CN110530957A - 一种细菌耐药性电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌耐药性电化学检测方法，属于电化学芯片和细菌检测技术领域。本发明利用特定的含刃天青的样品溶液再特定电化学环境下，结合示差脉冲伏安法对细菌进行了药敏性检测。本发明方法可以直接针对细菌活性进行检测，具有准确度高、操作简单，可以在短时间内进行耐药性、最低抑菌浓度的测定，可广泛用于医学等领域的各种研究和临床检测。

Description

一种细菌耐药性电化学检测方法
技术领域
本发明属于电化学芯片和细菌检测技术领域，具体涉及一种细菌耐药性电化学检测方法。
背景技术
刃天青(Resazurin,RZ)也称天兰化钠，树脂天青，为氧化还原染料，呈深蓝色或黑色，有绿色光泽，是一种安全无毒的水溶性染料。作为氧化还原指示剂，在细胞生物学研宄中，常用于线粒体的功能检测(刃天青法)以及细胞活力和细胞增殖能力的评估或用于细菌的检测分析；作为无氧指示剂，可用于微生物培养基的配制。同时刃天青作为一种氧化还原介体可以调控微生物的代谢活动。有代谢能力的活性物质能将刃天青(蓝色)不可逆地还原为试卤灵(粉红色)，试卤灵会继续被可逆地还原为二氢呋喃(白色)。刃天青(蓝色的消失)已用于表征牛奶中的细菌污染，测试各种生物材料，如生化抗氧化剂，测定细胞活力，***质量，病原微生物的敏感性测试，包括许多革兰氏阴性菌、肠球菌、生殖细菌，和量化沉积物中的微生物活性。刃天青在还原过程中还具有电化学性质，死细菌丧失了代谢能力而不能还原刃天青，电流也就不会变小，有代谢能力的活菌还原电化学，测试的电流会明显减少，所以该物质能特异性检测有代谢能力的活细菌。
长期以来，过量使用广谱抗生素和不当使用抗生素导致抗生素耐药菌株增加，这对全球公共卫生构成了越来越大的威胁。抗生素抗性的快速传播及其在食品安全、临床应用和生物环境监测领域的相关问题，需要合理使用抗生素以防止过量或不当使用。而且许多编码耐药性的基因可在动物和人类病原菌间相互转移和传播，严重危害养殖业和人类健康。因此，开展细菌耐药性检测在医学、食品和公共卫生等方面都具有重要意义。
为了应对这种威胁，迫切需要进行抗菌药敏试验(AST)，以快速诊断沙门氏菌的耐药性，以确保快速准确地使用抗生素。有多种实验室方法可用于表征微生物对抗生素的体外敏感性。常规AST有常量肉汤稀释和微量稀释试验、纸片扩散试验和琼脂稀释法。细菌耐药性的常规检测方法的优点为操作简便、成本低，当然，还有一些效果较好的检测方法，比如有试卡法、mPCR法等，其中mPCR法是一种基于微生物中抗性基因的分子检测方法，具有快速、高效等特点。但是常规的细菌耐药性方法往往比较耗时、易受干扰，以PCR为代表的分子生物学方法的诊断结果往往还需用常规方法予以验证，尚不能取代基于细菌培养的药敏试验，在实际现场检测有较大的局限性。而且抗性遗传机制的发展和对所有可能突变的同时测试的限制表明了细菌活力测定在抗生素敏感性测试中的效用。
由此可知，采用现有的常规实验室方法来检测药敏性，不能快速、便捷地得到耐药性结果，而且不能快速精准判别出耐药性情况，在实际应用中会造成较大的不良后果。
发明内容
为了实现快速、准确的检测细菌耐药性，本发明构建了基于电化学检测的方法，能够快速、准确、无特异性检测细菌耐药性，解决耐药性检测现有技术中检测时间长、步骤糅杂、所需仪器复杂的技术问题。
本发明使用的电化学方法仅需要简单的电子器件，并且可以从受限制的液滴直接进行电子检测。电化学检测的速度较快、简单、方便，重要的是成本较低，可以和其他技术联合使用，所以电化学传感器在实际应用中的前景可观。
本发明的原理是基于刃天青的电化学性质，通过活菌代谢将刃天青还原成试卤灵，刃天青和试卤灵具有不同的电化学信号，可以根据电流强度来表示刃天青的还原程度，由此可以来判别抗生素的作用。
本发明的目的是提供一种能够用于检测细菌耐药性的电化学方法，包括以下步骤：
(1)利用多壁碳纳米管和电镀金纳米颗粒修饰丝网印刷电极，得到修饰丝网印刷电极；
(2)以步骤(1)中所得修饰丝网印刷电极作为工作电极，将样品溶液添加在工作电极上，采用示差脉冲伏安法测定电流值；所述样品溶液中包括细菌、抗生素和刃天青，其中刃天青的溶度为0.1-0.5mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述修饰丝网印刷电极中多壁碳纳米管的浓度为0.1-5mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述修饰丝网印刷电极中电镀金纳米颗粒是通过10mL含有1％氯金酸和1mmol/L硫酸溶液作为镀金液制备得到。并采用时间电流法进行，其中电镀电压为-0.2-0.4V，优选-0.3V；电镀时间为80-120s，优选100s。
