CN110541044A - 鉴定桃果实离核性状的分子标记引物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组可以鉴定桃种质粘离核性状的分子标记引物组合及其应用，以期应用于桃粘离核性状分子标记辅助选择。本发明提供一组可以鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合，为JYSNP‑1，JYSNP‑2，JYSNP‑3中任一个，可用于桃育种材料果实粘离核性状的快速鉴定。本发明基于开发的分子标记引物组合提供用于辅助筛选优良桃种质资源的方法，在桃粘离核性状表型预测上有重要的指导意义，具有操作简单、高效快速、成本低、结果准确等优点。

Description

鉴定桃果实离核性状的分子标记引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一组鉴定桃果实离核性状的分子标记引物组合及其应用，属于分子生物学领域。
背景技术
桃[Prunus persica(L.)Batsch]属于蔷薇科(Rosaceae)，李属(Prunus L.)，起源于我国西部地区，是我国重要的栽培果树之一。我国桃种质资源较为丰富，利用现有资源选育具有更高经济价值的新优品种是提高我国桃品质和产量的有效途径之一。果肉粘离核是桃果实的重要性状之一；离核是指当人吃或掰开果实，果肉可以与桃核顺利分离，并且桃核上不会残留多少果肉；而粘核指果肉不会与桃核顺利分离，并且桃核上会残留很多果肉。在《果树种质资源描述符》中，针对桃粘离核性状一项，分为离核、半离核、粘核3级。
通过常规杂交育种方法选育优良品种，存在育种周期长、占地面积大、栽培管理费用高等不足。现代生物技术的发展为桃育种提供一种有效的辅助方法——DNA分子标记，如SSR、AFLP、SNP等直接以遗传物质DNA为研究对象，揭示物种间的遗传多样性，可借此有效的开展育种过程中早期鉴定和选择工作。相信在不久的将来随着分子生物技术的进一步发展以及各种作物图谱的日趋饱和分子标记辅助育种定会发挥更大的作用。
近年来，相关研究虽然开发了与桃果实粘离核基因连锁的SSR、AFLP等分子标记，但是尚有一定连锁距离，且受限于标记密度、数量和研究手段等众多因素的影响，仅为桃粘离核性状分子标记辅助育种方面研究提供参考依据，其实用价值、准确率和检测效率不详。授权公告号为CN201511000523.7的发明专利公开了一种调控桃果实离核核软化性状的基因及其应用，其中，提供了与果实粘离核性状相关联的分子标记，可以用于粘离核表型的检测；但是，该分子标记PCR扩增产物片段过长(>1000bp)，难以应用于荧光毛细管电泳和荧光定量PCR仪基因分型等高通量检测技术平台(通常要求产物片段长度<500bp，但是建议产物片段长度<200bp，效果较好)，此外，该分子标记数量较少，须对样品逐一检测，不能实现高通量分型，当面对大量群体样本检测任务时，检测效率极低，工作量较大，费时费工，实用性较差。因此，提供一种新的分子标记组合及其检测方法，借以提高灵敏性、准确性和工作效率，并实现高通量分型检测和大群体样本的分子标记辅助筛选，成为本领域研究人员急需解决的技术问题。
目前SNP的常用检测方法是等位基因特异性PCR(A1lele apecific PCR，AS-PCR)，AS-PCR是基于引物3’端碱基与DNA模板匹配与否来区分SNP位点。理论上，只要末位碱基不配对，那么引物无法有效延伸；但是末位单碱基错配往往不能达到预期的分辨效果。随着指数级的DNA扩增，错配产物的数量也相当可观，完全可以达到影响分辨率的程度。有鉴于此，本发明基于利用Pfu高保真DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)聚合酶对引物3’末端错配碱基的校正机制，再对引物的3’末端加以硫代磷酸化修饰，配对的修饰引物得到产物，而不配对的修饰引物则被终止聚合反应因而不会有产物。这种配对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果完美地满足了基因分型检测时非此即彼的要求，实现了基因检测***中假阳性的显著降低。
发明内容
本发明的目的是提供一组可用于鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合及其应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合，包括一个引物对，所述引物对从以下三个引物对中选择其一：
JYSNP-1：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCAATAATTTTA*G*G-3’，
R：5’-CAGAGTAAATGTTGTTAACCACT*T*G-3’；
JYSNP-2：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGATCGAGCCTTG*C*T-3’，
R：5’-CAATGCTTTTTTGGCTAAGCTAC*G*A-3’；
JYSNP-3：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGATCGAGCCTTG*C*T-3’，
R：5’-CAGAGTAAATGTTGTTAACCACT*T*G-3’；
其中，*表示为硫代修饰。
优选的，还包括尾巴引物，所述尾巴引物序列为：
Tail：5’-<FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，合成时任选其中1-4种荧光标记均可；
本发明还公开了上述的分子标记引物组合在鉴定桃粘离核性状中的应用。
优选的，其步骤包括：
(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中之一；
(2)DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA，桃嫩叶是指当年生枝条上生长日期低于20天的桃幼叶；
(3)PCR扩增：基于上述桃基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物JYSNP-1、JYSNP-2或JYSNP-3进行PCR扩增；
(4)扩增产物检测与分析：对扩增产物进行琼脂糖电泳检测条带大小分析，确定桃果实粘离核性状。
还可以采取以下步骤：
(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中之一，以及尾巴引物；
(2)DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA；
