CN110541008A - 一种长链二元酸铵的制备方法及其应用 - Google Patents
一种长链二元酸铵的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了发酵法制备长链二元酸铵盐溶液的方法及其制得的长链二元酸铵盐溶液或长链二元酸铵,该发酵以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐中的一种或多种为底物,在发酵时和/或所述发酵结束后,加入液氨和/或氨水。制得的长链二元酸铵盐溶液和/或长链二元酸铵,可以用于聚酰胺盐溶液制备过程中作为微生物发酵的能源、底物以及pH调节剂使用,不会在发酵体系中留下过多的无机酸根离子,避免了后续对无机离子的处理过程,大大降低了后续处理工作和成本,减少了无机离子对环境的损害。
Description
技术领域
本发明涉及一种长链二元酸铵的制备方法。
背景技术
长链二元酸有着非常广泛的用途,以长链二元酸为原料可以合成特种聚酰胺、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长,反应需要高温高压,对催化剂要求比较苛刻,因此在工业规模上的长链二元酸品种较少,只有十二碳二元酸等少数品种。而生物法是以长链烷烃为底物,通过微生物转化得到,利用微生物双末端氧化的特殊功能以正构烷烃为底物发酵制备长链二元酸。
生物法制备长链二元酸的工艺中,通常在反应液中先形成长链二元酸的盐(钾盐或者钠盐),在此基础上对含长链二元酸各种盐的反应液进行一系列的处理,以获得长链二元酸产品,该方法的负面影响是:副产物中无机盐难以回收利用,在环保压力日益增加的今天,对副产物的处理需要耗费大量人力、物力和财力。
另一方面,生物发酵法生产长链二元酸的发酵液,是一个复杂的气相、固相、水相和油相混合的体系,其中除了包括长链二元酸盐以外,还包含菌体、蛋白质、残留的底物、糖类、色素、无机盐等多种杂质,因此从长链二元酸的发酵液中,获得长链二元酸,需要经过除菌、脱色、酸化、过滤等预处理获得初级产品,然后进一步进行重结晶、脱色、洗涤等处理,这种方法步骤冗长,生产成本较高。
而现有技术中,对于长链二元酸的盐,除了经过大量后续步骤获得长链二元酸,再作为副产物花费大量精力处理遗留的无机盐以外,并没有更多的利用方式。因此,对于如何获得高质量的长链二元酸的盐,并且能够后续利用,也没有特别的研究。
发明内容
本发明的目的,是提供一种长链二元酸铵盐及其制备方法。本发明的长链二元酸铵盐,可以用于聚酰胺盐溶液制备过程中作为微生物发酵的能源、底物以及pH调节剂使用,整个过程不会在发酵体系中留下过多的无机酸根离子,从而避免了后续对无机离子的处理过程,大大降低了后续处理工作和成本,减少了无机离子对环境的损害。
本发明的目的之一,提供一种发酵法制备长链二元酸铵盐溶液的方法,所述发酵以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐中的一种或多种为底物,在所述发酵时和/或所述发酵结束后,加入液氨和/或氨水。
本发明的发明人,为了制备长链二元酸铵盐,在所述发酵时和/ 或所述发酵结束后,加入液氨和/或氨水,一方面,液氨和/或氨水可以部分参与调节pH,另一方面,还可以选择性的作为氮源使用。因此在加入液氨和/或氨水时,需要综合多方面因素考虑,才能保证发酵体系的稳定,保证最终产物的产量和纯度。而现有发酵过程中,都没有制备长链二元酸铵盐的方法,更加不会对液氨和/或氨水的添加量、添加方式和氨水浓度等有任何说明。
本发明的一个优选的技术方案,所述液氨和/或氨水的加入方式为连续加入,或,间歇分批加入。
本发明的一个优选的技术方案,所述液氨和/或氨水可以是发酵过程中加入,也可以是发酵结束后加入。
本发明的一个优选的技术方案,所述氨水的加入量为50~500g/L,优选100~300g/L。
本发明的一个优选的技术方案,所述液氨的加入量为12~125g/L,优选35~80g/L。
本发明的一个优选的技术方案,所述连续加入为恒速加入,或,变速加入。所述恒速加入的加入速度为0.35~3.5g/h/L。所述变速加入的加入速度为0~3.5g/h/L。
本发明的一个优选的技术方案,所述氨水浓度为氨气含量25%以上,所述百分比为质量百分比。
本发明的一个优选的技术方案,当所述发酵结束后加入氨水时,所述氨水的加入量为100~300g/L。
本发明的一个优选的技术方案,当所述发酵时和发酵结束后加入氨水时,所述发酵时氨水的加入量为50~200g/L,且所述发酵结束后氨水的加入量为100~300g/L。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的温度为28~32℃。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的通风比为0.3~0.7vvm。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的罐压为0.05~0.14
MPa,所述罐压为表压。
本发明的一个优选的技术方案,菌体生长期控制pH为3.0~6.5,发酵产酸期控制pH为5.0~8.0。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的溶氧为10%以上。
本发明的一个优选的技术方案,发酵12~18h时第一次批加底物,之后当发酵液中底物含量低于5%~8%时再批加底物,发酵过程中可补加葡萄糖。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的周期为130~180h。
本发明的一个优选的技术方案,所述底物包括C9-C18的烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;更优选为C11、C12、C13、 C14、C15和C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种;
