酸(HClO4) 终止反应。然后将反应物放置10分钟，加入16.6μl的3M K2CO3以中和溶液。通过以4,000 rpm离心10分钟(Sorvall ST 16R离心机)除去沉淀的盐。通过HPLC(Waters 2695)用 Kinetex(50x 4.6mm,5μm；Phenomenex)分析80μl上清液。用过以下步骤洗脱NAD和代谢物：1分钟内从100％A:KPO4(5.026g K2HPO4和2.876KH2PO4的1L H2O溶液) 至3％甲醇的1ml/min梯度，然后1.5分钟内至15％甲醇的线性梯度，保持1分钟，随后回复至0％甲醇持续2.5分钟用于重新平衡。通过260nm处的吸光度监测NAD(3分钟) 和ADPR(1.5分钟)。对每种化合物的浓度建立百分比对照转化率。从样品和对照(裂解物+NAD)中减去ADPR空白(没有裂解物，仅有NAD)值，并且从样品和空白中减去NAD耗尽的对照值以确定最大的ADPR转化率或NAD耗尽率(所用的裂解物稀释液通常产生约50％的转化率)。空白和对照一式三份(或更多份)进行，然后取平均值。使用 Grafit绘制来自10点剂量曲线的重复数据点，并使用4参数对数拟合(4Parameter log fit) 计算IC50。
实施例11
化合物IA-6的合成。
根据上文方案1A制备化合物IA-6。根据下面的方案2A制备侧链。
方案2A:
然后根据上文方案1A，使用该分子制备化合物IA-6。合成路径如下所示。
实施例12
化合物IA-2、1A-3、1A-6和IA-8抑制SARM1 NAD酶活性的10点剂量曲线
如图33中所示，化合物IA-2、1A-3、1A-6和IA-8显示出对SARM1 NAD酶活性的抑制。采用上述测定3(基于HPLC的测定2)以评估来自0.01-250μM的化合物IA-2、1A-3、 1A-6和IA-8的10点化合物曲线(平均n＝2)的一式两份样品的NAD消耗和ADPR产生。结果如图33所示，其中图33A显示了NAD消耗随化合物IA-2、1A-3、1A-6和IA-8浓度的变化，以及图33B显示了ADPR产生随化合物IA-2、1A-3、1A-6和IA-8浓度的变化。可以看出，这些化合物IA-6浓度从0.01-250μM增加时，导致更高的NAD消耗和更低的ADPR 产生。在下表5A中提供了这些化合物在测定3中的IC50。
表5A.化合物IA-2、1A-3、1A-6和IA-8抑制SARM1 NAD酶活性的IC50值
化合物 IC<sub>50</sub>(μM，NAD消耗) IC<sub>50</sub>(μM，ADPR产生)
I<sup>A</sup>-2 3.5 3.3
I<sup>A</sup>-3 21.4 28.3
I<sup>A</sup>-6 3.3 3.2
I<sup>A</sup>-8 7.4 8.7
实施例13
化合物IA-3、IA-8、IA-9、IA-10、IA-11和IA-13对SARM1 NAD酶活性抑制的筛选
如下表6A中所示，化合物IA-3、IA-8、IA-9、IA-10、IA-11和IA-13显示出对SARM1 NAD酶活性的抑制。采用上述测定3(基于HPLC的测定)以评估来自在化合物IA-3、IA-8、IA-9、IA-10、IA-11和IA-13各自为150μM下的单点筛选(平均n＝2)的一式两份样品的NAD 消耗和ADPR产生。在表6A中，对于化合物IA-3、IA-8、IA-9、IA-10、IA-11和IA-13，根据它们控制NAD消耗的能力进行分类，其中“A”表示>75％，“B”表示在50％-75％之间，以及“C”表示<50％。还根据它们控制ADPR产生的能力对化合物IA-3、IA-8、IA-9、 IA-10、IA-11和IA-13进行分类，其中“A”表示>75％，“B”表示在50％-75％之间，以及“C”表示<50％。
表6A.化合物IA-3、IA-8、IA-9、IA-10、IA-11和IA-13对SARM1 NAD酶活性抑制的单点筛选
化合物 NAD消耗(％) ADPR产生(％)
I<sup>A</sup>-3 A C
I<sup>A</sup>-8 B C
I<sup>A</sup>-9 A A
I<sup>A</sup>-10 A A
I<sup>A</sup>-11 A A
I<sup>A</sup>-13 A B
不希望受任何特定理论的束缚，认为本文所述的式IA所示的化合物可能通过独特的机制发挥作用，所述机制需要双质子化(在pH～1的壁细胞中)，然后重排成活化的四环中间体，所述中间体可快速灭活H+-K+ATP酶。这被认为是由式IA所示化合物的亚砜基团精确排列成式IA所示化合物的两个活化环而产生的。本文提供的数据表明与式IA所示化合物的苯并咪唑-吡啶-亚砜支架的细微SAR/区分和对SARM1 NAD酶活性的抑制。
实施例14
化合物IB-1的合成
根据上文方案1B制备化合物IB-1。合成路径如下所示。
实施例15
化合物IB-2的合成
根据上文方案1B制备化合物IB-2。合成路径如下所示。
实施例16
化合物IB-1和IB-2对SARM1 NAD酶活性抑制的剂量曲线
如图34中所示，化合物IB-1和IB-2显示出对SARM1 NAD酶活性的抑制。采用上述测定3(基于HPLC的测定)以评估0–约6μM的化合物IB-1和IB-2的7点化合物曲线 (平均n＝2)的一式两份样品的NAD消耗。结果如图34所示，由此可知，NAD酶活性随着化合物IB-1和IB-2浓度的增加而降低。上面的曲线代表化合物IB-1，下面的曲线代表 IB-2。在测定3中化合物IB-2的IC50被测定为约150nM，并且在测定3中化合物IB-1的 IC50被测定为约0.7μM。
实施例17
化合物IB-2对轴突变性的预防
小鼠DRG液滴培养：从胚胎第13.5天的CD1小鼠胚胎(每个胚胎50个神经节)中解剖小鼠背根神经节(DRG)，并与含有0.02％EDTA(Gibco)的0.05％胰蛋白酶溶液在 37℃下孵育15分钟。然后通过温和吹打粉碎细胞悬浮液，并用DRG生长培养基(神经基础培养基(Gibco)，其含有2％B27(Invitrogen)、100ng/ml 2.5S NGF(Harlan Bioproduts)、1mM尿苷(Sigma)、1mM 5-氟-2'-脱氧尿苷(Sigma)、青霉素和链霉素)洗涤3次。将细胞以100ml培养基/50个DRG的比例悬浮于DRG生长培养基中。这些悬浮液的细胞密度为～7x106个细胞/ml。使用包被有聚-D-赖氨酸(0.1mg/ml；Sigma)和层粘连蛋白(3mg/ml； Invitrogen)的96-或24-孔组织培养板(Corning)将细胞悬浮液(1.5ml/96孔，10ml/24 孔)置于孔的中心。在潮湿的组织培养箱(5％CO2)中使细胞贴壁15分钟，然后温和地加入DRG生长培养基(100ml/96孔，500ml/24孔)。在体外第1-2天(DIV)时加入慢病毒(1-10x 103pfu)并提取代谢物或在6-7DIV时进行轴突变性测定。当使用24孔DRG 培养物时，在DIV4时将50％的培养基更换为新鲜培养基。在轴突切断术或代谢物收集前 24小时加入NR(100mM)。
轴突变性测定：在DIV6时使用微手术刀片在显微镜下横向切断96孔中DRG液滴培养物的轴突。在轴突切断术后0-72小时，使用具有20x物镜的高含量成像仪(Operetta；Perkinelmer)拍摄远端轴突的明场图像(每孔6个视野)。使用ImageJ(NIH)计算得到的变性指数(DI)来量化轴突变性。获得每孔6个视野的平均DI，并对每个独立的孔进行平均。在轴突切断术之前(0小时)和之后(9-72小时)，从来自相同视野的轴突图像计算DI。重复实验3次，一式3个独立的孔(n＝9)。对于统计分析，使用单因素ANOVA 和利用R(RRID：SCR002394)的Holm-Bonferroni多重比较来比较DI。来自该实验的数据表示为下面图35的柱状图，并且图像显示在图36中。