(3)PCR扩增：基于上述桃基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物JYSNP-1、JYSNP-2或JYSNP-3进行PCR扩增；
(4)扩增产物检测与分析：对扩增产物使用尾巴引物在ABI遗传分析仪上进行分析，确定桃果实粘离核性状。
优选的，其详细步骤为：
(1)引物合成：委托生物技术公司分别合成引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中任一即可；值得注意的是，若后期使用遗传分析仪进行PCR扩增产物片段大小的检测与分析，需要另行合成尾巴引物，尾巴引物的5’端可添加四种不同的荧光基团之一，即从FAM、HEX、PET和NED中选择其一即可；
(2)DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、加入0.8mL 65℃预热的CTAB裂解液后混匀，裂解液的配方为：100mmol/LTris·Cl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4mmol/L NaCl，2.5％CTAB(M/V)，3％PVP(M/V)、2％β-巯基乙醇(V/V)；65℃水浴1h，期间不时轻轻摇动；
C、水浴结束待冷却后加入0.8mL抽提混合液后混匀，抽提混合液的配方为：氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)；4℃，10000rpm，10min，小心将上清液移入新的2mL离心管中，重复加入0.8mL抽提混合液后混匀，4℃，10000rpm，10min；
D、小心将上清液移入新的2mL离心管中，加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)，混匀，室温静置30min；小心吸出絮团状沉淀，用70％乙醇洗涤；
E、超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.2mL ddH2O溶解DNA；同时取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为80ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；
(3)PCR扩增反应体系为：基因组DNA模板1.0μL(80ng/μL)，2×EasyPfu PCRSuperMix 10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，ddH2O补足至20μL；上述PCR扩增反应体系仅适用于常规琼脂糖电泳检测PCR产物条带大小情况；若采用ABI遗传分析仪上分析PCR产物条带大小情况，需在体系中加入尾巴引物(10μM)0.5μL，同时将正向引物添加量改为(10μM)0.5μL即可。扩增PCR程序如下：94℃ 5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 10min；
(4)PCR扩增产物检测与分析：经上述扩增过程得到的PCR产物，取5μL进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；或在ABI遗传分析仪上进行检测，数据结果用软件Genemapper或者Peak Scanner进行片段大小读数；其中，JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3引物扩增后片段大小分别为178bp、194bp和106bp。若PCR扩增获得其中任一相应引物大小条带者，即为阳性，代表桃果实为离核性状，否则即为粘核性状；
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中分子标记引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3扩增产物带型稳定、清晰且重复性好，易于分辨；此外，上述引物扩增后产物片段大小差异明显，用琼脂糖电泳检测即可；上述引物可单独用于分子标记辅助筛选，亦可同时使用，减少了试验成本，极大的提高了工作效率；
(2)本发明中分子标记引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3扩增产物片段大小介于100bp-200bp之间，适用于荧光毛细管电泳和荧光PCR仪等高通量分型检测技术平台，进一步提升了基因分型准确率和检测效率，检测效果可靠；同时，将通用引物M13序列添加在引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3的5’端，同时加入已经添加荧光基团的尾巴引物序列(Tail)共同用于PCR扩增，以此可以进一步降低荧光引物合成的成本，只需要合成1-4条添加荧光标识的尾巴引物即可，可以与特异性分子标记引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3任意组合使用，从而降低了试验成本；
(3)本发明基于利用Pfu高保真DNA聚合酶对引物3’末端错配碱基的校正机制，再对正向和反向引物的3’末端加以双硫代磷酸化修饰，配对的修饰引物得到产物，而不配对的修饰引物则被终止聚合反应因而不会有产物，实现了基因检测***中假阳性的显著降低，进一步提升了基因分型检测的准确率。
本发明下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
附图说明
图1为桃种质资源DNA样本的JYSNP-2和JYSNP-3引物PCR扩增产物琼脂糖电泳分型效果；
图2为桃种质资源DNA样本的JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3引物PCR扩增产物荧光毛细管电泳分型效果；
图3为桃种质资源DNA样本的JYSNP-2引物在荧光定量PCR仪平台上的分型效果。
具体实施方式
实施例1
一组鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合的应用方法，其详细步骤为：
(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司分别合成引物JYSNP-1、JYSNP-2、JYSNP-3和尾巴引物；其中，尾巴引物的5’端添加三种不同的荧光基团，即FAM、HEX和NED；
表1：相关引物序列
注：*表示为硫代修饰。
