CN110537631A - 一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂中的应用以及一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法。本发明将植物甾醇酯代替油脂添加到哺乳动物的无油脂日粮饲料中，能够降低血清和羊水中胆汁酸水平、胎盘胆汁酸转运体表达水平和胚胎后肢芽胆汁酸受体表达水平，而且能够提高体重、肌肉含量、抓握力、比目鱼肌纤维数量、腓肠肌肌纤维横截面积和肌球蛋白重链mRNA表达水平；另外，植物甾醇酯在进入哺乳动物体内后，经过小肠的消化作用而转化为植物甾醇和脂肪酸，不会产生任何毒副作用，因此，植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂方面具有广泛的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于食品及饲料技术领域。更具体地，涉及一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法。
背景技术
近年来，大量研究已证实妊娠期母体营养水平对胎儿及新生儿机体组织器官的生长发育、免疫及代谢等方面有着重要作用，这标志着母体程序性调控胎儿生长发育理论取得了重要的进展。因此，孕产妇营养不足和营养过剩都可能对发育中的胎儿有不利影响。
胆汁酸是动物机体脂代谢的重要调节物质。初级胆汁酸由肝脏中的胆固醇合成，与甘氨酸或牛磺酸结合，增加其溶解度，分泌到胆汁中，并通过肠道微生物在结肠中转化为次级胆汁酸，在回肠和结肠中再吸收回到肝脏。最近的研究表明，循环总胆汁酸与骨骼肌体积相关，12α-羟基甾醇胆汁酸(包括脱氧胆酸)与骨骼肌体积减小相关，而非12α-羟基甾醇胆汁酸(包括鹅去氧胆酸)与骨骼肌体积增大相关。但是，目前尚未明确母体的胆汁酸水平是如何影响子代肌纤维生长和分化的。
植物甾醇酯是植物甾醇和脂肪酸酯化反应后的产物，在结构上和胆固醇非常相似。现有技术中，已有研究表明植物甾醇酯是健康安全的食品成分，并在降低血胆固醇浓度和预防心血管疾病中发挥着重要作用。植物甾醇酯可以减轻由高胆固醇饮食和衰老引起的认知缺陷，可以预防高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝，并且可以通过降低高脂饮食大鼠结肠内容物中的短链脂肪酸含量来调节大鼠肠道内环境。因此，植物甾醇酯在胆固醇分解和合成过程中发挥着重要作用，并对机体的健康和代谢有重要意义。另外，现有专利CN107048067A公开了植物甾醇酯在制备鸡饲料添加剂方面的应用以及一种母源性添加植物甾醇酯促进子代鸡生长的方法，表明植物甾醇酯在作为鸡饲料添加剂中具有很好的应用价值。但是，目前，还未有任何有关植物甾醇酯作为制备哺乳动物饲料添加剂的原料，来促进子代生长和肌肉发育方面的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂中的空白，提供一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法。将植物甾醇酯代替油脂添加到哺乳动物的无油脂日粮饲料中，能够调控母胎间胆汁酸代谢、显著促进子代生长和肌肉发育，因此，植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂中具有广泛的应用价值。
本发明的目的是提供植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂或饲料中的应用。
本发明另一目的是提供一种哺乳动物饲料。
本发明再一目的是提供一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现，将植物甾醇酯代替油脂添加到哺乳动物的无油脂日粮饲料中，能够降低血清和羊水中胆汁酸水平、胎盘胆汁酸转运体表达水平和胚胎后肢芽胆汁酸受体表达水平，而且能够提高体重、肌肉含量、抓握力、比目鱼肌纤维数量、腓肠肌肌纤维横截面积和肌球蛋白重链mRNA表达水平，可用于制备哺乳动物饲料添加剂。
因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂或饲料中的应用。
优选地，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够调控母胎间胆汁酸代谢的饲料添加剂中的应用。
更优选地，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够降低血清和羊水中胆汁酸水平、胎盘胆汁酸转运体表达水平和胚胎后肢芽胆汁酸受体表达水平的饲料添加剂中的应用。
