CN110520538A - 灌注培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括增加钾浓度和降低钠与钾的摩尔比，以减少浪费的细胞排出且增加蛋白质生产。本发明进一步涉及无血清灌注培养基，其包含高钾离子浓度和低摩尔比的钠与钾，并且涉及这种培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养细胞、或用于在生产阶段期间减少细胞排出体积的用途。

Description

灌注培养基
技术领域
本发明涉及在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括增加钾浓度和降低钠与钾的摩尔比，以减少浪费的细胞排出且增加蛋白质生产。本发明进一步涉及无血清灌注培养基，其包含高钾离子浓度和低摩尔比的钠与钾，并且涉及这种培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养细胞、或用于在生产阶段期间减少细胞排出体积的用途。
背景技术
三种方法通常用于商业过程中用于通过哺乳动物细胞培养生产重组蛋白质：分批培养、补料分批培养和灌注培养。
通过添加新鲜培养基并同时去除耗尽培养基，基于灌注的方法提供了超过分批和补料分批方法的潜在改善。大规模商业细胞培养策略可以达到60-90x 106个细胞/mL的高细胞密度，在此时反应器体积的约三分之一到超过一半可以是生物量。通过基于灌注的培养，已实现了>1x 108个细胞/mL的极端细胞密度。典型的灌注培养开始于持续一天或更久的分批培养启动，以允许快速的初始细胞生长和生物量积累，随后为向培养物中连续、逐步和/或间歇添加新鲜灌注培养基，并且同时在培养的生长和生产阶段自始至终去除耗尽培养基，伴随细胞的保留。各种方法，例如沉降、离心或过滤，可以用于去除耗尽培养基，同时维持细胞。已利用了工作体积的一小部分/天到许多个工作体积/天的灌注流速。
用于生物制剂制造的连续加工具有超过传统的补料分批的众多优点，但仍存在许多挑战。培养基中的改善已实现了更高的活细胞密度(VCD)，并且依次又实现了灌注过程中的更高滴度。然而，这些升高的细胞密度可以变得无法持续，导致活力丧失和灌注运行的缩短。增加培养基制备、使用、贮存和处置是必要的，以支持长期灌注培养，特别是具有高细胞密度的那些，其还需要甚至更多的营养素，并且与分批和补料分批相比，所有这些都驱使生产成本甚至更高。
钾和钠离子浓度是关于培养中的细胞的重要环境因子。内部离子浓度由细胞保持显著恒定，并且钾和钠主要负责跨细胞膜的膜电位。通常，体内细胞内钠和钾离子浓度分别为12mM和139mM左右，并且在细胞外的典型体内钠和钾离子浓度分别为约145mM和4mM。在20世纪70年代早期首次观察到较高的钾浓度可能对细胞增殖具有抑制作用，然而，迄今为止，这还没有成功地用于改善灌注细胞培养。
Orr等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1972)69(1):243-247)公开了使用含有12％小牛血清的Ham's F12培养基、或其中钠已替换为钾的等价培养基，114mM(Na+/K+＝0.53)的钾浓度抑制单层BHK细胞中的细胞增殖。36至72mM的钾浓度实际上增加了细胞密度。在钾浓度高于128mM的培养物中，细胞很快变圆，脱离板且死亡。对于用114mM处理的细胞还报道了形态学变化。该文件缺乏增加的钾浓度在灌注细胞培养中是有益的，以控制细胞排出或改善生产率的任何指示。
JP H01247097A公开了在无血清培养基中用30mM氯化钾处理杂交瘤细胞灌注培养增加了抗体产生(滴度和细胞比生产率)，并且同时减少了细胞增殖率和细胞活力。因此，增加氯化钾浓度看起来减少活力。另外，增加的蛋白质生产看起来与减少的活力联系。
WO 2011/134920公开了用于补料分批培养的用于CHO细胞的化学成分确定的细胞培养基，其包含10:1至1:1的钠与钾的摩尔比以及约8至约12mM的钾浓度。
Sato等人(Cytotechnology(1989)2：63-67)公开了无血清培养基中升高的磷酸钾和磷酸钠浓度刺激杂交瘤细胞中的单克隆抗体产生。然而，KCl显示没有效应。另外，其中公开了30mM的磷酸钾浓度严重减少活力，特别是在连续培养中。进一步地，它教导了增加钠浓度而不是用钾取代钠增加生产率。
Suzuki等人(Biotechnol.Prog.(1990)6(3)：231-236)公开了在分批培养中用无血清RPMI 1640中的10至100mM乙酸钾处理杂交瘤细胞培养物导致生长速率依赖性抗体产生。然而，这种关联性仅适用于相对较高的生长速率，且活力减少至58％，提示乙酸钠并不适合于长期灌注培养。
Fong等人(Cytotechnology(1997)24：47-54)公开了浓度为约10mM的乙酸钾增加杂交瘤细胞中的抗体产生，同时维持或仅略微增加灌注培养中的细胞密度。然而，这种灌注培养在乙酸钾的存在下仅维持少于4天，没有公开活力数据。另外，观察到的效应可能是由于渗透压或乙酸盐中的增加。使用的培养基是具有10％血清的RPMI 1640培养基，包含>100mM的钠，并且因此培养物不是无血清培养物，并且以钠超过钾的摩尔过量来执行。
Yoon等人，(Biotechnology and Bioprocess Engineering(2007)，12：399-403)公开了高钾离子浓度(≥60mM)在使用无血清培养基的重复分批模式下，增加CHO细胞中的蛋白质生产且抑制细胞生长。高达40mM的钾浓度据报道不显著影响细胞生长，并且以60mM或更高的浓度显示影响细胞活力。另外，该文件没有提及钠浓度。
钾和钠存在于所有细胞培养基中，并且改变其浓度优于必须引入其它添加剂，因为不存在关于安全性和清除的关注。另外，当开发培养基时，希望保持培养基尽可能简单且限于必需化合物。这避免了不必要的化合物且减少渗透压问题。虽然培养基经常进行改变和改善，但仍然需要通过减少浪费和增加生产率来改善灌注培养。
发明内容
浪费的细胞排出可以用于维持可持续的VCD并保存活力。在连续过程中，大部分培养基和因此产物由于细胞“排出”而损失，所述细胞“排出”虹吸出增殖细胞和培养基，以便在生物反应器内维持恒定、可持续的活细胞密度。由于细胞排出，可以损失高达三分之一的可收获材料。因此，使用细胞排出降低了产物得率/运行，因为未收获在细胞排出内的产物。为了降低细胞排出体积并且因此保留更多上清液用于收获，因此一旦在生产阶段达到所需的活细胞密度，就抑制细胞增殖是有利的，而不影响活力或特定蛋白质生产率。通过减少或消除细胞排出，与常规灌注方法相比，蛋白质生产增加。因此，一旦已获得最佳VCD，就需要控制细胞生长，因此最小化细胞排出，以增加每次灌注运行回收的产物，并且同时增加细胞比生产率，以生成用于操作灌注过程的更有效方法。
在本发明中，提供了包含Na:K比小于1且钾浓度>30mM的钠和钾的灌注培养基，以及使用所述培养基培养哺乳动物细胞的方法。显示培养基抑制增殖且增加细胞比生产率(qp)而不负面影响活力。特别地，高钾浓度诱导灌注细胞培养中的中国仓鼠卵巢(CHO)的细胞生长停滞，并且低钠浓度增加细胞比生产率。通过控制细胞生长并因此最小化细胞排出，每次灌注运行回收的产物极大增加，得到用于操作灌注过程的更有效方法。这通过对细胞比生产率的正面作用得到进一步增强。
在一个方面，提供了在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞；和(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，其中步骤(b)是任选的。
在一个相关方面，提供了减少灌注细胞培养中表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的细胞排出的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞；和(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，其中步骤(b)是任选的。
在另一个相关方面，增加表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的蛋白质生产的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞；和(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，其中步骤(b)是任选的。
一旦达到靶细胞密度，就开始步骤(c)。因此，它可以以10x 106个细胞/ml至约120x 106个细胞/ml或甚至更高的细胞密度开始。优选地，步骤(c)以至少10x 106个细胞/ml、至少20x 106个细胞/ml、至少30x 106个细胞/ml、至少40x 106个细胞/ml、或至少50x106个细胞/ml的细胞密度起始。最优选地，步骤(c)以约30至约50x 106个细胞/ml的细胞密度起始。
本发明方法的步骤(c)可以进一步包括通过细胞排出来维持细胞密度。与使用相同的无血清灌注培养基(其包含浓度小于30mM的钾离子和大于2的钠与钾的摩尔比)，并且在相同的条件下培养的灌注细胞培养相比，使用本发明的方法，细胞排出减少。
在本发明方法的一些实施方案中，钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。在一些实施方案中，钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。
根据本发明，钾离子作为一种或多种钾盐提供。在一个优选实施方案中，一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾。优选地，一种或多种钾盐取代无血清灌注培养基中的相应钠盐。更具体地，一种或多种钾盐优选取代步骤b)的无血清灌注培养基中的相应钠盐。
无血清灌注培养基的渗透压应该在300至1400mOsmol/kg，优选300至500mOsmol/kg，更优选330至450mOsmol/kg，且甚至更优选360至390mOsmol/kg的范围内。
哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选CHO-DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO DXB11细胞、CHO-S细胞、CHO GS缺陷细胞或这些细胞中任一种的衍生物。
无血清灌注培养基可以是化学成分确定的和/或无水解产物的。优选地，无血清灌注培养基是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的，更优选地，无血清灌注培养基是化学成分确定的，并且是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。
在一个进一步方面，提供了使用本发明方法生产治疗蛋白质的方法，任选地包括将治疗蛋白质纯化且配制成药学上可接受的制剂的进一步步骤。
在另一个方面，提供了无血清灌注培养基，其包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。在一些实施方案中，钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。在一些实施方案中，钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。