(2)待测群体样品桃叶片DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、加入0.8mL 65℃预热的CTAB裂解液后混匀，裂解液的配方为：100mmol/LTris·Cl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4mmol/L NaCl，2.5％CTAB(M/V)，3％PVP(M/V)、2％β-巯基乙醇(V/V)；65℃水浴1h，期间不时轻轻摇动；
C、水浴结束待冷却后加入0.8mL抽提混合液后混匀，抽提混合液的配方为：氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)；4℃，10000rpm，10min，小心将上清液移入新的2mL离心管中，重复加入0.8mL抽提混合液后混匀，4℃，10000rpm，10min；
D、小心将上清液移入新的2mL离心管中，加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)，混匀，室温静置30min；小心吸出絮团状沉淀，用70％乙醇洗涤；
E、超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.2mL ddH2O溶解DNA；同时取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为80ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；
(3)PCR扩增反应体系为：基因组DNA模板1.0μL(80ng/μL)，2×EasyPfu PCRSuperMix 10μL，正向引物(10μM)0.5μL，尾巴引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)
1μL，ddH2O补足至20μL；扩增PCR程序如下：94℃ 5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃30s，35个循环，72℃ 10min；
(4)PCR扩增产物检测与分析：
PCR产物在ABI 3730遗传分析仪(美国ABI公司)上进行检测，可以使用添加三种不同荧光基团的尾巴引物进行PCR扩增，也可以使用添加同一种荧光基团的尾巴引物，以降低试验成本；将上述使用不同特异引物进行PCR扩增获得的产物混合后在在ABI遗传分析仪上进行检测，数据结果用软件Genemapper或者Peak Scanner进行片段大小读数；其中，JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3引物扩增后片段大小分别为178bp、194bp和106bp。若PCR扩增获得其中任一相应引物大小条带者，即为阳性(桃果实为离核性状)，否则即为粘核性状，每一批次分型鉴定需加入两个参比样本(NJCT1和NJCT2)，即性状已经确定为离核的检测样本，若参比样本扩增为阳性，即为试验结果可取，否则说明试验失败，相应试验数据亦不能使用；最后，将所有试材的粘离核性状鉴定结果使用表格2进行记录，具体分型效果见图2。
表2本发明实例中所用到的70份桃种质资源粘离核鉴定结果信息
注：*预期片段大小的扩增产物的有与无分别用“+”和“-”表示。
实施例2
一组鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合的应用方法，其详细步骤为：
(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托相关生物技术公司合成引物JYSNP-1、JYSNP-2、JYSNP-3中任选其一即可(本实例中仅合成引物JYSNP-2)；
表1：相关引物序列
注：*表示为硫代修饰。
(2)待测群体样品桃叶片DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、加入0.8mL 65℃预热的CTAB裂解液后混匀，裂解液的配方为：100mmol/LTris·Cl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4mmol/L NaCl，2.5％CTAB(M/V)，3％PVP(M/V)、2％β-巯基乙醇(V/V)；65℃水浴1h，期间不时轻轻摇动；
C、水浴结束待冷却后加入0.8mL抽提混合液后混匀，抽提混合液的配方为：氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)；4℃，10000rpm，10min，小心将上清液移入新的2mL离心管中，重复加入0.8mL抽提混合液后混匀，4℃，10000rpm，10min；
D、小心将上清液移入新的2mL离心管中，加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)，混匀，室温静置30min；小心吸出絮团状沉淀，用70％乙醇洗涤；
E、超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.2mL ddH2O溶解DNA；同时取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为80ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；
(3)PCR扩增反应体系为：基因组DNA模板1.0μL(80ng/μL)，2×Super EvaGreenMaster Mix for HRM PCR Super Mix 5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)
0.5μL，10×ROX reference dye ddH2O补足至10μL；基于ABI Q6Flex实时荧光定量PCR***平台，使用基因分型实验类型“Genotyping”即可；扩增PCR程序如下：94℃ 5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，40个循环，最后72℃ 10min，收集荧光信号；
(4)基因分型分析与鉴定结果：经上述扩增过程得到的PCR产物，取5μL进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；若采用此方法进行产物片段大小检测，可直接使用两对特异引物，即JYSNP-2和JYSNP-3，由于两者片段的大小差异较大，可以直接在琼脂糖电泳上获得分辨，同时，两者PCR扩增产物可以使用同一个泳道进行电泳检测，互不影响，省工省时；若PCR扩增获得其中任一相应引物大小条带者，即为阳性(桃果实为离核性状)，否则即为粘核性状；值得注意的是，每一批次分型鉴定需加入两个参比样本(NJCT1和NJCT2)，即性状已经确定为离核的检测样本，若参比样本扩增为阳性，即为试验结果可取，否则说明试验失败，相应试验数据亦不能使用；最后，在参比样本扩增为阳性条件下的其余所有试材的粘离核性状鉴定结果使用表格进行记录，具体分辨效果见图1；
