CN110520734A - 用于减少信号生成数字测定中的噪声的方法 - Google Patents

Abstract

公开了使用着色剂降低信号生成数字测定(诸如荧光数字免疫测定)中的背景噪声的方法。所述方法利用特异性结合生物样品中的分析物的结合成员。所述结合成员与信号生成化合物(例如酶)缀合，所述信号生成化合物与结合成员解离。着色剂与信号生成底物(例如酶的荧光或生色底物)一起添加，或在信号生成底物之后添加，以降低荧光数字免疫测定中的背景噪声。检测在信号生成化合物和信号生成底物之间生成的信号，并将其与分析物的存在和/或浓度关联。

Description

用于减少信号生成数字测定中的噪声的方法

[技术领域]

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月6日提交的美国临时专利申请号62/455,436的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。

本公开涉及使用着色剂(诸如墨或染料)降低信号生成数字测定中的背景噪声的方法。

[背景技术]

可以准确地分析样品中的目标分析物的方法和装置是诊断(诸如例如诊断疾病、病症或病况)、预测、环境评估、食品安全、化学或生物战剂的检测等所必需的。用于定量样品中低水平的分析物分子的大多数现有技术使用扩增程序来增加报告分子的数目以提供可测量的信号。目前技术的实例包括用于在基于抗体的测定中扩增信号的酶联免疫吸附测定(ELISA)，以及用于在基于DNA的测定中扩增靶标DNA链的聚合酶链式反应(PCR)。大多数检测方案要求整体存在大量分子，以使聚集信号高于检测阈值。该要求限制大多数检测技术的灵敏度和动态范围(即，可以检测的浓度范围)。许多已知的方法和技术进一步受到非特异性结合的问题的困扰，其导致背景信号的增加并限制可以准确或可再现地检测的最低浓度。

数字ELISA是下一代免疫测定的候选者，因为其可以使用缀合物检测一个分子的酶。参见图1和2。在数字ELISA程序中，个别靶分析物被捕获在抗体包被的固相(例如珠子)上，且然后与和酶缀合的检测抗体反应。在除去未结合的检测抗体之后，将珠子与酶的底物一起捕获在每个液滴室中，并用重油包封珠子(参见图2的步骤3中的黄色层)。在图2的步骤3-8期间，水相被重油置换并随后被除去。其通常花费30-40分钟来完全除去水相，其也包括荧光物质(参见图2的步骤1-7中的天蓝色层)。因为图2中显示的除去步骤7是手动进行的，所以鉴于进行这样的测定的各种时间，这造成挑战，这导致准确性问题取决于每次测定的个体差异以及测试的样品数目。通过实例的方式，如果步骤7不正确进行(即，存在水层的不完全除去)，则信号(“发光”)背景噪声阻碍数字计数装置(例如光学显微镜)下荧光液滴的数目的计数。此外，任何光源，诸如室内灯，可引起高背景噪声。作为结果，需要改进的数字测定，其容易地可适应于高通量测定，其具有降低的背景噪声，即背景信号(例如，荧光或发光)，和高准确性。

[发明概述]

本发明涉及用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定。所述测定包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物和着色剂，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

本发明涉及用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定。所述免疫测定包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物和着色剂，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

本发明涉及用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定。所述测定包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至置换的水相中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

本发明涉及用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定。所述测定包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至密封剂中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

本发明涉及用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定。所述免疫测定包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至置换的水相中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

本发明涉及用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定。所述免疫测定包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至密封剂中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

本发明涉及降低用于检测样品中的分析物的信号生成数字测定中的荧光背景噪声的方法。该方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在，其中数字计数装置包括黑色装置。

本发明涉及降低用于检测样品中的分析物的荧光数字免疫测定中的荧光背景噪声的方法。该方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在，其中数字计数装置包括黑色装置。

本文阐述的主题的细节(关于它的结构和运行)可以通过研究附图而明白，在附图中，相同的附图标记表示相同的部件。附图中的部件不一定按比例，而是把重点放在解释主题的原理。此外，所有插图意图传达概念，其中可以示意地、而不是按照字面上或精确地解释相对大小、形状和其它详细属性。

附图简述

[图1] 图1显示荧光数字ELISA测定的程序。

[图2] 图2显示使用滴油密封步骤和水相除去步骤的荧光数字ELISA测定的程序。

[图3] 图3显示对置换的水相使用“黑色墨添加”的荧光数字ELISA测定的改进程序。

[图4] 图4显示使用用于计数珠子的数目的四甲基罗丹明(TRITC)滤光器和用于计数荧光液滴的数目的荧光素滤光器的处理(A)、(B)和(C)的图像分析数据。

[图5-1] 图5显示处理(B)和(C)的信号%(真实信号)。

[图5-2] 图5显示处理(B)和(C)的信号%(真实信号)。

[图6] 图6显示荧光素检测中的发光图像的2种代表性模式(处理(B)的16种不可分析片)。

[图7A] 图7A显示使用黑色墨与用于酶促反应的溶液混合的荧光数字ELISA测定的改进程序。

[图7B] 图7B显示公开的方法可以如何限制与瞬逝光检测***类似的光区域的示意图。

[图8] 图8显示“黑色墨预混合”研究的信号%(真实信号)和S/N比。

[图9] 图9A显示印度墨的实例，图9B显示酸性黑2(“ABk2”)的化学结构，图9C显示酸性橙7(“AO7”)的化学结构，图9D显示直接蓝14的化学结构(“DBu14”)。

[图10] 图10显示染料化合物预混合研究的信号%(真实信号)和S/N比。

[图11] 图11显示染料组合研究的信号%(真实信号)。黑色墨：印度墨，ABk2：酸性黑2，AO7：酸性橙7和DBu14：直接蓝14。

[图12] 图12A和12B显示15 mM酸性橙7 (AO7)和4 mM直接蓝14 (DBu14)的组合的吸收光谱(图12A)和荧光素的发射和激发光谱(图12B)。注意；发射峰位于AO7和DBu14之间的谷周围。

[图13] 图13显示用于检测30分钟之后的低浓度抗原(0.1 fM抗原样品)的改进的荧光数字免疫测定、“添加方法”和“预混合方法”的信号%(真实信号)和S/N比。抗原是重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)。

[图14] 图14显示用于降低背景噪声的一个替代实施方案。

[实施方案的描述]

详述

本公开的实施方案涉及着色剂(诸如一种或多种深色/黑色墨或染料)用于减少测定(诸如数字ELISA)中的背景信号(例如荧光)而无需除去水相的用途。例如，在数字免疫测定中，目标分析物被捕获在捕获分子和检测分子(其与信号生成化合物(例如诸如酶))之间的固体支持物上以形成捕获分子-目标分析物-检测分子复合物。然后将含有捕获分子-目标分析物-检测分子复合物的固体支持物包埋在液滴中，并将液滴移至一系列反应容器(例如孔)中，其在每个反应容器内产生水相。可以通过添加密封剂在“溶剂孔密封”方法中密封或覆盖反应容器，所述密封剂包括一种或多种溶剂，诸如具有比水相更重的密度的亲水或疏水溶剂。在将密封剂添加至反应容器之后，密封剂由于其较重的密度而朝向反应容器的底部移动并且置换水相，因此迫使其到达表面并在上部水相和下部溶剂相之间产生清晰的分离。例如，可以用重质氟化油覆盖多个反应容器，并交换水相和油相。在交换水相和油相之后，除去水相。可以使用本领域已知的常规技术除去上部水相。

溶剂密封方法的问题之一是残余水相可以引起背景信号或可检测标记(例如荧光)。背景信号的另一种来源是任何光，诸如室内灯。另一个问题是需要在检测之前从油除去水溶液，这是非常耗时的步骤并且导致测定的通量非常低和每次测试的孵育时间非常可变。将着色剂添加至任何溶液相，包括水相或密封剂(例如油)相，抑制背景荧光噪声并消除除去水相的需要，改善可以进行测定的容易性和分析期间获得的图像质量。因此，本发明通过减少进行测定所需的步骤数目来简化和缩短数字测定的方案。例如，通过本发明公开的方法消除了在检测之前从油中除去水溶液的需要。此外，本发明可以进行修改用于高通量测定，应用于全自动分配***，减少测定产生的信号的背景，和改进数据准确性。本发明可以解决数字测定(特别是数字ELISA测定)的低通量问题和数据的准确性问题，这取决于个体差异或测试次数。另外，本文描述的改进方法提供一种独特的应用，其可以模拟“瞬逝光检测***”，而不需要使用高度昂贵的数字计数装置，诸如扫描近场光学显微镜。本公开的方法，例如，图7A中显示的方法，可以限制光区域(如图7B中所示)，其与瞬逝光检测***中的光区域相当。

1.定义

在描述本发明的实施方案之前，应当理解，本发明不限于描述的特定实施方案，因为这些当然可以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且无意进行限制。

本文中使用的“包含”、“包括”、“具有”、“可以”“含有”及其变体意图是开放式的过渡短语、术语或词语，其不排除另外动作或结构的可能性。单数形式“一个/种”、“且”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指明。本发明也预见到“包含”本文呈现的实施方案或元件、“由其组成”和”基本上由其组成”的其它实施方案，不论是否明确地阐述。

就本文中列举的数字范围而言，明确地预见到具有相同精确度的在二者之间的每个***数字。例如，就6-9的范围而言，除了6和9以外还预见到数字7和8，且就范围6.0-7.0而言，明确地预见到数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

在本文中可互换地使用的“亲和力”和“结合亲和力”表示结合成员与分析物的结合的趋势或强度。例如，结合亲和力可以由平衡解离常数(K_D)、解离速率(k_d)或结合速率(k_a)表示。

本文中使用的“类似物”表示具有与目标分子类似的结构的分子(例如，核苷类似物、核苷酸类似物、糖磷酸酯类似物、分析物类似物等)。分析物类似物是在结构上类似于分析物、但是结合成员对其具有不同亲和力的分子。

如本文可互换使用的“分析物”、“靶分析物”、“目标分析物”是指在本文公开的方法和装置中测量的分析物。本文进一步描述了目标分析物。

本文中使用的“一种抗体(Antibody)”和“多种抗体(antibodies)”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、动物抗体诸如但不限于禽(例如鸭子或鹅)、鲨鱼、鲸和哺乳动物，包括非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、犬、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如猴、黑猩猩等)、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')₂片段、二硫键连接的Fv(“sdFv”)和抗独特型(“抗Id”)抗体、双结构域抗体、双重可变结构域(DVD)或三重可变结构域(TVD)抗体(双重可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu，C.,等人，Nature Biotechnology，25(11):1290-1297(2007)和PCT国际专利申请WO 2001/058956中，其各自的内容通过引用并入本文)和上述任何的功能活性表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。为了简单起见，针对分析物的抗体在本文中经常被称为“抗分析物抗体”或仅“分析物抗体”。

本文中使用的“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。该部分不包括完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')₂片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变区的单链多肽、含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽和含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。

“珠子”和“颗粒”在本文中可互换地使用，且表示基本上球形的固体支持物。

“结合蛋白”在本文中用于指与结合配偶体结合并形成复合物的单体或多聚体蛋白，所述结合配偶体诸如例如多肽、抗原、化学化合物或其它分子或任一种的底物。结合蛋白特异性结合结合配偶体。结合蛋白包括抗体，以及其抗原结合片段和本领域已知和下文描述的其它各种形式和衍生物，以及包含一个或多个结合抗原分子或抗原分子上的特定位点(表位)的抗原结合结构域的其它分子。因此，结合蛋白包括，但不限于，抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG₁分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体和保留结合抗原的能力的任何这样的抗体的片段。

本文中使用的“捕获分子”是指用于捕获或固定生物样品中的目标分析物的特异性结合配偶体或特异性结合成员。捕获分子经常是除了目标分析物之外的复合物的一种组分，并且还可以含有一种或多种检测分子。所述复合物可以任选地与固体支持物结合。

“组分、”“多种组分、”或“至少一种组分”通常表示捕获抗体、检测试剂或缀合物、校准物、对照、灵敏度实验对象组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如，作为溶液)、停止溶液等，其根据本文所述的方法和本领域中已知的其它方法可以被包括在用于测定测试样品(诸如患者尿、血清、全血、组织抽吸物或血浆样品)的试剂盒中。一些组分可以是在溶液中或者被冻干以重构用于测定。

本文中使用的“接触”及其语法等同词表示任何类型的组合动作，其使结合成员与样品中的目标分析物足够近，以致于如果对所述结合成员特异性的目标分析物存在于所述样品中，将发生结合相互作用。接触可以以多种不同的方式实现，包括将所述样品与结合成员组合，通过引入结合成员与分析物紧密靠近而将靶分析物暴露于结合成员，等。

本文中使用的“对照”表示分析物的参比标准，诸如本领域中已知的或接受的，或使用可接受的方式凭经验确定，诸如通常采用的。“参比标准”是用作类似物质的测量基础的标准化物质。例如，在U.S. Pharmacopeial Convention (USP-NF), Food ChemicalsCodex, and Dietary Supplements Compendium (它们都可在http://www.usp.org得到)和其它众所周知的来源中公开了经记载的参比标准。在文献中描述了用于标准化参比的方法。还众所周知的是，通过使用分析物的校正曲线或通过与替代参比标准进行对比，定量存在的分析物的量的方式。通过质谱法、比重测定方法和通过本领域已知的其它技术，可以使用已知浓度的分析物的系列稀释物或溶液产生标准曲线。在文献中已经描述的替代参比标准包括标准添加(也被称作标准添加方法)或数字聚合酶链式反应。

本文中使用的“检测分子”是指特异性结合配偶体或特异性结合成员，其用于检测生物样品中的目标分析物的存在和/或定量或测量生物样品中的目标分析物的量。检测分子经常是复合物的一种组分，其可以含有一种或多种捕获分子和目标分析物。所述复合物可以任选地与固体支持物结合。

本文中使用的“固定化”表示所述第一特异性结合成员与固体支持物的表面的稳定结合。“稳定结合”是指两个实体之间的物理结合，其中结合的平均半衰期是一天或更多，例如，在生理条件下。在某些方面，两个实体之间的物理结合在PBS中在4℃具有2天或更多、1周或更多、1个月或更多(包括6个月或更多，例如，1年或更多)的平均半衰期。根据某些实施方案，所述稳定结合源自两个实体之间的共价键、两个实体之间的非共价键(例如，离子键或金属键)或其它形式的化学吸引力，诸如氢键合、范德华力等。

本文中使用的“标记”和“可检测的标记”是指结合至抗体或分析物以使得抗体和分析物之间的反应可检测的部分，并且如此标记的抗体或分析物被称为“可检测标记的”。标记可以产生可通过视觉或仪器装置检测的信号。各种标记包括产生信号的物质，诸如色原、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。本文描述了其它标记。在这方面，所述部分自身可以不是可检测的，但是与另一个部分反应后，可变得可检测。术语“可检测标记的”的使用旨在涵盖这样的标记。

本文中使用的“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的单一抗体除了可以少量存在的可能天然存在的突变以外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这样的抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”表示核苷碱基聚合物或寡聚体，其中核苷碱基通过糖磷酸酯键(糖-磷酸酯主链)连接。示例性的多核苷酸和寡核苷酸包括2'-脱氧核糖核苷酸的聚合物(DNA)和核糖核苷酸的聚合物(RNA)。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸组成，完全由2'-脱氧核糖核苷酸组成，或由它们的组合组成。“核酸”包括“多核苷酸”和“寡核苷酸”，且包括核苷酸单体的单链和双链聚合物。