本发明的一个优选的技术方案,所述长链二元酸铵盐的结构式为: H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4,其中4≤n≤18。所述长链二元酸铵盐包括长链二元酸一铵盐和/或长链二元酸二铵盐;优选包括:壬二酸一铵盐和/或二铵盐、癸二酸一铵盐和/或二铵盐、十一碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十二碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十三碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十四碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十五碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十六碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十七碳二元酸一铵盐和/或二铵盐,和十八碳二元酸一铵盐和/或二铵盐中的一种或多种。
本发明的一个优选的技术方案,所述长链二元酸铵盐中,长链二元酸二铵盐的纯度为90%以上,一般而言为90%-100%,可以为:90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,所述百分比为占长链二元酸胺盐总量的质量百分比。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的菌种包括:热带假丝酵母(CandidaTropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵的培养基包括:碳源、氮源、磷源、微量金属元素源和生长因子。
其中,所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、***糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种。所述碳源的浓度优选10~60g/L。
其中,所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种。所述氮源的浓度优选1~10g/L。
其中,所述磷源包括或者是磷酸正盐、磷酸一氢盐和磷酸二氢盐中的一种或多种;优选包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵和磷酸二氢钠中的一种或多种。所述磷源的浓度优选1~10g/L。
其中,所述微量金属元素包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种;优选地,所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种。每种所述微量元素的浓度优选0.1~50ppm。
其中,所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种;优选地,所述生长因子包括或者是维生素B1、维生素B2、维生素C和生物素中的一种或多种。每种所述生长因子的浓度优选 0.01~1ppm。
本发明的一个优选的技术方案,所述发酵培养基为水溶液培养基;优选地,所述发酵培养基包含如下成分:葡萄糖10~60g/L、硝酸钾 0.2~6g/L、磷酸二氢钾0.2~6g/L、硫酸铵0.5~3g/L以及硫酸镁0.5~6g/L。
本发明的目的之二,提供如上所述长链二元酸铵盐溶液的制备方法制得的长链二元酸铵盐溶液。
本发明的目的之三,提供一种发酵液或其处理液,其包括长链二元酸铵盐,所述长链二元酸铵盐的浓度为80~180g/L。
所述发酵液中包括但不仅限于水分、长链二元酸盐、菌体和其它杂质。所述的发酵处理液是除去发酵液中的除长链二元酸铵盐以外的一种或者多种其它组分或降低其含量后得到的液体。可以通过陶瓷膜过滤、离心机、絮凝过滤、活性炭过滤等手段除去发酵液中除长链二元酸盐以外的一种或者多种其它组分或降低其含量来获得发酵处理液。
本发明的目的之四,提供一种长链二元酸铵的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将长链二元酸铵从如上所述的长链二元酸铵盐溶液,或者,如上所述的发酵液或其处理液中分离出来,即可。
本发明的一个优选的技术方案,;所述分离的方法包括:蒸发干燥。
本发明的一个优选的技术方案,所述长链二元酸铵中包括菌体或者不包括菌体。
本发明的目的之五,提供如上所述的长链二元酸铵盐溶液和/或长链二元酸铵在戊二胺发酵过程中的应用。
在上述应用中,长链二元酸铵盐溶液和/或长链二元酸铵可以作为营养物质、或者作为底物、或者作为pH调节剂应用,或者作为上述组合的应用,例如可以作为营养物质和底物应用。
在作为上述应用时,是以长链二元酸铵固体形式,或者以长链二元酸铵盐溶液的形式来应用,没有限定,只要保证实现其作为营养物质、或者作为底物、或者作为pH调节剂的效果即可。
所述营养物质可以为N源。当长链二元酸铵盐和/或长链二元酸铵作为N源使用时,发酵培养基的配方可以为:KH2PO4 0.02%-0.06%, MgSO4·7H2O 0.10%-0.50%,MnSO4·H2O 0.01%-0.05%,长链二元酸铵盐0.1%-1.0%,葡萄糖1.0%-6.0%,玉米浆0.1%-0.5%,苏氨酸 0.01%-0.03%,所述百分比为质量体积比,g/100mL,所述ppm为 g/10000mL。
当作为底物应用时,在戊二胺发酵时,补加补料培养基,所述补料培养基包括:长链二元酸铵盐溶液和/或长链二元酸铵5%-60%和葡萄糖10%-80%,所述百分比为质量体积比,g/100mL。
其中,长链二元酸铵盐溶液的量以有效成分长链二元酸铵的量计。