更进一步优选地，所述胎盘胆汁酸转运体为有机阴离子转运多肽2A1和/或有机阴离子转运多肽4A1。
更进一步优选地，所述胚胎后肢芽胆汁酸受体为法尼酯X受体和/或G蛋白偶联胆汁酸受体。
优选地，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够促进子代生长和肌肉发育的饲料添加剂中的应用。
更优选地，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够提高体重、肌肉含量、抓握力、比目鱼肌纤维数量、腓肠肌肌纤维横截面积和肌球蛋白重链mRNA表达水平的饲料添加剂中的应用。
更进一步优选地，所述肌球蛋白重链为1型、2a型、2b型或2x型肌球蛋白重链中的任意一种或几种。
优选地，所述哺乳动物为妊娠哺乳动物。
优选地，所述饲料为无油脂饲料。
优选地，所述植物甾醇酯为β-谷甾醇酯、豆甾醇酯或菜油甾醇酯中的任意一种或几种。
本发明还提供了一种哺乳动物饲料，包含有效量的植物甾醇酯，且无油脂。
另外，本发明还提供了一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法，将植物甾醇酯代替油脂添加到哺乳动物的日粮饲料中。
优选地，所述植物甾醇酯的质量百分比为1％～10％。
更优选地，所述植物甾醇酯的质量百分比为1％～5％。
更进一步优选地，所述植物甾醇酯的质量百分比为3.33％。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法。本发明研究发现将植物甾醇酯代替油脂添加到哺乳动物的无油脂日粮饲料中，能够降低血清和羊水中胆汁酸水平、胎盘胆汁酸转运体表达水平和胚胎后肢芽胆汁酸受体表达水平，而且能够提高体重、肌肉含量、抓握力、比目鱼肌纤维数量、腓肠肌肌纤维横截面积和肌球蛋白重链mRNA表达水平。
本发明在哺乳动物的无油脂日粮饲料中添加植物甾醇酯后得到的全价饲料是一种安全的饲料，植物甾醇酯在进入哺乳动物体内后，经过小肠的消化作用而转化为植物甾醇和脂肪酸，不会产生任何毒副作用，与一般的饲料添加剂相比，可以调控母胎间胆汁酸代谢、显著促进子代生长和肌肉发育；另外，在哺乳动物的无油脂日粮饲料中添加植物甾醇酯的方法简便，无特殊设备的要求，因此，植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂方面具有广泛的推广应用价值。
附图说明
图1是植物甾醇酯对妊娠母鼠血清胆汁酸水平的影响结果；其中，PE代表植物甾醇酯。
图2是植物甾醇酯对妊娠母鼠羊水胆汁酸水平的影响结果；其中，PE代表植物甾醇酯。
图3是植物甾醇酯对胎盘胆汁酸转运体的影响结果；其中，OATP2A1代表有机阴离子转运多肽2A1；OATP4A1代表有机阴离子转运多肽4A1。
图4是植物甾醇酯对胚胎后肢芽胆汁酸受体的影响结果；其中，FXR代表法尼酯X受体；TGR5代表G蛋白偶联胆汁酸受体；Tubulin代表微管蛋白。
图5是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)体重的影响结果。
图6是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)的肌肉和脂肪含量的影响结果。
图7是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)的抓握力的影响结果。
图8是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)的肌肉组织比率的影响结果；其中，GAS代表腓肠肌，SOL代表比目鱼肌，TA代表胫骨前肌，EDL代表趾长伸肌，BAT代表褐色脂肪，iWAT代表皮下脂肪。
图9是植物甾醇酯对子代小鼠比目鱼肌纤维数量的影响结果。
图10是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)腓肠肌肌纤维横截面积的影响结果。
图11是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)肌球蛋白重链mRNA表达水平的影响结果；其中，MHC 1、MHC 2a、MHC 2b、MHC 2x分别代表1、2a、2b、2x型肌球蛋白重链。
图12是植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)肌纤维比例的影响结果；其中，MHC1、MHC 2a、MHC 2b分别代表1、2a、2b型肌球蛋白重链。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1植物甾醇酯对母胎间胆汁酸代谢的影响
1、试验日粮的制备