本文中使用的“预定截止(cutoff)”和“预定水平”是指测定截止值，其用于通过将测定结果与预定截止/水平比较，来评估诊断、预后或治疗效力结果，其中预定截止/水平已经与各种临床参数(例如疾病的存在、疾病阶段、疾病严重度、疾病进展、非进展或改进等)联系或相关。本公开提供了示例性预定水平。然而，众所周知，截止值可能依赖于免疫测定的性质(例如采用的抗体、反应条件、样品纯度等)而变化。进一步完全在本领域技术人员的一般能力内的是，基于公开提供的描述，将本文公开的内容针对其它免疫测定进行调整，以获得用于那些其它免疫测定的免疫测定特异性截止值。尽管测定之间预定截止/水平的精确值可不同，但本文所述的相关性应当是普遍适用的。

如在本文所述的诊断测定中所用的，“预处理试剂”，例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是将存在于测试样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物增溶的试剂。如本文进一步所述，不是所有样品都需要预处理。此外，增溶分析物引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的(不要求分离步骤)或异质的(要求分离步骤)。使用异质性预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤前，将任何沉淀的分析物结合蛋白从测试样品去除。预处理试剂任选地可以包含：(a) 一种或多种溶剂和盐，(b) 一种或多种溶剂、盐和去污剂，(c) 去污剂，(d) 去污剂和盐，或(e) 适合于细胞裂解和/或分析物的增溶的任何试剂或试剂组合。

在本文描述免疫测定和试剂盒上下文中，“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照、和灵敏度实验对象组。为了确立校准(标准)曲线以内推(interpolation)分析物(诸如抗体或分析物)的浓度，通常使用“校准物”或“标准品”(例如，一种或多种，诸如多种)。或者，可以使用接近预定阳性/阴性截止的单个校准物。可以共同使用多个校准物(即，多于一个校准物或不同量的校准物)，以构成“灵敏度实验对象组”。

本文中使用的“受体”表示识别内源化学信号并对其做出应答的蛋白-分子。当这样的内源化学信号结合受体时，它们造成某种形式的细胞/组织-应答。受体的实例包括、但不限于神经受体、激素受体、营养物受体和细胞表面受体。

“一种重组抗体(Recombinant antibody)”和“多种重组抗体(recombinantantibodies)”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，包括通过重组技术将编码一种或多种单克隆抗体的全部或部分的核酸序列克隆至适当的表达载体内，并且随后在适当的宿主细胞中表达抗体。该术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、由抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能抗体、异源缀合物Ab、DVD-Ig(R)和如本文(i)中所述的其它抗体。(在Wu，C.,等人，Nature Biotechnology，25:1290-1297(2007)中描述的双重可变结构域免疫球蛋白及其制备方法)。在本文中使用的术语“双功能抗体”是指包含对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即双功能抗体具有双重特异性。

本文中使用的“样品”、“测试样品”、“生物样品”、“来自受试者的样品”、“流体生物样品”和“患者样品”可以互换使用，并且是指含有或怀疑含有目标分析物的流体样品。

如本文所用，“信号生成化合物”是指任何分子、化合物、蛋白等，其在暴露于合适或适当的转化剂(诸如信号生成底物)后可转化为可检测产物或可检测标记。“可检测产物”或“可检测标记”是通过使用本领域已知的选择技术充当检测实体便于检测的任何分子、颗粒等。信号生成化合物的实例是酶诸如淀粉酶、多核苷酸酶、精氨酸酶、腺苷酶、氨基多肽酶、胃蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、酪氨酸酶、醇脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、心肌黄酶、乙二醛酶、醛缩酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶(诸如β-半乳糖苷酶)、磷酸酶、磷酸化酶和己糖激酶或其组合。

如本文所用，“信号生成底物”是指任何分子、化合物、蛋白、物质、颗粒等，其可以转化为或产生信号生成化合物，所述信号生成化合物在暴露于合适或适当转化剂诸如信号生成化合物后被转化为可检测产物或可检测标记。“可检测化合物”或“可检测标记”是通过使用本领域已知的选择技术充当检测实体便于检测的任何分子、颗粒等。信号生成底物可以是比色的，化学发光的或化学荧光的。信号生成底物的实例是酶促底物，诸如化学发光底物，诸如CDP-Star(R)，(4-氯-3-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.1.s- up.3,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)，CSPD(R)或(3-(4-甲氧基螺){1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.1-.sup.3,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)；发光底物，诸如对硝基苯基磷酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)，4-硝基蓝四唑鎓氯化物(NBT)或碘硝基四唑鎓(INT)；荧光底物，诸如4-甲基伞形酮基磷酸酯(4-MUP)；和生色底物，诸如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)，5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二钠或对硝基苯基磷酸酯。

在本文中可互换地使用的“特异性结合配偶体”或“特异性结合成员”表示相比于显著更少的其他分子识别，特异性识别其他分子的两种或更多种不同分子中的一种。所述两种不同分子中的一种具有在表面上或在内腔中的区域，其特异性地结合其它分子的特定空间和极性组构并因此被定义为与所述其它分子的特定空间和极性组构互补。所述分子可以是特异性结合对的成员。例如，特异性结合成员可以包括、但不限于蛋白，诸如受体、酶和抗体。

除了常见免疫测定的抗原和抗体特异性结合对以外，其它特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)，碳水化合物和凝集素，互补核苷酸序列，效应子和受体分子，辅因子和酶，酶和酶抑制剂等。此外，特异性结合对可以包括作为原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原，抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物和片段，无论是分离的还是重组产生的。

如本文可互换使用的术语“固相”或“固体支持物”是指任何不溶性或可以通过后续反应使其不溶的材料。可以针对其固有的吸引和固定捕获试剂的能力选择固相。或者，固相可以具有与之附着的具有吸引和固定捕获试剂的能力的连接试剂。例如，连接试剂可以包括相对于捕获试剂本身或与捕获试剂缀合的带电物质，带相反电荷的带电物质。一般而言，连接试剂可以是固定在(附着至)固相上并且具有通过结合反应固定捕获试剂的能力的任何结合配偶体(优选特异性的)。连接试剂使得在测定进行之前或在测定进行期间，捕获试剂能够与固相材料间接结合。例如，固相可以是塑料、衍生化塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括例如试管、微量滴定孔、片、珠、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其它配置。

本文中使用的术语“受试者”和“患者”可互换地是指任何脊椎动物，包括但不限于，哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠，非人的灵长类(例如，猴，诸如食蟹猴或猕猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，所述受试者可以是人或非人。所述受试者或患者可能正在接受其它形式的治疗。

本文中使用的“阈值”表示根据经验确定的和主观的截止水平，获得的超过它的数据被视作“信号”，且获得的低于它的数据被视作“噪声”。采用基于CUSUM(累加和算法)的计算机程序来处理获得的数据，并基于从用户输入的阈值来检测事件。通过检测尽可能多的事件，随后为了特定目的而过滤此后的数据，来避免使用者之间的变动。对于“松”阈值，较少的事件数目将被计数为信号。对于“紧”阈值，较大的事件数目将被计数为信号。将阈值设定为松或紧是基于测定的期望灵敏度或特异性以及在给定的评估中是否偏好假阳性或假阴性的主观选择。

“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在本文中各自可互换使用，以描述逆转、减轻或抑制疾病的进展、或这样的术语适用于其的这样的疾病的一种或多种症状。根据受试者的状况，该术语还指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式执行。该术语还指在受该疾病折磨之前，降低疾病或与这样的疾病相关的症状的严重程度。这种在受折磨前，对疾病的严重程度的预防或降低是指将本发明的抗体或药物组合物施用于在施用时不受疾病折磨的受试者。“预防”还指预防疾病或与这样的疾病相关的一种或多种症状的复发。当“治疗”如上定义时，“治疗”和“治疗性”是指治疗的行为。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，将以本文件，包括定义，为准。下面描述了优选的方法和材料，但与本文所述的方法和材料相同或等同的那些可以用于实施或测试本发明。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以其整体通过引用并入，以包括和描述关于其引用出版物的方法和/或材料。本文公开的材料、方法和实例仅仅是说明性的，且并不意欲是限制性的。

2.改进的信号生成数字测定

本发明涉及改进的测定，诸如荧光免疫测定，其采用一系列反应容器(例如一个或多个孔)，使用溶剂孔密封进行密封，并且表现出降低的背景噪声。

在荧光免疫测定中，信号生成化合物的单分子可以通过在飞升室中累积由信号生成底物产生的可检测标记而生成可检测信号。尽管数字ELISA具有巨大的潜力，但缺点之一是该测定需要进行许多步骤。这些步骤包括：1)在固体支持物上形成捕获分子-目标分析物-检测分子复合物；2)将所述复合物捕获在液滴中；3)将液滴移入反应容器中并添加信号生成底物(与液滴同时或依次以任何顺序)以形成水相，4)将溶剂、诸如氟化油(FC40)添加至反应容器，引起水相和溶剂相转换，导致反应容器中水溶液的分离；5)除去水相(其为反应容器中的上层或顶层)；和6)使用数字计数装置(诸如光学显微镜)获取反应容器的图像。在步骤5中除去水相是为了消除背景信号相的目的，但非常耗时。具体地，本领域技术人员必须确保完全除去水相，因为水相的不完全除去将导致残余背景信号(荧光或发光噪声)。该背景噪声由上层水相中存在的信号(荧光或发光)引起，并且妨碍在数字计数装置(诸如光学显微镜)下信号生成液滴的数量的计数。

为了删除信号背景噪声，本发明涉及进行数字测定的改进方法，其涉及在添加液滴之前或之后或在将液滴和信号生成底物添加至反应容器之前或之后将一种或多种着色剂(诸如染料组分(例如黑色墨水))添加至溶液相(水性或密封剂(例如油))中。作为结果，着色剂(诸如黑色墨水或混合黑色墨水)的添加获得与去除水相相同的结果，因此在测定中完全不需要该步骤。在本文所述的染料混合方法中，着色剂不仅抑制通过溶剂添加而分离的水相中的背景信号噪声，而且还抑制数字计数装置中任何地方的背景信号噪声。作为结果，可以从具有最深色调(诸如黑色)的图像容易地获得没有背景的真实信号。尽管不希望受任何理论的束缚，但据信可以获得这样的真实信号的原因是反应容器的光程长度非常小(例如，如果使用飞升反应容器，腔室为仅4微米)，并且真实信号的透射率不受溶液中着色剂的影响或干扰。

本公开描述了使用包含多个反应容器的阵列使用涉及密封剂的溶剂密封方法测量或检测流体生物样品中存在的分析物的改进方法。例如，图1和2显示使用滴油密封方法的数字免疫测定的示意图。“数字ELISA”基于一百万个飞升大小的油包水(W/O)液滴的阵列装置。数字免疫测定可以是超高灵敏度免疫测定，诸如数字ELISA，其可以检测浓度约为阿mol/L至亚飞mol/L水平(阿=10^-18，飞=10^-15)的靶分子。滴油密封的其它方法包括描述于以下中的那些：例如，Rondelez等人, Nature biotechnology 23(3):361-365 (2005), Kim等人, Lab on a Chip 12(23):4986-4991(2012)，日本专利号3727026和国际专利公开号WO2012/121310 and WO2016/006208，其各自的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，生成信号的数字免疫测定包括飞升液滴阵列。

用于测量或检测分析物的方法包括将流体生物样品暴露或接触多个固体支持物以产生混合物，每个固体支持物包含至少一个能够结合分析物的第一特异性结合成员(“结合成员”可替换地称为“特异性结合成员”，且和如下所述)，其中所述特异性结合成员的至少一些级分结合分析物，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，且所述特异性结合成员的至少一些级分不结合任何分析物；向混合物中添加一个或多个第二特异性结合成员或使混合物与一个或多个第二特异性结合成员接触，所述第二特异性结合成员能够结合分析物，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，所述第二特异性结合成员包含信号生成化合物；将信号生成底物添加至固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物；和将固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中。在改进的方法中，在将固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中(即，飞升室形成)之前或之后添加着色剂。

将多个反应容器用密封剂(诸如重质氟化油)覆盖，并改变水相和密封剂相(例如油相)。在一些实施方案中，通过倾斜多个反应容器来改变水相和密封剂相(例如油相)。在一些实施方案中，所述重质氟化物油是FC-40、FC-72、FC-84、FC-77、FC-3255、FC-3283、FC-43、FC-70)、3M Novec 4200、3M Novec 4300、3M FC-4432、3M FC-4430或3M FC-4434。在改变水相和密封剂相(例如油相)之后，除去水相。将多个反应容器移至数字计数装置，诸如荧光显微镜，并且检测可检测信号的存在或不存在。所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。在一些实施方案中，使用光学显微镜(诸如荧光显微镜)检测可检测信号以获取荧光图像。在一些实施方案中，使用荧光显微镜检测可检测信号以获取荧光图像。

在一些实施方案中，多个反应容器可以是微孔阵列或纳米孔阵列。在一些实施方案中，所述微孔阵列或纳米孔阵列具有至少约4 mm、至少约5 mm、至少约6 mm、至少约7 mm、至少约8 mm、至少约9 mm、或至少约10 mm的直径。在一些实施方案中，所述微孔阵列具有6mm的直径。在一些实施方案中，所述微孔阵列或纳米孔阵列含有近似100,000至近似1,000,000个孔、近似200,000至近似750,000个孔或近似300,000至近似500,000个孔。在一些实施方案中，所述微孔阵列含有约100,000、约200,000、约300,000、约350,000、约375,000、约400,000、约425,000、约450,000、约475,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或约1,000,000个孔。在一些实施方案中，所述微孔阵列含有400,000个孔。在一些实施方案中，所述孔在孔的底部可以具有至少约1 μM直径、至少约2 μM直径、至少约3 μM直径、至少约4 μM直径、至少约5 μM直径、至少约6 μM直径、至少约7 μM直径、至少约8μM直径、至少约9 μM直径或至少约10 μM直径。在一些实施方案中，多个反应容器可以是微孔阵列或纳米孔阵列，其具有6 mm的直径且含有约400,000个在孔的底部具有5 μm直径的孔。

固定化的第一特异性结合成员和分析物之间的复合物形成之后，可以与样品一起从所述第一特异性结合成员附近除去任何未结合的分析物，而第一特异性结合成员和分析物的复合物由于它与固体支持物的结合可以保留。任选地，可以使固体支持物与洗涤缓冲液接触以除去非特异性地结合至固体支持物的任何分子。

第一个接触步骤和任选的样品除去和/或任选的洗涤步骤之后，可以使第一特异性结合成员和分析物的复合物与第二特异性结合成员接触，由此导致夹心复合物的形成，其中所述两个结合成员结合所述分析物。第二成员与第一特异性结合成员-分析物复合物的任选混合可以在第二个接触步骤中进行。在某些实施方案中，分析物分子相对于表面的固定化可以辅助任何多余的第二特异性结合成员从溶液中除去，无需担忧从所述表面移去分析物分子。在某些实施方案中，所述第二特异性结合成员可以包括与其附接的信号生成化合物。

如上面所指出的，所述第二个接触步骤可以在对于分析物和第二特异性结合成员之间的结合相互作用而言足够的条件下进行。所述第二个接触步骤之后，可以除去任何未结合的第二特异性结合成员，随后是任选的洗涤步骤。在一些实施方案中，在将固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中之前，除去未结合与第一特异性结合成员结合的分析物的第二特异性结合成员。

