CN110512005B - 泛素特异性蛋白酶8在调控湖羊肉质及育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及泛素特异性蛋白酶8(USP8)在调控湖羊肉质及育种中的应用。实验发现，USP8可以影响湖羊肌肉的食用品质，USP8表达量越高，湖羊的食用品质就越好，因此可以通过筛选USP8的表达量来挑选肉质好的湖羊作为种羊。本发明明确了USP8对肌卫星细胞的早期分化过程有抑制作用，为湖羊品种的进一步保护与选育提供基础理论依据，同时也为今后的新品系定向选育工作提供了部分参考和技术储备。

Description

泛素特异性蛋白酶8在调控湖羊肉质及育种中的应用

(一)技术领域

本发明属于动物分子标记技术领域，特别是涉及泛素特异性蛋白酶8在调控湖羊肉质及育种中的应用。

(二)背景技术

湖羊隶属于哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyl)、牛科(Bovine)、绵羊属(Sheep)，是我国一级地方畜禽保护品种，同时也是享誉世界的多胎绵羊品种之一。湖羊肉质口感丰富、鲜嫩多汁，并且具有早熟、繁殖力强等特性，具有极高的经济价值。

湖羊对环境的适应力强、性成熟早、适宜圈养、繁殖力强，适宜作为杂交选育的母本，但其胴体瘦肉率低、个体生长发育速度慢的问题也不容忽视。探索湖羊肌卫星细胞生长分化的相关基因及其作用机制，有助于分析出湖羊肌肉生长发育的调控机理，为湖羊新品种的选育工作提供理论基础。

USPs是一个家族内成员数量最多、且家族内不同因子的结构差异非常大的去泛素化酶亚家族。不同的USP因子参与的信号通路也不尽相同，现在已知许多分化过程都可被USPs所调控。泛素特异性蛋白酶8(Ubiquitin-specific protease 8,USP8,UBPY)是去泛素化酶USP家族成员之一，参与真核细胞中重要的蛋白质降解途径-泛素-蛋白酶体途径，可通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命，进而调控许多生物学功能包括细胞周期、细胞分化、细胞免疫及细胞凋亡。目前，已经有研究显示USP4可抑制肌卫星细胞的分化，且主要与AKT和p38信号通路相关联；USP19也能抑制肌卫星细胞的分化，但却是通过抑制未折叠蛋白响应(UPR)来调节分化。

去泛素化酶作为近些年的研究热点，还没有出现关于USP8调节肌生成的相关报道。

(三)发明内容

本发明的目的是提供泛素特异性蛋白酶8在调控湖羊肉质及育种中的应用。

本发明采用的技术方案是：

泛素特异性蛋白酶8在调控湖羊肉质中的应用。USP8可促进湖羊肌卫星细胞增值，并且其表达量与肌纤维密度呈线性相关。USP8表达量越高，肌纤维密度越大，而肌纤维的密度和直径与肌肉的系水力和剪切力有关。系水力直接影响肉的风味、质地、营养成分、多汁性等食用品质，系水力越强，其蛋白质保持水分的能力强，不易变形，能较好的保持肌肉的肉嫩多汁性，相对会有较好的口感；剪切力是评价肉品嫩度的另一重要指标，剪切力越大则肌肉嫩度越差。

具体的，所述泛素特异性蛋白酶8用于调控湖羊肌卫星细胞分化。

本发明还涉及泛素特异性蛋白酶8在湖羊育种中的应用。

具体的，所述应用为：利用下述引物为扩增引物，对湖羊基因组DNA进行PCR扩增，获得湖羊基因组中USP8的表达量数据；

上游引物：5'-CTGCTTCTGTTCCTAATGGATGGTCTC-3'

下游引物：5'-TGAGGCACTGTACTGTGGACTTGA-3'

USP8可以影响湖羊肌肉的食用品质，USP8表达量越高，湖羊的食用品质就越好，可以通过筛选USP8的表达量来挑选肉质好的湖羊作为种羊。

USP8基因全长4122bp，可编码1085个氨基酸。近些年来它在其余物种中也陆陆续续被检测出来，该基因在羊上位于七号染色体、在人上位于十五号染色体、在小鼠上位于二号染色体、在兔子上位于三号染色体，经过blast比对发现，该基因呈现高度保守性。