根据本发明，钾离子作为一种或多种钾盐提供。在一个优选实施方案中，一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾。优选地，一种或多种钾盐取代无血清灌注培养基中的相应钠盐。
无血清灌注培养基的渗透压应该在300至1400mOsmol/kg，优选300至500mOsmol/kg，更优选330至450mOsmol/kg，且甚至更优选360至390mOsmol/kg的范围内。
无血清灌注培养基可以是化学成分确定的和/或无水解产物的。优选地，无血清灌注培养基是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的，更优选地，无血清灌注培养基是化学成分确定的，并且是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。
在另外一个方面，提供了本发明的无血清灌注培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养哺乳动物细胞、或用于减少灌注培养中的总细胞排出体积的用途。可替代地，提供了本发明的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的蛋白质生产的用途。
附图说明
图1：细胞排出对总生产率的作用。产生单克隆抗体mAb1的CHO细胞系在3L玻璃灌注生物反应器中以2L工作体积培养，利用如所示的两种不同的再循环装置：ATF#1和ATF#2使用ATF2装置(Repligen，Waltham，MA)重复，并且TFF生物反应器使用离心泵(Levitronix，Zurich，瑞士)。每天测量收获(渗透物)流(回收产物)和生物反应器内容物(反应器滴度)的滴度，并且计算在细胞培养结束时(第29天)在排出和反应器中产生的总克数(总体产生的)和损失的产物。
图2：对深孔灌注模型中的Na+/K+浓度变化的细胞生长和生产率响应。响应程度表示为与对照条件Na＝78mM，K＝37mM(Na:K 2)的差异比例，其中0.4的得分对应于其中在所示Na+和K+水平下的预料响应为对照(Na:K 2)条件的40％的区域。对于在产生单克隆抗体mAb1的CHO细胞系中测试的浓度范围，显示了累积比生长速率(SGR)(A)和累积细胞比生产率(qp)(B)的等高线图。关于测试条件的实际数据点在两个等高线图中作为标记物显示。代表性的活细胞密度(VCD)和活力图对于细胞培养的整个时间过程分别显示于小图(C)和(D)中。活细胞密度(VCD)以e5个细胞/mL给出，其为“105细胞/mL”的技术拼写。在一段时间内在活细胞密度中观察到不同条件之间的差异，而在整个7天培养自始至终，活力始终保持很高(>85％)。
图3：在深孔灌注模型中用不同Na+/K+浓度处理的产生单克隆抗体mAb1的CHO细胞系的细胞周期分析。使用碘化丙锭染色和FACS分析执行细胞周期分析。对于测试浓度比Na:K 2(37mM钾)和Na:K 0.5(76mM钾)，亚G0、G0/1、S和G2/M期的细胞的条形图和细胞聚集体显示于小图(A)中，并且G0/1:G2M比率显示于小图(B)中。执行双尾斯氏t检验，以确定相对于Na:K 2的统计显著性(*p<0.05；**p<0.001)。
图4：对2L灌注反应器中的Na+/K+浓度变化的细胞生长和生产率响应。对于产生单克隆抗体mAb2的CHO-K1细胞系，对于小图(A)中的每日qp、小图(B)中的每日比生长速率(SGR)、小图(C)中的活力和小图(D)中的细胞排出流速显示了代表性图解。用于生物反应器培养的细胞在相同的灌注培养基(9Na+/K+)中生长，直至达到靶细胞密度，然后转换为Na:K0.5培养基(～76mM K)(实心正方形)或保留在Na:K 9培养基(12mM K)(空心菱形)上。箭头指示当培养基从Na:K 9比率培养基转换到降低的Na:K 0.5比率培养基时的时间点(第10天)。
图5：在灌注培养的第22天时，对2L灌注反应器中的Na+/K+浓度变化的细胞生长和生产率响应。用于生物反应器培养的细胞在相同的灌注培养基(9Na+/K+)中生长，直至达到靶细胞密度，然后转换为0.5Na/K培养基(76mM K)或保留在9Na/K培养基(12mM K)上。对于表达单克隆抗体mAb1(CHO-DG44 mAb1)、mAb2(CHO-K1 mAb2)或mAb3(CHO-K1 mAb3)的三种CHO细胞系，在代表性图中显示了两种不同培养基之间的累积平均qp和平均比生长速率(SGR)中的差异。平均qp和平均SGR表示为对其在培养基转换之前的分别值标准化的在培养基转换之后的平均qp和SGR(即关于mAb1和3的第10-22天/第0-10天，以及关于mAb2的第12-22天/第0-12天)。执行双尾斯氏t检验，以确定统计显著性(*p<0.05，**p<0.001)。
具体实施方式
一般实施方案“包含(comprising)”或“包含(comprised)”涵盖更具体的实施方案“由......组成”。此外，单数和复数形式不以限制方式使用。如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”指定单数和复数两者，除非明确陈述仅指定单数。
如本文使用的，术语“灌注”指维持细胞培养生物反应器，其中同时添加并从反应器中去除等体积的培养基，同时将细胞保留在反应器中。灌注培养也可以称为连续培养。这提供了稳定的新鲜营养素源和细胞废弃产物的不断去除。灌注通常用于获得比常规生物反应器分批或补料分批条件高得多的细胞密度，且因此更高的体积生产率。可以连续收获分泌性蛋白质产物，同时将细胞保留在反应器中，例如通过过滤、交替切向流(ATF)、细胞沉降、超声分离、水力旋流器、或者本领域技术人员已知的任何其它方法或如Kompala和Ozturk所述的(Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-BasedTherapies，(2006)，Taylor&Francis Group，LLC，第387-416页)。哺乳动物细胞可以在悬浮培养中生长(同质培养)或者附着于表面或包埋在不同装置中(异质培养)。为了保持生物反应器中的工作体积恒定，收获率和细胞排出(流体去除)应该等于预定的灌注速率。培养通常通过分批培养起始，并且灌注在接种后第2-3天时开始，此时细胞仍然处于指数生长期并且在营养限制发生之前。
通过添加新鲜培养基并同时去除耗尽培养基，基于灌注的方法提供了超过分批和补料分批方法的潜在改善。大规模商业细胞培养策略可以达到60-90x 106个细胞/mL的高细胞密度，在此时反应器体积的约三分之一到超过一半可以是生物量。通过基于灌注的培养，已实现了>1x 108个细胞/mL的极端细胞密度。典型的灌注培养开始于持续一天或更久的分批培养启动，以允许快速的初始细胞生长和生物量积累，随后为向培养物中连续、逐步和/或间歇添加新鲜补料培养基，并且同时在培养的生长和生产阶段自始至终去除耗尽培养基，伴随细胞的保留。各种方法，例如沉降、离心或过滤，可以用于去除耗尽培养基，同时维持细胞。已利用了工作体积的一小部分/天到许多个工作体积/天的灌注流速。
如本文使用的，术语“灌注速率”是添加和去除的体积，且通常每天进行测量。它取决于细胞密度和培养基。它应该最小化以减少目的产物的稀释，即收获滴度，同时确保营养素添加和副产物去除的足够速率。灌注通常在接种后第2-3天时开始，此时细胞仍然处于指数生长期，且因此灌注速率可以增加超过培养。灌注速率中的增加可以是增量的或连续的，即基于细胞密度或营养素消耗。它通常以0.5或1个容器体积/天(VVD)开始，并且可以上升到约5VVD。优选地，灌注速率为0.5至2VVD。增加可以是0.5至1VVD。为了灌注中的连续增加，可以将生物量探针与收获泵对接，使得灌注速率作为由生物量探针确定的细胞密度的线性函数增加，基于所需细胞特异性灌注速率(CSPR)。CSPR等于灌注速率/细胞密度，并且理想的CSPR取决于细胞系和细胞培养基。理想的CSPR应该导致最佳的增长率和生产率。50至100pL/细胞/天的CSPR可以是合理的开始范围，其可以进行调整以找到用于特定细胞系的最佳速率。
如本文使用的，术语“稳态”指其中细胞密度和生物反应器环境保持相对恒定的条件。这可以通过细胞排出、营养素限制和/或温度降低来实现。在大多数灌注培养中，营养素供应和废物去除允许恒定的细胞生长和生产率，并且需要细胞排出以维持恒定的活细胞密度或将细胞维持在稳态。在稳态下的典型活细胞密度为20至50e6个细胞/ml。活细胞密度可以取决于灌注速率而变。通过增加灌注速率或通过优化用于与灌注一起的培养基，可以达到更高的细胞密度。在非常高的活细胞密度下，灌注培养在生物反应器内变得难以控制。
术语“细胞排出(cell bleed)”和“细胞排出(cell bleeding)”可互换使用，并且指从生物反应器中去除细胞和培养基，以便在生物反应器内维持恒定、可持续的活细胞密度。恒定、可持续的活细胞密度也可以称为靶细胞密度。可以使用汲取管和蠕动泵以限定的流速来完成这种细胞排出。管道应该具有合适的尺寸，其中太窄的管易于细胞聚集和堵塞，而如果太大则细胞可能沉降。可以基于生长速率确定细胞排出，因此活细胞密度可以以连续方式限制至所需体积。可替代地，细胞可以以一定频率(例如，每天一次)去除，并且替换为培养基，以将细胞密度维持在可预测的范围内。理想地，细胞排出速率等于生长速率以维持稳定的细胞密度。
通常，用细胞排出去除的目的产物被弃去，且因此对于收获物损失。与渗透物相反，细胞排出含有细胞，这使得在纯化之前的产物贮存更加困难并且可能对产物质量具有不利作用。因此，在贮存和产物纯化之前必须连续地去除细胞，这将是费力和成本低效的。对于缓慢生长的细胞，细胞排出可以是被去除流体的约10％，且对于快速生长的细胞，细胞排出可以是被去除流体的约30％。因此，通过细胞排出的产物损失可以是总体生产的产物的约30％。如本文使用的，“渗透物”指细胞已从其中分离以保留在培养容器中的收获物。
术语“培养物”或“细胞培养物”可互换使用，指在适合于允许细胞群存活和/或生长的条件下，维持在培养基中的细胞群。本发明仅涉及哺乳动物细胞培养物。哺乳动物细胞可以悬浮培养或附着至固体支持物。如技术人员将明确的，细胞培养物指包含细胞群和群体悬浮于其中的培养基的组合。
如本文使用的，术语“培养”指通过其哺乳动物细胞在受控条件下和在支持细胞生长和/或存活的条件下生长或维持的过程。如本文使用的，术语“维持细胞”与“培养细胞”可互换使用。培养也可以指在培养基中接种细胞的步骤。
如本文使用的，术语“分批培养”是不连续方法，其中细胞在固定体积的培养基中生长短时间段，随后为完全收获。使用分批方法生长的培养物经历细胞密度的增加，直到达到最大细胞密度，随后为随着培养基组分被消耗和代谢副产物(例如乳酸盐和氨)的水平积累，活细胞密度中的下降。收获通常在达到最大细胞密度(通常为5-10x 106个细胞/mL，取决于培养基制剂、细胞系等)的点时或之后不久发生，通常为3至7天左右。