在一些实施方案中，所述信号生成化合物可以是碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶(β-Gal)。在一些实施方案中，所述信号生成底物可以是用于信号生成化合物的荧光底物。例如，所述信号生成底物可以是4-甲基伞形酮基磷酸酯(MUP)、荧光素二磷酸酯(FDP)、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基磷酸酯(DiFMUP)或9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO磷酸酯)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在反应混合物中的信号生成化合物的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是左旋咪唑。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之前或在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之后将混合物孵育一定时间段，其中所述时间段是孵育时段，且为约40分钟至约300分钟。在一些实施方案中，所述流体样品是血清、血浆或全血样品。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述流体样品与多个固体支持物接触之前，使所述流体样品与一种或多种去污剂、表面活性剂、非极性溶剂、超声处理、加热或其组合接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用以下公式计算截止值的步骤：CO=2S/N, S/N CO= 2 S/N，S/N比率是计算的来自具有分析物的血清样本的%信号除以来自没有分析物的血清样本的%信号。在一些实施方案中，所述固体支持物是磁性固体支持物。

本公开描述了用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的方法。所述方法包括使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物。每个固体支持物包括至少一个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物。用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物。将一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员添加至洗涤的混合物，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物。所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物。用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物。将信号生成底物添加至洗涤的固体支持物复合物。所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号。将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中。多个分开位置包括微孔阵列，如上所述。所述微孔或纳米孔用密封剂(例如重质氟化油)覆盖。改变水相和密封剂相(例如油相)。使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在。所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。在改进的方法中，在将洗涤的固体支持物空间分离至多个分开位置(即，飞升室形成)之前或之后添加着色剂。

在一些实施方案中，分析物的检测的灵敏度为至少约0.1 fM至至少约10 fM，至少约0.5 mIU/mL，或至少约0.24 pg/mL。在一些实施方案中，分析物的检测的灵敏度为至少约0.05 fM、至少约0.06 fM、至少约0.07 fM、至少约0.08 fM、至少约0.09 fM、至少约0.10fM、至少约0.11 fM、至少约0.12 fM、至少约0.13 fM、至少约0.14 fM、至少约0.15 fM、至少约0.5 fM、至少约1.0、至少约5 fM、至少约10 fM、至少约20 fM、至少约30 fM、至少约40fM、至少约50 fM、至少约60 fM、至少约70 fM、至少约80 fM、至少约90 fM或至少约100 fM。

例如，公开的方法可用于测量或检测生物样品中存在的分析物或用于诊断患者或筛选血液供应。

在示例性情况下，所述方法可以包括使样品与第一特异性结合成员(“结合成员”，可替换地称为“特异性结合成员”，且如下所述)接触，其中所述第一特异性结合成员固定在固体支持物上，且其中所述第一特异性结合成员特异性结合分析物；使所述分析物与第二特异性结合成员接触，所述第二特异性结合成员特异性结合分析物，且所述第二特异性结合成员包括下述的信号生成化合物或信号生成底物。

在某些情况下，可以将所述第一特异性结合成员固定化在固体支持物上。具有在其上面固定化了结合试剂(诸如一个或多个特异性结合成员)的表面的固体支持物可以是呈平面或非平面构象的任何方便表面，诸如微流体芯片的表面、隔室的内表面、珠子(如本文中定义)的外表面或多孔珠子的内表面和/或外表面。例如，所述第一特异性结合成员可以共价地或非共价地附接至珠子，例如，胶乳、琼脂糖、sepharose、抗生蛋白链菌素、甲苯磺酰基活化的、环氧树脂、聚苯乙烯、氨基珠子、胺珠子、羧基珠子等。在某些实施方案中，所述珠子可以是颗粒，例如，微粒。在某些实施方案中，所述微粒可以是约0.1 nm至约10微米，约50 nm至约5微米，约100 nm至约1微米，约0.1 nm至约700 nm，约500 nm至约10微米，约500nm至约5微米，约500 nm至约3微米，约100 nm至700 nm，或约500 nm至700 nm。例如，所述微粒可以是约4-6微米、约2-3微米或约0.5-1.5微米。小于约500 nm的颗粒有时被视作纳米颗粒。因而，所述微粒任选地可以是约0.1 nm至约500 nm之间、约10 nm至约500 nm之间、约50nm至约500 nm之间、约100 nm至约500 nm之间、约100 nm、约150 nm、约200 nm、约250 nm、约300 nm、约350 nm、约400 nm、约450 nm或约500 nm的纳米颗粒。

在某些实施方案中，所述珠子可以是磁珠或磁性颗粒。磁性珠子/颗粒可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁的、超顺磁的或铁磁流体的。示例性的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO₂、MnAs、MnBi、EuO、NiO/Fe。亚铁磁性材料的实例包括NiFe₂O₄、CoFe₂O₄、Fe₃O₄ (或FeO^.Fe₂O₃)。珠子可以具有固体核心部分，其为磁性的且被一个或多个非磁性层包围。可替代地，所述磁性部分可以是在非磁性核心周围的层。在其上面固定化了第一特异性结合成员的固体支持物可以以干燥形式或以液体形式储存。在使样品与在其上面固定化了第一特异性结合成员的磁珠接触之前或之后，可以使磁珠处于磁场中。

接触步骤之后，可以将样品和第一特异性结合成员孵育足够的时间段以允许发生结合成员和分析物之间的结合相互作用。另外，所述孵育可以是在促进特异性结合相互作用的结合缓冲液中。通过改变结合缓冲液，可以在测定中操作或改变所述第一特异性结合成员和/或所述第二特异性结合成员的结合亲和力和/或特异性。在某些实施方案中，通过改变结合缓冲液，可以增加所述结合亲和力和/或特异性。在某些实施方案中，通过改变结合缓冲液，可以降低所述结合亲和力和/或特异性。

使用下述的公开的方法可以测量所述第一特异性结合成员和/或所述第二特异性结合成员的结合亲和力和/或特异性。在某些实施方案中，使用一组条件测定样品的一个等分试样，并与使用不同组的条件测定的样品的另一个等分试样进行对比，由此确定所述条件对结合亲和力和/或特异性的影响。例如，变化或改变所述条件可以是以下一种或多种：从样品除去靶分析物，添加与靶分析物或配体竞争结合的分子，和改变pH、盐浓度或温度。额外地或可替换地，持续时间可以是可变的，且改变条件可以包括在再次执行检测方法之前等待持续时间。

所述结合缓冲液可以包括抗原-抗体结合缓冲液的分子标准，例如，白蛋白(例如，BSA)、非离子型去污剂(吐温-20、Triton X-100)和/或蛋白酶抑制剂(例如，PMSF)。在某些情况下，在加入样品之前或之后，可以将结合缓冲液加入微流体芯片、隔室等中。在某些情况下，在与样品接触之前，所述第一特异性结合成员可以存在于结合缓冲液中。用于发生结合成员和分析物之间的结合相互作用的时间长度可以根据经验确定，且可以取决于结合成员和分析物之间的结合亲和力和结合亲合力。在某些实施方案中，所述接触或孵育可以持续5秒至1小时的时间段，例如，10秒至30分钟，或1分钟至15分钟，或5分钟至10分钟，例如，10秒、15秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时或2小时。结合相互作用的其它条件(例如，温度、盐浓度)也可以根据经验确定，或可以基于生产商的说明书。例如，所述接触可以在室温(21℃-28℃，例如，23℃-25℃)、37℃或4℃进行。在某些实施方案中，在接触步骤过程中可以进行样品与第一特异性结合成员的任选混合。

固定化的第一特异性结合成员和分析物之间的复合物形成之后，可以与样品一起从所述第一特异性结合成员附近除去任何未结合的分析物，而第一特异性结合成员和分析物的复合物由于它与固体支持物的结合可以保留。任选地，可以使固体支持物与洗涤缓冲液接触以除去非特异性地结合至固体支持物的任何分子。

第一个接触步骤和任选的样品除去和/或任选的洗涤步骤之后，可以使第一特异性结合成员和分析物的复合物与第二特异性结合成员接触，由此导致夹心复合物的形成，其中所述两个结合成员结合所述分析物。第二成员与第一特异性结合成员-分析物复合物的任选混合可以在第二个接触步骤中进行。在某些实施方案中，分析物分子相对于表面的固定化可以辅助任何多余的第二特异性结合成员从溶液中除去，无需担忧从所述表面移去分析物分子。在某些实施方案中，所述第二特异性结合成员可以包括与其附接的信号生成化合物。

如上面所指出的，所述第二个接触步骤可以在对于分析物和第二特异性结合成员之间的结合相互作用而言足够的条件下进行。所述第二个接触步骤之后，可以除去任何未结合的第二特异性结合成员，随后是任选的洗涤步骤。通过合适的方式，例如，微滴驱动、电泳、电润湿、介电电泳、静电驱动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱法、离心或抽吸，可以使任何未结合的第二特异性结合成员与第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物分离。从第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物的附近除去任何未结合的第二特异性结合成员后，可以通过合适的方式分离信号生成化合物，所述信号生成化合物附接到存在于所述第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物中的第二特异性结合成员。

在某些实施方案中，所述信号生成化合物从第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物的分离在不会导致所述复合物的破坏的条件下实施，从而导致仅所述信号生成化合物从所述复合物的释放。在其它情况下，所述信号生成化合物从第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物的分离在可能导致所述复合物的破坏的条件下实施，从而导致所述信号生成化合物、以及所述第二特异性结合成员、所述分析物、所述第一特异性结合成员中的一种或多种从所述复合物的释放。

信号生成化合物分子的数目可以与所述复合物中分析物分子的数目相关联，后者与所述样品中分析物的浓度成比例。在某些实施方案中，信号生成化合物和分析物浓度之间的关联可以是直接的(较高的信号生成化合物分子数目与较高的分析物浓度有关)。在其中将信号生成化合物-带标签的竞争物或分析物(诸如示踪剂(如本文中定义))与样品相组合的实施方案中，所述信号生成化合物-带标签的竞争物或分析物会与所述样品中的分析物竞争对第一特异性结合成员的结合，信号生成化合物和分析物浓度之间的关联可以是相反的(较低的信号生成化合物分子数目与较高的分析物浓度有关)。信号生成化合物分子数目和分析物浓度之间的关联(无论是直接的还是相反的)可以是线性的或对数的。

在某些实施方案中，使用不同的第一特异性结合成员和第二特异性结合成员中的多个(其中一对第一结合成员和第二结合成员对样品中的单个分析物是特异性的)，可以执行单个样品中的多种分析物的同时分析。在这些实施方案中，与对单个分析物特异性的第一对第一特异性结合成员和第二特异性结合成员的第二特异性结合成员结合的信号生成化合物可以与下述信号生成化合物或信号生成底物区分开：与对不同分析物特异性的第二对第一特异性结合成员和第二特异性结合成员的第二特异性结合成员结合的信号生成化合物或信号生成底物。如上面所指出的，基于底物的差异，第一信号生成化合物可以与第二信号生成化合物或信号生成底物区分开。

在某些实施方案中，可以基本上准确地确定的流体样品中分析物的浓度小于约5000 fM (10^-15摩尔)、小于约3000 fM、小于约2000 fM、小于约1000 fM、小于约500 fM、小于约300 fM、小于约200 fM、小于约100 fM、小于约50 fM、小于约25 fM、小于约10 fM、小于约5 fM、小于约2 fM、小于约1 fM、小于约500 aM (10^-18摩尔)、小于约100 aM、小于约10aM、小于约5 aM、小于约1 aM、小于约0.1 aM、小于约500 zM (10^-21摩尔)、小于约100 zM、小于约10 zM、小于约5 zM、小于约1 zM、小于约0.1 zM或更小。

在某些情况下，检测限度(例如，在溶液中可以确定的分析物的最低浓度)是约100fM、约50 fM、约25 fM、约10 fM、约5 fM、约2 fM、约1 fM、约500 aM (10^-18摩尔)、约100 aM、约50 aM、约10 aM、约5 aM、约1 aM、约0.1 aM、约500 zM (10^-21摩尔)、约100 zM、约50 zM、约10 zM、约5 zM、约1 zM、约0.1 zM或更小。在某些实施方案中，可以基本上准确地确定的流体样品中分析物的浓度是在约5000 fM至约0.1 fM之间、约3000 fM至约0.1 fM之间、约1000 fM至约0.1 fM之间、约1000 fM至约0.1 zM之间、约100 fM至约1 zM之间、约100 aM至约0.1 zM之间或更小。

检测上限(例如，在溶液中可以确定的分析物的较高浓度)是至少约100 fM、至少约1000 fM、至少约10 pM (皮摩尔)、至少约100 pM、至少约100 pM、至少约10 nM (纳摩尔)、至少约100 nM、至少约1000 nM、至少约10µM、至少约100µM、至少约1000µM、至少约10mM、至少约100 mM、至少约1000 mM或更大。

在某些情况下，可以快速地检测分析物在样品中的存在和/或浓度，通常在小于约1小时中，例如，45分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、1分钟或30秒。

在一些实施方案中，一种或多种检测的信号对应于结合成员与分析物的结合事件。在一些实施方案中，一种检测的信号对应于结合成员与分析物的结合事件。在一些实施方案中，两种或更多种检测的信号对应于结合成员与分析物的结合事件。

在一些实施方案中，将包含所述第一特异性结合成员和第二特异性结合成员的固体支持物依次或同时添加至样品。

a)着色剂

在本发明中，在飞升室形成之前或之后添加着色剂。着色剂抑制上相中荧光物质的发光，而不需要除去水相的耗时步骤。在一些实施方案中，着色剂与信号生成底物同时添加。在一些实施方案中，在信号生成底物之前将着色剂添加至洗涤的固体支持物复合物。在一些实施方案中，在信号生成底物之后将着色剂添加至洗涤的固体支持物复合物。在一些实施方案中，将着色剂添加至置换的水相中或添加至密封剂相(例如油相)中。