去泛素化酶是近些年的研究热点，但是却缺少关于USP8与哺乳动物肌卫星细胞相关性的研究。本发明就是以生长培养基和分化培养基为载体，分别进行了湖羊肌卫星细胞的培养及诱导分化，并检测目的基因及肌生成相关基因的表达水平以及蛋白的表达水平。此外，还通过了RNA干扰的方式进行目的基因的敲降，以探究USP8是否通过调节肌生成相关基因来调控肌卫星细胞的分化过程。最终得出结论，USP8对肌卫星细胞的早期分化过程有抑制作用。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明明确了USP8对肌卫星细胞的早期分化过程有抑制作用，为湖羊品种的进一步保护与选育提供基础理论依据，同时也为今后的新品系定向选育工作提供了部分参考和技术储备。

(四)附图说明

图1为湖羊及杜湖杂交羊的肌肉横截面的Masson染色切片光学显微照片；注：A1，B1，C1指湖羊；A2,B2,C2指杂交羊。(A1，A2)股二头肌，BFM；(B1，B2)背最长肌，LDM；(C1，C2)臀中肌，GMM。C，胶原纤维；M，肌肉纤维。

图2为湖羊及杜湖杂交羊的肌肉纵截面的Masson染色切片光学显微照片；注：A1，B1，C1指湖羊；A2,B2,C2指杂交羊。(A1，A2)股二头肌，BFM；(B1，B2)背最长肌，LDM；(C1，C2)臀中肌，GMM。

图3为细胞分化0d-5d的形态(10×)及USP8在不同分化阶段的表达量分析；

注：A图是细胞从分化0d至分化5d的形态图，B图是USP8在不同分化阶段的mRNA表达量分析，C图是USP8在不同分化阶段的蛋白表达量分析。

图4为转染siRNA48h后USP8在mRNA和蛋白水平的表达量分析

注：A图是细胞从分化0d至分化5d的形态图，B图是USP8在不同分化阶段的mRNA表达量分析，C图是USP8在不同分化阶段的蛋白表达量分析。

图5为免疫细胞化学分析siNT或siUSP8处理的肌卫星细胞中的MyoG表达。用MyoG阳性细胞为绿色，细胞核为蓝色。

图6为免疫细胞化学分析siNT或siUSP8处理的肌卫星细胞中的Desmin表达情况。绿色为Desmin阳性细胞，蓝色为细胞核。

图7为转染后其他与肌卫星细胞分化相关的标志基因的mRNA表达量。

图8为转染后其他与肌卫星细胞分化相关的标志基因的蛋白表达量。

(五)具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

实施例1：

1试验材料与方法

1试验材料及仪器设备

1.1试验材料

本试验所用的实验动物六月龄雄性湖羊(Ovis aries)，来自浙江省嘉兴市桐乡众成湖羊专业合作社，湖羊的平均体重为48.50±2.95kg。采样前24h，湖羊禁食。本试验所用的六月龄雄性杜湖杂交羊F1代，来自浙江省杭州市临安羊场，同样在采样前24h禁食。

本次试验所用的湖羊肌卫星细胞由扬州大学孙伟老师课题组馈赠。

1.2主要化学试剂

无水乙醇(上海沪试、国药集团化学试剂有限公司)；DEPC处理水、1×PBS缓冲液(上海生工生物科技有限公司)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；masson染液套装、分化液、返蓝液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)。胎牛血清(FBS)500mL装、DMEM培养液500mL装、DMEM/F-12培养液500mL装、胰蛋白酶100mL装、青霉素链霉素双抗100mL装(Gibco)；1×PBS、马血清(Solarbio)；甘油(上海沪试)；细胞小培养瓶、6孔细胞培养板、12孔细胞培养板、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板(Corning)；Trizol、DEPC水(天根生物科技有限公司)；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ、Xfect^TMTransfection Reagent(大连宝生物生物科技有限公司)；多聚甲醛、TritonX-100、盐酸(上海沪试)；BSA、阴性山羊血清(Sigma)、USP8抗体(proteintech)；MyHC抗体、MyoG抗体(SantaCruz)；Pax7、MyoD(华安生物)；荧光二抗(Thermo Life)；siRNA及siRNA-Mate(吉玛基因)。