如本文使用的，术语“补料分批培养”通过提供推注或连续培养基补料来补充已消耗的那些培养基组分，改善了分批过程。由于补料分批培养在培养过程自始至终接受另外的营养素，因此当与分批方法相比时，它们具有达到更高的细胞密度(>10至30x 106细胞/ml，取决于培养基制剂、细胞系等)和增加的产品滴度的潜力。与分批过程不同，可以通过操纵补料策略和培养基制剂来创建且维持双相培养，以区分达到所需细胞密度的细胞增殖时期(生长期)与悬浮或缓慢细胞生长时期(生产期)。像这样，与分批培养相比，补料分批培养具有达到更高产物滴度的潜力。与分批方法一样，代谢副产物积累将导致细胞活力在一段时间内下降，因为这些在细胞培养基内逐渐积累，这将生产阶段的持续时间限制为约1.5至3周。补料分批培养是不连续的，并且收获通常在代谢副产物水平或培养物活力达到预定水平时发生。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中与“氨基酸残基序列”可互换使用，并且指氨基酸的聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化或蛋白质加工。可以在多肽的结构中进行修饰和改变，例如与其它蛋白质的融合，氨基酸序列取代、缺失或***，同时分子维持其生物学功能活性。例如，某些氨基酸序列取代可以在多肽或其基础核酸编码序列中进行，并且可以获得具有相同特性的蛋白质。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物。术语“多肽”通常指具有大于10个氨基酸的序列，并且术语“肽”指具有长度至多10个氨基酸的序列。
如本文使用的，术语“异源蛋白质”指衍生自与宿主细胞不同的生物或不同的物种的多肽。异源蛋白质由异源多核苷酸编码，所述异源多核苷酸通过实验放入并非天然表达该蛋白质的宿主细胞内。异源多核苷酸也可以称为转基因。因此，它可以是编码异源蛋白质的基因或开放读码框(ORF)。当关于蛋白质使用时，术语“异源”还可以指示蛋白质包含在彼此相同的关系中未发现或实际上相同长度的氨基酸序列。因此，它还涵盖重组蛋白质。异源还可以指多核苷酸序列，例如基因或转基因、或其一部分，在其中通常未发现它的位置中***哺乳动物细胞的基因组内。在本发明中，异源蛋白质优选是治疗蛋白质。
术语“培养基(medium)”、“细胞培养基”和“培养基(culture medium)”在本文中可互换使用，并且指滋养细胞，特别是哺乳动物细胞的营养素溶液。细胞培养基制剂是本领域众所周知的。通常，细胞培养基提供对于最低限度的生长和/或存活由细胞所需要的必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素，以及缓冲剂和盐。培养基还可以含有增强生长和/或存活高于最小速率的补充组分，包括但不限于激素和/或其它生长因子、特定离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能源；如本文所述。在某些实施方案中，有利地将培养基配制为对于细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。根据本发明的培养基是在细胞培养开始后添加的灌注培养基。在某些实施方案中，细胞培养基是起始营养素溶液(基础培养基或接种培养基)和在细胞培养开始后添加的任何培养基的混合物。
如本文使用的，术语“无血清”指不含动物或人血清的细胞培养基，例如胎牛血清。优选地，无血清培养基不含从任何动物或人衍生的血清中分离的蛋白质。各种组织培养基，包括成分确定的培养基，是商购可得的，例如，可以使用下述细胞培养基中的任何一种或组合：RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔最低基础培养基、F-12K培养基、Ham's F12培养基、Iscove改良达尔贝科培养基、McCoy's 5A培养基、Leibovitz's L-15培养基和无血清培养基如EX-CELLTM300系列(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)等等。也可获得此类培养基的无血清形式。细胞培养基可以补充有另外或增加浓度的组分，例如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲剂、抗生素、脂质、微量元素等等，取决于待培养细胞的要求和/或所需的细胞培养参数。
如本文使用的，术语“无蛋白质”指不含任何蛋白质的细胞培养基。因此，它缺乏从动物或人中分离的蛋白质，衍生自血清或重组产生的蛋白质，例如在哺乳动物、细菌、昆虫或酵母细胞中生产的重组蛋白质。无蛋白质培养基可以含有单一重组蛋白质，例如胰岛素或***，但仅在明确陈述这种添加时。
如本文使用的，术语“化学成分确定的”指培养基，其是无血清的并且不含任何水解产物，例如衍生自酵母、植物或动物的蛋白质水解产物。优选地，化学成分确定的培养基也是无蛋白质的或仅含有选择的重组产生的(非动物衍生的)蛋白质，例如胰岛素或***。化学成分确定的培养基由表征且纯化的物质的混合物组成。化学成分确定的培养基的实例是例如来自Invitrogen(Carlsbad，CA，US)的CD-CHO培养基。
如本文使用的，术语“悬浮细胞”或“非贴壁细胞”涉及在液体培养基中悬浮培养的细胞。贴壁细胞如CHO细胞可以适于在悬浮液中生长，且从而丧失其附着于容器或组织培养皿的表面的能力。
如本文使用的，术语“生物反应器”意指可用于细胞培养物生长的任何容器。生物反应器可以具有任何大小，只要它可用于细胞培养；通常，生物反应器的大小适合于在其内部生长的细胞培养物的体积。通常，生物反应器将为至少1升，并且可以是2、5、10、50、100、200、250、500、1,000、1,500、2,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多，或两者之间的任何体积。可以在培养期过程中控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。基于相关考虑，本领域普通技术人员将意识到并且能够选择合适的生物反应器，用于在实践本发明中使用。用于本发明方法中的细胞培养物可以在适合于灌注培养的任何生物反应器中生长。
如本文使用的，“细胞密度”指给定体积的培养基中的细胞数目。“活细胞密度”指给定体积的培养基中的活细胞数目，如通过标准活力测定(例如台盼蓝染料排除法)测定的。
如本文使用的，术语“细胞活力”意指培养中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文使用的，术语还指相对于在那时在培养中的存活和死亡细胞总数目，在特定时间存活的细胞部分。
如本文使用的，术语“滴度”意指在给定量的培养基体积中，通过细胞培养物产生的目的多肽或蛋白质(其可以是天然存在的或重组的目的蛋白质)的总量。滴度可以以毫克或微克多肽或蛋白质/毫升(或其它体积量度)培养基为单位表示。
如本文使用的，术语“得率(收率或产率)”指在某一时间段内在灌注培养中产生的异源蛋白质的量。“总得率”指在整个运行期间在灌注培养中产生的异源蛋白质的量。
如本文使用的，术语“减少(reduction)”、“减少(reduced)”或“减少(reduce)”一般意指与参考水平相比至少10％的降低，例如与对照哺乳动物细胞培养(其使用包含的钾离子低于本发明的灌注培养基中使用的浓度的相同的无血清灌注培养基，在相同条件下培养)相比，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％或直到且包括100％的降低，或10-100％之间的任何整数降低。
如本文使用的，术语“增强(enhancement)”、“增强(enhanced)”、“增强(enhanced)”、“增加(increase)”或“增加(increased)”一般意指与对照细胞相比至少10％的增加，例如与对照哺乳动物细胞培养(其使用包含的钾离子低于本发明的灌注培养基中使用的浓度的相同的无血清灌注培养基，在相同条件下培养)相比，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约200％、或至少约300％的增加，或10-300％之间的任何整数降低。
如本文使用的，“对照细胞培养物”或“对照哺乳动物细胞培养物”是和与它与之比较的细胞培养物相同的细胞，除了灌注培养基不具有本发明的灌注培养基的钾浓度之外，优选地，对照灌注培养基不具有本发明的灌注培养基的钾浓度，并且不具有本发明的灌注培养基的摩尔Na:K比。
如本文使用的，术语“哺乳动物细胞”是适合于生产异源蛋白质，优选治疗蛋白质，更优选分泌型重组治疗蛋白质的细胞系。根据本发明的优选哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞，例如仓鼠细胞。哺乳动物细胞是分离的细胞或细胞系。哺乳动物细胞优选是转化和/或永生化的细胞系。它们适于细胞培养中的连续传代，并且不包括原代非转化的细胞或其为器官结构的部分的细胞。优选的哺乳动物细胞是BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-S细胞、CHO-DXB11(也称为CHO-DUKX或DuxB11)、和CHO-DG44细胞或此类细胞系中任一种的衍生物/后代。特别优选的是CHO-DG44、CHO-K1和BHK21，且甚至更优选的是CHO-DG44和CHO-K1细胞。最优选的是CHO-DG44细胞。还涵盖的是哺乳动物细胞，特别是CHO-DG44和CHO-K1细胞的谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷衍生物。哺乳动物细胞可以进一步包含编码异源蛋白质，优选重组分泌性治疗蛋白质的一个或多个表达盒。哺乳动物细胞也可以是鼠细胞，例如鼠骨髓瘤细胞，例如NS0和Sp2/0细胞或此类细胞系中任一种的衍生物/后代。然而，这些细胞、其它哺乳动物细胞(包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系)的衍生物/后代也可以用于本发明中，特别是用于生产生物药物蛋白。
如本文使用的，术语“生长阶段”指细胞培养的阶段，其中细胞以指数方式增殖并且生物反应器中的活细胞密度增加。培养中的细胞通常遵循标准生长模式增殖。培养物接种后的第一个生长阶段是滞后阶段，其为当细胞适应培养环境并为快速生长做准备时的缓慢生长时期。滞后阶段随后为生长阶段(也称为对数阶段或对数期)，其中细胞以指数方式增殖并消耗生长培养基的营养素的时期。一旦达到靶细胞密度和/或开始收获，就开始“生产阶段”。典型的靶细胞密度在10x 106个细胞/ml至约120x 106个细胞/ml的范围内，但可以甚至更高。因此，根据本发明的靶细胞密度为至少10x 106个细胞/ml、至少20x 106个细胞/ml、至少30x 106个细胞/ml、至少40x 106个细胞/ml或至少50x 106个细胞/ml。最优选地，靶细胞密度为约30至约50x 106个细胞/ml。活细胞密度取决于灌注速率，并且可以使用常规或连续细胞排出维持在恒定水平下。
如本文使用的，术语“生长停滞”指停止数目的增加，即停止细胞***的细胞。细胞周期包括间期和***期。间期由三个阶段组成：DNA复制局限于S期；G1是M相和S相之间的间隙，而G2是S相和M相之间的间隙。在M期，核***，然后细胞质***。在不存在有丝***信号以增殖的情况下或在诱导生长停滞的化合物的存在下，细胞周期停滞。细胞可以部分地拆解其细胞周期控制***，并且从周期中退出到称为G0的特殊的非***状态。
如本文使用的，术语“约”指围绕所提供的实际值的变化提供，并且涵盖该值的正和负10％。
使用灌注培养来培养细胞的方法