在一些实施方案中，所述着色剂是黑色着色剂，诸如黑色或深色墨，诸如黑色墨，染料组分或基于颜料的组合物。在一些实施方案中，所述着色剂是印度墨，酸性黑2，酸性橙7，直接蓝14或其组合。可以根据用于数字测量技术上的信号检测的荧光材料来选择任何合适的染料组分。例如，可以使用AO7和DBu14试剂的组合，因为该组合可以在飞升室中有效地影响荧光素信号。在一些实施方案中，可以选择染料组合以观察任何测定的靶标(有利的)发射信号(参见例如，图12)。

i)印度墨

印度墨(也称为中国墨)是由与水组合以形成液体的各种细烟灰(称为灯黑)构成的简单的黑色或彩色墨。碳分子在胶体悬浮液中并且在干燥之后形成防水层。可以添加粘合剂诸如明胶或更常见的虫胶以使墨一旦干燥就更耐用，但粘合剂是不必要的。印度墨可以呈瓶装形式或作为墨棒(最常见地，棒)的固体形式，所述固体形式在使用前必须研磨并与水混合。如果使用粘合剂，则印度墨可以是防水的或不防水的。

ii)酸性黑2

酸性黑2，也称为苯胺黑，是主要由苯胺获得的深黑色颜料(或染料)。酸性黑2的化学结构显示于图9B中。

iii)酸性橙7

酸性橙7(“AO7”)也称为2-萘酚橙、橙II或酸性橙II，是通过2-萘酚或β-萘酚和氨基苯磺酸的重氮鎓化合物之间的偶联反应产生的染料。酸性橙7的化学结构显示于图9C中。

iv)直接蓝14

直接蓝14(“DBU14”)，也称为TRYPAN BLUE和VisionBlue，是重氮萘磺酸盐，其广泛用作染色剂。直接蓝14的化学结构显示于图9C中。

b)“添加”方法

着色剂可用于使用“添加”方法降低背景荧光。“添加”方法包括在水相被密封剂(例如油)置换(即，包括荧光物质的上部液相)或将着色剂添加至密封剂(例如油)之后将着色剂添加至水相或水相溶液，以有效地降低飞升室中的背景荧光噪声。着色剂抑制上部液相或水相中的荧光物质的发光。例如，“黑色墨添加”方法涉及在通过密封剂(例如油)置换水相之后将黑色墨添加至水相或水相溶液，或者添加至密封剂(例如油)，因此除去水相溶液的耗时步骤不是必需的。

c) “预混合”方法

着色剂可用于使用“预混合”方法降低背景荧光(参见图7A)。“预混合”方法在密封剂(例如油)密封之后不需要任何额外的程序，因为水相或水相溶液本身是深色的，诸如黑色，因此该程序是简化且更有效，因为仅需要翻转密封剂(例如油)。将着色剂(诸如黑色墨)与信号生成底物一起添加至水相或水相溶液，所述水相或水相溶液包括洗涤的固体支持物复合物，其包括与之附接的信号生成化合物，或者在将信号生成底物添加至洗涤的固体支持物复合物之前，将着色剂(诸如黑色墨)添加至含有信号生成化合物或洗涤的固体支持物复合物的水相或水相溶液。预混合着色剂诸如黑色墨与水相或水相溶液也可以抑制荧光素的发光，即使上部液相(水相)包括荧光物质。例如，“黑色墨预混合”方法涉及将黑色墨与反应的信号生成化合物/信号生成底物(即酶/底物)溶液混合，因此除去水相溶液的耗时步骤不是必要的。

d) 密封剂

在本发明中，反应容器可以通过使用密封剂(例如亲水性或疏水性溶剂)添加一种或多种溶剂(“溶剂孔密封”)来密封或覆盖，所述密封剂具有比水性相更重的密度。可以使用的亲水性溶剂包括亲水性醇、亲水性醚、酮、腈溶剂、二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺或其混合物。亲水性醇的实例包括乙醇、甲醇、丙醇和甘油。亲水性醚的实例包括四氢呋喃、聚环氧乙烷和1,4-二氧杂环己烷。酮的实例包括丙酮和甲基乙基酮。腈溶剂的实例包括乙腈。可以使用的疏水性溶剂包括烃、不饱和烃、芳烃、硅油、全氟化碳、卤素溶剂、疏水性离子液体及其混合物。饱和烃的实例包括烷烃，诸如癸烷和十六烷。不饱和烃的实例包括角鲨烯。芳烃的实例包括苯和甲苯。全氟化碳的实例涵盖Fluorinert(R)、FC-40、FC-72、FC-84、FC-77、FC-3255、FC-3283、FC-43、FC-70)、3M Novec 4200、3M Novec 4300、3M FC-4432、3M FC-4430或3M FC-4434。卤素溶剂的实例涵盖氯仿、二氯甲烷和氯苯。疏水性离子液体表示至少在水中不解离的离子液体。离子液体的实例包括1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐。

e)信号生成化合物和信号生成底物

分析物的检测通过可检测产物或可检测标记(即，由至少一种信号生成化合物和至少一种信号生成底物生成的信号)关联。在一些实施方案中，所述至少一种信号生成化合物是酶，并且所述至少一种信号生成底物是酶的底物。在一些实施方案中，酶的底物是比色、荧光(非荧光)底物或生色底物。在一些实施方案中，所述可检测信号是荧光信号。例如，所述酶可以是多核苷酸酶、精氨酸酶、腺苷酶、氨基多肽酶、胃蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、酪氨酸酶、醇脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、心肌黄酶、乙二醛酶、醛缩酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶(诸如β-半乳糖苷酶)、磷酸酶、磷酸化酶和己糖激酶或其组合。可以使用的酶促底物的实例包括化学发光底物，诸如CDP-StarV(R)，(4-氯-3-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.1.s- up.3,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)，CSPD(R)或(3-(4-甲氧基螺){1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.1- .sup.3,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)；发光底物，诸如对硝基苯基磷酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)，4-硝基蓝四唑鎓氯化物(NBT)或碘硝基四唑鎓(INT)；荧光底物，诸如4-甲基伞形酮基磷酸酯(4-MUP)；和生色底物，诸如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)，5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二钠或对硝基苯基磷酸酯。

在一些方面，可以使用的酶包括含有与除了酶的活性结合位点以外的位点结合的抑制剂分子(诸如蛋白、肽等)的酶。这样的抑制剂分子改变酶的活性结合位点的构象并且防止其与底物结合。抑制剂分子的实例包括蛋白酶抑制剂。可以使用本领域已知的常规技术从酶除去抑制剂，以允许酶结合底物，因此允许信号生成反应发生。

在一些实施方案中，所述酶可以将非荧光底物转化为荧光底物。在一些实施方案中，所述酶可使用生色底物生成颜色。

3.用于降低荧光数字免疫测定中的荧光背景噪声的方法

公开的方法还涉及降低用于检测样品中的分析物的荧光数字免疫测定中的荧光背景噪声的方法，如上所述。固相材料，诸如CYTOP、环烯烃聚合物(COP)和其它树脂，具有一些自发荧光，其通过增加背景噪声来影响检测。公开的方法使用包括黑色装置的数字计数装置。所述黑色装置包括固相材料，所述固相材料包含附接至透明装置的炭黑或黑色薄膜片。包含炭黑或黑色薄膜片的固相材料可以减少自发荧光。在一些实施方案中，所述固相材料是CYTOP、环烯烃聚合物(COP)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施方案中，所述固相材料包括CYTOP(R)、环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯(PC)或聚丙烯(PP)。在一些实施方案中，所述黑色装置足够厚，使得可以传输至纳米孔的激发光和来自纳米孔的信号光。在一些实施方案中，所述装置厚度为约0.1 mm至约1 mm，约0.5 mm至约1 mm，约0.1 mm至约0.75 mm，约0.5 mm至约0.75 mm。在一些实施方案中，所述装置厚度为小于约1 mm，小于约0.9 mm，小于约0.8 mm，小于约0.7 mm，小于约0.6 mm，小于约0.5 mm，小于约0.4 mm，小于约0.3 mm，小于约0.2 mm，或小于约0.1 mm。

在一些实施方案中，所述方法包括使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；用密封剂(例如油)覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂(例如油)置换；和使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括添加着色剂，如上所述。在一些实施方案中，将着色剂与信号生成底物同时添加至洗涤的固体支持物复合物，在信号生成底物之前添加至洗涤的固体支持物复合物，在信号生成底物之后添加至洗涤的固体支持物复合物，添加至置换的水相，或添加至密封剂(例如油)，如上所述。

4.特异性结合成员

本领域技术人员会明白，所述结合成员将取决于要分析的分析物。多种靶分子的结合成员是已知的，或可以使用已知技术容易地发现或开发。例如，当靶分析物是蛋白时，结合成员可以包括蛋白，特别是源自骆驼科动物的抗体或其片段(例如，抗原结合片段(Fab)、Fab' 片段、F(ab')₂片段、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv (“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体，诸如可变重链结构域(“VHH”；也被称作“VHH片段”) (VHH和制备它们的方法描述在Gottlin等人, Journal of Biomolecular Screening, 14:77-85 (2009))、重组VHH单结构域抗体和V_NAR片段、二硫键连接的Fv (“sdFv”)和抗-独特型(“抗-Id”)抗体和以上任一种的功能上有活性的表位结合片段、全长多克隆或单克隆抗体、抗体-样片段等)、其它蛋白，诸如受体蛋白、蛋白A、蛋白C等。在其中分析物是小分子(例如，类固醇、后胆色素类、类视黄醇和脂类)的情况下，所述第一特异性结合成员和/或所述第二特异性结合成员可以是支架蛋白(例如，脂质运载蛋白)或受体。在某些情况下，蛋白分析物的结合成员可以是肽。例如，当靶分析物是酶时，合适的结合成员可以包括酶基底和/或酶抑制剂，其可以是肽、小分子等。在某些情况下，当靶分析物是磷酸化的物质时，所述结合成员可以包含磷酸盐结合剂。例如，所述磷酸盐结合剂可以包含金属离子亲和介质诸如在美国专利号7,070,921和美国专利申请号2006/0121544中描述的那些。

当靶分子是碳水化合物时，潜在地合适的捕获组分(如本文中定义)包括，例如，抗体、凝集素和选择素。本领域普通技术人员会明白，可以与目标靶分子特异性地结合的任何分子可以潜在地用作结合成员。

对于某些实施方案，合适的靶分析物/结合成员复合物可以包括、但不限于，抗体/抗原、抗原/抗体、受体/配体、配体/受体、蛋白/核酸、酶/基底和/或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素和/或选择素、蛋白/蛋白、蛋白/小分子等。

在一个特定实施方案中，所述第一特异性结合成员和/或第二特异性结合成员可以通过链接附接到固体支持物，所述链接可以包含促进结合成员与支持物的附接的、所述支持物和/或结合成员的任何部分、官能化或修饰。结合成员和支持物之间的链接可以包括一个或多个化学或物理(例如，经由范德华力、氢键合、静电相互作用、疏水/亲水相互作用等的非特异性附接)键和/或提供这样的键的化学间隔物。

在某些实施方案中，固体支持物还可以包含保护性的、阻断性的或钝化性的层，该层可以消除或减小在测定过程中非捕获组分(例如，分析物分子、结合成员)与结合表面的非特异性附接，所述非特异性附接可能导致检测过程中的假阳性信号或导致信号的损失。在某些实施方案中可以用于形成钝化层的材料的实例包括、但不限于：聚合物，诸如聚乙二醇，其排斥蛋白的非特异性结合；具有该性质的天然存在的蛋白，诸如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性剂，例如，两性离子表面活性剂，诸如磺基甜菜碱；天然存在的长链脂类；聚合物刷子，和核酸，诸如鲑鱼精DNA。

某些实施方案利用是蛋白或多肽的结合成员。如本领域已知的，可以使用任何数目的技术将多肽附接至多种固体支持物。已知多种将反应性部分添加至蛋白的技术，例如，在美国专利号5,620,850中描述的方法。此外，已知将蛋白附接至表面的方法，例如，参见Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990)。

如本文中解释的，结合成员和分析物之间的结合是特异性的(例如，当结合成员和分析物是结合对的互补部分时)。在某些实施方案中，所述结合成员特异性地结合所述分析物。“特异性地结合”或“结合特异性”是指，结合成员以足以在分析物分子和测试样品的其它组分或污染物之间区分的特异性结合分析物分子。例如，根据一个实施方案，所述结合成员可以是特异性地结合分析物上的表位的抗体。根据一个实施方案，所述抗体可以是能够特异性地结合目标分析物的任何抗体。例如，适当的抗体包括、但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、微体、结构域抗体(dAb) (例如，诸如在Holt等人(2014) Trends inBiotechnology 21:484-490中所述)，且包括单结构域抗体sdAb，其为天然存在的，例如，如在软骨鱼和骆驼科中，或其为合成的，例如，纳米抗体、VHH或其它结构域结构)、合成的抗体(有时被称作抗体模拟物)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时被称作“抗体缀合物”)和分别每种的片段。作为另一个实施例，所述分析物分子可以是抗体，且所述第一特异性结合成员可以是抗原且所述第二特异性结合成员可以是特异性地结合靶抗体的第二抗体，或所述第一特异性结合成员可以是特异性地结合靶抗体的第二抗体且所述第二特异性结合成员可以是抗原。

在某些实施方案中，所述结合成员可以是化学上程序化的抗体(cpAb) (描述在Rader (2014) Trends in Biotechnology 32:186-197中)、双特异性的cpAb、抗体募集分子(ARM) (描述在McEnaney等人(2012) ACS Chem. Biol. 7:1139-1151)、支化捕获剂诸如三配体捕获剂(描述在Millward等人(2011) J. Am. Chem. Soc. 133:18280-18288)、从非抗体支架衍生出的经工程改造的结合蛋白诸如单抗体(源自人纤连蛋白的第十个纤连蛋白III型结构域)、亲和体(源自免疫球蛋白结合蛋白A)、DARPins (基于锚蛋白重复模块)、anticalins (源自脂质运载蛋白后胆色素-结合蛋白和人脂质运载蛋白2)和半胱氨酸结肽(knottin) (描述在Gilbreth和Koide, (2012) Current Opinion in StructuralBiology 22:1-8；Banta等人(2013) Annu. Rev. Biomed. Eng. 15:93-113)、WW结构域(描述在Patel等人(2013) Protein Engineering, Design & Selection 26(4):307-314)、重新设定目标的受体配体、affitins (描述在Behar等人(2013) 26:267-275)和/或Adhirons(描述在Tiede等人(2014) Protein Engineering, Design & Selection 27:145-155)。

根据一个其中分析物是生物细胞(例如，哺乳动物、禽类、爬虫类、其它脊椎动物、昆虫、酵母、细菌、细胞等)的实施方案，所述结合成员可以是对细胞表面抗原(例如，细胞表面受体)具有特异性亲和力的配体。在一个实施方案中，所述结合成员可以是粘附分子受体或其部分，其对在靶细胞类型的表面上表达的细胞粘附分子具有结合特异性。在使用中，粘附分子受体与在靶细胞的细胞外表面上的粘附分子结合，由此固定化或捕获所述细胞，然后可以使用第二特异性结合成员检测结合的细胞，所述第二特异性结合成员可以与第一特异性结合成员相同或可以结合在细胞的表面上表达的不同分子。

在某些实施方案中，分析物分子和结合成员之间的结合亲和力应当在测定的条件下足以保持结合，所述条件包括用于除去非特异性地结合的分子或颗粒的洗涤步骤。在某些情况下，例如在某些生物分子的检测中，分析物分子与它的互补结合成员的结合常数可以是在至少约10⁴至约10⁶ M^-1、至少约10⁵至约10⁹ M^-1、至少约10⁷至约10⁹ M^-1之间、大于约10⁹ M^-1或更大。

5.示例性的靶分析物

本领域技术人员会明白，使用本发明的方法和装置，可以检测并任选地定量可被第一特异性结合成员和第二特异性结合成员特异性地结合的任何分析物。

在某些实施方案中，所述分析物可以是生物分子或生物学分子。生物分子或生物学分子的非限制性实例包括大分子，例如，蛋白、脂类和碳水化合物。在某些情况下，所述分析物可以是激素、抗体、生长因子、细胞因子、酶、受体(例如，神经、激素、营养物和细胞表面受体)或它们的配体、癌症标志物(例如，PSA、TNF-α)、心肌梗塞的标志物(例如，肌钙蛋白、肌酸激酶、BNP、pro-BNP、NT-ProBNP、CK-MB、半乳凝素-3等)、甲状腺标志物(例如，抗Tg、抗TPO、游离T3、游离T4、T-摄取、总T3、总T4、TSH)、毒素、药物(例如，成瘾的药物)、代谢剂(例如，包括维生素)，等。蛋白分析物的非限制性实施方案包括肽、多肽、蛋白片段、蛋白复合物、融合蛋白、重组蛋白、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白等。在一些实施方案中，所述分析物可以是生物标志物，诸如用于创伤性脑损伤、败血症或凝血的生物标志物，涉及一般化学的分析物(例如氨、AST、胆固醇等)，蛋白(例如转铁蛋白、CRP等)，用于治疗药物监测的分析物(例如，甲氨蝶呤)，用于移植的分析物(例如他克莫司)，滥用药物，或用于遗传病症的生物标志物。