如上所述，化合物IB-2显示在小鼠背根神经节(DRG)液滴培养物测定中能预防轴突变性。图35显示了对照样品(图35左侧的分组)和包含化合物IB-2的样品(图35右侧的分组)以及在0小时、6小时、12小时和24小时时间间隔时暴露于两个样品后的轴突变性水平。可以看出，与对照样品相比，在6小时、12小时和24小时的时间间隔后暴露于化合物IB-2的轴突显示出了轴突变性的显著降低。
图36显示了在暴露于(图36A)和未暴露于(图36B)化合物IB-2的变性条件下，受损轴突的SEM显微照片。可以看出，暴露于化合物IB-2的轴突在变性条件下是完整的，而未暴露于化合物IB-2的轴突发生了变性。
实施例18
本实施例证明使用全长SARM1成功开发了体外测定。本实施例中描述的测定可用于，例如，鉴定和/或表征在体内抑制全长SARM1的化合物。
表达SARM1的细胞在长时间生长后表现出表达降低。在表达SARM1的细胞中NAD+的水平较低，但这些细胞不会死亡。此外，C-末端的GFP标签降低SARM1 NAD酶活性。目前描述的测定克服了这些挑战。
如下所述产生并测试缺乏线粒体靶向序列(MTS)的全长SARM1(FL-MTS SARM1)。
亲和标记的FL-MTS SARM1的产生
NRK1-HEK293T细胞代表已经稳定转染了FCIV表达载体的多克隆细胞系，所述FCIV表达载体表达人烟酰胺核苷激酶1(NRK1)，NRK1是一种将NAD+生物合成前体烟酰胺核苷(NR)转化为NMN的酶，而NMN是NAD+的直接前体。当这些表达NRK1的细胞补充有NR时，NAD+水平提高并且细胞活力增强，从而能够有效产生和纯化SARM1。
对于这些实验，将缺少对应于SARM1线粒体靶向序列的前26个残基的人SARM1在N-末端用StrepTag亲和标签进行工程改造(称为FL-MTS SARM1；参见图37A)。将该修饰的SARM1蛋白克隆到慢病毒载体FCIV中以产生FL-MTS SARM1哺乳动物表达载体。产生类似的构建体，其中将在SARM1第642位处的催化性Glu残基变为Ala。在本实施例描述的测定中，将该无活性的突变体FL-MTS SARM1(E642A)用作阴性对照。最后，以类似的方式构建具有活性的SARM1突变体(SAM-TIR)，其N-末端的StrepTag 与SARM1的第409-724位残基融合，并且在这些测定中将所述SARM1突变体用作阳性对照。
为了产生StrepTag-FL-MTS SARM1和StrepTag-FL-MTS SARM1(E642A)或具有活性的SARM1 SAM-TIR蛋白，将NRK1-HEK293T细胞以每板20x 106个细胞接种到150cm2平板上。第二天，使用X-tremeGENE 9DNA转染试剂(Roche产品#06365787001)，用15μg FCIV-FL-MTSSARM1或FCIV FL-MTS SARM1(E642A)或SARM1 SAM-TIR表达载体转染所述细胞。在转染时，向培养物补充1mM NR，以使得来自SARM1蛋白表达的毒性最小化。转染后48小时，收集细胞，通过1,000rpm离心进行沉淀(Sorvall ST 16R 离心机，Thermo Fisher)，并用冷PBS(0.01M磷酸盐缓冲盐水NaCl 0.138M；KCl 0.0027 M；pH 7.4)洗涤一次。将细胞重悬于含有蛋白酶抑制剂(Complete蛋白酶抑制剂混合物， Roche产品#11873580001)的PBS中，并通过超声处理制备细胞裂解物(Branson Sonifer 450，输出＝3，超声(stroke)20次)。将裂解物离心(4℃ 12,000×g 10分钟)以除去细胞碎片，将含有亲和标记的FL-MTS SARM1或FL-MTS SARM1(E642A)或SARM1 SAM-TIR蛋白的上清液储存在-80℃以备用。对于亲和纯化，将上清液与100μL MagStrep(Strep-Tactin) 3型XT珠粒悬浮液(IBA Lifesciences)一起孵育30分钟。然后用结合缓冲液将与FL-MTS SARM1或FL-MTS SARM1(E642A)或SARM1 SAM-TIR蛋白结合的珠粒洗涤三次，并重悬于100μL结合缓冲液中用于酶测定。
NAD裂解活性测定
使用载有亲和标记的FL-MTS SARM1或FL-MTS SARM1(E642A)蛋白的MagStrep 珠粒(1-4ul珠粒上1至30ng)或具有活性的SAM-TIR蛋白(0.25ng)和PBS(pH 7.4) 制备反应混合物，终体积为12μl。然后加入NAD(5μM终浓度)，使最终反应体积为20 μl。将反应物在37℃孵育60分钟，然后加入180μl 0.55M高氯酸(HClO4)终止反应，并置于冰上。在冰上10分钟后，将反应板以4,000rpm离心10分钟(Sorvall ST 16R离心机)。将上清液(120μl)转移到新的板中，并加入10μl的3M K2CO3以中和溶液。通过 4,000rpm离心10分钟除去沉淀的盐(Sorvall ST 16R离心机)。将含有提取的代谢物的上清液(90μl)与0.5M磷酸钾缓冲液(10μL)混合，并通过HPLC(Shimadzu Nexera X2) 用C18反相色谱柱(Kinetex 100x 3mm,2.6μm；Phenomenex)分析代谢物以定量NAD和 ADPR(NAD裂解反应的产物)。使用NAD和ADPR的内标来产生用于定量各化合物的标准曲线。将每个实验样品中每种化合物的水平归一化为同时分析的0min时间点。根据这些值，计算NAD/ADPR的比，作为NAD裂解活性的量度。
图37B显示了来自于测定的HPLC迹线，其中箭头所示的峰对应于NAD、NAM和 ADPR。如图37C和37D所示，全长SARM1显示出显著低于SAM-TIR的NAD酶活性，而FL SARM1E642A突变体具有显著低于全长SARM1的NAD酶活性。
因此，目前描述的测定使用全长SARM1成功测定了NAD酶活性。
虽然我们已经描述了本公开的许多实施方案，但显然可以对基本实施例进行改变以提供利用本公开所述化合物和方法的其他实施方案。因此，应当理解，本公开的范围由所附权利要求限定，而不是由已经通过实施例呈现的具体实施方案限定。

Claims (145)

1.一种抑制SARM1 NAD酶活性和/或在有此需要的患者中治疗神经退行性或神经性疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据式IA所示的组合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
XA为-S-、-SO-或-SO2-；
R1A为氢、C1-4脂族基、碱金属、碱土金属、铵或N+(C1–4烷基)4；
环AA选自苯并稠合环和5-6元杂芳族稠合环，所述5-6元杂芳族稠合环具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子；
环BA选自苯基，8-10元双环芳香碳环，具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
RXA和RYA独立地为氢、任选地被1-4个卤素取代的C1-4脂族基、-ORA、-SRA、-N(RA)2、-N(RA)C(O)RA、-C(O)N(RA)2、-N(RA)C(O)N(RA)2、-N(RA)C(O)ORA、-OC(O)N(RA)2、-N(R)S(O)2RA、-S(O)2N(RA)2、-C(O)RA、-C(O)ORA、-OC(O)RA、-S(O)RA、-S(O)2RA、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
每个RA独立地为氢或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
mA和nA独立地为0、1、2或3。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述式IA所示的化合物选自下组：
3.根据权利要求1所述的方法，其中XA为–SO-。
4.根据权利要求1所述的方法，其中nA为0或1，且mA为2或3。
5.根据权利要求1所述的方法，其中环AA为芳基并稠合环，且环BA为杂芳基环。