在本发明的一种实施方式中，所述修饰丝网印刷电极是将丝网印刷电极浸置于乙醇水溶液(4:1，v/v)中浸泡1min，然后将丝网印刷电极用超纯水淋洗，完成多壁碳纳米管-金纳米颗粒丝网印刷电极的制备。
在修饰丝网印刷电极增强电信号后，通过细菌、抗生素与刃天青的进一步培育，在电极上检测刃天青溶液的电流。并且，在丝网印刷电极表面滴涂多壁碳纳米管和电镀金纳米颗粒，增加电子传递速率，从而增大灵敏度、信号强度。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的样品溶液是将鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别用NB培养基在37℃摇床中培养，培养后将其稀释成7.5×105cfu/mL；然后加入刃天青，使其浓度为0.2mmol/L、加入不同用量的抗生素氧氟沙星，混合，在37℃下在金属浴中震荡孵育1-6小时。
在本发明的一种实施方式中，还需要同时准备一个未添加抗生素、其他相同的细菌溶液，用于对照试验。
优选的，所述细菌、抗生素与刃天青的培养时间为4小时。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中包括将样品溶液通过0.22μm过滤器过滤以除去细菌，防止其影响测量信号，随后测量溶液的电化学值：取100～150μl样品溶液滴于多壁碳纳米管-金纳米颗粒修饰的丝网印刷电极上，采用示差脉冲伏安法进行测量，电压设置范围：-0.7V～0V，记录扫描中的电流值。
在本发明的一种实施方式中，是以修饰丝网印刷电极作为测试元件，其以PET为基底，以碳作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，碳作为对电极。然后使用循环伏安法、示差脉冲伏安法(DPV)来测试刃天青浓度的电信号，所用电压为：-0.1V～-0.7V，测试得到示差脉冲伏安法的电流变化更明显，而循环伏安法的不明显，所以选择示差脉冲伏安法来进行后续耐药性试验。
本发明的检测部分需要在电化学检测仪上完成，其构造如下：电化学检测仪为已设定电压的电化学工作站，配备有LED显示屏，用于记录电子从对电极，经过电导液，再从工作电极流回工作站时形成的阻抗值和电流值。
本发明的有益效果：
本发明利用刃天青的电化学性质来监测细菌的代谢活性，可以实现现场检测，该方法灵敏度高、操作简单，样品可以不经复杂处理，所用仪器设备相对简单。本发明直接针对细菌活性进行检测，可以在几小时内进行耐药性、最低抑菌浓度的测定，可以推广适用于医学等领域的各种研究和临床检测。
附图说明
图1为修饰的丝网印刷电极的制备示意图及检测原理；
图2为鼠伤寒沙门氏菌耐药性检测结果；
图3为金黄色葡萄球菌耐药性检测结果；
图4为不同浓度刃天青溶液的电化学信号；其中，A是以在AuNP/MWCNT/SPCE基底上通过循环伏安法CV测得的电化学信号；B是示差脉冲伏安法DPV在AuNP/MWCNT/SPCE基底上得到的电化学信号；C是以循环伏安法CV在裸SPCE基地上测得的电化学信号；D是示差脉冲伏安法DPV在裸SPCE基底上得到的电化学信号。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式。本发明还可以通过不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式以前，应理解，本发明的保护范围不局限与下属特定的具体实施方案。
结合图1，对电化学传感器的制备进行说明，包括以下步骤：(1)在丝网印刷电极表面修饰多壁碳纳米管；(2)将所述多壁碳纳米管丝网印刷电极浸置于镀金液中，通过电镀修饰成多壁碳纳米管-金纳米颗粒丝网印刷电极；(3)再将菌、抗生素与刃天青的反应溶液置于电极上，进行检测。
修饰丝网印刷电极的制备：
(1)先在丝网印刷电极表面修饰多壁碳纳米管，修饰方法：将丝网印刷电极在0.5mol/L的铁硫酸溶液中活化，采用循环伏安法扫描，电压为：-0.2V～0.6V，扫描速率为：50mv/s，扫描圈数为：10；配置1mg/mL的多壁碳纳米管溶液，超声30min，待其混匀后滴涂在活化后的丝网印刷电极表面，放置在室温使其自然风干；