在参比样本分析鉴定结果为可信条件下，继续开展分型鉴定分析；基于ABI Q6Flex实时荧光定量PCR***平台(美国ABI公司)自动分析结果中Allelic DiscriminationPlot可知样本粘离核性状；其中，与参比样本(NJCT1和NJCT2)划分在同一区域的群体即为离核性状，其余为粘核(见图3)，将最终结果用表格形式进行记录，参见表2。
表2本发明实例中所用到的76份桃种质资源粘离核鉴定结果信息
注：*预期片段大小的扩增产物的有与无分别用“+”和“-”表示。

Claims (8)

1.一种鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合，包括一个引物对，所述引物对从以下三个引物对中选择其一：
JYSNP-1：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCAATAATTTTA*G*G-3’，
R：5’-CAGAGTAAATGTTGTTAACCACT*T*G-3’；
JYSNP-2：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGATCGAGCCTTG*C*T-3’，
R：5’-CAATGCTTTTTTGGCTAAGCTAC*G*A-3’；
JYSNP-3：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGATCGAGCCTTG*C*T-3’，
R：5’-CAGAGTAAATGTTGTTAACCACT*T*G-3’；
其中，*表示为硫代修饰。
2.根据权利要求1所述的分子标记引物组合，其特征在于：还包括尾巴引物，所述尾巴引物序列为：
Tail：5’-<FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。
3.权利要求1或2所述的分子标记引物组合在鉴定桃粘离核性状中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其步骤包括：
(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中之一；
(2)DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA；
(3)PCR扩增：基于上述桃基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物JYSNP-1、JYSNP-2或JYSNP-3进行PCR扩增；
(4)扩增产物检测与分析：对扩增产物进行琼脂糖电泳检测条带大小分析，确定桃果实粘离核性状。
5.根据权利要求3所述的应用，其步骤包括：
(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中之一，以及尾巴引物；
(2)DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA；
(3)PCR扩增：基于上述桃基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物JYSNP-1、JYSNP-2或JYSNP-3进行PCR扩增；
(4)扩增产物检测与分析：对扩增产物使用尾巴引物在ABI遗传分析仪上进行分析，确定桃果实粘离核性状。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：步骤(2)DNA的提取具体为：
A、用液氮研磨0.2g左右的嫩叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、加入0.8mL 65℃预热的CTAB裂解液后混匀，裂解液的配方为：100mmol/L pH 8.0的Tris·Cl，20mmol/L pH 8.0的EDTA，1.4mmol/L NaCl，2.5％CTAB(M/V)，3％PVP(M/V)、2％β-巯基乙醇(V/V)；65℃水浴1h，期间不时轻轻摇动；
C、水浴结束待冷却后加入0.8mL抽提混合液后混匀，抽提混合液的配方为：氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)；4℃、10000rpm离心10min，将上清液移入新的2mL离心管中，重复加入0.8mL抽提混合液后混匀，4℃、10000rpm离心10min；
D、将上清液移入新的2mL离心管中，加入等体积的经-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温静置30min；吸出絮团状沉淀，用70％乙醇洗涤；
E、超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.2mL ddH2O溶解DNA；同时取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为80ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(3)中PCR扩增的反应体系为：80ng/μL的基因组DNA模板1.0μL，2×EasyPfu PCR SuperMix 10μL，10μM的正向引物1μL，10μM的反向引物1μL，ddH2O补足至20μL；扩增PCR程序如下：94℃ 5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃30s，35个循环，72℃ 10min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(3)中PCR扩增的反应体系为：80ng/μL的基因组DNA模板1.0μL，2×EasyPfu PCR SuperMix 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物1μL，10μM的尾巴引物0.5μL，ddH2O补足至20μL；扩增PCR程序如下：94℃ 5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 10min。
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