6.根据权利要求1所述的方法，其中环AA为苯并稠合环，且环BA为吡啶环。
7.根据权利要求1所述的方法，其中环AA为杂芳族稠合环，且环BA为杂芳基环。
8.根据权利要求1所述的方法，其中环AA选自下组：吡啶并稠合环、嘧啶并稠合环、哒嗪并稠合环、吡嗪并稠合环、三嗪并稠合环、吡咯并稠合环、噻吩并稠合环、呋喃并稠合环、噻唑并稠合环、异噻唑并稠合环、咪唑并稠合环、吡唑并稠合环、恶唑并稠合环和异恶唑并稠合环。
9.根据权利要求1所述的方法，其中环BA选自下组：苯基、联苯基、萘基、蒽基、茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基、四氢萘基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。
10.根据权利要求1所述的方法，其中R1A为氢、C1-4脂族基或碱金属。
11.根据权利要求1所述的方法，其中R1A为氢、甲基或钠。
12.根据权利要求1所述的方法，其中RYA为氢、任选地被1-4个卤素或-ORA取代的C1-4脂族基；以及RA为任选地被取代的C1-6脂族基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中RYA为氢、-CH3、-OCH3、-OCH2CF3或-O(CH2)3OCH3。
14.根据权利要求1所述的方法，其中RXA为氢、–ORA或杂芳基；以及RA为任选地被取代的C1-6脂族基或苄基。
15.根据权利要求14所述的方法，其中RXA为氢、-OCH3、-OCHCF2、吡咯基或-OCH2-苯基。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将所述式IA所示化合物作为药学上可接受的组合物的一部分进行施用。
17.根据权利要求1所述的方法，其中将所述式IA所示化合物进行口服施用。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述式IA所示化合物以0.01-100mg/kg患者体重的范围进行施用。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经退行性或神经性疾病或病症与轴突变性、轴突损伤、轴突病变、脱髓鞘疾病、脑桥中央髓鞘溶解症、神经损伤疾病或病症、代谢疾病、线粒体疾病、代谢轴突变性、由白质脑病或脑白质营养不良导致的轴突损伤相关。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经退行性或神经性疾病或病症选自下组：脊髓损伤、中风、多发性硬化、进行性多灶性白质脑病、先天性髓鞘发育不良、脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、脑桥中央髓细胞溶解症、渗透性低钠血症、缺氧性脱髓鞘、缺血性脱髓鞘、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、尼曼-皮克病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、脑室周围白质软化病、球形细胞脑白质营养不良(Krabbe病)、华勒变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS、Lou Gehrig病)、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、泰-萨克斯病、高歇氏病、Hurler综合征、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗引起的神经***并发症(化疗引起的神经病变、CIPN)、神经病变、急性缺血性视神经病变、维生素B12缺乏症、孤立性维生素E缺乏综合征、巴-科综合征、青光眼、莱伯氏遗传性视神经萎缩(神经病变)、莱伯先天性黑朦、视神经脊髓炎、异染性脑白质营养不良、急性出血性脑白质炎、三叉神经痛、贝尔麻痹、脑缺血、多***萎缩、外伤性青光眼、热带痉挛性下肢瘫痪、人T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)相关性脊髓病、西尼罗河病毒性脑病、拉克罗斯病毒性脑炎、布尼亚病毒性脑炎、小儿病毒性脑炎、特发性震颤、腓骨肌萎缩症、运动神经元疾病、脊髓性肌萎缩症(SMA)、遗传性感觉和自主神经病变(HSAN)、肾上腺髓鞘病、进行性核上麻痹(PSP)、弗里德里希共济失调、遗传性共济失调、噪音引起的听力丧失、先天性听力丧失、路易体痴呆、额颞叶痴呆、淀粉样变性、糖尿病神经病变、HIV神经病变、肠神经病和轴突病、吉兰-巴雷综合征和严重急性运动轴突神经病变(AMAN)。
21.一种抑制SARM1 NAD酶活性和/或在有此需要的患者中治疗神经退行性或神经性疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据式IB所述的组合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
X1B和X2B独立地为-O-、-S-或–NRB-，前提是X1B和X2B中的一个为-O-或-S-，并且X1B和X2B不同时为–O-；
YB为–N-或–CH-；
每个R1B独立地为氢或任选地被取代的C1-4脂族基；
环AB选自苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
每个RXB独立地为氢、卤素或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
每个RB独立地为氢或选自下组的任选被取代的基团：C1-6脂族基、3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环、苯基、8-10元双环芳香碳环、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和的单环杂环、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环、或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环；
LB为共价键、C1-6元直链或支链二价烃链、环丙亚基、环丁亚基或氧杂环丁亚基；以及
nB为0、1、2、3或4。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述式IB所示化合物选自下组：
23.根据权利要求21所述的方法，其中X1B和X2B为-S-，且YB为–N-。
24.根据权利要求21所述的方法，其中环AB为芳基或杂芳基。
25.根据权利要求21所述的方法，其中环AB选自下组：苯基、联苯基、萘基和蒽基。
26.根据权利要求21所述的方法，其中环AB选自下组：茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘基亚胺基、菲啶基、四氢萘基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。
27.根据权利要求21所述的方法，其中R1B为任选地被取代的C1-4脂族基。
28.根据权利要求21所述的方法，其中R1B为甲基。
29.根据权利要求21所述的方法，其中LB为共价键或1-6元直链或支链二价烃链。
30.根据权利要求21所述的方法，其中LB为共价键或亚甲基。
31.根据权利要求21所述的方法，其中RXB为氢、卤素或任选地被取代的C1-6脂族基。
32.根据权利要求21所述的方法，其中RXB为氢或-Cl。
33.根据权利要求21所述的方法，其中将所述式IB所示化合物作为药学上可接受的组合物的一部分进行施用。
34.根据权利要求21所述的方法，其中将所述式IB所示化合物进行口服施用。