本发明的工艺制得的长链二元酸铵盐溶液和/或长链二元酸铵,可以用于聚酰胺盐溶液制备过程中作为微生物发酵的能源、底物以及 pH调节剂使用,并且能够在发酵液中初步形成可后续聚合的长链二元酸胺盐(即尼龙盐),整个过程不会在发酵体系中留下过多的无机酸根离子,从而避免了后续对无机离子的处理过程,大大降低了后续处理工作和成本,减少了无机离子对环境的损害。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细说明,以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出,实施例用于理解本发明的构思,本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中, pH自然,28~32℃下,200~250rpm、振幅26~50mm摇床培养1~2天;
YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨。 pH7.0-7.5。
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0~6.8,28~32℃下,通风比0.3~0.7vvm,罐压 0.05~0.14MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养15~30h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620 为0.5~1.0。
种子培养基包括:10-30g/L蔗糖,1.5-10g/L玉米浆液,1-10g/L 酵母提取液,4-12g/L KH2PO4,0.5-5g/L脲,0-30mL/L底物。所述培养基用水制备,并在121℃下灭菌20min。脲单独灭菌,110℃下灭菌 15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合,作为种子培养基使用。
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵过程控制温度28~32℃,通风比为0.3~0.7vvm,罐压为0.05~0.14MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0~6.5,发酵最初12~18h内控制pH 4.0~5.0,发酵12~18h直至发酵结束控制 pH为5.0~8.0;发酵12~18h时第一次批加底物,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物,发酵过程中可补加葡萄糖;总发酵周期130-180h。
发酵过程或发酵结束时补加液氨和/或氨水;发酵过程补加氨水方式可以是整个发酵过程连续补加,也可以是间歇分批补加,也可以是发酵结束一次性补加。
底物包括C9~C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;优选包括C11~C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种;
长链二元酸铵盐可以是C9~C18的长链二元酸铵盐。
发酵的菌种包括:热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake),例如:热带假丝酵母(Candida Tropicalis) (保藏号为CCTCC M203052),或者热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145(保藏号为CCTCC M 2011192),或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4013(保藏号为CCTCC M2011486),或者热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CAT H1614(保藏号为CCTCC M 2013143),或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4014(保藏号为CCTCC M2011487),或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4012 (保藏号为CCTCC M2011485),或者清酒假丝酵母(Candidasake) CATH4016(保藏号为CCTCC M2011488),或者清酒假丝酵母 (Candidasake)CATH430(保藏号为CCTCCM2011489)。
所述发酵培养基包括:碳源,10~60g/L;氮源,1~10g/L;磷源, 1~10g/L;微量金属元素源,每种均为0.1~50ppm;生长因子,每种均为0.01~1ppm。
碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、***糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种;氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种;磷源包括或者是磷酸正盐、磷酸一氢盐和磷酸二氢盐中的一种或多种;优选包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵和磷酸二氢钠中的一种或多种;微量金属元素源,包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种;优选地,所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种;生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种;优选地,所述生长因子包括或者是维生素 B1、维生素B2、维生素C和生物素中的一种或多种。