在某些实施方案中，所述分析物可以是翻译后修饰的蛋白(例如，磷酸化的、甲基化的、糖基化的蛋白)，且所述第一特异性结合成员或所述第二特异性结合成员可以是对翻译后修饰特异性的抗体。经修饰的蛋白可以结合固定化在固体支持物上的第一特异性结合成员，其中所述第一特异性结合成员结合经修饰的蛋白，但是不结合未经修饰的蛋白。在其它实施方案中，所述第一特异性结合成员可以结合未经修饰的和经修饰的蛋白，且所述第二特异性结合成员可以是对翻译后修饰的蛋白特异性的。

在某些实施方案中，所述分析物可以是细胞，例如，循环的肿瘤细胞、致病性细菌、病毒(包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒、丝状病毒(例如，西尼罗河病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒)、肝炎病毒(例如，甲型、乙型、丙型、丁型和戊型)；HPV、细小病毒等；孢子等。

通过本文呈现的方法可以分析的分析物的一个非限制性列表包括Aβ42淀粉样蛋白β-蛋白、胎球蛋白-A、tau、分泌粒蛋白II、朊病毒蛋白、α-突触核蛋白、tau蛋白、神经丝轻链、parkin、PTEN诱导的假定激酶1、DJ-1、富亮氨酸重复序列激酶2、突变的ATP13A2、Apo H、血浆铜蓝蛋白、过氧化物酶体增殖子活化的受体γ共活化剂-1α(PGC-1α)、转甲状腺素蛋白、维生素D-结合蛋白、活性B12、B12、皮质醇、叶酸、果糖胺(frustosamine)、高半胱氨酸、完整PTH、胃蛋白酶原I和II、DHEA-S、***、hCG、孕酮、催乳素、SHBG、睾酮、促细胞凋亡的激酶R(PKR)和它的磷酸化的PKR(pPKR)、IL-12p40、CXCL13、IL-8、Dkk-3(***)、p14endocan片段、血清、ACE2、针对CD25的自身抗体、hTERT、CAI25(MUC 16)、VEGF、sIL-2、骨桥蛋白、人附睾蛋白4(HE4)、α-胎蛋白、白蛋白、白蛋白尿、微白蛋白尿、嗜中性粒细胞明胶酶-相关的脂质运载蛋白(NGAL)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、白介素18(IL-18)、肾损伤分子-1(KIM-1)、肝脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、LMP1、BARF1、IL-8、BRAF、CCNI、EGRF、FGF19、FRS2、GREB1和LZTS1、α-淀粉酶、癌胚抗原(CEA)、CA 125、IL8、硫氧还蛋白、β-2微球蛋白水平- 监测病毒的活性、肿瘤坏死因子-α受体- 监测病毒的活性、甲胎蛋白(AFP)、CA15-3、CA 19-9、CYFRA 21-1、HE-4、PIVKA-11、ProGRP、SCC、CA15-3、促卵泡激素(FSH)、黄体化激素(LH)、T-细胞淋巴瘤侵入和转移1(TIAM1)、N-钙粘着蛋白、EC39、双调蛋白、脱氧尿苷三磷酸酶、分泌型凝溶胶蛋白(pGSN)、PSA(***特异性抗原)、胸腺素βl5、胰岛素、血浆C-肽、糖基化的血红蛋白(HBA1c)、C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、ARHGDIB(Rho GDP-解离抑制剂2)、CFL1(丝切蛋白-1)、PFN1(profilin-1)、GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶P)、S100A11(蛋白S100-A11)、PRDX6(过氧化物氧还蛋白-6)、HSPE1(10 kDa热激蛋白、线粒体的)、LYZ(溶菌酶C前体)、GPI(葡萄糖-6-磷酸异构酶)、HIST2H2AA(组蛋白H2A类型2-A)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、HSPG2(基膜-特异性的硫酸类肝素蛋白聚糖核心蛋白前体)、LGALS3BP(半乳糖凝集素-3-结合蛋白前体)、CTSD(组织蛋白酶D前体)、APOE(载脂蛋白E前体)、IQGAP1(RasGTPase-活化样蛋白IQGAP1)、CP(血浆铜蓝蛋白前体)和IGLC2(IGLC1蛋白)、PCDGF/GP88、EGFR、HER2、MUC4、IGF-IR、p27 (kip1)、Akt、HER3、HER4、PTEN、PIK3CA、SHIP、Grb2、Gab2、PDK-1(3-磷酸肌醇磷脂依赖性的蛋白激酶-1)、TSC1、TSC2、mTOR、MIG-6(ERBB受体反馈抑制剂1)、S6K、src、KRAS、MEK促***原活化蛋白激酶1、cMYC、TOPO II拓扑异构酶(DNA)IIα170kDa、FRAP1、NRG1、ESR1、ESR2、PGR、CDKN1B、MAP2K1、NEDD4-1、FOXO3A、PPP1R1B、PXN、ELA2、CTNNB1、AR、EPHB2、KLF6、ANXA7、NKX3-1、PITX2、MKI67、PHLPP、脂联素(ADIPOQ)、纤维蛋白原α链(FGA)、瘦素(LEP)、高级糖基化终产物-特异性的受体(AGER aka RAGE)、α-2-HS-糖蛋白(AHSG)、血管生成素(ANG)、CD14分子(CD14)、铁蛋白(FTH1)、胰岛素-样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)、白介素2受体、α(IL2RA)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)和Von Willebrand因子(VWF)、髓过氧化物酶(MPO)、IL1α、TNFα、核周抗-嗜中性粒细胞胞质抗体(p-ANCA)、乳铁蛋白、钙卫蛋白、威尔曼瘤-1蛋白、水通道蛋白-1、MLL3、AMBP、VDAC1、大肠杆菌(E. coli)肠毒素(热不稳定的外毒素、热稳定的肠毒素)、流感HA抗原、破伤风毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、志贺样毒素I、志贺样毒素II、难辨梭菌(Clostridium difficile)毒素A和B等。

使用主题方法可以在样品(诸如环境样品、得自有需要的患者或受试者的生物样品)中测量的示例性靶标包括：滥用的药物(例如***)、蛋白生物标志物(包括但不限于，核仁素、核因子-kB必需的调节剂(NEMO)、CD-30、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、血管内皮生长因子(VEGF)、MUC1糖型、免疫球蛋白 μ重链(IGHM)、免疫球蛋白E、αvβ3整联蛋白、α-凝血酶、HIV gp120、NF-κB、E2F转录因子、HER3、纤溶酶原激活物抑制剂、腱糖蛋白C、CXCL12/SDF-1、***特异性的膜抗原(PSMA)、胃癌细胞、HGC-27)；细胞(包括但不限于，非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌细胞、(DLD-1)、H23肺腺癌细胞、Ramos细胞、T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)细胞、CCRF-CEM、急性髓样白血病(AML)细胞(HL60)、小细胞肺癌(SCLC)细胞、NCIH69、人胶质母细胞瘤细胞、U118-MG、PC-3细胞、过表达HER-2的人乳腺癌细胞、SK-BR-3、胰腺癌细胞系(Mia-PaCa-2))；和传染性病原体(包括但不限于，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、大肠杆菌O157:H7、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌属(Salmonella)O8和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))。

使用主题方法可以在得自有需要的患者或受试者的样品中测量的示例性靶标包括、但不限于：HBV核衣壳蛋白、CDK2、E2F转录因子、胸苷酸合酶、Ras、EB1和高级糖化终产物的受体(RAGE)。

6.样品

本文中使用的“样品”、“测试样品”、“生物样品”表示含有或疑似含有目标分析物的流体样品。所述样品可以源自任意合适的来源。在某些情况下，所述样品可以包含液体、流动的微粒固体、或固体颗粒的流体混悬液。在某些情况下，在本文描述的分析之前可以处理所述样品。例如，所述样品可以在分析之前从它的来源分离或纯化；但是，在某些实施方案中，可以直接测定未处理的含有分析物的样品。分析物分子的来源可以是合成的(例如，在实验室中生产)、环境(例如，空气、土壤、流体样品，例如，水供给等)、动物(例如，哺乳动物)、植物或它们的任意组合。在一个特定实施例中，分析物的来源是人体物质(例如，体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、***、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间隙液、肺灌洗液、脑脊液、粪便、组织、器官等)。组织可以包括、但不限于骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。所述样品可以是液体样品或固体样品的液体提取物。在某些情况下，所述样品的来源可以是器官或组织，诸如活组织检查样品，其可以通过组织崩解/细胞裂解而溶解。

可以分析宽范围体积的流体样品。在几个示例性实施方案中，样品体积可以是约0.5 nL、约1 nL、约3 nL、约0.01 μL、约0.1 μL、约1 μL、约5 μL、约10 μL、约100 μL、约1mL、约5 mL、约10 mL等。在某些情况下，流体样品的体积是在约0.01 μL至约10 mL之间、约0.01 μL至约1 mL之间、约0.01 μL至约100 μL之间、或约0.1 μL至约10 μL之间。

在某些情况下，所述流体样品在用于测定中之前可以稀释。例如，在其中分析物分子的来源是人体液(例如，血液、血清)的实施方案中，可以用适当的溶剂(例如，缓冲液诸如PBS缓冲液)稀释所述流体。在使用之前，可以将流体样品稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更大。

在某些情况下，所述样品可以经历分析前处理。分析前处理可以提供另外的功能性诸如非特异性的蛋白除去和/或有效的、仍然可廉价实现的混合功能性。分析前处理的一般方法可以包括使用电动陷俘、AC动电学、表面声波、等速电泳、介电电泳、电泳、或本领域中已知的其它预浓缩技术。在某些情况下，在用于测定中之前可以浓缩流体样品。例如，在其中分析物分子的来源是人体液(例如，血液、血清)的实施方案中，通过沉淀、蒸发、过滤、离心或它们的组合可以浓缩所述流体。在使用之前，可以将流体样品浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更大。

在某些实施方案中，在测量分析物之前没有扩增分析物(即，分析物的拷贝数没有增加)。例如，在其中分析物是DNA或RNA的情况下，没有将所述分析物复制以增加所述分析物的拷贝数。在某些情况下，所述分析物是蛋白或小分子。

7.方法的变体

公开的确定目标分析物在样品中的存在或量的方法可以如上所述。考虑到用于分析分析物的其它方法，还可以调整所述方法。众所周知的变体的实例包括、但不限于，免疫测定，诸如夹心免疫测定(例如，单克隆-多克隆夹心免疫测定，包括酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争性抑制免疫测定(例如，正向和反向)、酶多种免疫测定技术(EMIT)、竞争性结合测定、生物发光共振能量转移(BRET)、一步抗体检测测定、均匀测定、异质测定、运行中捕获(capture on the fly)测定等。在某些情况下，下面的描述可以与上述方法重叠；在其它情况下，下面的描述可以提供替代。

a) 免疫测定

使用免疫测定可以分析目标分析物和/或肽或其片段。使用本文描述的抗体并检测与目标分析物的特异性结合，可以确定目标分析物的存在或量。可以利用任何免疫测定。所述免疫测定可以是例如酶联免疫测定(ELISA)、竞争性抑制测定，诸如正向或反向竞争性抑制测定或竞争性结合测定。在某些实施方案中，一个信号生成化合物或信号生成底物附接到捕获抗体和检测抗体。可替代地，用于捕获的微粒也可以起作用用于检测。

可以使用均质形式。例如，在从受试者获得测试样品之后，制备混合物。所述混合物含有针对分析物评价的测试样品、第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体。添加测试样品、第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不重要。使测试样品与第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体同时接触。在一些实施方案中，测试样品中含有的第一特异性结合配偶体和任何目标分析物可以形成第一特异性结合配偶体-目标分析物-抗原复合物，且第二特异性结合配偶体可以形成第一特异性结合配偶体-目标分析物-第二特异性结合配偶体复合物。在一些实施方案中，测试样品中含有的第二特异性结合配偶体和任何目标分析物可以形成第二特异性结合配偶体-目标分析物-抗原复合物，且第一特异性结合配偶体可以形成第一特异性结合配偶体-目标分析物-第二特异性结合配偶体复合物。此外，第二特异性结合配偶体用如本文所述的可检测标记进行标记或含有如本文所述的可检测标记。

可以使用异质形式。例如，在从受试者得到测试样品之后，制备第一混合物。所述混合物含有要针对目标分析物进行评估的测试样品和第一特异性结合配偶体，其中所述第一特异性结合配偶体和在所述测试样品中所含的任何目标分析物形成第一特异性结合配偶体-目标分析物复合物。优选地，所述第一特异性结合配偶体是抗-目标分析物抗体或其片段。为了形成所述混合物而加入测试样品和第一特异性结合配偶体的次序不是关键性的。优选地，所述第一特异性结合配偶体固定化在固相上。在免疫测定中使用的固相(用于第一特异性结合配偶体，和任选地，第二特异性结合配偶体)可以是本领域中已知的任何固相，例如，但不限于、磁性颗粒、珠子、纳米珠子、微米珠子、纳米颗粒、微粒、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片(例如，微流体芯片)。在其中固相是珠子的那些实施方案中，所述珠子可以是磁珠或磁性颗粒。磁性珠子/颗粒可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁的、超顺磁的或铁磁流体的。示例性的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO₂、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁性材料的实例包括NiFe₂O₄、CoFe₂O₄、Fe₃O₄ (或FeO^.Fe₂O₃)。珠子可以具有固体核心部分，其为磁性的且被一个或多个非磁性层包围。可替代地，所述磁性部分可以是在非磁性核心周围的层。在其上面固定化了第一特异性结合成员的固体支持物可以以干燥形式或以液体形式储存。在使样品与在其上面固定化了第一特异性结合成员的磁珠接触之前或之后，可以使磁珠处于磁场中。

形成含有第一特异性结合配偶体-目标分析物复合物的混合物之后，使用本领域中已知的任何技术从所述复合物除去任何未结合的目标分析物。例如，通过洗涤可以除去未结合的目标分析物。但是，理想地，第一特异性结合配偶体比存在于测试样品中的任何目标分析物过量地存在，使得存在于测试样品中的所有目标分析物被第一特异性结合配偶体结合。

除去任何未结合的目标分析物之后，将第二特异性结合配偶体加入所述混合物中以形成第一特异性结合配偶体-目标分析物-第二特异性结合配偶体复合物。所述第二特异性结合配偶体优选地是结合目标分析物上的表位的抗-目标分析物抗体，所述表位不同于所述第一特异性结合配偶体结合的目标分析物上的表位。此外，也优选地，所述第二特异性结合配偶体用信号生成化合物或信号生成底物标记或含有信号生成化合物或信号生成底物，如上所述。

固定化的抗体或其片段的应用可以整合在免疫测定中。所述抗体可以固定化在多种支持物上，诸如磁性或色谱基体颗粒、胶乳颗粒或改性的表面胶乳颗粒、聚合物或聚合物薄膜、塑料或塑料薄膜、平面基底、微流体表面、固体基底材料的碎片等。

b) 夹心免疫测定

夹心免疫测定测量两个抗体层(即，捕获抗体(即至少一种捕获抗体)和检测抗体(即至少一种检测抗体))之间的抗原的量。捕获抗体和检测抗体结合抗原(例如，目标分析物)上的不同表位。理想地，捕获抗体与表位的结合不会干扰检测抗体与表位的结合。单克隆或多克隆抗体可以在夹心免疫测定中用作捕获抗体和检测抗体。