35.根据权利要求21所述的方法，其中所述式IB所示化合物以0.01-100mg/kg患者体重的范围进行施用。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述神经退行性或神经性疾病或病症与轴突变性、轴突损伤、轴突病变、脱髓鞘疾病、脑桥中央髓鞘溶解症、神经损伤疾病或病症、代谢疾病、线粒体疾病、代谢轴突变性、由白质脑病或脑白质营养不良导致的轴突损伤相关。
37.根据权利要求21所述的方法，其中所述神经退行性或神经性疾病或病症选自下组：脊髓损伤、中风、多发性硬化、进行性多灶性白质脑病、先天性髓鞘发育不良、脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、脑桥中央髓细胞溶解症、渗透性低钠血症、缺氧性脱髓鞘、缺血性脱髓鞘、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、尼曼-皮克病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、脑室周围白质软化病、球形细胞脑白质营养不良(Krabbe病)、华勒变性沃勒变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS、Lou Gehrig病)、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、泰-萨克斯病、高歇氏病、Hurler综合征、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗引起的神经***并发症(化疗引起的神经病变、CIPN)、神经病变、急性缺血性视神经病变、维生素B12缺乏症、孤立性维生素E缺乏综合征、巴-科综合征、青光眼、莱伯氏遗传性视神经萎缩、莱伯先天性黑朦、视神经脊髓炎、异染性脑白质营养不良、急性出血性脑白质炎、三叉神经痛、贝尔麻痹、脑缺血、多***萎缩、外伤性青光眼、热带痉挛性下肢瘫痪、人T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)相关性脊髓病、西尼罗河病毒性脑病、拉克罗斯病毒性脑炎、布尼亚病毒性脑炎、小儿病毒性脑炎、特发性震颤、腓骨肌萎缩症、运动神经元疾病、脊髓性肌萎缩症(SMA)、遗传性感觉和自主神经病变(HSAN)、肾上腺髓鞘病、进行性核上麻痹(PSP)、弗里德里希共济失调、遗传性共济失调、噪音引起的听力丧失和先天性听力丧失。
38.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含i)SARM1的突变体或片段，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性；
b.孵育所述混合物；
c.在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+和ADPR；
d.测定NAD+:ADPR的摩尔比；和
e.如果所述摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述定量所述混合物中的NAD+和ADPR包括进行HPLC分析。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述混合物包含含有所述SARM1的突变体或片段的细胞裂解物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中细胞裂解物是包含所述SARM1的突变体或片段的NRK1-HEK293T细胞的裂解物。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段是SARM-TIR片段。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段由人SARM1的第410至721位残基组成。
44.根据权利要求38所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段由与人SARM1的第410至721位残基同源的鼠SARM1残基组成。
45.根据权利要求38所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。
46.根据权利要求38所述的方法，其中如果所述NAD+:ADPR的摩尔比大于4:1，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
47.根据权利要求40所述的方法，其中所述定量所述裂解物中的NAD+包括进行化学发光测定。
48.一种由SARM1的突变体或片段组成的多肽，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性。
49.一种由以下组成的多肽：
SARM1的突变体或片段，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性；和
至少一个标签。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中所述至少一个标签选自下组：Strep标签、His标签、及其组合。
51.根据权利要求49所述的多肽，其中所述SARM1的突变体或片段是SARM1-TIR片段。
52.根据权利要求49所述的多肽，其由SARM1-TIR片段、His标签和链霉亲和素标签组成。
53.根据权利要求52所述的多肽，其中所述链霉亲和素标签是串联的链霉亲和素标签。
54.根据权利要求49所述的多肽，按照氨基至羧基末端的顺序，其由串联的链霉亲和素标签、SARM1-TIR片段和His标签组成。
55.根据权利要求49所述的多肽，其中所述SARM1的突变体或片段是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。
56.根据权利要求49所述的多肽，其中所述SARM1的突变体或片段由人SARM1的第410至721位残基组成。
57.根据权利要求49所述的多肽，其中所述SARM1的突变体或片段由与人SARM1的第410至721位残基同源的鼠SARM1残基组成。
58.一种多肽，其具有组成型NAD酶活性，并且与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段的序列具有至少70％的序列同一性。
59.根据权利要求58所述的多肽，其与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段的序列具有至少80％的序列同一性。
60.根据权利要求58所述的多肽，其与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段的序列具有至少90％的序列同一性。
61.根据权利要求58所述的多肽，其与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段的序列具有至少95％的序列同一性。
62.一种具有组成型NAD酶活性的人SARM1的片段。
63.一种编码权利要求48-62中任一项所述的多肽的载体。
64.一种组合物，其包含：
权利要求48-62中任一项所述的多肽；和固体支持物。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述固体支持物是珠粒。
66.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含结合了以下物质的固体支持物：i)权利要求48-62中任一项所述的多肽和至少一个标签，ii)NAD+，和iii)候选抑制剂；
b.孵育所述混合物；
c.在所述孵育后定量所述NAD+；和
d.如果NAD+的浓度大于对照的浓度，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一个标签为N-末端标签。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述N-末端标签为链霉亲和素标签。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述N-末端蛋白质标签是串联的链霉亲和素标签。