出于理解的目的，然而不限于其，技术人员将了解，用于蛋白质生产的细胞培养和培养运行可以包括三种一般类型；即灌注培养、分批培养和补料分批培养。在灌注培养中，例如，在培养期过程中向细胞提供新鲜培养基补充物，同时每天去除旧培养基并且例如每天或连续地收获产物。在灌注培养中，可以每天添加灌注培养基并且可以连续添加，即作为滴注或输注。对于灌注培养，只要细胞保持存活并且环境和培养条件得到维持，细胞就可以根据需要保留在培养物中。由于细胞连续生长，通常需要在运行期间去除细胞，以便维持恒定的活细胞密度，其被称为细胞排出。细胞排出含有用细胞去除的培养基中的产物，其通常被弃去并因此被浪费。因此，在没有或仅具有最低限度细胞排出的生产阶段期间维持活细胞密度是有利的，并且增加每次运行的总得率。
在分批培养中，细胞最初在培养基中培养，并且该培养基不被去除、替换或补充，即，在培养运行结束期间或之前，细胞不用新培养基“补料”。在培养运行结束时收获所需产物。
对于补料分批培养，通过在运行期间每天(或连续)用新鲜培养基补充培养基一次或多次来增加培养运行时间，即，细胞在培养期过程中用新培养基(“补料”培养基)“补料”。补料分批培养可以包括如上所述的各种补料方案和时间，例如，每天、每隔一天、每两天等、每天多于一次、或每天少于一次，等等。进一步地，补料分批培养物可以用补料培养基连续补料。然后在培养/生产运行结束时收获所需产物。
根据本发明，哺乳动物细胞在灌注培养中培养。在异源蛋白质生产期间，期望具有受控***，其中细胞生长至所需活细胞密度，然后将细胞转换至生长停滞的高生产率状态，其中细胞使用能量和底物来产生目的异源蛋白质，而不是细胞生长和细胞***。用于完成该目标的方法，例如温度变动和氨基酸饥饿，并非总是成功的，并且可以对产品质量具有不期望的作用。如本文所述，通过执行常规细胞排出，在生产阶段期间的活细胞密度可以维持在所需水平下。然而，这导致目的异源蛋白质弃去。在生产阶段期间的细胞生长停滞导致对于细胞排出的需求减少，且甚至可以使细胞维持在更生产性的状态下。
本文提供的是在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)通过用无血清灌注培养基灌注，在生长阶段期间培养哺乳动物细胞；和(c)通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段期间培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，其中步骤(b)是任选的。
本文还提供的是减少灌注细胞培养中的细胞排出、和/或增加表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的蛋白质生产的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞；和(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，其中步骤(b)是任选的。
本发明还涵盖的是灌注培养以非常高的细胞密度接种，并且在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞后立即或不久开始灌注。进一步地，步骤(b)通过用无血清灌注培养基灌注在阶段期间培养哺乳动物细胞可以是任选的，使得通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段期间根据步骤(c)立即培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。
因此，本文还提供的是培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞、和/或减少灌注细胞培养中的细胞排出、和/或增加表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的蛋白质生产的方法，其包括：(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；(b)任选地通过用无血清灌注培养基灌注，在生长阶段期间培养哺乳动物细胞；和(c)通过用无血清灌注培养基灌注，在生产阶段期间培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。增加蛋白质生产涵盖在灌注运行中或在一定时间段内增加的蛋白质产物产率。它还涵盖增加的特定蛋白质生产/细胞或两者。
根据本发明的方法，在步骤(a)中培养哺乳动物细胞可以限于在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，并且因此不需要包括在灌注开始之前的实际培养步骤。进一步根据本发明的方法，通过灌注在生产阶段期间培养哺乳动物细胞包括：通过以恒定的活细胞密度灌注在生产阶段维持哺乳动物细胞。
一旦达到靶细胞密度，就开始生产阶段。优选地，一旦达到靶细胞密度，就开始步骤(c)。它可以以在10x 106个细胞/ml至约120x 106个细胞/ml或甚至更高范围内的细胞密度开始。优选地，步骤(c)以至少10x 106个细胞/ml、至少20x 106个细胞/ml、至少30x 106个细胞/ml、至少40x 106个细胞/ml、或至少50x 106个细胞/ml的细胞密度起始。最优选地，步骤(c)以约30至约50x 106个细胞/ml的细胞密度起始。
本发明的方法可以进一步包括在步骤(c)中通过细胞排出来维持细胞密度。在该上下文中提及的细胞密度是活细胞密度，其可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，控制细胞排出速率的计算可以基于维持Incyte或Futura生物量电容探针值(Hamilton公司、Aber instruments)，其对应于靶VCD，或者每日细胞和活力计数可以经由任何细胞计数装置离线获得，所述细胞计数装置例如血细胞计数器、Vi-Cell(Beckman Coulter)、CedexHiRes(Roche)或Viacount测定(EMD Millipore Guava EasyCyte)。使用本发明的方法，与对照灌注细胞培养相比，细胞排出减少，其中对照灌注细胞培养是这样的灌注细胞培养，其使用相同的无血清灌注培养基(其不含根据本发明的钾浓度和钠离子与钾离子的比率)，在相同条件下培养。更具体地，与对照灌注细胞培养相比，细胞排出减少，其中对照灌注细胞培养是这样的灌注细胞培养，其使用相同的无血清灌注培养基(其包含浓度小于30mM的钾离子和大于2的钠与钾的摩尔比)，在相同条件下培养。
本发明的无血清灌注培养基中的优选钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。在一些实施方案中，钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。合适的钾浓度和Na:K比的实例为约40mM至约200mM和约0.1至0.9的摩尔Na:K比、约40mM至约200mM和约0.2至0.8的摩尔Na:K比；约40mM至约200mM和约0.2至0.7的摩尔Na:K比；约40mM至约200mM和约0.3至0.6的摩尔Na:K比；约40mM至约200mM和约0.4至0.5的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.1至0.9的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.2至0.8的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.2至0.7的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.3至0.6的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.4至0.5的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.1至0.9的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.2至0.8的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.2至0.7的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.3至0.6的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.4至0.5的摩尔Na:K比。特别优选的是约60mM至约150mM的钾浓度和约0.6至0.3的摩尔Na:K比，甚至更优选的是约60mM至约150mM的钾浓度以及约0.5和0.4的摩尔Na:K比，且甚至更优选的是约80mM至约100mM的钾浓度以及约0.5和0.4的摩尔Na:K比。根据本发明的钾浓度连同根据本发明的摩尔Na:K比一起导致G0/G1细胞周期停滞。另外，根据本发明的钾浓度连同根据本发明的摩尔Na:K比一起导致增加的细胞比生产率(qp)。因此，根据本发明的高钾浓度和所得到的本发明的低钠浓度看起来协同作用。不受理论束缚，看起来根据本发明的钾浓度是G0/G1细胞周期停滞所需要的，并且钠离子的同时减少和因此减少的摩尔Na:K比促进了增加的细胞比生产率。
钾离子可以作为一种或多种钾盐提供。在一个优选实施方案中，一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾。更优选地，钾盐是碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。优选地，通过钾盐的添加不改变培养基的渗透压。这可以通过用相应的钾盐替换钠盐来实现。因此，技术人员将理解，通常用于细胞培养基中的任何钠盐是待用作相应钾盐的优选盐。优选地，钾盐优选取代步骤(b)的无血清灌注培养基中的相应钠盐。
本发明的无血清灌注培养基中的优选钠离子浓度小于100mM，更优选小于60，甚至更优选10-50mM。钠离子可以作为一种或多种钠盐提供。在一个优选实施方案中，一种或多种钠盐选自碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠、L-酪氨酸二钠盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、***钠、丙酮酸钠、谷胱甘肽钠、D-葡萄糖酸钠、琥珀酸钠和抗坏血酸钠。更优选地，钠盐是碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠、L-酪氨酸二钠盐、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
出于相同的原因并且允许在生长阶段期间生长，在接种培养基中以及在生长阶段期间，应该避免本发明的无血清灌注培养基的钾离子浓度和摩尔Na:K比。因此，步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基应该包含浓度低于本发明的无血清灌注培养基的钾离子浓度的钾、以及比本发明的无血清灌注培养基的摩尔Na:K比更高的摩尔Na:K比。优选地，步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基包含小于30mM的钾浓度。更优选地，步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基包含小于30mM的钾浓度，以及大于1，优选大于2的钠与钾的摩尔比。