(1)称取植物甾醇酯(40％β-谷甾醇酯、30％豆甾醇酯和10％菜油甾醇酯)，制备无油脂日粮；
(2)将植物甾醇酯和无油脂日粮混合制得全价饲料，其中，植物甾醇酯的质量分数为全价饲料的3.33％。
其中，无油脂日粮的配方、营养水平和制备方法均参照常规，植物甾醇酯和无油脂日粮混合的设备为常规设备。
2、试验小鼠分组和处理
试验选用8～10周龄体况良好的C57BL雌性小鼠12只，随机分成2个组，每组6只鼠，妊娠前饲喂普通日粮。每天20时将种公鼠与母鼠合笼配种，第二天早上8时拿出公鼠并对母鼠进行检栓，若发现***栓，则记为妊娠第0.5天，并更换试验日粮；若未发现***栓，继续饲喂普通日粮并重复此操作。对照组采用无油脂日粮+1.97％油酸；植物甾醇酯组在对照组日粮基础上用植物甾醇酯等能值替换油酸。试验中除合笼外均采用单笼饲养，试验期内小鼠自由采食及自由饮水。试验设置组别及处理饲粮组成如表1所示。
表1 试验设置组别及处理饲粮组成
3、组织采样
在妊娠期12.5天、妊娠期17.5天和分娩当天分别采集母鼠血清、胚胎后肢芽、羊水和胎盘。使用眼球取血法进行采血，用1.5mL离心管收集血液，静置待血液凝固后，以4℃3000rpm离心15分钟，收集血清，-20℃冰箱保存备用。其余样品分别放入离心管且投入装有液氮的容器中，采样结束后转移样品至-80℃冰箱中，保存备用。
3周龄及8周龄子代小鼠采血完毕后颈椎脱臼处死，采集子代小鼠的肌肉组织，包括：腓肠肌(GAS)、比目鱼肌(SOL)、胫骨前肌(TA)、趾长伸肌(EDL)、褐色脂肪(BAT)和皮下脂肪(iWAT)，称重记录后装于离心管，并将左腿腓肠肌贴于硬纸片上，尽量保持肌肉原始形态，然后完整地装进管壁开孔的离心管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱，保存备用。
4、试验方法
母鼠血清胆汁酸和羊水胆汁酸水平的检测通过南京建成生物科技有限公司胆汁酸试剂盒进行。通过进行胎盘的PCR试验，研究植物甾醇酯对胎盘胆汁酸转运体(有机阴离子转运多肽2A1、有机阴离子转运多肽4A1)的影响。通过进行胚胎后肢芽的Western Blot试验，研究植物甾醇酯对胚胎后肢芽胆汁酸受体(法尼酯X受体、G蛋白偶联胆汁酸受体)的影响。
5、试验结果
植物甾醇酯对妊娠母鼠血清胆汁酸水平的影响结果如图1所示，可以看出，植物甾醇酯显著降低了妊娠17.5天母鼠的血清中的胆汁酸水平。植物甾醇酯对妊娠母鼠羊水胆汁酸水平的影响结果如图2所示，可以看出，植物甾醇酯显著降低了妊娠17.5天母鼠的羊水中的胆汁酸水平。植物甾醇酯对胎盘胆汁酸转运体的影响结果如图3所示，可以看出，植物甾醇酯降低了有机阴离子转运多肽2A1和有机阴离子转运多肽4A1的表达水平。植物甾醇酯对胚胎后肢芽胆汁酸受体的影响结果如图4所示，可以看出，植物甾醇酯显著地降低了法尼酯X受体、G蛋白偶联胆汁酸受体的表达水平。
以上结果表明：植物甾醇酯能够调控母胎间的胆汁酸代谢。
实施例2植物甾醇酯对子代生长的影响
1、试验方法
子代小鼠出生后，每周测定子代小鼠的体重至8周龄。3周龄断奶后，公母分笼饲养，饲喂普通日粮。
在子代小鼠生长至8周龄后，测定体组成。将子代小鼠保定后，刺激其尾部，使其排尿排粪，之后测量体重并记录，将子代小鼠轻轻固定并放入核磁共振成像仪(上海纽迈科技有限公司，MesoQMR23-060H型)，检测子代小鼠肌肉和脂肪含量。
在8周龄子代小鼠体组成测定完成后，待子代小鼠恢复三天，进行抓握力的测定。将子代小鼠置于爪抓计(深圳瑞沃德科技有限公司，BIO-GS3型)触网上，平行于触网拉动子代小鼠，读取并记录机器显示的测定值，每只子代小鼠测定10次，取平均值用于后续统计。抓握力测定完成后，待子代小鼠恢复三天，进行采样。
分别测定子代小鼠的GAS、SOL、TA、EDL、BAT和iWAT的组织比例。
2、试验结果
植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)体重的影响结果如图5所示，可以看出，与对照组相比，植物甾醇酯显著增加了0～6周龄子代小鼠的体重。植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)的肌肉和脂肪含量的影响结果如图6所示，可以看出，植物甾醇酯能够显著提高8周龄子代公鼠和母鼠的肌肉含量，降低子代公鼠的脂肪含量。植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)的抓握力的影响结果如图7所示，可以看出，植物甾醇酯能够显著提高8周龄子代公鼠和母鼠的抓握力。植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)的肌肉组织比率的影响结果如图8所示，可以看出，植物甾醇酯可以显著增加子代公鼠的GAS、TA、BAT的比率，显著降低iWAT的比率；植物甾醇酯可以显著增加子代母鼠TA的比率。