70.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一个标签是C-末端标签。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述C-末端标签是His标签。
72.根据权利要求66所述的方法，其中所述固体支持物是His标签纯化珠。
73.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一个标签为至少两个标签。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述至少两个标签为N-末端标签和C-末端标签。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述N-末端标签为串联的链霉亲和素标签，且所述C-末端标签为His标签。
76.根据权利要求66所述的方法，其中所述定量NAD+包括进行HPLC测定。
77.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含i)至少一种培养的神经元和ii)候选的SARM1 NAD酶抑制剂，所述培养的神经元包含至少一个轴突；
b.向所述混合物中加入标记的NAM；
c.横向切断所述至少一个轴突；
d.定量所述混合物中标记的和未标记的NAD+的量；和
e.当损伤后NAD+的消耗速率与不含所述候选抑制剂的对照混合物的消耗速率相比降低时，鉴定出SARM1 NAD酶抑制剂。
78.根据权利要求77所述的鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法还包括确定NAD+消耗的净速率。
79.根据权利要求77所述的鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，其中所述确定NAD+消耗的净速率包括计算轻NAD+相对于重NAD+随时间的减少％。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述标记的NAM是氘标记的NAM。
81.根据权利要求77所述的方法，其中所述标记的NAM是D4-NAM。
82.根据权利要求77所述的方法，其中所述定量所述标记的和未标记的NAD+包括进行HPLC测定。
83.根据权利要求77所述的方法，其中所述至少一种培养的神经元是至少一种培养的背根神经节神经元。
84.一种鉴定轴突变性抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含i)至少一种培养的神经元和ii)候选抑制剂，所述培养的神经元包含轴突；
b.破坏所述神经元；
c.使用至少一个显微镜图像计算变性指数；和
d.当与对照相比，变性指数具有统计学显著的降低时，鉴定出轴突变性抑制剂。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述破坏所述神经元包括横向切断所述轴突。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述破坏所述神经元包括向所述混合物中加入长春新碱。
87.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含i)SARM1的突变体或片段，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述突变体或片段具有组成型NAD酶活性；
b.孵育所述混合物；
c.在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+；和
d.如果NAD+的量大于不含所述候选抑制剂的对照混合物中的NAD+的量，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
88.一种根据权利要求87所述的方法，其中所述定量所述混合物中的NAD+包括进行化学发光测定。
89.一种根据权利要求87所述的方法，其中所述定量所述混合物中的NAD+包括进行HPLC分析。
90.一种根据权利要求87所述的方法，其中所述混合物包含含有所述SARM1的突变体或片段的细胞裂解物。
91.根据权利要求87所述的方法，其中所述细胞裂解物是包含所述SARM1的突变体或片段的NRK1-HEK293T细胞的裂解物。
92.根据权利要求87所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段是SAM-TIR片段。
93.根据权利要求87所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段由人SARM1的第410至721位残基组成。
94.根据权利要求87所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段由鼠SARM1组成，所述鼠SARM1经过修饰以显示组成型NAD酶活性。
95.根据权利要求87所述的方法，其中所述SARM1的突变体或片段是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。
96.一种治疗轴突病变的方法，所述方法包括施用药学有效量的SARM1 NAD酶活性抑制剂。
97.一种抑制SARM1 NAD酶活性的方法，所述方法包括使SARM1与SARM1 NAD酶抑制剂接触。
98.一种体外细胞，所述细胞包含权利要求48-62中任一项所述的多肽。
99.根据权利要求98所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
100.根据权利要求98所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
101.一种体外细胞，其包含编码权利要求48-62中任一项所述的多肽的核酸。
102.根据权利要求101所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
103.根据权利要求101所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
104.一种原核细胞，其包含权利要求48-62中任一项所述的多肽。
105.根据权利要求104所述的原核细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
106.一种原核细胞，其包含编码权利要求48-62中任一项所述的多肽的核酸序列。
107.根据权利要求106所述的原核细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
108.一种治疗轴突病变的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的SARM1 NAD酶活性抑制剂。
109.根据权利要求108所述的治疗轴突病变的方法，其中所述SARM1 NAD酶活性抑制剂是质子泵抑制剂。
110.根据权利要求108所述的治疗轴突病变的方法，其中所述SARM1 NAD酶活性抑制剂是式IC所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
XC为N或C；
R1C为H、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基或C1-C5卤代烷氧基；
R2C为C1-C5烷基或C1-C5烷氧基；
R3C为C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或醚；以及
R4C为H、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。