生长培养基配制：10％FBS(胎牛血清)+90％DMEM培养基+1％双抗，加入siRNA后，生长培养基配方为：10％FBS(胎牛血清)+90％DMEM培养基

分化培养基配制：+1％双抗，加入siRNA后，分化培养基的配方为：2％马血清+98％DMEM/F-12培养基。

1.3主要仪器设备

-80℃超低温冰箱、5415R低温高速离心机、微量分光光度计Nanodrop2000、移液器、480II荧光定量PCR仪(德国Eppendorf)；JY96-II超声波细胞粉碎机(宁波新芝)；Synergy HTX多功能酶标仪(美国BioTek)；高压灭菌锅、鼓风干燥器(美国STIK)；分析天平(德国赛多利斯)；DYCP-34A电泳槽(北京六一)；DYY-8C电泳仪(北京六一)；凝胶成像***(法国VILBER)；吸水力测定仪、LAB、PH值测定仪、剪切力测定仪、磁力搅拌器、涡旋振荡器、砍刀、手术刀；超低温冰箱、5415R冷冻高速离心机、Nanodrop2000、移液枪；480II荧光定量PCR仪(Roche)；JY96-II超声波细胞粉碎机(宁波新芝)；Synergy HTX多功能酶标仪(BioTek)；TU-1810紫外分光光度计(北京普析)；高压灭菌锅、烘箱(美国STIK)；分析天平(德国赛多利斯)；磁力搅拌器、涡旋振荡器、微波炉等。

2试验方法

2.1采样

2.1.1采样前的准备

采样前先准备好60个15mL离心管、120个5mL冻存管、酒精棉球、烧杯、烧杯、镊子、手术刀，上述耗材准备完全后放入高压灭菌锅，灭菌完毕放入烘箱备用。再准备好钢尺、酒精棉球、硫酸纸、两包滤纸、网质分装袋、记号笔、标签纸、捞勺、实验服、棉签、贴好标签纸的解剖盘、胶带、创可贴、冰袋、液氮、试管架、相机等。

制作好测量数据填写样表，这样可以在采样过程中可以节省大量时间，也能提高原始数据的准确性。

2.1.2采样流程

(1)在羊场专业的屠宰师傅的帮助下，将羊剥皮去势，取出内脏后，再进行解剖。接着由一人负责将肌肉(股二头肌、背最长肌、臀中肌)剥离出来，之后拿到测量区测定肌肉的重量和长度，测量后由专人负责用硫酸纸临摹眼肌的边线，用于准确计算眼肌的面积。

(2)肌肉剥离出来后，由一人负责测量肌肉的剪切力和系水力。由另一人剪取肌肉内5小块5mm×2mm的肌肉放入冻存管中并投入盛放液氮的泡沫箱内。之后，再取一块1cm×1cm的肌肉放入含有肌肉固定液的15mL离心管中。

(3)取完一头羊的全部所需部位后，将泡沫箱内所有的冻存管用捞勺盛出，迅速放入做好标记的网质分装袋内，最后把袋子放入液氮罐中。

(4)为保证后续实验中RNA的纯度，在采样过程中应当注意，采取不同部位的肌肉样品之前，用酒精把手术刀和镊子擦拭干净。

2.2石蜡切片的制备及Masson染色

2.2.1切片的制作

(1)取材：等待采样时放入固定液中的肌肉被固定24h之后，从离心管中将固定完毕的肌肉组织取出，放置在干净的通风橱内，接着用手术剪刀将待用的肌肉剪整齐，之后剪切好的肌肉做好标记放入脱水盒内。

(2)脱水：将脱水盒放置于专用的机器里，设置好仪器后用不同浓度的无水乙醇依次对样本执行脱水操作。脱水操作的先后次序为：先用75％无水乙醇洗脱4h，接下来用85％无水乙醇洗脱2h，之后用90％无水乙醇再洗脱2h，再将无水乙醇的浓度升高至95％洗脱1h，接着用纯的无水乙醇洗脱90min，再换用无水乙醇Ⅱ洗脱30min，换用醇苯对样本洗脱5～10min，最后用二甲苯Ⅰ洗脱8min后再用二甲苯Ⅱ洗脱8min后，就完成了洗脱操作。再把样本依次浸入蜡I、蜡Ⅱ和蜡Ⅲ内各1h。