通常，采用至少两种抗体来分离和定量测试样品中的目标分析物。更具体地，所述至少两种抗体结合形成免疫复合物(其被称作“夹心”)的目标分析物的某些表位或目标分析物片段。一种或多种抗体可以用于捕获测试样品中的目标分析物(这些抗体经常被称作“捕获”抗体)，且一种或多种也结合目标分析物的具有信号生成化合物或信号生成底物的抗体可以用于完成夹心(这些抗体经常被称作“检测”抗体或“检测”抗体)。在夹心测定中，测定中的任意其它抗体与它各自表位的结合理想地不会减少抗体与它的表位的结合。换而言之，选择抗体，使得与疑似含有目标分析物的测试样品发生接触的一种或多种第一抗体不会结合被第二或随后抗体识别的全部或部分表位，由此干扰一种或多种第二检测抗体的结合目标分析物的能力。上述捕获抗体是捕获抗体的实例。上述检测抗体是检测抗体的实例。

在一个优选的实施方案中，疑似含有目标分析物的测试样品可以同时或依次与至少一种捕获抗体和至少一种检测抗体接触。在夹心测定形式中，首先使疑似含有目标分析物(膜相关的目标分析物、可溶性的目标分析物、膜相关的目标分析物的片段、可溶性的目标分析物的片段、目标分析物(膜相关的或可溶性的目标分析物)的变体或其任意组合)的测试样品与至少一种捕获抗体接触，所述捕获抗体在允许形成抗体-目标分析物复合物的条件下特异性地结合特定表位。如果使用超过一种捕获抗体，形成多种捕获抗体-目标分析物复合物。在夹心测定中，以相对于在测试样品中预见到的目标分析物或目标分析物片段的最大量摩尔过量的量使用抗体，优选地，至少一种捕获抗体。

任选地，在使测试样品与至少一种第一捕获抗体接触之前，所述至少一种捕获抗体可以结合至促进抗体-目标分析物复合物从测试样品分离的固体支持物。可以使用本领域中已知的任何固体支持物，包括、但不限于，呈平面基底或珠子等形式的由聚合材料制成的固体支持物。使用化学偶联剂或通过本领域中已知的其它方式，通过吸附、通过共价键合，可以使所述抗体结合至固体支持物，前提条件是，这样的结合不会干扰所述抗体的结合目标分析物或目标分析物片段的能力。此外，如果必要的话，可以将固体支持物衍生化以允许与所述抗体上的各种官能团的反应性。这样的衍生化需要使用某些偶联剂，例如，但不限于，马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、叠氮基、炔基和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。

使疑似含有目标分析物的测试样品与至少一种捕获抗体接触之后，将测试样品孵育以便允许形成捕获抗体-目标分析物复合物。所述孵育可以在约4.5至约10.0的pH、在约2℃至约45℃的温度进行，并持续至少约1分钟至约18小时、约2-6分钟或约3-4分钟的时间段。

形成捕获抗体-目标分析物复合物之后，然后使所述复合物与至少一种检测抗体接触(在允许形成捕获抗体-目标分析物-检测抗体复合物的条件下)。如果使捕获抗体-目标分析物复合物与超过一种检测抗体接触，那么形成捕获抗体-目标分析物-检测抗体检测复合物。与捕获抗体一样，当使至少一种检测(和随后)抗体与捕获抗体-目标分析物复合物接触时，捕获抗体-目标分析物-检测抗体复合物的形成需要在与上述那些类似的条件下的孵育时间段。优选地，至少一种检测抗体含有信号生成化合物或信号生成底物。在形成捕获抗体-目标分析物-检测抗体复合物之前、同时或之后，信号生成化合物或信号生成底物可以结合至少一种检测抗体。

为了形成测定混合物而加入测试样品和特异性结合配偶体的次序不是关键性的。如果第一特异性结合配偶体被附接至信号生成化合物或信号生成底物，那么形成信号生成化合物或信号生成底物附接的的第一特异性结合配偶体-目标分析物复合物。可替换地，如果使用第二特异性结合配偶体且所述第二特异性结合配偶体被附接至信号生成化合物或信号生成底物，那么形成信号生成化合物或信号生成底物附接的第一特异性结合配偶体-目标分析物-第二特异性结合配偶体的复合物。使用本领域已知的任何技术，诸如洗涤，可以从混合物除去任何未结合的特异性结合配偶体，无论是标记的还是未标记的。

接着，产生信号，其指示目标分析物或其片段的存在。基于产生的信号的参数，可以定量样品中目标分析物的量。任选地，通过质谱法、比重测定方法和本领域已知的其它技术，可以使用已知浓度的目标分析物的系列稀释物或溶液产生标准曲线。

c) 正向竞争性抑制

在正向竞争形式中，使用已知浓度的经标记的目标分析物的等分试样与测试样品中的目标分析物竞争对目标分析物抗体的结合。

在正向竞争测定中，可以使固定化的特异性结合配偶体(诸如抗体)依次或同时与测试样品和经标记的目标分析物、其目标分析物片段或目标分析物变体接触。目标分析物肽、目标分析物片段或目标分析物变体可以与信号生成化合物或信号生成底物标记。在该测定中，所述抗体可以固定化在固体支持物上。可替换地，所述抗体可以偶联到已经固定化在固体支持物(诸如微粒或平面基底)上的抗体，诸如抗物种抗体。

在与上面关于夹心测定形式描述的那些类似的条件下孵育经标记的目标分析物、测试样品和抗体。然后可以产生两种不同的抗体-目标分析物复合物。具体地，产生的抗体-目标分析物复合物之一含有信号生成化合物或信号生成底物，而其它抗体-目标分析物复合物不含有信号生成化合物或信号生成底物。在定量可检测产物或可检测标记之前，所述抗体-目标分析物复合物可以、但是不一定与测试样品的剩余部分分离。不论抗体-目标分析物复合物是否与测试样品的剩余部分分离，然后定量抗体-目标分析物复合物中的可检测产物或可检测标记(例如，可检测信号)的量。然后可以确定在测试样品中的目标分析物(诸如膜相关的目标分析物、可溶性的目标分析物、可溶性的目标分析物的片段、目标分析物(膜相关的或可溶性的目标分析物)的变体或其任意组合)的浓度，例如，如上所述。如果有益的话，通过将抗体-目标分析物复合物中的可检测产物或可检测标记(例如，可检测信号)的量与标准曲线进行对比，可以进行确定。使用已知浓度的目标分析物(诸如膜相关的目标分析物、可溶性的目标分析物、可溶性的目标分析物的片段、目标分析物(膜相关的或可溶性的目标分析物)的变体或其任意组合)的系列稀释物可以产生标准曲线，其中通过质谱法、比重测定法和通过本领域已知的其它技术确定浓度。

任选地，可以如下将抗体-目标分析物复合物与测试样品分离：使所述抗体结合固体支持物，诸如上面关于夹心测定形式讨论的固体支持物，并然后从与固体支持物的接触除去测试样品的剩余部分。

d) 反向竞争测定

在反向竞争测定中，固定化的目标分析物可以依次或同时接触测试样品和至少一种标记的抗体。目标分析物可以结合至固体支持物，诸如上面关于夹心测定形式讨论的固体支持物。

在与上面关于夹心测定形式描述的那些类似的条件下孵育固定化的目标分析物、测试样品和至少一种标记的抗体。然后产生两种不同的目标分析物-抗体复合物。具体地，产生的目标分析物-抗体复合物之一被固定化且含有信号生成化合物或信号生成底物，而其它目标分析物-抗体复合物没有固定化且含有信号生成化合物或信号生成底物。通过本领域已知的技术，诸如洗涤，从固定化的目标分析物-抗体复合物的存在除去未固定化的目标分析物-抗体复合物和测试样品的剩余部分。一旦除去未固定化的目标分析物抗体复合物，然后定量固定化的目标分析物-抗体复合物中的信号生成化合物或信号生成底物的量。然后可以通过如上所述对比可检测信号的量来确定测试样品中的目标分析物的浓度。如果有益的话，这可以使用标准曲线完成。使用已知浓度的目标分析物或目标分析物片段的系列稀释物可以产生标准曲线，其中通过质谱法、比重测定法和通过本领域已知的其它技术确定浓度。

e) 一步免疫测定或运行中捕获测定

在一步免疫测定或运行中捕获测定中，用固定化试剂预包被固体基底。将捕获剂、分析物和检测剂一起加入固体基底，继之以在检测前的洗涤步骤。捕获剂可以结合分析物且包含固定化试剂的配体。捕获剂和检测剂可以是抗体或本文描述的或本领域已知的能够捕获或检测的任意其它部分。所述配体可以包含肽标签，且所述固定化试剂可以包含抗-肽标签抗体。可替代地，所述配体和所述固定化试剂可以是能够结合在一起从而用于运行中捕获测定的任何试剂对(例如，特异性结合对和其它，诸如本领域已知的)。可以测量超过一种分析物。在某些实施方案中，可以用抗原包被固体基底，且要分析的分析物是抗体。

在某些实施方案中，使用用固定化试剂(诸如生物素、抗生蛋白链菌素等)预包被的固体支持物(诸如微粒)和至少第一特异性结合成员和第二特异性结合成员(其分别作为捕获试剂和检测试剂起作用)。第一特异性结合成员包含固定化试剂的配体(例如，如果在固体支持物上的固定化试剂是抗生蛋白链菌素，在第一特异性结合成员上的配体可以是生物素)且也结合目标分析物。第二特异性结合成员包含信号生成化合物或信号生成底物且结合目标分析物。可以将固体支持物和第一和第二特异性结合成员加入测试样品(依次或同时)。在第一特异性结合成员上的配体结合固体支持物上的固定化试剂以形成固体支持物/第一特异性结合成员复合物。存在于样品中的任何目标分析物结合固体支持物/第一特异性结合成员复合物以形成固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物。第二特异性结合成员结合固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物，并检测信号生成化合物或信号生成底物。在检测之前可以采用任选的洗涤步骤。在某些实施方案中，在一步测定中，可以测量超过一种分析物。在某些其它实施方案中，可以采用超过两种特异性结合成员。在某些其它实施方案中，可以加入多种信号生成化合物或信号生成底物。在某些其它实施方案中，可以检测多种目标分析物。

一步免疫测定或运行中捕获测定的应用可以以本文中描述的和本领域已知的多种形式进行。例如所述形式可以是夹心测定诸如上述，但是可替代地可以是竞争测定，可以采用单个特异性结合成员，或使用其它变体诸如已知的。

f) 组合测定(用Ag/Ab共包被微粒)

在组合测定中，将固体基底(诸如微粒)用抗原和抗体共包被以分别从样品捕获抗体和抗原。可以将固体支持物用两种或更多种不同抗原共包被以从样品捕获两种或更多种不同抗体。可以将固体支持物用两种或更多种不同抗体共包被以从样品捕获两种或更多种不同抗原。

另外，本文所述的方法可以使用封闭剂阻止测定化合物之间的特异性的或非特异性的结合反应(例如，HAMA参与)。一旦所述试剂(和任选地，任何对照)被固定化在支持物上，可以在所述支持物上封闭所述试剂的剩余结合位点。可以使用本领域普通技术人员已知的任意合适的封闭剂。例如，可以采用牛血清白蛋白(“BSA”)、酪蛋白在PBS中的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)溶液、Tween 20™(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)或其它合适的表面活性剂，以及其它封闭剂。

从本发明会明白，本文公开的方法(包括变体)可以用于诊断疑似具有疾病、障碍或病症的受试者中的疾病、障碍或病症。例如，所述样品分析可以用于检测疾病标志物，例如，癌症标志物、心脏病症的标志物、毒素、病原体，例如，病毒、细菌或其部分。所述方法也可以用于测量存在于生物样品中的分析物。所述方法还可以用在血液筛查测定中以检测靶分析物。所述血液筛查测定可以用于筛查血液供给。

8.多路复用

所述方法可以包括一种或多种(或可替代地两种或多种)特异性结合成员以在多路复用测定中检测样品中的一种或多种(或可替代地两种或多种)靶分析物。一个或多个(或可替换地，两个或更多个)特异性结合成员中的每一个结合不同的靶分析物，并且每个特异性结合成员与不同的信号生成化合物或信号生成底物缀合。例如，第一特异性结合成员结合第一靶分析物，第二特异性结合成员结合第二靶分析物，第三特异性结合成员结合第三靶分析物，等，并且第一特异性结合成员用第一信号生成化合物或第一信号生成底物标记，第二特异性结合成员用第二信号生成化合物或第二信号生成底物标记，第三特异性结合成员用第三信号生成化合物或第三信号生成底物标记，等。在一些实施方案中，可以在测定期间的不同时间改变样品的条件，允许检测第一信号生成化合物或第一信号生成底物、第二信号生成化合物或第二信号生成底物、第三信号生成化合物或第三信号生成底物等，由此检测一种或多种(或者可替换地)两种或更多种)靶分析物。在一些实施方案中，同时检测一种或多种(或可替换地两种或更多种)信号生成化合物或信号生成底物。在一些实施方案中，连续检测一种或多种(或可替换地两种或更多种)信号生成化合物或信号生成底物。在一些实施方案中，一种或多种(或可替换地两种或更多种)信号生成化合物或信号生成底物生成不同的可检测信号，诸如不同波长的荧光信号。

或者，一个或多个(或可替换地，两个或更多个)特异性结合成员中的每一个结合不同的靶分析物，并且每个特异性结合成员与不同的固体支持物(诸如不同的荧光团珠)缀合。例如，第一特异性结合成员结合第一靶分析物，第二特异性结合成员结合第二靶分析物，第三特异性结合成员结合第三靶分析物，等，第一特异性结合成员用第一信号生成化合物或第一信号生成底物标记，第二特异性结合成员用第二信号生成化合物或第二信号生成底物标记，第三特异性结合成员用第三信号生成化合物或第三信号生成底物标记，等，并且所述第一特异性结合成员固定在第一固体支持物上，所述第二特异性结合成员固定在第二固体支持物上，所述第三特异性结合成员固定在第三固体支持物上，等。在一些实施方案中，一种或多种(或可替换地两种或更多种)信号生成化合物或信号生成底物生成不同的可检测信号，诸如不同波长或荧光信号，并且同时或连续检测不同的固体支持物。

在一些实施方案中，第一特异性结合成员结合第一靶分析物，第二特异性结合成员结合第二靶分析物，第三特异性结合成员结合第三靶分析物，等，第一特异性结合成员、第二特异性结合成员、第三特异性结合成员等用信号生成化合物或信号生成底物标记，并且所述第一特异性结合成员固定在第一固体支持物上，所述第二特异性结合成员固定在第二固体支持物上，所述第三特异性结合成员固定在第三固体支持物上，等。在一些实施方案中，所述信号生成化合物或信号生成底物生成可检测信号，诸如不同波长或荧光信号，并且同时或连续检测不同的固体支持物。

9.试剂盒

本文中还提供了执行上述方法的试剂盒。所述试剂盒可以包括关于用公开的方法分析分析物的说明书。在试剂盒中包括的说明书可以附连到包装材料，或可以作为包装说明书来包含。所述说明书可以是书写的或印刷的材料，但不限于此。本发明预见到能够存储这样的说明书并将它们传递给最终使用者的任何介质。这样的介质包括、但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、卡带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。本文中使用的“说明书”可以包括提供所述说明书的因特网站点的地址。

可替换地或额外地，所述试剂盒可以包含校准物或对照，例如，经纯化的和任选地冻干的目标分析物，或呈液体、凝胶或其它形式，和/或至少一个用于与上述方法一起使用的容器(例如，试管、微孔滴定板或条带)，和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一种可以提供为浓缩的溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒包含执行测定必需的所有组分，即试剂、标准品、缓冲液、稀释剂等。所述说明书还可以包括关于制作标准曲线的说明书。