本发明的无血清灌注培养基的渗透压应该在300至1400mOsmol/kg，优选300至500mOsmol/kg，更优选330至450mOsmol/kg，且甚至更优选360至390mOsmol/kg的范围内。其中渗透压作为mOsmol/kg水提供。
用于本发明的无血清灌注培养基和本发明方法的无血清灌注培养基可以是化学成分确定的和/或无水解产物的。无水解产物意指培养基不含有来自动物、植物(大豆、马铃薯、大米)、酵母或其它来源的蛋白质水解产物。通常，化学成分确定的培养基是无水解产物的。在任何情况下，无血清灌注培养基应该不含衍生自动物来源的化合物，特别是从动物中衍生且分离的蛋白质或肽(这不包括通过细胞培养产生的重组蛋白质)。优选地，无血清灌注培养基是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。更优选地，无血清灌注培养基是化学成分确定的，并且是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。这也适用于步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基。
灌注培养通常以作为分批培养的接种培养物开始。灌注可立即开始或者在一天或多天后开始。通常，在细胞培养的第2天之时或之后开始灌注。在一个实施方案中，步骤(b)中的灌注在细胞培养的第2天之时或之后开始。一旦达到靶细胞密度，就通过增加细胞培养中的钾离子浓度并且同时减少摩尔Na:K比来诱导生长停滞，以获得细胞培养中的本发明的无血清灌注培养基的浓度和比率。在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注来培养哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。
通常，根据本发明的哺乳动物细胞培养包括细胞培养的连续灌注。在灌注已开始后，灌注速率可能增加。通常，较高的灌注速率支持较高的活细胞密度，且因此允许较高的靶细胞密度。灌注速率可以从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天。优选地，灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。
本发明的方法进一步包括从灌注细胞培养中收获异源蛋白质。这优选从渗透物连续地完成，所述渗透物是细胞已通过细胞保留装置回收后产生的上清液。由于与补料分批相比，产物蛋白质在灌注生物反应器内部的细胞培养中的较短产物停留时间，对蛋白酶、唾液酸酶和其它降解蛋白质的暴露降到最低，其可以导致灌注培养中产生的异源蛋白质的产品质量更佳。
根据本发明的方法，任何细胞灌注生物反应器和细胞保留装置都可以用于灌注培养。用于灌注的生物反应器与用于分批/补料分批培养的生物反应器并无很大不同，除了它们尺寸更紧凑并连接到细胞保留装置之外。用于将细胞保留在生物反应器内部的方法主要由细胞是附着于表面生长还是在单细胞悬浮液或细胞聚集体中生长来决定。虽然历史上大多数哺乳动物细胞附着于表面或基质生长(异源培养)，但已努力使许多工业哺乳动物细胞系适应悬浮生长(同源培养)，主要是因为悬浮培养更容易按比例扩大。因此，用于本发明的方法中的细胞优选在悬浮液中生长。但不限于其，用于悬浮生长的细胞的示例性保留***是旋转过滤器、外部过滤例如切向流过滤(TFF)、交替切向流(ATF)***、细胞沉降(垂直沉降和倾斜沉降)、离心、超声分离和水力旋流器。灌注***可以分为两类：基于过滤的***，例如旋转过滤器、外部过滤和ATF，以及开放灌注***，例如重力沉降器、离心机、超声分离装置和水力旋流器。基于过滤的***显示高度的细胞保留，并且它不随着流速而变化。然而，过滤器可能堵塞，且因此培养运行的长度有限或需要更换过滤器。关于ATF***的一个例子是来自Repligen的ATF2***，并且关于TFF***的一个例子是使用离心泵的来自Levitronix的TFF***。错流过滤器如中空纤维(HF)或平板过滤器可以与ATF和TFF***一起使用。具体地，由改性聚醚砜(mPES)、聚醚砜(PES)或聚砜(PE)制成的中空纤维可以与ATF和TFF***一起使用。HF的孔径范围可以从几百kDa到15μM。开放灌注***不会堵塞，并且因此至少在理论上可以无限期地操作。然而，在更高的灌注速率下，细胞保留程度减少。目前存在可以在工业规模下使用的四种***：交替切向过滤器(ATF)、重力(特别是倾斜沉降器)、切向流过滤(TFF)和离心机。适合于异源或同源培养的细胞保留装置由Kompala和Ozturk(Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies，(2006)，Taylor&Francis Group，LLC，第387-416页)更详细地描述。灌注培养不是真正的稳态过程，只有当从生物反应器中去除细胞排出流时，总细胞浓度和活细胞浓度才达到稳态。
灌注生物反应器中的物理参数如pH、溶解氧和温度应该在线监测并实时控制。可以使用离线或在线取样执行细胞密度、活力、代谢产物和产物浓度的测定。当灌注操作以连续收获和进料开始时，灌注速率通常指收获流速，其可以手动设定为所需值。例如，用于生物反应器的重量控制可以激活进料泵，使得可以维持生物反应器中的恒定体积。可替代地，可以通过将培养物体积泵出高于预定水平来实现水平控制。必须调整生物反应器中的灌注速率，以向细胞递送足够的营养素。随着生物反应器中的细胞密度增加，必须增加灌注速率。
可以例如使用细胞密度测量、pH测量、氧消耗或代谢产物测量来控制灌注速率。细胞密度是用于灌注速率调整的最重要的测量。取决于细胞密度测量如何进行，可以每天或实时调整灌注速率。已开发了几种在线探针用于估计细胞密度，并且是本领域技术人员已知的，例如电容探针，例如Incyte探针(Hamilton Company)或Futura探针(Aberinstruments)。这些细胞密度探针也可以用于通过从生物反应器中去除过量细胞，即细胞排出，将细胞密度控制在所需的设定点下。因此，细胞排出由培养中的哺乳动物细胞的比生长速率决定。细胞排出通常不被收获，且因此被视为废物。
在另外一个方面，提供了本发明的无血清灌注培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养哺乳动物细胞、或用于减少灌注培养中的总细胞排出体积的用途。可替代地，提供了本发明的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的蛋白质生产的用途。培养基的用途如关于本发明的方法中使用的无血清灌注培养基(步骤(c)的)所公开的。
通过本发明的方法和用途产生的异源蛋白质可以是任何分泌蛋白质，优选地它是治疗蛋白质。由于大多数治疗蛋白质是重组治疗蛋白质，因此它最优选是重组治疗蛋白质。关于治疗蛋白质的实例是(但不限于其)抗体、融合蛋白、细胞因子和生长因子。
根据本发明的方法在哺乳动物细胞中产生的治疗蛋白质包括但不限于抗体或融合蛋白，例如Fc-融合蛋白。其它分泌性重组治疗蛋白质可以是例如酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段，以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其它多肽和支架。
其它目的重组蛋白质是例如(但不限于其)：胰岛素，***，hGH，tPA，细胞因子，例如白细胞介素(IL)，例如白细胞介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干扰素(IFN)α，IFNβ，IFNγ，IFNω或IFNτ，肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNFα和TNFβ，TNFγ，TRAIL；G-CSF，GM-CSF，M-CSF，MCP-1和VEGF。还包括的是***或任何其它激素生长因子，以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其它多肽的产生。
优选的治疗蛋白质是抗体或其片段或衍生物，更优选IgG1抗体。因此，本发明可以有利地用于产生抗体，例如单克隆抗体、多特异性抗体或其片段，优选单克隆抗体、双特异性抗体或其片段。在本发明的范围内的示例性抗体包括但不限于抗CD2、抗CD3、抗CD20、抗CD22、抗CD30、抗CD33、抗CD37、抗CD40、抗CD44、抗CD44v6、抗CD49d、抗CD52、抗EGFR1(HER1)、抗EGFR2(HER2)、抗GD3、抗IGF、抗VEGF、抗TNFα、抗IL2、抗IL-5R或抗IgE抗体，并且优选选自抗CD20、抗CD33、抗CD37、抗CD40、抗CD44、抗CD52、抗HER2/neu(erbB2)、抗EGFR、抗IGF、抗VEGF、抗TNFα、抗IL2和抗IgE抗体。
抗体片段包括例如“Fab片段”(片段抗原结合＝Fab)。Fab片段由两条链的可变区组成，其由相邻的恒定区保持在一起。这些可以通过例如用木瓜蛋白酶的蛋白酶消化从常规抗体形成，但类似地Fab片段也可以通过基因工程产生。进一步的抗体片段包括F(ab’)2片段，其可以通过用胃蛋白酶的蛋白水解切割来制备。
使用基因工程方法，能够产生缩短的抗体片段，其仅由重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成。这些被称为Fv片段(片段可变＝可变部分的片段)。由于这些Fv片段缺乏两条链通过恒定链的半胱氨酸的共价键合，因此Fv片段经常是稳定的。通过短肽片段将重链和轻链的可变区连接是有利的，所述短肽片段例如具有10至30个氨基酸，优选15个氨基酸。以这种方式，获得通过肽接头连接、由VH和VL组成的单条肽链。这种抗体蛋白质被称为单链-Fv(scFv)。scFv-抗体蛋白的实例是本领域技术人员已知的。
根据本发明的优选治疗抗体是双特异性抗体。双特异性抗体通常在一个分子中组合关于靶细胞(例如恶性B细胞)和效应细胞(例如T细胞、NK细胞或巨噬细胞)的抗原结合特异性。示例性双特异性抗体(但不限于其)是双抗体、BiTE(双特异性T细胞衔接物)形式和DART(双重亲和性重新靶向)形式。双抗体形式在两条分开的多肽链上分开具有两种抗原结合特异性的重链和轻链的同源可变结构域，其中两条多肽链是非共价结合的。DART格式基于双抗体格式，但它通过C末端二硫桥提供了另外的稳定作用。
另一种优选的治疗蛋白质是融合蛋白，例如Fc融合蛋白。因此，本发明可以有利地用于产生融合蛋白，例如Fc融合蛋白。此外，根据本发明的增加蛋白质生产的方法可以有利地用于产生融合蛋白，例如Fc融合蛋白。
融合蛋白的效应部分可以是天然或修饰的异源蛋白质的完全序列或序列的任何部分，或者天然或修饰的异源蛋白质的完全序列或序列的任何部分的组合物。免疫球蛋白恒定结构域序列可以得自任何免疫球蛋白亚型例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2亚型，或类别例如IgA、IgE、IgD或IgM。优先地，它们衍生自人免疫球蛋白，更优选衍生自人IgG，且甚至更优选衍生自人IgG1和IgG2。Fc-融合蛋白的非限制性实例是MCP1-Fc、ICAM-Fc、EPO-Fc和scFv片段等等，其偶联至包含N联糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的CH2结构域。Fc-融合蛋白可以通过基因工程方法构建，通过将包含N联糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的CH2结构域引入另一种表达构建体内，所述另一种表达构建体包含例如其它免疫球蛋白结构域、酶促活性蛋白质部分或效应结构域。因此，根据本发明的Fc融合蛋白还包含单链Fv片段，其连接至包含例如N联糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的CH2结构域。