(3)包埋：把浸入蜡Ⅲ1h后的肌肉组织取出，等待其融化，蜡块融化好后，重新将其放进包埋框内，再次进行包埋操作。在蜡块重新凝固之前，把样本从脱水盒内取出，按照具体要求再将样本放入包埋框内，并做好标记。将样本放入-20℃冰箱内冷却，待蜡块重新凝固后，取出蜡块。

(4)切片：把包埋好的蜡块再修剪好，之后将其放于专用的切片机上，将机器设置好切成厚度约为4μM的片。使切片悬于机器上，再准备好40℃的水，将组织于水上展开铺平，最后用新的载玻片把组织从水中取出放入60℃高温烘箱内烤片。

2.2.1 Masson染色

(1)脱蜡水洗：将烤好的切片按顺序依次按照程序进行脱蜡水系，先用二甲苯溶液洗脱Ⅰ20min，再换用二甲苯Ⅱ溶液洗脱20min，再换用无水乙醇洗脱Ⅰ5min，接着使用无水乙醇Ⅱ溶液洗脱5min，之后用75％的无水乙醇洗脱5min，最后将切片放在超纯水下水洗。

(2)返蓝染色：把切片置于重铬酸钾溶液内浸泡过夜，过夜后用超纯水洗净切片。洗净后，先将铁苏木素A液与B液混合起来配成专用的苏木素染液，把切片放入配好的铁苏木素染液中染色3min，先用超纯水洗一次，洗净后用专用的分化液使切片分化。用返蓝液使切片返蓝，完成后用超纯水冲洗。

(3)酸性浸染：把返蓝的后的切片投入丽春红酸性品红染液，染液过程保持在5-10min，染色结束后用超纯水冲洗。

(4)染色：把切片浸入磷钼酸水溶液中，3min取出；取出后，直接把切片放入苯胺蓝染液中染色5min。

(5)分化：将所有染色过程完成，之后用1％冰醋酸进行切片分化，同时准备好三个烧杯，在烧杯内倒满无水乙醇，分化后再用两个烧杯内的无水乙醇将切片完成脱水操作。

(6)封片：切片放入第三个盛有无水乙醇的烧杯内洗脱5min，再用二甲苯处理切片5min使其透明，最后用中性树胶封片。

(7)染色后的胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。

(8)重铬酸钾染完后水洗要稍快，切片洗干净即可。

(9)根据切片的数量对铁苏木素染液复合液进行调整，也可以现配现用；

(10)若最后切片结果现实胶原蓝色太浅，说明分化过度；若分化不足，则易与丽春红的颜色叠加呈紫蓝色。

2.3数据分析

用ImageJ 1.48v统计湖羊和杜湖杂交羊F1代上股二头肌、背最长肌和臀中肌肌纤维的直径与密度，再使用IBM SPSS Statistics 20.0软件对数据进行ANOVA(单因素方差分析)以及t检验，当P值小于0.05时，则判断作为数据间差异显著，当P值小于0.01时，判定数据间存在极显著差异。

2.4挑选基因

根据浙江省农科院合作课题组前期基因组芯片测序结果筛选在湖羊和杂交羊上差异表达的基因，探究其对湖羊肉质的影响。

2.5细胞培养

2.5.1细胞传代

(1)拿到冻存的细胞后，首先把冻存管放入37℃水浴锅内，3min后取出冻存管；

(2)用移液枪将冻存管内的细胞转移至15mL离心管内，37℃，1500rpm离心3min；

(3)离心结束后，用2mL的1×PBS重悬细胞，再将离心管放入离心机内，37℃，1500rpm离心3min；离心完毕后再用PBS重悬细胞，重复离心操作；

(4)在最后一次离心过程中，取好细胞瓶，并在细胞瓶上标记好细胞名称，培养日期、培养人等信息，做好标记后，在细胞瓶内先加入3mL的生长培养基；

(5)待离心结束把离心管内PBS吸出后，用1mL的生长培养基重悬细胞，用移液枪把细胞悬液吹打混匀，之后把细胞悬液加入培养瓶中；

(6)把培养瓶放入细胞培养箱中，37℃、5％CO₂条件下培养细胞。

2.5.2细胞培养

(1)每天定时在显微镜下观察培养瓶中的细胞，约2天后，培养瓶中的细胞贴壁并铺满细胞瓶；

(2)在细胞瓶内加入2mL0.25％的胰酶消化瓶内细胞，在显微镜下观察细胞消化情况，约5min后，细胞消化完全，再向瓶内加入2mL的生长培养基终止消化过程；

(3)将细胞瓶内的4mL液体移入15mL离心管内，37℃，1500rpm离心3min；

(4)离心结束后，吸出上清液。用2mL的1×PBS重悬细胞，再将离心管放入离心机内，37℃，1500rpm离心3min；离心完毕后再用PBS重悬细胞，重复离心操作；