所述试剂盒还可以包含用于定量目标分析物的参比标准。所述参比标准可以用于建立标准曲线以内插和/或外推目标分析物浓度。所述试剂盒可以包括在浓度水平方面变化的参比标准。例如，所述试剂盒可以包括具有高浓度水平、中浓度水平或低浓度水平的一种或多种参比标准。关于参比标准的浓度范围，这可以根据测定进行优化。参比标准的示例性浓度范围包括但不限于，例如：约10 fg/mL、约20 fg/mL、约50 fg/mL、约75 fg/mL、约100fg/mL、约150 fg/mL、约200 fg/mL、约250 fg/mL、约500 fg/mL、约750 fg/mL、约1000 fg/mL、约10 pg/mL、约20 pg/mL、约50 pg/mL、约75 pg/mL、约100 pg/mL、约150 pg/mL、约200pg/mL、约250 pg/mL、约500 pg/mL、约750 pg/mL、约1 ng/mL、约5 ng/mL、约10 ng/mL、约12.5 ng/mL、约15 ng/mL、约20 ng/mL、约25 ng/mL、约40 ng/mL、约45 ng/mL、约50 ng/mL、约55 ng/mL、约60 ng/mL、约75 ng/mL、约80 ng/mL、约85 ng/mL、约90 ng/mL、约95 ng/mL、约100 ng/mL、约125 ng/mL、约150 ng/mL、约165 ng/mL、约175 ng/mL、约200 ng/mL、约225ng/mL、约250 ng/mL、约275 ng/mL、约300 ng/mL、约400 ng/mL、约425 ng/mL、约450 ng/mL、约465 ng/mL、约475 ng/mL、约500 ng/mL、约525 ng/mL、约550 ng/mL、约575 ng/mL、约600 ng/mL、约700 ng/mL、约725 ng/mL、约750 ng/mL、约765 ng/mL、约775 ng/mL、约800ng/mL、约825 ng/mL、约850 ng/mL、约875 ng/mL、约900 ng/mL、约925 ng/mL、约950 ng/mL、约975 ng/mL、约1000 ng/mL、约2µg/mL、约3µg/mL、约4µg/mL、约5µg/mL、约6µg/mL、约7µg/mL、约8µg/mL、约9µg/mL、约10µg/mL、约20µg/mL、约30µg/mL、约40µg/mL、约50µg/mL、约60µg/mL、约70µg/mL、约80µg/mL、约90µg/mL、约100µg/mL、约200µg/mL、约300µg/mL、约400µg/mL、约500µg/mL、约600µg/mL、约700µg/mL、约800µg/mL、约900µg/mL、约1000µg/mL、约2000µg/mL、约3000µg/mL、约4000µg/mL、约5000µg/mL、约6000µg/mL、约7000µg/mL、约8000µg/mL、约9000µg/mL或约10000µg/mL。

在试剂盒中提供的任何特异性结合成员可以包含至少一种信号生成化合物或一种或多种信号生成底物等，或所述试剂盒可以包括用于标记特异性结合成员的试剂、或用于检测特异性结合成员和/或用于标记分析物的试剂、或用于检测分析物的试剂。如果需要的话，所述试剂盒可以含有一种或多种不同的信号生成化合物和/或信号生成底物。特异性结合成员、校准物和/或对照可以提供在单独容器中或预分配在适当的测定形式中。

所述试剂盒可以包括一种或多种特异性结合成员，例如，以在多路复用测定中检测样品中的一种或多种靶分析物。所述试剂盒中不同类型的特异性结合成员的数目可以随所述试剂盒的预期用途宽泛地变化。所述试剂盒中特异性结合成员的数目可以在1种至约10种的范围内或更高。例如，所述试剂盒可以包括1-10种特异性结合成员、1-9种特异性结合成员、1-8种特异性结合成员、1-7种特异性结合成员、1-6种特异性结合成员、1-5种特异性结合成员、1-4种特异性结合成员、1-3种特异性结合成员、1-2种特异性结合成员、2-10种特异性结合成员、2-9种特异性结合成员、2-8种特异性结合成员、2-7种特异性结合成员、2-6种特异性结合成员、2-5种特异性结合成员、2-4种特异性结合成员、3-10种特异性结合成员、3-9种特异性结合成员、3-8种特异性结合成员、3-7种特异性结合成员、3-6种特异性结合成员、3-5种特异性结合成员、3-4种特异性结合成员、4-10种特异性结合成员、4-9种特异性结合成员、4-8种特异性结合成员、4-7种特异性结合成员、4-6种特异性结合成员、5-10种特异性结合成员、5-9种特异性结合成员、5-8种特异性结合成员、5-7种特异性结合成员、5-6种特异性结合成员、6-10种特异性结合成员、6-9种特异性结合成员、6-8种特异性结合成员、6-7种特异性结合成员、7-10种特异性结合成员、7-9种特异性结合成员、7-8种特异性结合成员、8-10种特异性结合成员、8-9种特异性结合成员或9-10种特异性结合成员。所述一种或多种特异性结合成员中的每一种可以结合不同的靶分析物，且每种特异性结合成员可以与不同的信号生成化合物和/或信号生成底物缔合。例如，所述试剂盒可以包括：结合第一靶分析物的第一特异性结合成员、结合第二靶分析物的第二特异性结合成员、结合第三靶分析物的第三特异性结合成员等，且所述第一特异性结合成员与第一信号生成化合物和/或第一信号生成底物缔合，所述第二特异性结合成员与第二信号生成化合物和/或第二信号生成底物缔合，所述第三特异性结合成员与第三信号生成化合物和/或第三信号生成底物缔合，等。除了一种或多种特异性结合成员以外，所述试剂盒还可以包含一种或多种另外的测定组分，诸如合适的缓冲介质，等。所述试剂盒还可以包括用于检测和测量信号生成化合物和/或信号生成底物的装置，诸如上述的那些。最后，所述试剂盒可以包含关于在根据本发明的分析物检测方法中使用特异性结合成员的说明书，其中关于使用的这些说明书可以存在于试剂盒包装上和/或包装说明书上。

任选地，所述试剂盒包括质量控制组分(例如，灵敏度实验对象组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备是本领域众所周知的，且描述在多种免疫诊断产品的插页上。灵敏度实验对象组成员任选地用于确立测定性能特征，且进一步任选地是试剂盒试剂的完整性和测定的标准化的有用指示剂。

所述试剂盒还可以任选地包括进行诊断测定或便利质量控制评价所需的其它试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。用于分离和/或处理测试样品的其它组分(诸如缓冲液和溶液)(例如，预处理试剂)也可以包括在试剂盒中。所述试剂盒可以另外包括一种或多种其它对照物。试剂盒的一种或多种组分可以被冻干，在该情况下，试剂盒可以进一步包含适合用于重构冻干的组分的试剂。所述组分中的一种或多种可以呈液体形式。

所述试剂盒的各种组分任选地在必要时提供在合适的容器中。所述试剂盒还可以包括用于容纳或储存样品的容器(例如，用于尿、唾液、血浆、脑脊液或血清样品的容器，或用于储存、运输或处理组织从而产生组织抽吸物的适当容器)。在适当的情况下，试剂盒任选地也可以含有反应容器、混合容器和促进试剂或测试样品的制备的其它组分。所述试剂盒还可以包括一个或多个用于辅助获得测试样品的样品收集/获取器械，诸如各种血液收集/转移装置诸如微取样装置、微针或其它最小侵袭性的无痛血液收集方法；血液收集试管；刺血针；毛细管血液收集试管；其它刺破单个指尖的血液收集方法；口腔拭子，鼻/喉拭子；16-号或其它尺寸的针，用于冲孔活组织检查的环形刀片(例如，1-8 mm或其它适当的尺寸)，外科手术刀或激光(例如，特别是手持式)，注射器，无菌容器，或插管，其用于得到、储存或抽吸组织样品；等。所述试剂盒可以包括一个或多个用于辅助关节抽吸、锥形活组织检查、冲孔活组织检查、细针抽吸活组织检查、图像引导的经皮针吸活组织检查、支气管肺泡灌洗、内窥镜活组织检查和腹腔镜活组织检查的器械。

如果需要的话，所述试剂盒可以含有固相，诸如磁性颗粒、珠子、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片。

如果需要的话，所述试剂盒可以进一步包含一种或多种组分，所述组分是单独的或与说明书进一步组合，所述组分用于针对另一种分析物测定测试样品，所述另一种分析物可以是生物标志物，诸如疾病状态或障碍(诸如传染性疾病、心脏疾病、代谢疾病、甲状腺疾病等)的生物标志物。

本发明具有由下述非限制性实施例例证的多个方面。

1.实施例

[实施例1]

“黑色墨添加”方法

图3中显示的“黑色墨添加”方法涉及在用密封剂(例如油)置换水相之后将黑色墨(诸如印度墨)添加至水相(包括荧光底物的上部液相)中(参见图3的步骤7)。用于测定的底物是荧光素-二磷酸酯(FDP)。用于酶促反应的缓冲液是1M二乙醇胺(DEA)、1 mM MgCl₂、0.05%Tween20和300 μ M FDP，pH 9.25。使用“黑色墨添加”方法的数字ELISA(其中将黑色墨添加至水相并且未除去水相)(C；参见图3)与未除去水相的数字ELISA(A)和除去水相的数字ELISA(B)进行比较。通过使用荧光素滤光器在光学显微镜下计数荧光液滴的数目来测定靶标分子的数目。同时，使用四甲基罗丹明(TRITC)滤光器计数珠子的总数。用“黑色墨添加”方法的数字ELISA显示对计数荧光液滴的数目和增加的可分析图像数目的改进(图4和5以及表1)。

[表1]

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如图4中所示，即使添加黑色墨，TRITC和荧光素过滤的图像两者均为清晰的。存在于上部水相中的荧光物质妨碍在光学显微镜下计数荧光液滴的数目。对于其中未除去水相的“A”没有荧光素数据(图4和表3)，这是由于上部水相中存在的荧光物质的强烈亮度。对于其中手动除去上部水溶液的“B”仅获得29片可分析图像(图4和表3)，这是因为没有完全除去的上部水相中存在荧光物质，其导致一些上部水相保留在孔中，其阻碍16片数据中的荧光液滴的数目的计数。相反，使用未除去水相的“黑色墨添加”方法获取45个图像中的44个。

对于针对“B”不可分析的16片数据获取的图像中存在2种模式的发光图像(图6-左上图像和右上图像)。一种模式(16片中的15片)显示荧光素滤光器的高背景图像，这是由于广泛发光(左上图像)，而另一种模式(16片中的1片)显示在边缘周围强烈发光的图像(右上图像)。在图6的底部图像中，将黑色墨添加至含有荧光反应的装置孔的密封剂(例如油)中。在左下图像中，由于上部水相的不完全除去导致的高背景通过添加黑色墨消失，因为具有荧光素滤光器的高背景图像的15片显示更清晰的图像，表明添加黑色墨可以减少背景荧光，即使上层水溶液的手动除去是不完全的。另一方面，即使添加黑色墨，也不能分析在一片中看到的具有在边缘周围强烈发光的图像的右图像模式，因为该发光信号来自装置侧上的残余水相(装置孔的底部侧)。

实施例2

“黑色墨预混合”方法

为了解决可能不完全的除去水相的耗时步骤的问题，开发了“黑色墨预混合X”方法。如图7A中所示，“黑色墨预混合”方法涉及在将酶反应添加至装置孔中之前将黑色墨(诸如印度墨)添加至酶反应溶液中。与“黑色墨添加”方法相比，用“黑色墨预混合”方法(即，将黑色墨添加至底物溶液)的数字ELISA显示改进的荧光液滴数目的计数和增加的可分析图像。表2显示每个样品中的实验条件和黑色墨的最终浓度。用于测定的底物是荧光素-二磷酸酯(FDP)。用于酶促反应的缓冲液是1M二乙醇胺(DEA)、1 mM MgCl₂、0.05% Tween20和300 μ MFDP，pH 9.25。如图8中所示，信号%水平几乎相同，表明所有图像都可以通过“黑色墨预混合”方法分析，其对真实信号(信号%)的检测几乎没有影响或没有影响。

[表2]

。

对于用“黑色墨添加”方法(“添加”)处理的样品，无法分析一些图像，因为发光信号源自装置侧(装置孔的底侧)上的残余水相。在用“黑色墨预混合”方法处理的样品中，无论水相是否存在，水相中荧光的发光都被抑制。因此，所有图像都得到完全分析，因为通过黑色墨/底物溶液消除了发光的信号。此外，用“黑色墨预混合IX”方法，3.3%、6.7%、10%的黑色墨获得与“黑色墨添加”方法的10%结果类似的结果(参见图8)。这些结果显示，黑色墨不影响溶液中的酶反应。此外，即使背景完全是黑色，也可以观察到真实的信号。

实施例3

其它染料

使用酸性黑2(“ABk2”)(另一种染料组分)来降低“黑色墨添加”和“黑色墨预混合”方法两者中的背景发光噪声。比较10%印度墨和25 mM酸性黑2，并且对于使用阈值优化的信号检测，具有类似图像。参见图10和表3。当分析数字测定的图像时，使用亮点作为用于检测的阈值。构成图像的所有像素具有与亮度对应的独特强度值。暗像素具有比亮像素更低的值。设置阈值以确定像素是亮还是暗(二值化)。当使用黑色墨方法时，适当的阈值与先前的测定不同，因此设置新阈值(“阈值优化”)。使用“黑色墨添加”或“黑色墨预混合”方法，印度墨(“黑色墨”)和酸性黑2(“ABk2”)两者均有效地降低背景荧光(“发光噪声”)。

[表3]

。

将其它染料酸性橙7 (AO7)和直接蓝14 (DBu14)(参见图9A和9B)组合，并与黑色墨(即ABk2)比较。参见表4和图11。染料的组合减少“黑色墨添加”或“黑色墨预混合”方法中的背景发光噪声。

[表4]

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15 mM酸性橙7 (AO7)和4 mM直接蓝14 (DBu14)的组合降低“黑色墨添加”中的背景发光噪声。参见图11。5 mM AO7和1 mM DBu14的组合降低“黑色墨预混合”方法中的背景发光噪声。用“黑色墨预混合”方法的较高浓度的AO7和DBu14(分别为15 mM和4 mM)也降低背景发光噪声，但用10 fM抗原的阳性信号低。

实施例4

低浓度抗原的检测

使用低浓度的抗原0.1 fM样品评估“黑色墨添加”和“黑色墨预混合”方法的检测能力(参见表5和图13)。

[表5]

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对于0.1 fM样品检测的信噪比(S/N)，对于使用“黑色墨添加”方法的ABk2为4.4，对于使用“黑色墨预混合MIX”方法的ABk2为3.1，且对于使用“黑色墨预混合”方法的AO7和DBu14的组合为1.9。

[实施例5]

黑色装置

可以制备“黑色装置”以降低背景发光噪声(参见图14)，作为向数字测定中添加黑色墨的替代方案。图14的左图显示使用在玻璃上透明制备的CYTOP或COP、PDMS聚合物的目前装置。图14的右图显示将黑色染料或材料添加至装置，例如，将炭黑添加至CYTOP或聚合物，或附接透明装置用于背景发光噪声降低的黑色薄膜片。

最后，尽管已经关于本文的不同实施方案和具体实施例描述了本发明的不同方面和特征，它们都可以常规地做出或实现，但应该理解，本发明获得所附权利要求的整个范围内的保护。

应当理解，前述详细描述和附随实施例仅仅是示例性的，且不应用作对本发明的范围的限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同方案限定。