在一个进一步方面，使用本发明的方法提供了产生治疗蛋白质的方法，并且任选地进一步包括将治疗蛋白质纯化且配制成药学上可接受的制剂的步骤。
治疗蛋白质，尤其是抗体、抗体片段或Fc融合蛋白优选地作为分泌性多肽从培养基中回收/分离。有必要从其它重组蛋白质和宿主细胞蛋白质中纯化治疗蛋白质，以获得治疗蛋白质的基本上同质制剂。作为第一步，从培养基中去除细胞和/或颗粒细胞碎片。进一步地，例如，通过在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex色谱以及在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱，从污染物可溶性蛋白质、多肽和核酸中纯化治疗蛋白质。用于纯化由哺乳动物细胞表达的异源蛋白质的方法是本领域已知的。
在一个实施方案中，使用本发明方法表达的异源蛋白质由一个或多个表达盒编码，所述表达盒包含编码异源蛋白质的异源多核苷酸。异源蛋白质可以置于可扩增的遗传选择标记物例如二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)的控制下。可扩增的选择标记物基因可以在与异源蛋白质表达盒相同的表达载体上。可替代地，可扩增的选择标记物基因和异源蛋白质表达盒可以在不同的表达载体上，但非常接近地整合到宿主细胞的基因组内。例如，同时共转染的两种或更多种载体经常紧密接近地整合到宿主细胞的基因组内。然后通过将扩增试剂(例如，用于DHFR的MTX或用于GS的MSX)加入培养基内，来介导含有分泌性治疗蛋白质表达盒的遗传区域的扩增。
还可以通过例如将异源蛋白质编码多核苷酸的多重拷贝克隆到表达载体内，来实现由哺乳动物细胞表达的足够高稳定水平的异源蛋白质。如上所述将异源蛋白质编码多核苷酸的多重拷贝克隆到表达载体内，并且扩增异源蛋白质表达盒可以进一步组合。
哺乳动物细胞系
如本文使用的，哺乳动物细胞是适合于产生分泌性重组治疗蛋白质的哺乳动物细胞系，并且因此也可以称为“宿主细胞”。根据本发明的优选哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞，例如仓鼠细胞。哺乳动物细胞是分离的细胞或细胞系。哺乳动物细胞优选是转化和/或永生化的细胞系。它们适于细胞培养中的连续传代，并且不包括原代非转化的细胞或其为器官结构的部分的细胞。优选的哺乳动物细胞是BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DXB11(也称为CHO-DUKX或DuxB11)、CHO-S细胞和CHO-DG44细胞或此类细胞系中任一种的衍生物/后代。特别优选的是CHO细胞，如CHO-DG44、CHO-K1和BHK21，且甚至更优选的是CHO-DG44和CHO-K1细胞。最优选的是CHO-DG44细胞。还涵盖的是哺乳动物细胞，特别是CHO-DG44和CHO-K1细胞的谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷衍生物。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选CHO-DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO DXB11细胞、CHO-S细胞、CHOGS缺陷细胞或衍生物。
哺乳动物细胞可以进一步包含编码异源蛋白质，例如治疗蛋白质，优选重组分泌性治疗蛋白质的一个或多个表达盒。宿主细胞也可以是鼠细胞，例如鼠骨髓瘤细胞，例如NS0和Sp2/0细胞或此类细胞系中任一种的衍生物/后代。可以用于本发明的含义中的哺乳动物细胞的非限制性实例也概括于表1中。然而，这些细胞、其它哺乳动物细胞(包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系)的衍生物/后代也可以用于本发明中，特别是用于生产生物药物蛋白。
表1：哺乳动物生产细胞系
1CAP(CEVEC's Amniocyte Production)细胞是基于原代人羊水细胞的永生化细胞系。它们通过用含有腺病毒5的功能E1和pIX的载体转染这些原代细胞而生成。由于真实的人翻译后修饰，CAP细胞允许具有优异生物活性和治疗功效的重组蛋白质的竞争性稳定生产。
当在无血清条件下，且任选地在不含动物起源的任何蛋白质/肽的培养基中建立、适应且完全培养时，哺乳动物细胞是最优选的。商购可得的培养基，例如Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，德国)、RPMI-1640(Sigma)、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；Sigma)、最低基础培养基(MEM；Sigma)、Iscove改良达尔贝科培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S-Invitrogen)、无血清CHO培养基(Sigma)和无蛋白CHO培养基(Sigma)是示例性的适当营养溶液。任何培养基都可以根据需要补充有各种化合物，其非限制性实例是重组激素和/或其它重组生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、***)、盐(如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等价能源、抗生素和微量元素。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需的补充剂。为了培养和选择表达可选择基因的遗传修饰细胞，将合适的选择试剂加入培养基中。
无血清灌注培养基
在另一个方面，提供了无血清灌注培养基，其包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。
在一些实施方案中，钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。在一些实施方案中，钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。
本发明的无血清灌注培养基中的优选钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。在一些实施方案中，钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。合适的钾浓度和Na:K比的实例为约40mM至约200mM和约0.1至0.9的摩尔Na:K比、约40mM至约200mM和约0.2至0.8的摩尔Na:K比；约40mM至约200mM和约0.2至0.7的摩尔Na:K比；约40mM至约200mM和约0.3至0.6的摩尔Na:K比；约40mM至约200mM和约0.4至0.5的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.1至0.9的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.2至0.8的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.2至0.7的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.3至0.6的摩尔Na:K比；约60mM至约150mM和约0.4至0.5的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.1至0.9的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.2至0.8的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.2至0.7的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.3至0.6的摩尔Na:K比；约80mM至约100mM和约0.4至0.5的摩尔Na:K比。特别优选的是约60mM至约150mM的钾浓度和约0.6至0.3的摩尔Na:K比，甚至更优选的是约60mM至约150mM的钾浓度以及约0.5和0.4的摩尔Na:K比，且甚至更优选的是约80mM至约100mM的钾浓度以及约0.5和0.4的摩尔Na:K比。根据本发明的钾浓度连同根据本发明的摩尔Na:K比一起导致G0/G1细胞周期停滞。另外，根据本发明的钾浓度连同根据本发明的摩尔Na:K比一起导致增加的细胞比生产率(qp)。因此，根据本发明的高钾浓度和所得到的本发明的低钠浓度看起来协同作用。不受理论束缚，看起来根据本发明的钾浓度是G0/G1细胞周期停滞所需要的，并且钠离子的同时减少和因此减少的摩尔Na:K比促进了增加的细胞比生产率。
钾离子可以作为一种或多种钾盐提供。在一个优选实施方案中，一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾。更优选地，钾盐是碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。优选地，通过钾盐的添加不改变培养基的渗透压。这可以通过用相应的钾盐替换钠盐来实现。因此，技术人员将理解，通常用于细胞培养基中的任何钠盐是待用作相应钾盐的优选盐。
本发明的无血清灌注培养基中的优选钠离子浓度小于100mM，更优选小于60，甚至更优选10-50mM。钠离子可以作为一种或多种钠盐提供。在一个优选实施方案中，一种或多种钠盐选自碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠、L-酪氨酸二钠盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、***钠、丙酮酸钠、谷胱甘肽钠、D-葡萄糖酸钠、琥珀酸钠和抗坏血酸钠。更优选地，钠盐是碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠、L-酪氨酸二钠盐、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
本发明的无血清灌注培养基的渗透压应该在300至1400mOsmol/kg，优选300至500mOsmol/kg，更优选330至450mOsmol/kg，且甚至更优选360至390mOsmol/kg的范围内。其中渗透压作为mOsmol/kg水提供。