111.根据权利要求108所述的治疗轴突病变的方法，其中所述SARM1 NAD酶活性抑制剂选自下组：
112.根据权利要求108所述的治疗轴突病变的方法，其中所述SARM1 NAD酶活性抑制剂选自下组：
113.一种治疗轴突病变的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(NHD)。
114.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a)提供混合物，所述混合物包含i)多肽，所述多肽与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段具有至少70％的序列同一性，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述多肽具有组成型NAD酶活性；
b)孵育所述混合物；
c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+和至少一种NAD酶裂解产物；和
d)如果NAD+与所述至少一种NAD酶裂解产物的摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
115.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段具有至少80％的序列同一性。
116.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段具有至少90％的序列同一性。
117.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽与具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段具有至少95％的序列同一性。
118.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽是具有组成型NAD酶活性的人SARM1片段。
119.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述至少一种NAD酶裂解产物是ADPR。
120.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述至少一种NAD酶裂解产物是Nam。
121.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述定量NAD+包括进行HPLC分析。
122.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述定量所述至少一种NAD酶裂解产物包括进行HPLC分析。
123.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述定量所述裂解物中的NAD+包括进行化学发光测定。
124.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述混合物包含含有所述多肽的细胞裂解物。
125.根据权利要求113-117中任一项所述的方法，其中细胞裂解物是包含所述多肽的NRK1-HEK293T细胞的裂解物。
126.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽是SARM-TIR片段。
127.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽由人SARM1的第410至721位残基组成。
128.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽由人SARM1的560-724位残基组成。
129.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽是缺失N-末端自身抑制结构域的SARM1多肽。
130.根据权利要求113所述的方法，其中如果NAD+与所述至少一种裂解产物的摩尔比大于4:1，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
131.一种抑制SARM1 NAD酶活性的方法，所述方法包括使SARM1多肽与质子泵抑制剂接触。
132.一种抑制SARM1 NAD酶活性的方法，所述方法包括使SARM1多肽与式IC所示的化合物或其药学上可接受的盐接触：
其中：
XC为N或C；
R1C为H、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、或C1-C5卤代烷氧基；
R2C为C1-C5烷基或C1-C5烷氧基；
R3C为C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或醚；以及
R4C为H、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。
133.一种根据权利要求108所述的抑制SARM1 NAD酶活性的方法，其中所述化合物或其盐选自下组：泰妥拉唑、泮托拉唑钠、右兰索拉唑、埃索美拉唑镁水合物和雷贝拉唑钠。
134.用于治疗轴突病变的式IC所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
XC为N或C；
R1C为H、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、或C1-C5卤代烷氧基；
R2C为C1-C5烷基或C1-C5烷氧基；
R3C为C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或醚；以及
R4C为H、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。
135.一种根据权利要求110所述的化合物，其中所述化合物或其盐选自下组：泰妥拉唑、泮托拉唑钠、右兰索拉唑、埃索美拉唑镁水合物、兰索拉唑、奥美拉唑或雷贝拉唑钠。
136.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含i)全长SARM1，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述全长SARM1具有组成型NAD酶活性；
b.孵育所述混合物；
c.在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+和ADPR；
d.测定NAD+:ADPR的摩尔比；以及
e.如果所述摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述定量所述混合物中的NAD+和ADPR包括进行HPLC分析。
138.根据权利要求136所述的方法，其中所述混合物包含含有所述全长SARM1的细胞裂解物。
139.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含结合了以下物质的固体支持物：i)全长SARM1和至少一个标签，ii)NAD+，和iii)候选抑制剂；
b.孵育所述混合物；
c.在所述孵育后定量所述NAD+；和
d.如果NAD+的浓度大于对照的浓度，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
140.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a.提供混合物，所述混合物包含i)全长SARM1，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述全长SARM1具有组成型NAD酶活性；
b.孵育所述混合物；