(2)再通过电镀修饰纳米金颗粒，修饰方法：将多壁碳纳米管丝网印刷电极浸置于10mL含有1％氯金酸和1mmol/L硫酸溶液的镀金液中进行镀金，采用时间电流法，电镀电压为：-0.3V，电镀时间为：100s；最后将丝网印刷电极浸置于乙醇水溶液(4:1，v/v)中浸泡1min，然后将丝网印刷电极用超纯水淋洗，完成多壁碳纳米管-金纳米颗粒丝网印刷电极的制备。
实施例1
(1)细菌处理：
将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028用NB培养基在37℃摇床中培养，然后使用细菌浊度仪，扣除背景后测定其浊度，再换算成菌液原始浓度。根据原始浓度用NB培养基将菌液稀释成7.5×105cfu/mL。然后加入刃天青和不同用量的抗生素氧氟沙星混合，在37℃下在金属浴中震荡孵育4小时；其中溶液中刃天青的浓度为0.2mmol/L，抗生素氧氟沙星浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。同时准备一个相同的细菌溶液，用于对照试验，不加抗生素。
(2)耐药性检测：
为了检测细菌耐药性，将上述孵育后的溶液通过0.22μm过滤器过滤以除去细菌，随后测量溶液的电化学值。取150μl溶液滴于上述方法制备好的修饰有多壁碳纳米管-金纳米颗粒的丝网印刷电极上，采用示差脉冲伏安法DPV进行测量，电压设置范围：-0.7V～0V，记录扫描中的电流值，经过计算后绘制检测结果，得到该菌的最低抑菌浓度。相对存活率(SR)是每种浓度抗生素条件下的还原变化电流与对照组的变化电流之比。
由图2可知，鼠伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。
实施例2
(1)细菌处理:
将金黄色葡萄球菌ATCC6538用NB培养基在37℃摇床中培养，然后使用细菌浊度仪，扣除背景后测定其浊度，再换算成菌液原始浓度。根据原始浓度用NB培养基将菌液稀释成7.5×105cfu/mL。然后加入刃天青和不同用量的抗生素氧氟沙星混合，在37℃下在金属浴中震荡孵育4小时；其中溶液中刃天青的浓度为0.2mmol/L，抗生素氧氟沙星浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。同时准备一个相同的细菌溶液，用于对照试验，不加抗生素。
(2)耐药性检测:
为了检测细菌耐药性，将上述孵育后的溶液通过0.22μm过滤器过滤以除去细菌，随后测量溶液的电化学值。将溶液取150μl滴于多壁碳纳米管-金纳米颗粒丝网印刷电极上，采用示差脉冲伏安法进行测量：电压设置范围：-0.7V～0V，记录扫描中的电流值，经过计算后绘制检测结果，得到该菌的最低抑菌浓度。相对存活率(SR)是每种浓度抗生素条件下的还原变化电流与对照组的变化电流之比。
由图3可知，金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为32μg/mL。
实施例3验证实验
微量肉汤稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)：无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物氧氟沙星溶液(Ofloxacin)分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μL，第12孔不加药作为生长对照。
将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的不同菌悬液，经NB肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置37℃普通空气孵箱中，孵育24h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL(相应Log2C如表1所示)。将培养后的96孔板放置于OD600的酶标仪中测定，以此得到耐药性数据，结果如表2所示。
表1最低抑制浓及相应Log2C
表2实施例1-2检测方法的准确性验证结果
由表2可知，实施例1-2得到的MIC值一般大于标准试验1个数量级左右(此处的数量级是指2的数量级)，属于较窄的使用范围，能够较为准确地指示较为适合的药物MIC使用条件。且实施例1-2中的方法与标准法测定的结果一致性较好，能够有效判断出细菌的耐药性。