(5)准备好6个6孔细胞培养板，并在培养板上分别标记好DM-0D(GM)、DM-1D、DM-2D、DM-3D、DM-4D、DM-5D以及细胞培养的日期；

(6)吸出PBS，用1mL的生长培养基重悬细胞，用移液枪把细胞悬液吹打混匀，之后再向离心管内加入3mL的生长培养基，重新吹打混匀，混匀后将细胞悬液均匀分至4个离心管中，再向每个离心管内分别加入2ml的生长培养基，吹打混匀；

(7)向每个孔内加入1mL的细胞悬液；

(8)将6孔板放入细胞培养箱中，37℃、5％CO₂条件下培养细胞；

(9)12h后，待细胞贴壁，吸出生长培养基，换为1mL的分化培养基；

(10)每日定时对细胞进行拍照，观察不同时期内分化培养基中的细胞形态。

2.6转染siRNA

2.6.1细胞铺板

(1)每天定时在显微镜下观察培养瓶中的细胞，约1天后，培养瓶中的细胞贴壁并铺满细胞瓶；

(2)在细胞瓶内加入2mL0.25％的胰酶消化瓶内细胞，在显微镜下观察细胞消化情况，约5min后，细胞消化完全，再向瓶内加入2mL的生长培养基终止消化过程；

(3)将细胞瓶内的4mL液体移入15mL离心管内，37℃，1500rpm离心3min；

(4)离心结束后，吸出上清液。用2mL的1×PBS重悬细胞，再将离心管放入离心机内，37℃，1500rpm离心3min；离心完毕后再用PBS重悬细胞，重复离心操作；

(5)在离心过程中，取出24孔板以及4个新的15mL离心管，并在24孔板上做好标记；

(6)吸出PBS，用1mL的生长培养基重悬细胞，用移液枪把细胞悬液吹打混匀，之后再向离心管内加入3mL的生长培养基，重新吹打混匀，混匀后将细胞悬液均匀分至4个离心管中，再向每个离心管内分别加入2ml的生长培养基，吹打混匀。

(7)向每个孔内加入500μL的细胞悬液。

(8)为了使转染效果达到最大化，铺板时细胞量不宜过多，瓶内细胞培养时间最多不超过48h，板内细胞培养时间最多不超过36h。

2.6.2转染siRNA

(1)待细胞数量达到1.5×105时，开始转染操作。

(2)先将室温下的siRNA-Mate放置于室温中，准备配制预混液。

(3)配制NC预混液(共12孔)：先将1400μL的OPTI-MEM加入到2mL的无菌EP管内，再加入7μL的NC，吹打混匀；随后在EP管内加入14μL的siRNA-Mate转染试剂，吹打混匀。

(4)配制siRNA预混液(共12孔)：先将1400μL的OPTI-MEM加入到2mL的无菌EP管内，再加入7μL的siRNA，吹打混匀；随后在EP管内加入14μL的siRNA-Mate转染试剂，吹打混匀。

(5)将混合物放置在室温中静置，设置计时器的时间为18min，使siRNA和转染实际可以充分作用形成转染复合物。

(6)在静置时，给24孔板换液，先用PBS冲洗，冲洗后再在每个孔内加入500μL不含双抗的分化培养基。加好培养基后，在培养板上做好标记，标注好siRNA和NC的转染位置。