以上结果表明：植物甾醇酯可以显著促进子代小鼠的生长。
实施例3植物甾醇酯对子代肌肉发育的影响
1、试验方法
将1日龄子代小鼠后肢芽和3周龄子代小鼠腓肠肌制作切片，将切片置于4％多聚甲醛固定10～20min，水洗1～2s，在苏木精中染色20～30s，之后流水冲洗5～10s，置于1％盐酸乙醇中1～3s，流水冲洗15～30s，置于1％伊红中染色30～60s，水洗1～2s，80％乙醇1～2s，95％乙醇1～2s，无水乙醇1～2s，二甲苯(Ⅰ)2～3s，二甲苯(Ⅱ)2～3s，中性树胶封片。H&E染色切片在显微镜下拍照后，使用Image J软件统计子代小鼠的比目鱼肌纤维数量(Soleus)和腓肠肌肌纤维横截面积，用于后续数据分析。
通过进行3周龄子代小鼠的腓肠肌的PCR试验，研究植物甾醇酯对其肌球蛋白重链(1型、2a型、2b型、2x型肌球蛋白重链)表达水平的影响。
将8周龄子代小鼠腓肠肌制作切片，将切片置于酸性预孵液中室温孵育10min，Tris-CaCl2洗涤两次，每次1min，置于SDH孵育液中37℃孵育45min，双蒸水冲洗两次，每次30s，置于ATP孵育液中37℃孵育30min，双蒸水冲洗两次，每次1min，2％CoCl2孵育5min，双蒸水冲洗两次，每次3min，置于2％(NH4)2S中30s，双蒸水冲洗两次，每次5min，苏木精避光染色3min，双蒸水冲洗两次，每次2min，梯度酒精脱色(50％，75％，100％，各2min)，二甲苯中浸泡2min，超净台风干5min，中性树胶封片。染色后的切片在显微镜下拍照，用Image J软件统计不同类型肌纤维数量并计算比例。
2、试验结果
植物甾醇酯对子代小鼠比目鱼肌纤维数量的影响结果如图9所示，可以看出，植物甾醇酯可以显著提高1日龄子代小鼠比目鱼肌纤维数量。植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)腓肠肌肌纤维横截面积的影响结果如图10所示，可以看出，植物甾醇酯可以提高3日龄子代小鼠腓肠肌肌纤维横截面积。
植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)肌球蛋白重链mRNA表达水平的影响结果如图11所示，可以看出，植物甾醇酯显著增加3周龄子代公鼠MHC 2a、MHC 2x的mRNA表达水平，显著增加3周龄子代母鼠MHC 2a的mRNA表达水平。
植物甾醇酯对子代小鼠(公鼠和母鼠)肌纤维比例的影响结果如图12所示，可以看出，植物甾醇酯可以显著降低8周龄子代公鼠的MHC 1型和MHC 2a型肌纤维比例，显著提高8周龄子代公鼠的MHC 2b型肌纤维比例；同时，植物甾醇酯可以显著降低8周龄子代母鼠的MHC 1型肌纤维比例，显著提高8周龄子代母鼠的MHC 2b型肌纤维比例。
以上结果表明：植物甾醇酯可以显著促进子代小鼠肌肉的发育。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.植物甾醇酯在制备哺乳动物饲料添加剂或饲料中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够调控母胎间胆汁酸代谢的饲料添加剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够促进子代生长和肌肉发育的饲料添加剂中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够降低血清和羊水中胆汁酸水平、胎盘胆汁酸转运体表达水平和胚胎后肢芽胆汁酸受体表达水平的饲料添加剂中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是指植物甾醇酯在制备能够提高体重、肌肉含量、抓握力、比目鱼肌纤维数量、腓肠肌肌纤维横截面积和肌球蛋白重链mRNA表达水平的饲料添加剂中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为妊娠哺乳动物。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为无油脂饲料。
8.根据权利要求1～5任一所述的应用，其特征在于，所述植物甾醇酯为β-谷甾醇酯、豆甾醇酯或菜油甾醇酯中的任意一种或几种。
9.一种哺乳动物饲料，其特征在于，包含有效量的植物甾醇酯，且无油脂。
10.一种母源性添加植物甾醇酯促进哺乳动物子代生长的方法，其特征在于，将植物甾醇酯代替油脂添加到哺乳动物的日粮饲料中。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20191206 |