下面通过实施例对本发明进行详细说明,以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出,实施例用于理解本发明的构思,本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
如没有特别说明,本发明所述的浓度均为质量百分比浓度。
1、发酵液液中长链二元酸铵盐浓度的检测方法:
取定量发酵液经过预处理、酯化后进气相检测,采用内标法计算长链二元酸的含量,再根据长链二元酸二铵的分子量折算长链二元酸二铵的浓度。
2、发酵液中硫酸根离子的检测方法参考:GB/T 13025.8-2012。
在本发明中,除非特别指出,在组分、反应条件、浓度等参数中使用“大约”来修正数值。因此在说明书和权利要求书中的数值参数是一个近似值,取决于本发明所期望的性能。至少,不应认为是对本发明权利要求保护的等同原则应用的限制。至少,每个参数的数值运用四舍五入,根据记载的有效数字的位数来确定。虽然在具体实施例中的数值尽可能做到准确,但是由于实验测试方法的***误差必然导致任何数据都会有一定的误差。
实施例1
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH 自然,29℃下,220rpm、振幅26~50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0-7.5;
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养18h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15;
种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液, 8g/L KH2PO4,3g/L脲,15mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌 20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖50g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸铵0.3g/L,硫酸镁1g/L;
发酵过程控制温度29℃,通风比为0.5vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,发酵最初12h内控制pH4.0~5.0,发酵12h直至发酵结束控制pH为 5.0~8.0;发酵12h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物,发酵过程中补加葡萄糖;发酵过程中以0.35g/h/L的速度恒速连续补加氨水(氨气含量25%),氨水的加入量为50g/L。
总发酵周期145h;得到十二碳二元酸铵盐溶液,浓度为80g/L。
实施例2
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH 自然,29℃下,220rpm、振幅26~50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0-7.5;
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养18h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15;
种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液, 8g/L KH2PO4,3g/L脲,15mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌 20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖30g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L,硫酸镁0.5g/L;
发酵过程控制温度29℃,通风比为0.5vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,发酵最初18h内控制pH4.0~5.0,发酵18h直至发酵结束控制pH为 5.0~8.0;发酵18h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物;发酵过程中0~8h以1g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),8~18h以2g/h/L的速度连续补加氨水 (氨气含量25%),18~48h以1g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量 25%),48~120h以0.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),氨水的加入量为100g/L。
总发酵周期150h;得到十二碳二元酸铵盐溶液,浓度为150g/L。
实施例3
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH 自然,29℃下,220rpm、振幅26~50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0-7.5;
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养18h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15;
种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液, 8g/L KH2PO4,3g/L脲,15mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌 20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖30g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L,硫酸镁0.5g/L;
发酵过程控制温度29℃,通风比为0.5vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,发酵最初18h内控制pH4.0~5.0,发酵18h直至发酵结束控制pH为 5.0~8.0;发酵18h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物;发酵过程中以0.7g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),发酵结束后补加100g/L氨水,氨水的总加入量为210g/L。
总发酵周期155h;得到十二碳二元酸铵盐溶液,浓度为180g/L。
实施例4
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH 自然,29℃下,220rpm、振幅26~50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0-7.5;
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养18h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15;
种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液, 8g/L KH2PO4,3g/L脲,15mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌 20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖40g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸铵2g/L,硫酸镁1.5g/L;
发酵过程控制温度29℃,通风比为0.5vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,发酵最初18h内控制pH4.0~5.0,发酵18h直至发酵结束控制pH为 5.0~8.0;发酵18h时第一次批加底物正十二烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物;发酵过程中以0.12g/h/L的速度连续补加液氨,液氨的加入量为20g/L。
总发酵周期165h;得到十二碳二元酸铵盐溶液,浓度为160g/L。
实施例5
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH 自然,29℃下,220rpm、振幅26~50mm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0-7.5;
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养18h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15;
种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液,8g/L KH2PO4,3g/L脲,15mL/L底物,用水制备,并在121℃下灭菌 20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖30g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L,硫酸镁0.5g/L;
发酵过程控制温度29℃,通风比为0.5vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,发酵最初18h内控制pH4.0~5.0,发酵18h直至发酵结束控制pH为 5.0~8.0;发酵18h时第一次批加底物正十三烷烃,之后当发酵液中底物含量低于5%时再批加底物;发酵过程中0~8h以1g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),8~18h以2g/h/L的速度连续补加氨水 (氨气含量25%),18~48h以1g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量 25%),48~120h以0.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),氨水的加入量为95g/L。
总发酵周期155h;得到十三碳二元酸铵盐溶液,浓度为145g/L。
实施例6
1、菌种活化:
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中,pH 自然,29℃下,220rpm摇床培养1天;YPD培养基包括:20g/L葡萄糖,10g/L酵母浸粉,20g/l蛋白胨;pH7.0;
2、种子罐培养,制备种子液:
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中,接种后发酵体系的起始pH值为6.0,29℃下,通风比0.5vvm,罐压0.1MPa,保持一定的搅拌速度,控制种子培养过程的溶解氧大于等于10%,培养 18-20h,培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15;
种子培养基包括:20g/L蔗糖,8g/L玉米浆液,5g/L酵母提取液, 8g/L KH2PO4,3g/L脲,用水制备,并在121℃下灭菌20min;脲单独灭菌,110℃下灭菌15min,冷却后与灭过菌的其他成分混合;
3、发酵:
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中,发酵培养基包括:葡萄糖40g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸铵4g/L,硫酸镁1g/L;
发酵过程控制温度29℃,通风比为0.3vvm,罐压为0.1MPa(表压),保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10%,发酵起始控制pH为6.0,发酵最初18h内控制pH4.0~5.0,发酵18h直至发酵结束控制pH为 5.0~8.0;发酵18h时第一次批加底物正十碳烷烃,之后当发酵液中底物含量低于2%时再批加底物;发酵过程中0~5h以0.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),5~18h以2g/h/L的速度连续补加氨水 (氨气含量25%),18~48h以1.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),48~120h以0.4g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25%),氨水的加入量为100g/L。
总发酵周期165h;得到十碳二元酸铵盐溶液,浓度为120g/L。
实施例7
实施例1制得的十二碳二元酸铵盐溶液在制备十二碳二元酸戊二胺盐溶液中的应用
种子培养基:KH2PO4 0.5%,MgSO4·7H2O 0.35%,MnSO4·H2O 16 ppm,十二碳二元酸铵盐0.4%,葡萄糖5%,玉米浆0.30%,苏氨酸 0.045%,亮氨酸0.025%;
发酵培养基:KH2PO4 0.04%,MgSO4·7H2O 0.30%,MnSO4·H2O 0.010%,十二碳二元酸铵盐0.4%,葡萄糖2.0%,玉米浆0.50%,苏氨酸0.030%;
发酵补料培养基:葡萄糖20%,十二碳二元酸铵盐5%。
菌株:发酵菌株为CIB132-3,构建方法见申请号为 PCT/CN2015/094121、公开号为WO2017/079872A1、公开日为2017 年5月18日的PCT申请,具体见该专利申请说明书实施例1-17,例如:实施例16和实施例17的CNB132-3的构建方法;
(1)种子罐培养:10L发酵罐(7L),发酵菌株为大肠杆菌 CIB132-3,接种比2%,通气比0.8vvm,温度39℃,转速400rpm,罐压0.05MPa,氨水控pH为7.0,在菌浓OD562达1.00后,接入发酵罐;
(2)发酵罐培养:10L发酵罐(7L),发酵菌株为CIB132-3,接种比20%,通气比0.8vvm,温度39℃,转速500rpm,罐压0.05 MPa,氨水控pH为7.0,发酵6h后流加配置好的补料培养基,发酵周期40h。
最终发酵液中,十二碳二元酸-戊二胺盐的浓度为270.63g/kg;硫酸根离子浓度为0.43g/kg。
实施例8
实施例5制得的十三碳二元酸铵盐溶液在制备十三碳二元酸戊二胺盐溶液中的应用
种子培养基:KH2PO4 0.4%,MgSO4·7H2O 0.25%,MnSO4·H2O 13.5ppm,癸二酸铵盐0.58%,葡萄糖15%,玉米浆0.27%,苏氨酸 0.035%,亮氨酸0.025%;
发酵培养基:KH2PO4 0.04%,MgSO4·7H2O 0.25%,MnSO4·H2O 0.017%,十三碳二元酸铵盐0.3%,葡萄糖3.5%,玉米浆0.50%,苏氨酸0.022%;
发酵补料培养基:葡萄糖50%,十三碳二元酸铵盐25%。
(1)种子罐培养:10L发酵罐(工作体积5.5L),发酵菌株为 CIB132-3,接种比2%,通气比0.4vvm,温度37℃,转速700rpm,罐压0.10MPa,氨水控pH为6.5,在菌浓OD562达1.00后,接入发酵罐。
(2)发酵罐培养:10L发酵罐(工作体积6L),发酵菌株为 CIB132-3(同实施例6),接种比20%,通气比0.4vvm,温度37℃,转速800rpm,罐压0.10MPa,氨水控pH为6.5,发酵5h后流加补料培养基,发酵周期为35h。
最终发酵液中十三碳二元酸-戊二胺盐的浓度为235.33g/kg,硫酸根离子含量为0.48g/kg。
对比例1
种子培养基:KH2PO4 0.5%,MgSO4·7H2O 0.35%,MnSO4·H2O 16 ppm,硫酸铵0.4%,葡萄糖5%,玉米浆0.30%,苏氨酸0.045%,亮氨酸0.025%;
发酵培养基:KH2PO4 0.04%,MgSO4·7H2O 0.30%,MnSO4·H2O 0.010%,硫酸铵0.4%,葡萄糖2.0%,玉米浆0.50%,苏氨酸0.030%;
发酵补料培养基:葡萄糖20%,硫酸铵5%。
(1)种子罐培养:10L发酵罐(7L),发酵菌株为CIB132-3,接种比2%,通气比0.8vvm,温度39℃,转速400rpm,罐压0.05MPa,氨水控pH为7.0,在菌浓OD562达1.00后,接入发酵罐;
(2)发酵罐培养:10L发酵罐(7L),发酵菌株为CIB132-3,接种比20%,通气比0.8vvm,温度39℃,转速500rpm,罐压0.05 MPa,氨水控pH为7.0,发酵6h后流加配置好的补料培养基,发酵周期40h。
最终发酵液中戊二胺的浓度为75.25g/kg,硫酸根离子含量为 56.73g/kg。
对比例2
种子培养基:KH2PO4 0.4%,MgSO4·7H2O 0.25%,MnSO4·H2O 13.5ppm,硫酸铵0.58%,葡萄糖15%,玉米浆0.27%,苏氨酸0.035%,亮氨酸0.025%;
发酵培养基:KH2PO4 0.04%,MgSO4·7H2O 0.25%,MnSO4·H2O 0.017%,硫酸铵0.3%,葡萄糖3.5%,玉米浆0.50%,苏氨酸0.022%;
发酵补料培养基:葡萄糖50%,硫酸铵25%。
种子罐培养方法:10L发酵罐(工作体积5.5L),发酵菌株为 CIB132-3,接种比2%,通气比0.4vvm,温度37℃,转速700rpm,罐压0.10MPa,氨水控pH为6.5,在菌浓OD562达1.00后,接入发酵罐。
发酵罐培养方法:10L发酵罐(工作体积6L),发酵菌株为CIB132-3,接种比20%,通气比0.4vvm,温度37℃,转速800rpm,罐压0.10MPa,氨水控pH为6.5,发酵5h后流加补料培养基,发酵周期为35h。
最终发酵液中戊二胺的浓度为55.25g/kg,硫酸根离子含量为 43.36g/kg。
Claims (11)
1.发酵法制备长链二元酸铵盐溶液的方法,所述发酵以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐中的一种或多种为底物,在所述发酵时和/或所述发酵结束后,加入液氨和/或氨水。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述液氨和/或氨水的加入方式为连续加入,或,间歇分批加入。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述氨水的加入量为50~500g/L,优选100~300g/L,所述氨水浓度为氨气含量25%以上,所述百分比为质量百分比;
和/或,所述液氨的加入量为12~125g/L,优选35~80g/L。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述连续加入为恒速加入,或,变速加入;所述恒速加入的加入速度为0.35~3.5g/h/L。所述变速加入的加入速度为0~3.5g/h/L;
当所述发酵结束后加入氨水时,所述氨水的加入量为100~300g/L;
当所述发酵时和发酵结束后都加入氨水时,所述发酵时氨水的加入量为50~200g/L,且所述发酵结束后氨水的加入量为100~300g/L。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述发酵的温度为28~32℃;所述发酵的通风比为0.3~0.7vvm;所述发酵的罐压为0.05~0.14MPa,所述罐压为表压;
所述发酵的菌种包括:热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述底物包括C9-C18的烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种;更优选为C11、C12、C13、C14、C15和C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种;
和/或,所述长链二元酸铵盐的结构式为:H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4,其中4≤n≤18;
所述长链二元酸铵盐包括长链二元酸一铵盐和/或长链二元酸二铵盐;优选包括:壬二酸一铵盐和/或二铵盐、癸二酸一铵盐和/或二铵盐、十一碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十二碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十三碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十四碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十五碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十六碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十七碳二元酸一铵盐和/或二铵盐,和十八碳二元酸一铵盐和/或二铵盐中的一种或多种;
和/或,所述长链二元酸铵盐中,长链二元酸二铵盐的含量为90%以上,一般而言为90%-100%,可以为:90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,所述百分比为占长链二元酸胺盐总量的质量百分比。
7.如权利要求1~6任一项所述方法制得的长链二元酸铵盐溶液。
8.一种发酵液或其处理液,其包括长链二元酸铵盐,所述长链二元酸铵盐的浓度为80~180g/L。
9.一种长链二元酸铵的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将长链二元酸铵从如权利要求7所述的长链二元酸铵盐溶液,或者,如权利要求8所述的发酵液或其处理液中分离出来,即可;所述分离的方法优选蒸发干燥。
10.权利要求7所述长链二元酸铵盐溶液和/或权利要求9所述长链二元酸铵在戊二胺发酵过程中的应用。
11.所述应用为作为营养物质、或者作为底物、或者作为pH调节剂的应用,或者作为营养物质和底物应用;
所述营养物质为N源;当长链二元酸铵盐和/或长链二元酸铵作为N源使用时,发酵培养基的配方可以为:KH2PO4 0.02%-0.06%,MgSO4·7H2O 0.10%-0.50%,MnSO4·H2O0.01%-0.05%,长链二元酸铵盐0.1%-1.0%,葡萄糖1.0%-6.0%,玉米浆0.1%-0.5%,苏氨酸0.01%-0.03%,所述百分比为质量体积比,g/100mL,所述ppm为g/10000mL;
当作为底物应用时,在戊二胺发酵时,补加补料培养基,所述补料培养基包括:长链二元酸铵盐溶液和/或长链二元酸铵5%-60%和葡萄糖10%-80%,所述百分比为质量体积比,g/100mL。
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