本发明的无血清灌注培养基可以是化学成分确定的和/或无水解产物的。无水解产物意指培养基不含有来自动物、植物(大豆、马铃薯、大米)、酵母或其它来源的蛋白质水解产物。通常，化学成分确定的培养基是无水解产物的。在任何情况下，无血清灌注培养基应该不含衍生自动物来源的化合物，特别是从动物中衍生且分离的蛋白质或肽(这不包括通过细胞培养产生的重组蛋白质)。优选地，无血清灌注培养基是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。更优选地，无血清灌注培养基是化学成分确定的，并且是无蛋白质的、或除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。
在另外一个方面，提供了本发明的无血清灌注培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养哺乳动物细胞、或用于减少灌注培养中的总细胞排出体积的用途。可替代地，提供了本发明的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的蛋白质生产的用途。培养基的用途如关于本发明的方法中使用的无血清灌注培养基(步骤(c)的)所公开的。
实施例
实施例1：细胞排出对总生产率的作用。
产生单克隆抗体mAb1的CHO细胞系在3L玻璃灌注生物反应器中以2L工作体积培养，利用如所示的两种不同的再循环装置：ATF#1和ATF#2使用ATF2装置(Repligen，Waltham，MA)重复，并且TFF生物反应器使用离心泵(Levitronix，Zurich，瑞士瑞士)。使用的中空纤维是具有0.2μm孔径和1mm管腔ID的聚醚砜(PES)。对于细胞培养的整个持续时间，使用具有浓度比Na:K 9的灌注培养基。再循环和灌注速率跨越所有三个反应器保持恒定。每天测量收获(渗透物)流(回收产物)和生物反应器内容物(反应器滴度)的滴度，以解释穿过中空纤维筛分的任何产物，其中细胞排出的滴度假定与生物反应器滴度相同。根据下述计算评估在细胞培养结束时(第29天)产生的总克数：
损失的产物：反应器＝工作体积反应器×反应器滴度第29天
总体生产的＝回收的产物+损失的产物：排出+损失的产物：反应器
从图1可以看出的，在稳态灌注过程中，细胞排出可以占总产物损失的约30％。
实施例2：对深孔灌注模型中的Na+/K+浓度变化的细胞生长和生产率响应。
用于灌注的无血清化学成分确定的培养基用作所有培养基实验的本底。在指示达到0.3至无穷大(无K+)的Na+/K+比率时，Na+和K+的水平被改变。这通过将培养基组分氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)和碳酸氢钠(NaHCO3)与分别的钾形式交换来实现，以获得如下表2中对于所有测试培养基显示的最终Na和K浓度，而不改变渗透压。对于所有条件，最终的培养基渗透压为360-390mosmol/kg水。使用产生单克隆抗体mAb 1(IgG1)的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(CHO-DG44)。使解冻的接种培养物在无血清的化学成分确定的接种培养基中生长，并且维持在摇瓶中直至达到靶细胞密度。用于深孔板工作的细胞直接接种到Axygen 24孔预灭菌的深孔板(Neta Scientific Inc，Hainesport，NJ)中。20e6细胞/mL的起始细胞密度用于深孔板模型工作，以模拟灌注的高细胞密度阶段并测试培养基深度。为了从摇瓶培养物实现如此高的细胞密度，将所需体积以1000rpm离心5分钟，并且将细胞团块重悬浮于灌注培养基中至所需密度，然后分配到深孔板内。工作体积/孔为3mL。细胞在33℃下伴随5％CO2、80％湿度和200rpm，在具有5.0cm轨道直径的培养箱中生长。每天通过以1200rpm将板离心5分钟，去除上清液，并且以2/3容器体积/天(VVD)的更换速率，将细胞重悬浮于新鲜培养基中，来执行培养基更换。
在深孔培养的第5天时执行细胞周期分析。细胞在含有Na:K 2(K＝37mM)或Na:K0.5(K＝76mM)的培养基中生长，并且在第5天时，通过在冷PBS中的2x洗涤进行固定，然后悬浮于70％乙醇中。细胞随后用碘化丙锭与RNA酶(BD Biosciences)就DNA含量进行染色，并且在Guava easyCyte流式细胞仪(EMD Millipore)上通过流式细胞术进行分析。
表2：
mM Na:K 9 Na:K 2 Na:K 1 Na:K 0.5 Na:K 0.4
NaCl(mM) 16 16 0 0 0
NaHCO<sub>3</sub>(mM) 25 0 0 0 0
NaOH 28 28 16 0 0
来自其它的Na+(mM) 34 34 34 34 34
KCl(mM) 12 12 12 39 39
KHCO<sub>3</sub>(mM) 0 25 25 25 25
KOH 0 0 12 12 30
Total Na+(mM) 103 78 50 34 34
K+(mM) 12 37 49 76 94
总Na+和K+(mM) 115 115 99 110 128
摩尔Na:K 8.6 2.1 1 0.45 0.36
对于测试的浓度范围，在图2A和B中显示了累积比生长速率(SGR)和累积细胞比生产率(qp)的等高线图。响应程度表示为与对照条件Na＝78mM，K＝37mM(Na:K 2)的差异比例，其中较暗区域表示较低细胞生长或较高比生产率的条件。虚线表示如标记的Na:K比。细胞生长和细胞比生产率两者均取决于Na和K浓度，其中更高的生产率和更慢的细胞生长在更高的K水平下发生。与小于1的Na:K比相比，更高的Na:K比(Na:K>2)涵盖更低生产率和更高细胞生长的区域。
关于图2C和D中的细胞培养的整个时间过程显示了代表性的活细胞密度(VCD)和活力图。减少Na:K比导致在一段时间内减少的活细胞密度，指示较低的比生长速率(图2C)，而在整个7天培养自始至终，活力始终保持很高(>85％)(图2D)。
用不同Na+/K+浓度处理的CHO细胞的细胞周期分析结果显示于图3中。与Na:K 2培养基相比，在Na:K 0.5培养基中培养的CHO细胞中，亚G0和G0/1期中的细胞比例增加，而S和G2/M期中的细胞部分降低(图3A)。这根据图3B甚至更加明显，显示了与Na:K 2培养基相比，关于在Na:K 0.5培养基中培养的CHO细胞的G0/1:G2/M比。这证实了降低钠与钾的比率使细胞停滞在G0/1期。
实施例3：2L灌注反应器中的细胞性能。
评价了表达不同单克隆抗体的三种CHO细胞系。用于生物反应器培养的细胞在相同的灌注培养基(9Na+/K+)中生长，直至达到靶细胞密度，然后转换为Na:K 0.5培养基(～76mM K)或保留在Na:K 9培养基(12mM K+)中。在所有灌注生物反应器中使用的中空纤维由具有0.2μm孔径和1mm管腔ID的聚醚砜(PES)制成。在所有实施例中使用的再循环装置是ATF2***(Repligen，Waltham，MA)或使用离心泵的TFF***(Levitronix，Zurich，瑞士)。两种***先前已证实在2L规模上是可互换的。所有研究都在3L玻璃搅拌釜生物反应器中以2L工作体积(Applikon Biotechnology，Delft，荷兰)进行。对于每种细胞系建立最小细胞比灌注速率，并且在稳态下范围为0.03至0.08nL/细胞/天。对于相同细胞系，该灌注速率在不同培养基条件之间保持相同。通过使用Incyte探针(Hamilton，Reno，NV)的在线反馈控制的细胞排出，活细胞密度在一段时间内保持恒定。在该实验中使用的细胞系是表达mAb1的CHO-DG44细胞(例示低生产细胞系；qp<20pg/细胞/天)、表达mAb2的CHO-K1细胞(例示中等生产细胞系；20pg/细胞/天<qp<40pg/细胞/天)、以及表达mAb3的CHO-K1细胞(例示高生产细胞系；qp>50pg/细胞/天)。
进一步地，在三种细胞系中分析对糖基化模式、酸性和碱性种类、或高和低分子种类的特定作用。对于所有三种细胞系，对于以减少Na:K比的反应器以及以对照培养基(Na:K9)的反应器，在细胞培养持续时间内每天收集渗透物。通过阳离子交换色谱(CEX)测量酸性和碱性种类，通过尺寸排阻色谱(SEC)测量高和低分子量种类，并且通过2-AA亲水相互作用液相色谱(HILIC)测量N-聚糖。就种类百分比分析色谱图。
对于中等生产者(mAb2)，在图4A至D中显示了代表性的每日qp、SGR、活力和细胞排出图。如从图4A可以看出的，与维持在Na:K9培养基中的对照细胞相比，在培养基在第10天时已转换为Na:K 0.5培养基后，细胞比生产率立即增加。同时，与对照细胞相比，比生长速率下降得更快并且至更低的总体水平(图4B)。这也通过维持恒定的活细胞密度所需的低得多的排出流速(图4D)来反映(数据未显示)。将Na:K比减少至0.5不影响细胞活力(图4C)。
表3
Na:K 0.5/Na:K 9(％差异)
细胞系 总排出体积
CHO-DG44 mAb1 48％
CHO-K1 mAb2 32％
CHO-K1 mAb3 51％
关于所有三种细胞系的最终总排出体积显示于表3中。排出体积针对对照(Na/K 9条件)标准化，并且表示为Na/K 0.5条件相对于Na/K 9条件的百分比。
对于表达不同单克隆抗体并且在其生产率中不同的三种不同的CHO细胞系，在灌注培养的第22天时，两种不同培养基之间的平均qp和SGR中的差异显示于图5中。平均qp和平均SGR表示为对其在培养基转换之前的分别值标准化的在培养基转换之后的平均qp和SGR(即关于mAb1和3的第10-22天/第0-10天，以及关于mAb2的第12-22天/第0-12天)。所有三种CHO细胞系在转换为Na:K 0.5培养基后显示比生长速率中的减少。这种效应在CHO-DG44 mAb1和CHO-K1 mAb2中最显著，其中在CHO-DG44 mAb1中具有甚至更强的效应。尽管在具有减少的Na:K比的培养基的CHO-K1 mAb3(IgG4)中，也存在朝向减少的比生长速率的趋势，但这种差异是统计学不显著的。对于CHO-K1 mAb3细胞的每日生长速率的评价揭示：在将培养基转换为较低的Na:K比之后的生长速率在一段时间内降低至相对于培养基转换前一天时的SGR约0.2，而对照培养中的生长速率直到第22天保持稳定在相对于培养基转换前一天时的SGR约0.6下。与测试的其它两种细胞系相比，CHO-DG44 mAb3看起来对培养基转换具有较慢的响应时间。因此可想象，如果培养持续时间已延长，则平均生长速率显示显著差异。同时，当在具有减少的Na:K比的培养基中培养时，细胞比生产率在所有三种细胞系中在统计学上显著增加。该效应对于CHO-K1 mAb2最显著。关于CHO-DG44 mAb1和CHO-K1 mAb3的增加处于类似略微较不明显的水平，但仍是统计学显著的。
在所测试的三种细胞系中未观察到对糖基化模式、酸性和碱性种类、或高和低分子种类的特定作用。
鉴于上文，将了解本发明还涉及下述项目：
项目
1.一种在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：
(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；
(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞；和
(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，
其中步骤(b)是任选的。
2.一种减少表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的细胞排出的方法，其包括：
(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；