c.在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+；和
d.如果NAD+的量大于不含所述候选抑制剂的对照混合物中的NAD+的量，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
141.一种鉴定SARM1 NAD酶抑制剂的方法，所述方法包括：
a)提供混合物，所述混合物包含i)具有组成型NAD酶活性的全长SARM1，ii)NAD+和iii)候选抑制剂，其中所述全长SARM1具有组成型NAD酶活性；
b)孵育所述混合物；
c)在所述孵育后定量所述混合物中的NAD+和至少一种NAD酶裂解产物；和
d)如果NAD+与所述至少一种NAD酶裂解产物的摩尔比大于不含所述候选抑制剂的对照混合物的摩尔比，则将所述候选抑制剂化合物鉴定为NAD酶抑制剂。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述至少一种NAD酶裂解产物是ADPR。
143.根据权利要求141所述的方法，其中所述至少一种NAD酶裂解产物是Nam。
144.根据权利要求141所述的方法，其中所述定量NAD+包括进行HPLC分析。
145.一种SARM1多肽，所述SARM1多肽至少包含SARM1 N-末端自身抑制结构域的功能片段，至少包含一个或多个SAM结构域的功能片段，和至少包含SARM1 TIR结构域的功能片段，其中所述SARM1多肽缺乏线粒体靶向序列。
CN201780072662.1A 2016-09-24 2017-09-22 Sarm1 nad酶活性抑制剂及其用途 Pending CN110545804A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662399339P 2016-09-24 2016-09-24
US62/399,339 2016-09-24
US201762473805P 2017-03-20 2017-03-20
US201762473916P 2017-03-20 2017-03-20
US201762473921P 2017-03-20 2017-03-20
US62/473,916 2017-03-20
US62/473,805 2017-03-20
US62/473,921 2017-03-20
PCT/US2017/053098 WO2018057989A1 (en) 2016-09-24 2017-09-22 INHIBITORS OF SARM1 NADase ACTIVITY AND USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110545804A true CN110545804A (zh) 2019-12-06

Family

ID=60002140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780072662.1A Pending CN110545804A (zh) 2016-09-24 2017-09-22 Sarm1 nad酶活性抑制剂及其用途

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11253503B2 (zh)
EP (1) EP3515426A1 (zh)
JP (1) JP7044789B2 (zh)
CN (1) CN110545804A (zh)
CA (1) CA3037884A1 (zh)
WO (1) WO2018057989A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114136941A (zh) * 2020-11-27 2022-03-04 北京大学深圳研究生院 一种sarm1酶抑制剂及其筛选方法和应用
CN116075511A (zh) * 2020-04-09 2023-05-05 达萨玛治疗公司 作为sarm1抑制剂的稠合吡唑衍生物

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018057989A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Washington University INHIBITORS OF SARM1 NADase ACTIVITY AND USES THEREOF
CA3079409A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Washington University Dominant negative sarm1 molecules as a therapeutic strategy for neurodegenerative diseases or disorders
WO2019236879A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 Disarm Therapeutics, Inc. Inhibitors of sarm1
WO2019236884A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 Disarm Therapeutics, Inc. Inhibitors of sarm1
EP3584244A1 (en) * 2018-06-20 2019-12-25 UCB Pharma GmbH Substituted alkoxypyridinyl indolsulfonamides
JP7273954B2 (ja) * 2018-10-19 2023-05-15 ディスアーム セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎａｄ＋またはｎａｄ＋前駆体と組み合わせたｓａｒｍ１の阻害
JP7212781B2 (ja) * 2018-12-19 2023-01-25 ディスアーム セラピューティクス， インコーポレイテッド 神経保護剤と組み合わせたｓａｒｍ１の阻害剤
EP3980011A4 (en) * 2019-06-06 2023-01-18 Disarm Therapeutics, Inc. MRSA1 INHIBITORS
WO2020252229A2 (en) * 2019-06-14 2020-12-17 Disarm Therapeutics, Inc. Inhibitors of sarm1
EP4007497A4 (en) * 2019-08-01 2023-11-29 Duke University BETA-ARRESTIN MODULATING COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF
CA3150878A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 Jonathan Bentley Inhibitors of sarm1
EP4052706A4 (en) * 2019-10-31 2023-11-08 Checkmate Therapeutics Inc. COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR INHIBITION OF AXONAL DEGENERATION
EP4065714A1 (en) * 2019-11-26 2022-10-05 Disarm Therapeutics, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
MX2022008395A (es) 2020-01-07 2022-09-26 Disarm Therapeutics Inc Inhibidores de sarm1.