实施例4电化学检测条件优化
(1)不同刃天青溶度的选择：
将4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0mM的刃天青溶液滴于裸丝网印刷电极和修饰的丝网印刷电极上，观察不同的信号差异，选择合适的刃天青浓度作为工作浓度。结果发现，高浓度的刃天青有两个阴极峰，而低浓度的只显示一个阴极峰，但低浓度的电流值较小，预测的准确度较低；所以基于同时得到更清晰的检测数据和较大的电流值考虑，故选用只有一个阴极峰并且电流较大的0.1-0.5mM的刃天青溶液，其中最优的是以0.2mM刃天青浓度作为工作浓度。
(2)不同电化学测定方法的选择：
分别利用不同方法在NB培养基中测试一系列浓度梯度的刃天青的电化学信号。如图4所示，图4-A是以在AuNP/MWCNT/SPCE基底上通过循环伏安法CV测得的电化学信号；图4-B是示差脉冲伏安法DPV在AuNP/MWCNT/SPCE基底上得到的电化学信号；图4-C是以循环伏安法CV在裸SPCE基地上测得的电化学信号；图4-D是示差脉冲伏安法DPV在裸SPCE基底上得到的电化学信号。其中，a：4mM；b：2mM；c：1mM；d：0.5mM；e：0.2mM；f：0.1mM；g：0.05mM；h：0.02mM；i：0mM。
刃天青电化学原理：高电位的阴极峰对应于不可逆双电子过程中刃天青转化为试卤灵，而低电位的阴极峰和氧化峰对应于可逆双电子过程中试卤灵转化为二氢呋喃。由图4可知，不同浓度的刃天青的电化学信号显示出显着差异，并且电流随着浓度的增加而显着增加。随着浓度的增加，刃天青的总峰值向低电位移动，峰形变宽。然而，当在低浓度下测量时，两个阴极峰有时重叠，因此在CV和DPV图中仅出现一个峰。CV和DPV都显示了刃天青的典型电化学信号，但是代表刃天青还原为试卤灵的信号峰在DPV上更显著，并且DPV的电流更强，故选择了DPV作为检测指标。

Claims (10)

1.一种检测细菌耐药性的电化学方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用多壁碳纳米管和电镀金纳米颗粒修饰丝网印刷电极，得到修饰丝网印刷电极；
(2)以步骤(1)中所得修饰丝网印刷电极作为测试元件，将样品溶液添加在修饰丝网印刷电极的工作电极上，采用示差脉冲伏安法测定电流值；所述样品溶液中包括细菌、抗生素和刃天青，其中刃天青的溶度为0.1-0.5mmol/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刃天青的溶度为0.1-0.4mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述修饰丝网印刷电极中多壁碳纳米管的浓度为0.1-5mg/mL。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述修饰丝网印刷电极中电镀金纳米颗粒是通过10mL含有1％氯金酸和1mmol/L硫酸溶液作为镀金液制备得到。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，电镀金纳米颗粒修饰丝网印刷电极时的电镀电压为-0.2-0.4V，电镀时间为80-120s。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品溶液是将细菌与刃天青、抗生素药物混合培养孵育1-6小时所得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养孵育时间为4h。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括：将样品溶液通过过滤器过滤，然后滴于多壁碳纳米管-金纳米颗粒修饰的丝网印刷电极上进行电化学检测。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述细菌包括鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。
10.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中电化学检测时的电压为-0.7V～0V。
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