(7)待静置完成后，每个孔内对应加入100μL的siRNA和NC的转染复合物，每个孔的终体系都为600μL。加完后，轻轻摇晃培养板使孔内液体混匀。

(8)在37℃、5％CO₂条件下培养细胞。48h内对细胞进行拍照、提取RNA及提取蛋白操作。

2.7细胞RNA及蛋白的提取

2.7.1采样

(1)按照培养天数，依次提取DM-0D(GM)、DM-1D、DM-2D、DM-3D、DM-4D、DM-5D的12孔细胞培养板内的细胞RNA及蛋白；

(2)每个板选取6个孔提RNA、另外6个孔用于提取蛋白；

(3)吸出原有的分化培养基，用PBS清洗细胞；

(4)每个孔内加入1mL的trizol，5min后，吸出孔内的细胞悬液至离心管中，注意，1个离心管内包含两孔的细胞悬液；

(5)配置蛋白提取液，向1000μL的ripa内依次加入130μL的EDTA和130μL的PMSF，加入后吹打混匀，向每个孔内加入150μL的蛋白提取液；待5min后，吸出孔内的细胞悬液至离心管中，注意，1个离心管内包含两孔的细胞悬液。

(6)将离心管放入-80℃冰箱中冷冻保存，待所有样品采取完毕后，一同提取RNA及蛋白。

2.7.2 RNA的提取

本试验按Trizol试剂说明书提取细胞的总RNA，步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取出RNA样品，37℃水浴锅内放置4min；

(2)在每个EP管内分别加入200μL氯仿，振荡15s，使其混合均匀后，在室温下放置5min；

(3)在4℃，12,000rpm的条件下离心15min。结束后，EP管内为下层淡红色的酚仿相、白色的中间相和无色的上层水相的混合物；

(4)轻轻吸取上清液至一无RNA酶的2mL EP管中，加入等量预冷的异丙醇，缓慢混匀，样品在室温下放置10min；

(5)4℃条件下，12,000×g离心15min，弃上清；

(6)加入预冷的75％乙醇(使用DEPC水配置)1mL，混匀，4℃条件下，7 500×g离心8min，弃上清；

(7)待沉淀自然风干后，加入25μL无RNase水溶解RNA；

(8)分别用超微量紫外分光光度计Nanodrop 2000和1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测所提总RNA的纯度和完整性；

(9)将提取好的RNA保存于-80℃。

2.7.3 Western Blot

按照碧云天生物公司试剂说明书操作。

2.8细胞免疫荧光化学(ICC)

(1)稀释抗体：一抗按照1：50的倍数稀释；二抗按照1：500的倍数稀释；

(2)细胞固定：将培养于96孔板的贴壁细胞上清吸去，加入4％的多聚甲醛100μL/孔，于37℃恒温培养箱固定30min；倒掉或吸去多聚甲醛溶液，加入200μL/孔1X PBS，洗涤两次，每次5min；

(3)透膜：加入0.25％的triton X-100(用PBS配制)100μL/孔，室温透膜30min；用PBS洗涤两次，每次5min；

(4)封闭：加入1％BSA(用PBS配制)60μL/孔，37℃封闭1h；

(5)加一抗：加入用1％BSA稀释好的一抗50μL/孔，放入湿盒4℃过夜；用PBS洗涤三次，每次5min；

(6)加二抗：加入用1％BSA稀释好的荧光二抗50μL/孔(含DAPI)，放入湿盒37度保温1h；用PBS洗涤三次，每次5min；

(7)观察及拍照：荧光显微镜下观察及拍照；

2.9目的基因片段扩增及实时荧光定量PCR

2.9.1反转录

表1：去除基因组内的DNA

将加好试剂的样品在42℃反应2min，并于4℃保存。

(1)反转录

反应液配置在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，按照反应数+2的量配制预混液，然后再分装到各个反应管中。

表2：反转录体系

将加好试剂的样品在37℃反应15min，再于85℃反应5s，最后于4℃保存。

2.9.2引物设计

参照NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中的基因序列，在用blast进行同源性比对，找到基因的保守区域，使用Primer 6.0软件设计引物。所有引物均交由擎科生物技术有限公司合成。引物序列如下表所示：

表3：目的基因引物序列

(3)