EP4132920A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Disarm Therapeutics, Inc. Indazole derivatives as inhibitors of sarm1
TWI786777B (zh) 2020-08-24 2022-12-11 美商達薩瑪治療公司 Sarm1之抑制劑
WO2022055940A1 (en) * 2020-09-08 2022-03-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Vista inhibitors
CN116568678A (zh) 2020-12-08 2023-08-08 达萨玛治疗公司 Sarm1的苯并吡唑抑制剂
US20220241416A1 (en) * 2021-01-28 2022-08-04 Bar Ilan University Methods for the identification of sarm1 nadase activity inhibitors and uses thereof
WO2022265960A1 (en) * 2021-06-13 2022-12-22 Daya Drug Discoveries, Inc. Prevention and treatment of neuronal damage with pyridoindolobenz[b, d] azepine compositions
IL311604A (en) * 2021-10-25 2024-05-01 Sironax Ltd SARM1 modulators, their preparation and uses
WO2023235719A2 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 The Scripps Research Institute Stereoselective allosteric inhibitors of sarm1
TW202415642A (zh) * 2022-06-07 2024-04-16 香港商維泰瑞隆（香港）生物科技有限公司 Ｓａｒｍ１調節劑、製劑及其用途
WO2024100421A1 (en) 2022-11-12 2024-05-16 Cambridge Enterprise Limited Sarm1 inhibitors for use in therapy and cosmetics

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120328629A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 University Of Miami Therapeutic Applications Targeting SARM1

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI90544C (fi) 1986-11-13 1994-02-25 Eisai Co Ltd Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten 2-pyridin-2-yyli-metyylitio- ja sulfinyyli-1H-bensimidatsolijohdannaisten valmistamiseksi
TW200640888A (en) 2005-02-11 2006-12-01 Solvay Pharm Bv [1,2,4]-dithiazoli (di) ne derivatives, inducers of glutha-thione-S-transferase and NADPH quinone oxido-reduc-tase, for prophylaxis and treatment of adverse conditions associated with cytotoxicity in general and apoptosis in particular
WO2018057989A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Washington University INHIBITORS OF SARM1 NADase ACTIVITY AND USES THEREOF

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120328629A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 University Of Miami Therapeutic Applications Targeting SARM1

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Major pathway identified in nerve cell death offers hope for therapies", 《HTTPS://WWW.SCIENCEDAILY.COM/RELEASES/2015/04/150421163346.HTM》 *
JING WANG等: "A local mechanism mediates NAD-dependent protection of axon degeneration", 《THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY》 *
JOSIAH GERDTS等: "Axon self destruction: new links among SARM1, MAPKs, and NAD+ metabolism", 《NEURON.》 *
JOSIAH GERDTS等: "SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction", 《SCIENCE.》 *
LEONEL E.ROJO等: "Selective Interaction of Lansoprazole and Astemizole with Tau Polymers: Potential New Clinical Use in Diagnosis of Alzheimer"s Disease", 《J ALZHEIMERS DIS.》 *
NILS HENNINGER等: "Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1", 《BRAIN》 *
PETER PAUL DE DEYN等: "Aripiprazole in the treatment of Alzheimeis disease", 《EXPERT OPINION ON PHARMACOTHERAPY》 *
RUPINDER K. SODHI等: "Defensive Effect of Lansoprazole in Dementia of AD Type in Mice Exposed to Streptozotocin and Cholesterol Enriched Diet", 《PLOS ONE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116075511A (zh) * 2020-04-09 2023-05-05 达萨玛治疗公司 作为sarm1抑制剂的稠合吡唑衍生物
CN114136941A (zh) * 2020-11-27 2022-03-04 北京大学深圳研究生院 一种sarm1酶抑制剂及其筛选方法和应用
CN114136941B (zh) * 2020-11-27 2024-04-16 北京大学深圳研究生院 一种sarm1酶抑制剂及其筛选方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20220040164A1 (en) 2022-02-10
CA3037884A1 (en) 2018-03-29
US11903935B2 (en) 2024-02-20
EP3515426A1 (en) 2019-07-31
WO2018057989A1 (en) 2018-03-29
US11253503B2 (en) 2022-02-22
JP2019535804A (ja) 2019-12-12
JP7044789B2 (ja) 2022-03-30
US20200129493A1 (en) 2020-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110545804A (zh) Sarm1 nad酶活性抑制剂及其用途
JP7319395B2 (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
JP7289375B2 (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
AU2021206651B2 (en) Inhibitors of SARM1
CN112955150A (zh) 与nad+或nad+前体组合的sarm1抑制剂
CA3102598A1 (en) Inhibitors of sarm1
CA3102645A1 (en) Inhibitors of sarm1
JP2023553426A (ja) Ｓａｒｍ１のベンゾピラゾール阻害剤
Micale et al. Novel 2H-isoquinolin-3-ones as antiplasmodial falcipain-2 inhibitors
JP7477642B2 (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
US20240238264A1 (en) Inhibitors of sarm1 nadase activity and uses thereof
JP7478252B2 (ja) Ｓａｒｍ１の阻害剤
EP4028013A1 (en) Inhibitors of sarm1
CN116940569A (zh) Sarm1抑制剂
学又 1 () Development, Selectivity, and Application of Paullones, a Family

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination