CN110540962B - 一种制备人定型内胚层细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备人定型内胚层细胞的方法，属于干细胞诱导与再生医疗技术领域。本发明的方法是将GDF3基因克隆到慢病毒载体，包装慢病毒；将包装后的慢病毒感染人体多潜能干细胞，抗性筛选获得稳定表达细胞系；使用小分子，诱导这种细胞系分化为内胚层细胞。本发明制备的内胚层细胞是通过GDF3诱导产生，且成本低廉，易于操作，可用于制备内胚层衍生细胞，并应用于组织工程，应用前景广阔。

Description

一种制备人定型内胚层细胞的方法

技术领域

本发明属于干细胞诱导与再生医疗技术领域，具体地说，涉及一种制备人定型内胚层细胞的方法。

背景技术

干细胞由于具有强大的增殖能力和分化为各种体细胞的潜能，因此是一种新的细胞来源，可以应用于再生医疗和组织工程。多潜能干细胞由于具有分化的全能性，其无限的增殖能力和发育为所有体细胞的能力也都得到充分证明，因此是一种非常有前景的细胞来源。人多潜能干细胞包括人胚胎(ES)干细胞和诱导多潜能(iPS)干细胞，其分化产生的内胚层细胞可以进一步发育为肝脏、肺、胰腺、肠和胃，因此在治疗脏器疾病或者开发相关的药物上有着广泛的用途。

内胚层细胞包括定型内胚层和胚外内胚层，能够定型发育为肝脏、肺、胰腺、肠和胃等组织的干细胞内胚层，称为定型内胚层细胞。

转化生长因子beta(Transforming Growth Factor beta，TGFb)超家族成员包括TGF-beta蛋白,骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs),生长分化因子蛋白(Growth Differentiation Factors，GDFs),胶质衍生的神经生长因子(Glial-derivedNeurotrophic Factors，GDNFs)等。在小鼠胚胎发育中，TGFb家族蛋白Activin A，Nodal和TGFb1以及GDF家族的GDF3，GDF8对于内胚层的形成有重要作用。应用人多潜能干细胞的分化上，Activin A、Nodal、TGFb1和GDF8均能诱导人多潜能干细胞分化为内胚层细胞。但是不同的蛋白诱导产生的内胚层细胞存在一定差异，表现在脂肪代谢和糖代谢差异。在目前诱导人多潜能干细胞向内胚层细胞分化的过程中，使用高浓度的重组Activin A蛋白是比较常见的一种方法。但是对于GDF3诱导人多潜能干细胞分化为内胚层细胞则没有报道。因此对于GDF3诱导分化产生的内胚层细胞的性质和分化特征并没有进行研究。

Tet-On诱导表达的***是一种可调控的基因表达体系。在没有四环素类物质存在时，外源基因不会开启表达。当加入四环素类似物比如强力霉素(Doxcylin,Dox)时，rtTA可以结合到启动子上从而开启外源基因的表达，因此是一种很方便的调控表达体系。通常Tet-On表达***由两个质粒组成，其中一个提供调控蛋白rtTA，另一个提供弱启动子驱动的外源基因。可以将两个质粒合并到一个质粒上，即成为Tet-One载体，方便转基因的表达。

慢病毒载体是经过改造后的假病毒，其本身不能复制，需要在包装细胞系比如293T细胞里组装出来。其宿主广泛，可以高效的感染人多潜能干细胞，并能逃避甲基化抑制，从而稳定的表达外源基因。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备人定型内胚层细胞的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：构建TetOne-Modified-GDF3的单一慢病毒载体；包装TetOne-Modified-GDF3的慢病毒；感染人多潜能干细胞系，并加入嘌呤霉素杀死未转入基因的细胞；扩增多潜能干细胞，然后传代扩增，扩增后的细胞在Dox作用下，诱导分化为内胚层细胞。

具体地，本发明提供了一种制备人定型内胚层细胞的方法，是在人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中表达或过表达GDF3基因。

GDF3基因是本领域已知的生长分化因子3(Growth Differentiation Factor 3，GDF3)，其是TGFb超家族的一个成员，其基因序列、编码的蛋白序列为本领域公知技术，技术人员可以选择GDF3基因的功能域片段采用基因工程的方法使该基因或其功能片段在多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中表达或过表达，均能实现制备人定型内胚层细胞的目的。

本发明的实施例中，所述GDF3基因来自人干细胞cDNA文库，经测序确认与NM_020634.2公开的GDF3基因cDNA序列一致。本发明所述的GDF3基因cDNA序列具有以下：

(a)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或***形成的与SEQ ID NO.2所示序列编码相同功能蛋白序列；

(c)在严格条件下能够与如(a)或(b)所述的核苷酸序列杂交并编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

进一步地，本发明提供了制备人定型内胚层细胞的方法，包括以下步骤：

(1)构建含有GDF3基因的表达盒，将表达盒连接至载体，构建含有GDF3基因表达盒的载体，所述表达盒含有或不含有强启动子；或将GDF3基因***慢病毒载体中，并对慢病毒载体进行包装；

(2)将步骤(1)的载体转入人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞，并加抗生素筛选，获得稳定整合的干细胞；

(3)将步骤(2)的细胞加入小分子，诱导分化为人定型内胚层细胞。

上述方法的步骤(1)所述的慢病毒载体为Tetone-Modifed，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明中所述慢病毒载体Tetone-Modifed通过以下方法制备得到，以pLVX-TetOne-Puro质粒为骨架载体，去除了pLVX-TetOne-Puro质粒上一段SV40 polyA signal序列，并且将启动嘌呤霉素表达的SV40启动子更换为了T2A序列，改造后的质粒命名为TetOne-Modified。

步骤(1)中，将GDF3基因***慢病毒载体的步骤包括：

1)Tetone-Modifed质粒用

(R3136S，New England Biolabs)和

(R3101S，New England Biolabs)双酶切线性化。之后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收线性化的质粒。

2)从实验室自行制备的肝细胞cDNA文库中扩增GDF3 cDNA序列。引物序列为：

F:TCCTACCCTCGTAAAGATGCTTCGTTTCTTGCCAGATTTGGC

R:CCAGTTTATCGACTTGCTACCCACACCCACATTCATCGACTA。

3)将扩增的GDF3 cDNA序列(SEQ ID NO.2)连入线性化的Tetone-Modifed质粒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，全式金生物技术有限公司)。

4)筛选阳性克隆并测序验证。测序正确的慢病毒命名为Tetone-Modifed-GDF3。

对慢病毒Tetone-Modifed-GDF3进行包装，本发明实施例的方法为：人胚胎肾上皮细胞系293T细胞的传代，当细胞汇合度达到80％-90％时可以进行病毒包装。离心管依次加入30μg DNA、1ml的HBS、67μl的CaCl₂。病毒质粒DNA用量pTetOne-Modified-GDF3 15μg，pMDLg/pRRE，pRSV REV，pVSVg(前述质粒均购自ATCC公司)均为5μg。震荡混匀后室温静置15分钟。轻轻将DNA、HBS、CaCl₂混合液一滴一滴均匀加入准备好的293T细胞培养皿中，十字法和八字法交替摇匀，使混合液在培养基中充分分散。在37℃二氧化碳培养箱中培养过夜，12小时后更换新鲜培养基。(每次包毒设置1个GFP对照组，转染效果较好的情况下，12小时换液时，GFP对照组应该有60％以上细胞会发荧光。反之表明转染试剂或转染过程有问题。)换液后36小时收病毒，将培养基收集到50mL离心管，1000转/分钟，3分钟离心。将上清用0.22μm滤膜过滤即为所需慢病毒毒液。将不同病毒按需求分装于15mL和1.5mL离心管，冻存于-80℃冰箱中备用。

本发明方法中，所述人诱导多潜能干细胞为iPS细胞；或任一种NIH编号的人胚胎干细胞系，包括BG01、BG02、BG03、BG04、SA01、SA02、SA03、ES01、ES02、ES03、ES04、ES05、ES06、TE03、TE32、TE33、TE04、TE06、TE62、TE07、TE72、UC01、UC06、WA01、WA07、WA09、WA13、WA14。

本发明方法的步骤(2)中所述抗生素为嘌呤霉素；或，步骤(3)中所述的小分子为四环素类抗生素，优选强力霉素。

所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为0.5-2μg/ml，优选1μg/ml；所述强力霉素的使用浓度为10-10000ng/ml，优选100ng/ml。

本发明还提供了一种人定型内胚层细胞或其衍生细胞，其含有高拷贝数的GDF3基因或含有能够表达GDF3基因的表达载体，所述GDF3基因的cDNA序列具有以下：

(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或***形成的与SEQ ID NO.2所示序列编码相同功能蛋白序列；

(3)在严格条件下能够与如1)或2)所述的核苷酸序列杂交并编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明提供了GDF3基因在诱导人多潜能干细胞分化为定型内胚层细胞中的应用。

本发明的方法是将GDF3基因克隆到慢病毒载体，包装慢病毒；将包装后的慢病毒感染人体多潜能干细胞，抗性筛选获得稳定表达细胞系；使用小分子，诱导这种细胞系分化为内胚层细胞。基于本发明的技术方案，本发明至少取得以下有益效果：

(1)本发明的人定型内胚层细胞制备方法是采用较少量的培养基质和分化蛋白因子，在较短时间内能够分化出更多的定型内胚层细胞，成本低廉，易于操作，节省耗材、降低成本，是现有技术中制备人定型内胚层细胞平均成本的三分之一。

(2)本发明方法是通过GDF3诱导产生内胚层细胞，且制得的内胚层细胞产量高。现有技术采用A蛋白介入分化的方式分化效率能达60-80％，并且成本高，GDF3蛋白诱导分化效率更低不到10％；而本发明采用GDF3病毒基因改性分化，能够达到90％以上的分化效率。

本发明方法中巧妙地引入嘌呤霉素和强力霉素，采用这两抗生素尤其是嘌呤霉素是为了杀死不表达GDF3的杂细胞，不采用这两种抗生素会导致杂细胞生长很快很多，导致分化效率急剧下降。实验表明不采用嘌呤霉素和强力霉素，使分化效率降低到28％、33％。而采用本发明的分化方法使得分化出正常的一个ips细胞会表达GDF3同时也会表达一个抗嘌呤霉素的基因，并且分化效率达到90％以上。

(3)本发明方法制得的定型内胚层细胞具有优异的特性，特别在脂肪代谢、糖代谢等方面性能优于常见方法制得的内胚层细胞，所制得的细胞应用于组织工程领域，前景广阔、市场价值巨大。

附图说明

图1为改造pLVX-TetOne-Puro质粒示意图。

图2为TetOne-Modified质粒图谱。

图3为病毒感染，并加嘌呤霉素筛选后的iPS细胞形态。

图4为TetOne-Modified-GDF3病毒感染的iPS细胞在Dox存在下分化3天的细胞形态。

图5为TetOne-Modified-GDF3病毒感染的iPS细胞在Dox存在下分化3天的内胚层标记蛋白染色结果。左图：染色前细胞总数，右图：染色后内胚层细胞数量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本实施例中所用的方法包括分子克隆、病毒包装和感染、免疫荧光染色、qRT-PCR、iPS细胞培养及分化等均为常规方法，使用的各种试剂和原料均为常见材料，其可通过商业途径购买得到。本技术方案只是提供了一种实施方式，不应作为对发明应用的限制。

实施例1 GDF3基因克隆到TetOne-Modified慢病毒载体

1、TetOne-Modified质粒构建：

TetOne-Modified质粒是在pLVX-TetOne-Puro质粒(Clontech公司，图片见图1)骨架上改造而来。去除了pLVX-TetOne-Puro质粒上一段SV40 polyAsignal序列，并且将启动嘌呤霉素表达的SV40启动子更换为了T2A序列，改造pLVX-TetOne-Puro质粒示意图见图1。

本发明发现并非任意的改造获得的质粒都适用于转入动物细胞并取得良好的效果，发明人通过大量实验筛选后发现，上述质粒的改造能转入哺乳动物细胞，并取得优异的效果。SV40 polyA signal序列和SV40启动子序列均来源于SV40病毒，若转入哺乳动物细胞内属于外源性序列。减少外源性序列可提高质粒转入哺乳动物细胞的安全性。改造后的质粒命名为TetOne-Modified，其序列如SEQ ID NO.1所示，TetOne-Modified质粒图谱见图2。

2、TetOne-Modified-GDF3构建过程：

人源GDF3 cDNA序列扩增自肝细胞cDNA，序列如SEQ ID NO.2所示。经测序确认与已报道GDF3 cDNA序列一致(参照序列NM_020634.2)。构建流程如下：

(1)Tetone-Modifed质粒用

(R3136S，New England Biolabs)和

(R3101S，New England Biolabs)双酶切线性化。之后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收线性化的质粒。

(2)从实验室自行制备的肝细胞cDNA文库中扩增GDF3 cDNA序列。引物序列为：

F:TCCTACCCTCGTAAAGATGCTTCGTTTCTTGCCAGATTTGGC

R:CCAGTTTATCGACTTGCTACCCACACCCACATTCATCGACTA

(3)将扩增的GDF3 cDNA序列连入线性化的Tetone-Modifed质粒。(pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit，全式金生物技术有限公司)

(4)筛选阳性克隆并测序验证。测序结果显示克隆序列正确，无突变克隆。

实施例2 TetOne-Modified-GDF3慢病毒包装

使用试剂盒：迈晨科技的增强型磷酸钙转染试剂，内含HBS和CaCl₂。

1、人胚胎肾上皮细胞系商用293T细胞可以购自ATCCA公司的传代：将8×10⁶个293T细胞铺到十厘米的细胞培养皿中，培养基为高糖DMEM加10％胎牛血清(Fetal BovineSerum，FBS，Vistech)。观察细胞形态，生长状态良好的细胞包毒效果更好。293T细胞正常生长形态为细胞饱满、大概三四个突起，细胞内颗粒较少，细胞之间的边界明显，不发生聚团或呈现梭状形态。当细胞汇合度达到80--90％时可以进行病毒包装。

以下操作在生物安全柜(Esco)里进行操作。

2、准备1.5ml离心管依次加入30μg DNA、1ml的HBS、67μl的CaCl₂。表1体现了30μgDNA的组成，组分为常用组分。

表1病毒质粒DNA用量

pTetOne-Modified-GDF3	15μg
		pMDLg/Prre	5μg
pRSV REV	5μg
		pVSVg	5μg

3、震荡混匀后室温静置15分钟。轻轻将DNA/HBS/CaCl₂混合液一滴一滴均匀加入准备好的293T细胞培养皿中，十字法和八字法交替摇匀，使混合液在培养基中充分分散。

4、在37℃二氧化碳培养箱中培养过夜，12小时后更换新鲜培养基。每次包毒设置1个GFP对照组，转染效果较好的情况下，12小时换液时，GFP对照组应该有60％以上细胞会发荧光。反之表明转染试剂或转染过程有问题。

5、换液后36小时收病毒，将培养基收集到50mL离心管，1000转/分钟，3分钟离心。将上清用0.22μm滤膜过滤即为所需慢病毒毒液。将不同病毒按需求分装于15mL和1.5mL离心管，冻存于-80℃冰箱中备用。

实施例3 TetOne-Modified-GDF3慢病毒感染iPS细胞

1、iPS细胞复苏、培养和传代

包被Geltrex：将Geltrex(Thermo Fisher Scientific)放置在冰上融化，然后用冰冷的DF12(Thermo Fisher Scientific)稀释到2mg/ml。加入5ml到10cm培养皿里，37℃放置30分钟到4小时。

配制PGM1：PGM1培养基购自赛贝生物，将添加物在4℃融化，加入基础培养基中，得到PGM1培养基。取12ml PGM1，加入5μM小分子Y27632(Selleck，CAS号：129830-38-2)。将水浴锅加热到37℃。取出冻存的iPS细胞，购自clonetech公司，迅速的放入水浴锅，轻轻摇晃，知道冰块完全融化。擦干冻存管。将细胞轻轻转移到15ml离心管中。逐滴加入5ml含有Y27632的PGM1，边加边轻轻摇晃。1000转/分离心3分钟。弃去上清，加入7ml含有Y27632的PGM1，重悬细胞。取出Geltrex包被的培养皿，吸去上清。将细胞接种到培养皿中，摇晃培养皿使细胞均匀分布在培养皿中。将细胞放入含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃培养。每天给细胞换液。4-5天后，细胞涨到80％-90％汇合度时，将细胞传代。把要传代的细胞皿的上清吸掉，用DPBS洗一次。加入3ml乙二胺四乙酸(Versene)，(购自Thermo FisherScientific)，37℃放置2分钟。弃去Versene，用含有5μM Y27632的PGM1培养基将细胞轻轻吹打下来。取1/10—1/15的细胞，接种到Geltrex包被的培养皿中。每个培养皿加入7ml含有Y27632的PGM1培养基。摇晃培养皿使细胞均匀分布在培养皿中，放回37℃培养箱，至少2-3小时不动。

2、TetOne-Modified-GDF3慢病毒感染iPS细胞

将储存于-80℃的实施例2包装后的TetOne-Modified-GDF3慢病毒取出，在冰上融化。

在生物安全柜里，将iPS细胞传代，接种到Geltrex包被的培养皿。同时加入3ml病毒上清，放入细胞培养箱培养。24小时后，在生物安全柜里，移除含有病毒上清的培养基。用DF12洗三遍，加入普通PGM1培养基培养细胞。24小时后，加入含有1μg/ml嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)的PGM1培养基。每天换液，培养5天。细胞长到80％-90％汇合度时，将细胞传代。嘌呤霉素筛选后的iPS细胞形态见图3。

实施例4强力霉素诱导TetOne-Modified-GDF3 iPS细胞分化为内胚层细胞

在传代后4-5天，待iPS细胞长到80-90％汇合度时可以用于传代分化。用Geltrex包被6孔板(Falcon)，置于37℃孵育30分钟到4小时。将细胞用PBS洗一遍，加入3mlAccutase(Thermo Fisher Scientific)37℃孵育两分钟。加入3ml PGM1培养基，将iPS细胞轻轻吹打下来，转移到15ml离心管(Falcon)中。1000转/分钟离心3分钟。弃去上清，用5mlPGM1+100ng/ml强力霉素(Doxcyclin，Sigma-Aldrich)培养基重悬，计数，稀释到1.4×10⁶/ml。强力霉素的使用浓度可以是10-10000ng/ml，以100ng/ml最佳。将细胞接种到Geltrex包被的6孔板中，每孔1.5ml，相当于每孔2.1×10⁶细胞。

在大约18小时后，细胞汇合度达到95％以上，用1640培养基(Thermo FisherScientific)洗一遍，然后换为1640+2％B27(不含Insulin,Thermo Fisher Scientific)+100ng/ml强力霉素+3μM CHIR99021(Selleck)。24小时后，将培养基换为1640+2％B27(不含Insulin)+100ng/ml强力霉素。这时候会出现大量细胞死亡，属正常现象。如果死细胞太多，可以用1640培养基洗一遍后再换液。每天换液，连续1-5天。如果细胞死亡量大，则可以加入含有0.1％-2％Insulin的试剂，比如0.5％的ITS(Thermo Fisher Scientific)。在分化的第二天即可见内胚层细胞的出现，以第三天为最佳。TetOne-Modified-GDF3病毒感染的iPS细胞在Dox存在下分化3天的细胞形态图见图4。

同时本实施例还设置了对比实例，在上述方法中，不添加嘌呤霉素、强力霉素，导致分化效率急剧下降，重复多次试验发现分化效率降低到28％、33％。

本发明的分化方法使得分化出正常的一个ips细胞会表达GDF3同时也会表达一个抗嘌呤霉素的基因，本发明通过添加嘌呤霉素杀死不表达GDF3(即也不表达抗嘌呤霉素基因)的杂细胞，以保留仅存的表达GDF3的符合要求的IPS细胞，进而有利于高效筛选出目标细胞。

实施例5内胚层细胞的鉴定

在分化的第三天将细胞取出，吸去培养基，加入PBS(Sigma-Aldrich)洗一遍。加入4％PFA(Solarbio)，室温放置20分钟用PBS洗三遍。加入含有0.1％Triton(Sigma-Aldrich)+3％BSA(Sigma-Aldrich)的PBS，室温放置45分钟。加入羊抗人ALB抗体(Bethyl，1:1000稀释)室温孵育1小时，然后加入FITC标记的驴抗羊二抗(Jackson ImmunoResearch，1:1000稀释)室温孵育1小时。加入DAPI(Sigma-Aldrich)室温孵育5分钟，用PBS洗三遍，加入PBS，在荧光显微镜下拍照。

通过分化前后染色的对比分化细胞的占比，不同细胞核染色结果不同，通过定向染色对比分化后细胞核与分化前细胞核的比例，可得知分化效果。TetOne-Modified-GDF3病毒感染的iPS细胞在Dox存在下分化3天的内胚层标记蛋白染色结果见图5。图5是分化效率的染色结果图，左图：染色前细胞总数，右图：染色后内胚层细胞数量，结果说明本发明方法制备人定型内胚层细胞的分化效率达到80％以上。

本发明分化获得的肝细胞具有更好的脂代谢和糖代谢性能，经本发明的肝细胞与普通A蛋白介入分化的方式分化的肝细胞进行葡萄糖氧化法检测，在1.0g/L的葡萄糖培养液中培养24h检测培养液内葡萄糖的含量，在初始浓度相同的情况下，明显本发明细胞培养液中葡萄糖浓度为0.47g/L，普通A蛋白介入分化的肝细胞培养液葡萄糖浓度0.71g/L。显然本发明方法分化的细胞具有更好的糖代谢能力。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京协同创新研究院

<120> 一种制备人定型内胚层细胞的方法

<130> KHP191113162.5

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga actacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgacttggat ccgccggcac cggtgtatac gggaattctt 2220

tacgagggta ggaagtggta cggaaagttg gtataagaca aaagtgttgt ggaattgaag 2280

tttactcaaa aaatcagcac tcttttatag gcgccctggt ttacataagc aaagcttata 2340

cgttctctat cactgatagg gagtaaactg gatatacgtt ctctatcact gatagggagt 2400

aaactgtaga tacgttctct atcactgata gggagtaaac tggtcatacg ttctctatca 2460

ctgataggga gtaaactcct tatacgttct ctatcactga tagggagtaa agtctgcata 2520

cgttctctat cactgatagg gagtaaactc ttcatacgtt ctctatcact gatagggagt 2580

aaactcgagg tgataattcc acggggttgg ggttgcgcct tttccaaggc agccctgggt 2640

ttgcgcaggg acgcggctgc tctgggcgtg gttccgggaa acgcagcggc gccgaccctg 2700

ggtctcgcac attcttcacg tccgttcgca gcgtcacccg gatcttcgcc gctacccttg 2760

tgggcccccc ggcgacgctt cctgctccgc ccctaagtcg ggaaggttcc ttgcggttcg 2820

cggcgtgccg gacgtgacaa acggaagccg cacgtctcac tagtaccctc gcagacggac 2880

agcgccaggg agcaatggca gcgcgccgac cgcgatgggc tgtggccaat agcggctgct 2940

cagcagggcg cgccgagagc agcggccggg aaggggcggt gcgggaggcg gggtgtgggg 3000

cggtagtgtg ggccctgttc ctgcccgcgc ggtgttccgc attctgcaag cctccggagc 3060

gcacgtcggc agtcggctcc ctcgttgacc gaatcaccga cctctctccc cagggggatc 3120

atcgaattac catgtctaga ctggacaaga gcaaagtcat aaactctgct ctggaattac 3180

tcaatggagt cggtatcgaa ggcctgacga caaggaaact cgctcaaaag ctgggagttg 3240

agcagcctac cctgtactgg cacgtgaaga acaagcgggc cctgctcgat gccctgccaa 3300

tcgagatgct ggacaggcat catacccact cctgccccct ggaaggcgag tcatggcaag 3360

actttctgcg gaacaacgcc aagtcatacc gctgtgctct cctctcacat cgcgacgggg 3420

ctaaagtgca tctcggcacc cgcccaacag agaaacagta cgaaaccctg gaaaatcagc 3480

tcgcgttcct gtgtcagcaa ggcttctccc tggagaacgc actgtacgct ctgtccgccg 3540

tgggccactt tacactgggc tgcgtattgg aggaacagga gcatcaagta gcaaaagagg 3600

aaagagagac acctaccacc gattctatgc ccccacttct gaaacaagca attgagctgt 3660

tcgaccggca gggagccgaa cctgccttcc ttttcggcct ggaactaatc atatgtggcc 3720

tggagaaaca gctaaagtgc gaaagcggcg ggccgaccga cgcccttgac gattttgact 3780

tagacatgct cccagccgat gcccttgacg actttgacct tgatatgctg cctgctgacg 3840

ctcttgacga ttttgacctt gacatgctcc ccggggctag cgagggcaga ggaagtcttc 3900

taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctggtac catgaccgag tacaagccca 3960

cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc cccgggccgt acgcaccctc gccgccgcgt 4020

tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgacccgga ccgccacatc gagcgggtca 4080

ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg 4140

cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg 4200

tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc 4260

aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca 4320

ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg 4380

gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca 4440

acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag 4500

gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg accgcgtctg gaacaatcaa 4560

cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt 4620

acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 4680

ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 4740

gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 4800

ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 4860

acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 4920

actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt 4980

gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 5040

gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt 5100

cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctggaat taattctgca 5160

gtcgagacct agaaaaacat ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg 5220

attgtgcctg gctagaagca caagaggagg aggaggtggg tttttccagt cacacctcag 5280

gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa 5340

aagaggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg 5400

atctaccaca cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc 5460

agatatccac tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta 5520

gaagaggcca ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg 5580

gatgacccgg agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac 5640

gtggcccgag agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag 5700

ggactttccg ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga 5760

gccctcagat cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga 5820

ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata 5880

aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta 5940

gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca 6000

tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata tcagagagtg agaggccttg 6060

acattgctag cgttttaccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc 6120

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 6180

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 6240

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 6300

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 6360

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 6420

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 6480

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 6540

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 6600

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 6660

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 6720

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 6780

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 6840

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 6900

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 6960

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7020

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 7080

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 7140

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 7200

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 7260

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 7320

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 7380

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 7440

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 7500

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 7560

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 7620

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 7680

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 7740

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 7800

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 7860

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 7920

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 7980

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 8040

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 8100

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 8160

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 8220

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag 8280

atcaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 8340

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 8400

tcttatcatg tctggatcaa ctggataact caagctaacc aaaatcatcc caaacttccc 8460

accccatacc ctattaccac tgccaattac ctagtggttt catttactct aaacctgtga 8520

ttcctctgaa ttattttcat tttaaagaaa ttgtatttgt taaatatgta ctacaaactt 8580

agtagttttt aaagaaattg tatttgttaa atatgtacta caaacttagt agt 8633

<210> 2

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcttcgtt tcttgccaga tttggctttc agcttcctgt taattctggc tttgggccag 60

gcagtccaat ttcaagaata tgtctttctc caatttctgg gcttagataa ggcgccttca 120

ccccagaagt tccaacctgt gccttatatc ttgaagaaaa ttttccagga tcgcgaggca 180

gcagcgacca ctggggtctc ccgagactta tgctacgtaa aggagctggg cgtccgcggg 240

aatgtacttc gctttctccc agaccaaggt ttctttcttt acccaaagaa aatttcccaa 300

gcttcctcct gcctgcagaa gctcctctac tttaacctgt ctgccatcaa agaaagggaa 360

cagttgacat tggcccagct gggcctggac ttggggccca attcttacta taacctggga 420

ccagagctgg aactggctct gttcctggtt caggagcctc atgtgtgggg ccagaccacc 480

cctaagccag gtaaaatgtt tgtgttgcgg tcagtcccat ggccacaagg tgctgttcac 540

ttcaacctgc tggatgtagc taaggattgg aatgacaacc cccggaaaaa tttcgggtta 600

ttcctggaga tactggtcaa agaagataga gactcagggg tgaattttca gcctgaagac 660

acctgtgcca gactaagatg ctcccttcat gcttccctgc tggtggtgac tctcaaccct 720

gatcagtgcc acccttctcg gaaaaggaga gcagccatcc ctgtccccaa gctttcttgt 780

aagaacctct gccaccgtca ccagctattc attaacttcc gggacctggg ttggcacaag 840

tggatcattg cccccaaggg gttcatggca aattactgcc atggagagtg tcccttctca 900

ctgaccatct ctctcaacag ctccaattat gctttcatgc aagccctgat gcatgccgtt 960

gacccagaga tcccccaggc tgtgtgtatc cccaccaagc tgtctcccat ttccatgctc 1020

taccaggaca ataatgacaa tgtcattcta cgacattatg aagacatggt agtcgatgaa 1080

tgtgggtgtg ggtag 1095

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctaccctc gtaaagatgc ttcgtttctt gccagatttg gc 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccagtttatc gacttgctac ccacacccac attcatcgac ta 42

Claims (4)

1.一种制备人定型内胚层细胞的方法，其特征在于，通过构建TetOne-Modified-GDF3的单一慢病毒载体；包装TetOne-Modified-GDF3的慢病毒；感染人多潜能干细胞系，并加入嘌呤霉素杀死未转入基因的细胞；扩增多潜能干细胞，然后传代扩增，扩增后的细胞在Dox作用下，诱导分化为内胚层细胞；从而在人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中表达或过表达GDF3基因，其中，所述的人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞均为商用干细胞；