表4：PCR反应体系及流程

反应40个循环后从55℃开始每10s上升0.5℃，取荧光值绘制溶解曲线，确定扩增产物的特异性。

3试验结果

3.1湖羊及杂交羊上三种肌肉肉质性状相关指标的测定

分别选取了六月龄雄性纯种湖羊以及六月龄雄性杜湖杂交羊F1代各三头，之后测量了两种羊上的臀中肌、股二头肌和背最长肌上与肉质性状相关的部分指标，结果如下表：

表5：肉质性状指标

注：同一指标数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

系水力直接影响肉的风味、质地、营养成分、多汁性等食用品质，通过表5可知，湖、羊股二头肌和背最长肌的系水力均显著高于杜湖杂交羊F1代，湖羊背最长肌的肌肉长度显著高于杂交羊，而湖羊臀中肌的剪切力显著低于杂交羊，说明湖羊在肉质性状上具有比杂交羊更大的优势。同时，湖羊肉的系水性显著高于杂交羊，说明其蛋白质保持水分的能力强，不易变形，能较好的保持肌肉的肉嫩多汁性，相对会有较好的口感；剪切力是评价肉品嫩度的另一重要指标，剪切力越大则肌肉嫩度越差，该结果也显示湖羊肌肉嫩度高于杂交羊；宰后僵直肌肉的肌肉长度与肉的嫩度呈正相关，湖羊背最长肌的肌肉长度显著高于杂交羊，说明了湖羊背最长肌的肌肉嫩度高于杂交羊，宰后肌肉僵直度较小，最大程度保持肉的嫩度。综上所述，通过对两种羊宰后各种肌肉性状指标的对比，可以看出湖羊的肉质相对于杂交羊更好。

3.1.1切片结果

6月龄的雄性纯种湖羊和杜湖杂交羊股二头肌、背最长肌和臀中肌样品经Masson染色后，结果参见图1～2，可以看出，湖羊股二头肌、背最长肌肉、臀中肌的肌纤维密度及直径均高于杂交羊，接着运用ImageJ测量肌纤维的直径和长度，使用SPSS 20.0进行数据统计分析二者是否具有显著性差异。

3.1.2湖羊及杂交羊肌纤维相关指标的测定

将Masson染色后的切片放至显微镜下，放大倍数调为10×10，观察后随机选取每张切片面积固定的区域拍片。最后在ImageJ软件内打开拍摄的切片，随机选取一块固定面积的区域，之后开始计算肌纤维的密度和直径。湖羊和杂交羊的肌纤维密度及直径统计结果如下表：

表6：肌纤维组织学特性

注：同一指标数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

肌纤维的密度和直径与肌肉的嫩度有关，肌纤维密度越大、直径越小则肌肉嫩度越高，口感越好。由表6可以看出，湖羊上臀中肌、股二头肌和背最长肌的肌纤维密度均显著高于杂交羊，湖羊上股二头肌和背最长肌的肌纤维直径显著低于杂交羊。这说明，湖羊的肌肉嫩度较高，这个结论和我们测出的剪切力及系水力指标的结果基本相同。

3.2基因挑选

由上述图表可知，湖羊及杜湖杂交羊在肌肉嫩度上的确存在差异，二者的肌纤维直径与肌纤维密度也存在差异。肌肉嫩度与肌纤维的直径与密度有关，而肌纤维是由肌卫星细胞分化而来。为了从分子层面上探究湖羊肌肉嫩度更高的原因，结合浙江省农科院合作课题组的基因芯片测序结果及文献查阅结果，选择了USP8作为目的基因，从细胞及分子层面进一步探究USP8在湖羊肌卫星细胞分化过程中的调控作用。

3.3 USP8在不同分化阶段的表达量分析及不同分化阶段的细胞形态细胞转移至分化培养基后，每天定时在放大倍数为10×的显微镜下观察并拍照，之后依次按照未分化、分化1d、2d、3d、4d、5d的顺序采取细胞样本，取样后提取RNA和蛋白，从mRNA和蛋白水平分析USP8的表达量。细胞的分化形态及表达量如图3所示。

由图3A可以看出，细胞在未分化时，大多都呈现出单核肌细胞的状态；待培养1天后，肌细胞开始慢慢融合形成梭形肌管；在第三天时，开始出现初级肌管已基本形成；待分化至第四天时，可以看到次级肌管已发育成为肌纤维，细胞核由中央向四周移动；第五天时，肌纤维数量不断增加，且肌纤维直径变大。

由上图3可得，USP8在分化初期，其mRNA表达量逐渐升高，在细胞移至分化培养基培养48h时，USP8的表达量达到顶峰；之后，随着时间的增加，USP8的表达量又开始逐渐下降，其蛋白水平的表达量也和该趋势相符。