本领域技术人员会明白对公开的实施方案的不同变化和修改。可以在不脱离其精神和范围的情况下做出这样的变化和修改，包括但不限于与化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或本发明的使用方法有关的那些。

为了完整性的原因，在以下编号的条款中阐述了本发明的不同方面：

条款1. 用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物和着色剂，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

条款2. 条款1的方法，其中所述信号生成数字测定是荧光数字免疫测定。

条款3. 用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物和着色剂，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

条款4. 条款1至3中任一项的方法，其中所述着色剂与所述信号生成底物同时添加。

条款5. 条款1至3中任一项的方法，其中在所述信号生成底物之前将所述着色剂添加至洗涤的固体支持物复合物。

条款6. 条款1至3中任一项的方法，其中在所述信号生成底物之后将所述着色剂添加至洗涤的固体支持物复合物。

条款7. 用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至置换的水相中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

条款8. 用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至密封剂中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

条款9. 条款7或8的方法，其中所述信号生成数字测定是荧光数字免疫测定。

条款10. 用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至置换的水相中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

条款11. 用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；(h)将着色剂添加至密封剂中；和(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

条款12. 条款1至11中任一项的方法，其中所述着色剂是黑色着色剂。

条款13. 条款1至12中任一项的方法，其中所述着色剂是基于颜料的组合物。

条款14. 条款1至13中任一项的方法，其中所述着色剂是印度墨、酸性黑2、酸性橙7、直接蓝14或其组合中的一种。

条款15. 条款2至6和9至14中任一项的方法，其中所述荧光数字免疫测定具有降低的背景荧光。

条款16. 条款1至15中任一项的方法，其中将一个或多个第二特异性结合成员同时或依次添加至一个或多个第一特异性结合成员。

条款17. 条款1至16中任一项的方法，其中所述信号生成化合物是碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。

条款18. 条款1至17中任一项的方法，其中所述信号生成底物是用于信号生成化合物的荧光底物。

条款19. 条款1至18中任一项的方法，其中所述信号生成底物是4-甲基伞形酮基磷酸酯(MUP)或荧光素二磷酸酯(FDP)。

条款20. 条款1至19中任一项的方法，其中使用荧光显微镜检测可检测信号以获取荧光图像。

条款21. 条款1至20中任一项的方法，其中所述密封剂具有比所述水相更重的密度。

条款22. 条款1至21中任一项的方法，其中所述密封剂是油。

条款23. 条款22的方法，其中所述油是重质氟化油。

条款24. 条款23的方法，其中所述重质氟化油是FC-40。

条款25. 条款1至24中任一项的方法，其中所述多个反应容器是纳米孔阵列。

条款26. 条款1至25中任一项的方法，其在步骤(e)中进一步包括信号生成化合物的抑制剂。

条款27. 条款26的方法，其中所述抑制剂是左旋咪唑。

条款28. 条款1至27中任一项的方法，其进一步包括在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之前或在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之后将混合物孵育一定时间段，其中所述时间段是孵育时段，且为约40分钟至约300分钟。

条款29. 条款1至28中任一项的方法，其中所述流体样品是血清、血浆或全血样品。

条款30. 条款1至29中任一项的方法，其进一步包括在使所述流体样品与多个固体支持物接触之前，使所述流体样品与一种或多种去污剂、表面活性剂、非极性溶剂、超声处理、加热或其组合接触。

条款31. 条款1至30中任一项的方法，其中所述固体支持物是磁性固体支持物。

条款32. 条款1至31中任一项的方法，其中通过倾斜所述多个反应容器在步骤(g)中通过密封剂置换所述水相。

条款33. 条款1至32中任一项的方法，其中所述分析物是生物分子。

条款34. 条款33的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽、DNA分子、RNA分子、糖或脂质。

条款35. 降低用于检测样品中的分析物的信号生成数字测定中的荧光背景噪声的方法，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在，其中所述数字计数装置包括黑色装置。

条款36. 条款35的方法，其中所述信号生成数字测定是荧光数字免疫测定。

条款37. 降低用于检测样品中的分析物的荧光数字免疫测定中的荧光背景噪声的方法，所述方法包括：(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在，其中所述数字计数装置包括黑色装置。

条款38. 条款35至37中任一项的方法，其中所述黑色装置包含固相材料，所述固相材料包含附接至透明装置的炭黑或黑色薄膜片。

条款39. 条款38的方法，其中所述固相材料是CYTOP、环烯烃聚合物(COP)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

条款40. 条款35至39中任一项的方法，其进一步包括将着色剂与信号生成底物同时添加至洗涤的固体支持物复合物，将着色剂在信号生成底物之前添加至洗涤的固体支持物复合物，将着色剂在信号生成底物之后添加至洗涤的固体支持物复合物，将着色剂添加至置换的水相，或将着色剂添加至密封剂。

条款41. 条款40的方法，其中所述着色剂是基于颜料的组合物。

条款42. 条款40或41的方法，其中所述着色剂是印度墨、酸性黑2、酸性橙7、直接蓝14或其组合中的一种。

条款43. 条款42的方法，其中所述着色剂是酸性橙7和直接蓝14的组合。

条款44. 条款35至43中任一项的方法，其中将一个或多个第二特异性结合成员同时或依次添加至一个或多个第一特异性结合成员。

条款45. 条款35至44中任一项的方法，其中所述信号生成化合物是碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。

条款46. 条款35至45中任一项的方法，其中所述信号生成底物是用于信号生成化合物的荧光底物。

条款47. 条款35至46中任一项的方法，其中所述信号生成底物是4-甲基伞形酮基磷酸酯(MUP)或荧光素二磷酸酯(FDP)。

条款48. 条款35至47中任一项的方法，其中使用荧光显微镜检测可检测信号以获取荧光图像。

条款49. 条款35至48中任一项的方法，其中所述密封剂具有比所述水相更重的密度。

条款50. 条款35至49中任一项的方法，其中所述密封剂是油。

条款51. 条款50的方法，其中所述油是重质氟化油。

条款52. 条款51的方法，其中所述重质氟化油是FC-40。

条款53. 条款35至52中任一项的方法，其中所述多个反应容器是纳米孔阵列。

条款54. 条款35至53中任一项的方法，其在步骤(e)中进一步包括信号生成化合物的抑制剂。

条款55. 条款54的方法，其中所述抑制剂是左旋咪唑。

条款56. 条款35至55中任一项的方法，其进一步包括在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之前或在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之后将混合物孵育一定时间段，其中所述时间段是孵育时段，且为约40分钟至约300分钟。

条款57. 条款35至56中任一项的方法，其中所述流体样品是血清、血浆或全血样品。

条款58. 条款35至57中任一项的方法，其进一步包括在使所述流体样品与多个固体支持物接触之前，使所述流体样品与一种或多种去污剂、表面活性剂、非极性溶剂、超声处理、加热或其组合接触。

条款59. 条款35至58中任一项的方法，其中所述固体支持物是磁性固体支持物。

条款60. 条款35至59中任一项的方法，其中通过倾斜所述多个反应容器在步骤(g)中通过密封剂置换所述水相。

条款61. 条款35至60中任一项的方法，其中所述分析物是生物分子。

条款62. 条款61的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽、DNA分子、RNA分子、糖或脂质。

条款63. 条款36至62中任一项的方法，其中所述荧光数字免疫测定包括飞升液滴阵列。

Claims (63)

1.用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物和着色剂，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和

(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

2.权利要求1的方法，其中所述信号生成数字测定是荧光数字免疫测定。

3.用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物和着色剂，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和

(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述着色剂与所述信号生成底物同时添加。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中在所述信号生成底物之前将所述着色剂添加至洗涤的固体支持物复合物。

6.权利要求1至3中任一项的方法，其中在所述信号生成底物之后将所述着色剂添加至洗涤的固体支持物复合物。

7.用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；

(h)将着色剂添加至置换的水相中；和

(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

8.用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的信号生成数字测定方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；

(h)将着色剂添加至密封剂中；和

(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

9.权利要求7或8的方法，其中所述信号生成数字测定是荧光数字免疫测定。

10.用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；

(h)将着色剂添加至置换的水相中；和

(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

11.用于确定流体样品中的分析物的单分子的存在或不存在的荧光数字免疫测定方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；

(h)将着色剂添加至密封剂中；和

(i)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在。

12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述着色剂是黑色着色剂。

13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述着色剂是基于颜料的组合物。

14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述着色剂是印度墨、酸性黑2、酸性橙7、直接蓝14或其组合中的一种。

15.权利要求2至6和9至14中任一项的方法，其中所述荧光数字免疫测定具有降低的背景荧光。

16.权利要求1至15中任一项的方法，其中将一个或多个第二特异性结合成员同时或依次添加至一个或多个第一特异性结合成员。

17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述信号生成化合物是碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。

18.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述信号生成底物是用于信号生成化合物的荧光底物。

19.权利要求1至18中任一项的方法，其中所述信号生成底物是4-甲基伞形酮基磷酸酯(MUP)或荧光素二磷酸酯(FDP)。

20.权利要求1至19中任一项的方法，其中使用荧光显微镜检测可检测信号以获取荧光图像。

21.权利要求1至20中任一项的方法，其中所述密封剂具有比所述水相更重的密度。

22.权利要求1至21中任一项的方法，其中所述密封剂是油。

23.权利要求22的方法，其中所述油是重质氟化油。

24.权利要求23的方法，其中所述重质氟化油是FC-40。

25.权利要求1至24中任一项的方法，其中所述多个反应容器是纳米孔阵列。

26.权利要求1至25中任一项的方法，其在步骤(e)中进一步包括信号生成化合物的抑制剂。

27.权利要求26的方法，其中所述抑制剂是左旋咪唑。

28.权利要求1至27中任一项的方法，其进一步包括在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之前或在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之后将混合物孵育一定时间段，其中所述时间段是孵育时段，且为约40分钟至约300分钟。

29.权利要求1至28中任一项的方法，其中所述流体样品是血清、血浆或全血样品。

30.权利要求1至29中任一项的方法，其进一步包括在使所述流体样品与多个固体支持物接触之前，使所述流体样品与一种或多种去污剂、表面活性剂、非极性溶剂、超声处理、加热或其组合接触。

31.权利要求1至30中任一项的方法，其中所述固体支持物是磁性固体支持物。

32.权利要求1至31中任一项的方法，其中通过倾斜所述多个反应容器在步骤(g)中通过密封剂置换所述水相。

33.权利要求1至32中任一项的方法，其中所述分析物是生物分子。

34.权利要求33的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽、DNA分子、RNA分子、糖或脂质。

35.降低用于检测样品中的分析物的信号生成数字测定中的荧光背景噪声的方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和

(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在，

其中所述数字计数装置包括黑色装置。

36.权利要求35的方法，其中所述信号生成数字测定是荧光数字免疫测定。

37.降低用于检测样品中的分析物的荧光数字免疫测定中的荧光背景噪声的方法，所述方法包括：

(a)使含有或怀疑含有分析物的流体样品与多个固体支持物接触以产生混合物，其中每个固体支持物包含一个或多个能够结合分析物的第一特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物；

(b)用第一洗涤缓冲液洗涤混合物中的固体支持物-第一特异性结合成员-分析物复合物，以除去未与分析物结合的任何固体支持物-第一特异性结合成员，由此产生洗涤的混合物；

(c)向洗涤的混合物中添加一个或多个能够结合分析物的第二特异性结合成员，由此产生固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，其中所述第二特异性结合成员包含与之附接的信号生成化合物；

(d)用第二洗涤缓冲液洗涤固体支持物-第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员复合物，以除去未与结合所述第一特异性结合成员的分析物结合的任何第二特异性结合成员，由此产生洗涤的固体支持物复合物；

(e)向洗涤的固体支持物复合物中添加信号生成底物，其中所述信号生成化合物和所述信号生成底物产生可检测信号；

(f)将洗涤的固体支持物复合物的至少一部分空间分离至多个分开位置中，其中多个分开位置包含多个反应容器，且其中洗涤的固体支持物复合物存在于水相中；

(g)用密封剂覆盖多个反应容器，其中水相被反应室中的密封剂置换；和

(h)使用数字计数装置检测可检测信号的存在或不存在，其中所述可检测信号的存在的检测表明样品中的分析物的单分子的存在，其中所述数字计数装置包括黑色装置。

38.权利要求35至37中任一项的方法，其中所述黑色装置包含固相材料，所述固相材料包含附接至透明装置的炭黑或黑色薄膜片。

39.权利要求38的方法，其中所述固相材料是CYTOP、环烯烃聚合物(COP)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

40.权利要求35至39中任一项的方法，其进一步包括将着色剂与信号生成底物同时添加至洗涤的固体支持物复合物，将着色剂在信号生成底物之前添加至洗涤的固体支持物复合物，将着色剂在信号生成底物之后添加至洗涤的固体支持物复合物，将着色剂添加至置换的水相，或将着色剂添加至密封剂。

41.权利要求40的方法，其中所述着色剂是基于颜料的组合物。

42.权利要求40或41的方法，其中所述着色剂是印度墨、酸性黑2、酸性橙7、直接蓝14或其组合中的一种。

43.权利要求42的方法，其中所述着色剂是酸性橙7和直接蓝14的组合。

44.权利要求35至43中任一项的方法，其中将一个或多个第二特异性结合成员同时或依次添加至一个或多个第一特异性结合成员。

45.权利要求35至44中任一项的方法，其中所述信号生成化合物是碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。

46.权利要求35至45中任一项的方法，其中所述信号生成底物是用于信号生成化合物的荧光底物。

47.权利要求35至46中任一项的方法，其中所述信号生成底物是4-甲基伞形酮基磷酸酯(MUP)或荧光素二磷酸酯(FDP)。

48.权利要求35至47中任一项的方法，其中使用荧光显微镜检测可检测信号以获取荧光图像。

49.权利要求35至48中任一项的方法，其中所述密封剂具有比所述水相更重的密度。

50.权利要求35至49中任一项的方法，其中所述密封剂是油。

51.权利要求50的方法，其中所述油是重质氟化油。

52.权利要求51的方法，其中所述重质氟化油是FC-40。

53.权利要求35至52中任一项的方法，其中所述多个反应容器是纳米孔阵列。

54.权利要求35至53中任一项的方法，其在步骤(e)中进一步包括信号生成化合物的抑制剂。

55.权利要求54的方法，其中所述抑制剂是左旋咪唑。

56.权利要求35至55中任一项的方法，其进一步包括在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之前或在向混合物中添加一种或多种第二特异性结合成员之后将混合物孵育一定时间段，其中所述时间段是孵育时段，且为约40分钟至约300分钟。

57.权利要求35至56中任一项的方法，其中所述流体样品是血清、血浆或全血样品。

58.权利要求35至57中任一项的方法，其进一步包括在使所述流体样品与多个固体支持物接触之前，使所述流体样品与一种或多种去污剂、表面活性剂、非极性溶剂、超声处理、加热或其组合接触。

59.权利要求35至58中任一项的方法，其中所述固体支持物是磁性固体支持物。

60.权利要求35至59中任一项的方法，其中通过倾斜所述多个反应容器在步骤(g)中通过密封剂置换所述水相。

61.权利要求35至60中任一项的方法，其中所述分析物是生物分子。

62.权利要求61的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽、DNA分子、RNA分子、糖或脂质。

63.权利要求36至62中任一项的方法，其中所述荧光数字免疫测定包括飞升液滴阵列。