(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞；和
(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，
其中步骤(b)是任选的。
3.一种增加表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的蛋白质生产的方法，其包括：
(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；
(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞；和
(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，
其中步骤(b)是任选的。
4.项目1至3中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括通过细胞排出来维持细胞密度。
5.项目4的方法，其中与使用相同的无血清灌注培养基(其包含浓度小于30mM的钾离子和大于2的钠与钾的摩尔比)，并且在相同的条件下培养的灌注细胞培养相比，细胞排出减少。
6.前述项目中任一项的方法，其中所述钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。
7.前述项目中任一项的方法，其中所述钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。
8.前述项目中任一项的方法，其中所述钾离子作为一种或多种钾盐提供。
9.项目8的方法，其中所述一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾。
10.项目9的方法，其中所述一种或多种钾盐取代所述无血清灌注培养基中的相应钠盐。
11.项目10的方法，其中所述钾离子作为一种或多种钾盐提供，并且所述一种或多种钾盐取代步骤b)的无血清灌注培养基中的相应钠盐。
12.前述项目中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
13.项目12的方法，其中所述CHO细胞是CHO-DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO DXB11细胞、CHO-S细胞、CHO GS缺陷细胞或这些细胞中任一种的衍生物。
14.前述项目中任一项的方法，其中步骤(a)的无血清培养基和步骤(b)的无血清灌注培养基包含低于30mM的钾离子。
15.前述项目中任一项的方法，其中步骤(b)中的灌注在所述细胞培养的第2天之时或之后开始。
16.前述项目中任一项的方法，其中所述灌注包括连续灌注。
17.前述项目中任一项的方法，其中所述灌注速率在灌注已开始后增加。
18.项目17的方法，其中所述灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天。
19.项目18的方法，其中所述灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。
20.前述项目中任一项的方法，其进一步包括从所述灌注细胞培养中收获所述异源蛋白质。
21.前述项目中任一项的方法，其中所述异源蛋白质是治疗蛋白质。
22.项目21的方法，其中所述治疗蛋白质选自抗体、融合蛋白、细胞因子和生长因子。
23.前述项目中任一项的方法，其中所述无血清灌注培养基是化学成分确定的。
24.前述项目中任一项的方法，其中所述无血清灌注培养基是无水解产物的。
25.前述项目中任一项的方法，其中所述无血清灌注培养基是除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。
26.项目1-24中任一项的方法，其中所述无血清灌注培养基是无蛋白质的。
27.项目1至26中任一项的方法，其中一旦达到10x 106个细胞/ml至约120x 106个细胞/ml的细胞密度，就开始步骤(c)。
28.项目1至27中任一项的方法，其中所述培养基的渗透压为300至1400mOsmol/kg，优选300至500mOsmol/kg。
29.一种生产治疗蛋白质的方法，其使用项目1至28中任一项的方法。
30.项目29的方法，其中由所述哺乳动物细胞表达的所述异源蛋白质是治疗蛋白质，并且其中将所述治疗蛋白质纯化且配制成药学上可接受的制剂。
31.一种无血清灌注培养基，其包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。
32.项目31的无血清灌注培养基，其中所述钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。
33.项目31或32的无血清灌注培养基，其中所述钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。
34.项目31至33中任一项的无血清灌注培养基，其中所述钾离子作为一种或多种钾盐提供。
35.项目34的无血清灌注培养基，其中所述一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾。
36.项目35的无血清灌注培养基，其中所述一种或多种钾盐和/或氢氧化钾取代所述无血清灌注培养基中的相应钠盐。
37.项目31至36中任一项的无血清灌注培养基，其中所述无血清灌注培养基是化学成分确定的。
38.项目31至37中任一项的无血清灌注培养基，其中所述无血清灌注培养基是无水解产物的。
39.项目31至38中任一项的无血清灌注培养基，其中所述无血清灌注培养基是除了重组胰岛素和/或***之外无蛋白质的。
40.项目31至38中任一项的无血清灌注培养基，其中所述无血清灌注培养基是无蛋白质的。
41.如第31至40项中任一项的无血清灌注培养基，其中所述培养基的渗透压为300至1400mOsmol/kg，优选300至500mOsmol/kg。
42.项目31至41中任一项的无血清灌注培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养哺乳动物细胞的用途。
43.项目31至41中任一项的无血清灌注培养基用于减少灌注培养中的总细胞排出体积的用途。
44.项目31至41中任一项的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的蛋白质生产的用途。
45.项目31至41中任一项的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的细胞特异性蛋白质生产的用途。

Claims (15)

1.一种在灌注细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：
(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；
(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞；和
(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，
其中步骤(b)是任选的。
2.一种减少表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的细胞排出的方法，其包括：
(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；
(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞；和
(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，
其中步骤(b)是任选的。
3.一种增加表达异源蛋白质的灌注细胞培养中的蛋白质生产的方法，其包括：
(a)在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞；
(b)在生长阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞；和
(c)在生产阶段期间，通过用无血清灌注培养基灌注培养所述哺乳动物细胞，所述无血清灌注培养基包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比，
其中步骤(b)是任选的。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括通过细胞排出来维持细胞密度，优选地，其中与使用包含浓度小于30mM的钾离子和大于2的钠与钾的摩尔比的相同的无血清灌注培养基，并且在相同的条件下培养的灌注细胞培养相比，细胞排出减少。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述钾离子浓度为约40mM至约200mM，优选约60mM至约150mM，且更优选约80mM至约100mM。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述钠与钾的摩尔比在约0.9和0.1之间、在约0.8和0.2之间、在约0.7和0.2之间，优选在约0.6和0.3之间，且更优选在约0.5和0.4之间。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述钾离子作为一种或多种钾盐提供，优选地其中所述一种或多种钾盐选自碳酸氢钾、氯化钾、氢氧化钾、L-酪氨酸二钾盐、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、***钾、丙酮酸钾、谷胱甘肽钾、D-葡萄糖酸钾、琥珀酸钾和抗坏血酸钾，更优选其中所述一种或多种钾盐取代所述无血清灌注培养基中的相应钠盐，最优选其中所述钾离子作为一种或多种钾盐提供，并且所述一种或多种钾盐取代步骤b)的无血清灌注培养基中的相应钠盐。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选CHO-DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO DXB11细胞、CHO-S细胞、CHO GS缺陷细胞或这些细胞中任一种的衍生物。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述异源蛋白质是治疗蛋白质，优选选自抗体、融合蛋白、细胞因子和生长因子。
10.一种生产治疗蛋白质的方法，其使用权利要求1至9中任一项的方法。
11.一种无血清灌注培养基，其包含浓度为30mM至250mM的钾离子和小于1的钠离子与钾离子的摩尔比。
12.权利要求11的无血清灌注培养基用于在生产阶段期间在灌注培养中培养哺乳动物细胞的用途。
13.权利要求11的无血清灌注培养基用于减少灌注培养中的总细胞排出体积的用途。
14.权利要求11的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的蛋白质生产的用途。
15.权利要求11的无血清灌注培养基用于增加灌注细胞培养中的细胞特异性蛋白质生产的用途。
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