所述GDF3基因的cDNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述方法包括以下步骤：

(1)将GDF3基因***慢病毒载体中，并对慢病毒载体进行包装；所述的慢病毒载体为Tetone-Modifed，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述慢病毒载体Tetone-Modifed通过以下方法制备得到，以pLVX-TetOne-Puro质粒为骨架载体，去除了pLVX-TetOne-Puro质粒上一段SV40 polyA signal序列，并且将启动嘌呤霉素表达的SV40启动子更换为了T2A序列，改造后的质粒命名为TetOne-Modified；

(2)将步骤(1)的载体转入人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞，并加嘌呤霉素筛选，获得稳定整合的干细胞；所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为0.5-2μg/ml；

(3)将步骤(2)的细胞加入强力霉素，诱导分化为人定型内胚层细胞，所述强力霉素的使用浓度为100ng/ml；

其中，步骤(1)中，将GDF3基因***慢病毒载体的步骤包括：

1)Tetone-Modifed质粒用R3136S，New England Biolabs和 R3101S，New EnglandBiolabs双酶切线性化，之后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收线性化的质粒；

2)从肝细胞cDNA文库中扩增GDF3 cDNA序列，引物序列为：

F:TCCTACCCTCGTAAAGATGCTTCGTTTCTTGCCAGATTTGGC

R:CCAGTTTATCGACTTGCTACCCACACCCACATTCATCGACTA；

3)将扩增的GDF3 cDNA序列连入线性化的 Tetone-Modifed质粒，所述cDNA序列为SEQID NO.2；

4)筛选阳性克隆并测序验证，测序正确的慢病毒命名为 Tetone-Modifed-GDF3；

5）对慢病毒Tetone-Modifed-GDF3进行包装。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人诱导多潜能干细胞为iPS细胞；或任一种NIH编号的人胚胎干细胞系，所述人胚胎干细胞系为商用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为 1μg/ml。

4.一种人定型内胚层细胞或其衍生细胞，其特征在于，所述人定型内胚层细胞或其衍生细胞是通过构建TetOne-Modified-GDF3的单一慢病毒载体；包装TetOne-Modified-GDF3的慢病毒；感染人多潜能干细胞系，并加入嘌呤霉素杀死未转入基因的细胞；扩增多潜能干细胞，然后传代扩增，扩增后的细胞在Dox作用下，诱导分化为内胚层细胞；从而在人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中过表达GDF3基因；使得所述人定型内胚层细胞或其衍生细胞含有高拷贝数的GDF3基因或含有能够表达GDF3基因的表达载体，所述GDF3基因的cDNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述人定型内胚层细胞或其衍生细胞通过以下步骤制备：

(1)将GDF3基因***慢病毒载体中，并对慢病毒载体进行包装；所述的慢病毒载体为Tetone-Modifed，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述慢病毒载体Tetone-Modifed通过以下方法制备得到，以pLVX-TetOne-Puro质粒为骨架载体，去除了pLVX-TetOne-Puro质粒上一段SV40 polyA signal序列，并且将启动嘌呤霉素表达的SV40启动子更换为了T2A序列，改造后的质粒命名为TetOne-Modified；

(2)将步骤(1)的载体转入人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞，并加嘌呤霉素筛选，获得稳定整合的干细胞；所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为0.5-2μg/ml；

(3)将步骤(2)的细胞加入强力霉素，诱导分化为人定型内胚层细胞，所述强力霉素的使用浓度为100ng/ml；

其中，步骤(1)中，将GDF3基因***慢病毒载体的步骤包括：

1)Tetone-Modifed质粒用R3136S，New England Biolabs和 R3101S，New EnglandBiolabs双酶切线性化，之后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收线性化的质粒；

2)从肝细胞cDNA文库中扩增GDF3 cDNA序列，引物序列为：

F:TCCTACCCTCGTAAAGATGCTTCGTTTCTTGCCAGATTTGGC

R:CCAGTTTATCGACTTGCTACCCACACCCACATTCATCGACTA；

3)将扩增的GDF3 cDNA序列连入线性化的 Tetone-Modifed质粒，所述cDNA序列为SEQID NO.2；

4)筛选阳性克隆并测序验证，测序正确的慢病毒命名为 Tetone-Modifed-GDF3；

5）对慢病毒Tetone-Modifed-GDF3进行包装。

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