3.4转染siRNA48h后USP8的表达量分析

待转染48h后，采取细胞样本，并从mRNA和蛋白水平分析USP8的表达量，结果如图4所示。

由图4可以看出，细胞转染siUSP8完成48h的时候，相较于阴性对照组，在mRNA水平上USP8的表达量显著降低。Western Blot的图像结果也证实了这一结论，在蛋白水平上，siRNA转染进细胞48h的时候，USP8蛋白的表达量也有降低。

3.5细胞免疫荧光化学图像

为了进一步验证mRNA和蛋白水平的试验结果，用细胞免疫荧光化学手段接着检测了重要肌生成标志基因MyoG以及Desmin的蛋白表达情况。如图5～6所示：

由细胞免疫荧光化学结果可以看出，转染siRNA完成后48h，肌红蛋白的表达量显著升高，这和MyoG基因的mRNA表达量以及Western Blot的结果一致。

结蛋白的表达量未呈现显著差异，这是由于该蛋白只在肌卫星细胞分化的中末期发挥作用，对细胞分化早期则未发现显著影响。

3.6转染48h后其他与肌卫星细胞分化相关的标志基因的表达量研究

待转染48h后，检测了MRFs家族、Mef2家族、Pax7及MyHC的mRNA表达量，如图7所示。

如图所示，转染siRNA48h之后，MyoG、Pax7以及MyHC的表达量显著升高，而MyoD、Myf5、Myf6及MEF2a、MEF2d基因表达量有上升趋势但不呈现显著差异。MEF2b、MEF2c的表达量有下降趋势，但不呈现显著差异。

转染后其他与肌卫星细胞分化相关的标志基因的蛋白表达量参见图8，由WB结果可以看出，转染48h后MyoG和Pax7的蛋白表达量显著提升，但MyoD和MyHC的蛋白表达量未呈现明显差异。

4讨论

肌肉主要是依靠组织内蛋白质含量升高以及细胞的增殖分化形成的，该形成过程也直接决定了肌纤维的种类及分化程度对肉质有直接影响，其中最大的影响就是肌肉的口感。研宄证明，肌纤维的直径及肌纤维的密度可以通过影响肌肉的剪切力及系水力进而影响肌肉的嫩度，最终影响肉类口感。

按照不同的因素，将肌纤维主要分为七大类。具体分类如下表所示。

表7：肌纤维的分类

各种肌纤维所占的比例与家畜肉质品质高度相关。I型和Ⅱa型肌纤维在肌纤维总量中占比增加时，肌肉评分会升高，外观也会呈鲜红色；相反，若Ⅱb型肌纤维比例增加，肌肉评分降低，外观也不会呈鲜红色而是偏暗。这是由于I型和Ⅱa型肌纤维内肌红蛋白和血红蛋白浓度较高，在这两种蛋白的作用下，肌肉颜色呈鲜红色；同理，Ⅱb型肌纤维内这两种蛋白含量低，故肌肉不呈鲜红色，评分也降低。同时，Ⅱb型肌纤维比重大的肉类系水力比较低。

湖羊背最长肌的与系水力均显著高于杂交羊，湖羊背最长肌的肌肉长度显著高于杂交羊，而湖羊臀中肌的重量和长度显著低于杂交羊。这说明湖羊的肌肉嫩度要强于杂交羊，口感相对也较好。湖羊背最长肌肌纤维的直径显著小于杂羊，相应地，湖羊背最长肌肌纤维的密度显著大于杂交羊。肌纤维的密度与直径也同肌肉嫩度有关，肌纤维密度越大、直径越小则肉质嫩度越高，口感越好。

将具有自我更新以及能够促进肌纤维再生的胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞称为肌卫星细胞，肌卫星细胞可以作为优质载体，供我们体外研究肌肉生长分化的作用机理。在骨骼肌中，肌卫星细胞即为肌卫星细胞的存在状态，肌卫星细胞是一种未分化的一类位于肌纤维基底膜与肌膜之间，环绕多核肌纤维的单核小圆球形细胞。

在分化培养基培养过程中，肌卫星细胞伴随着时间的增加融合度也大大增加，细胞融合后形成四周肌丝包围中央细胞核的形态，该形态又被称作肌小管；该形态在培养基中进一步分化成肌原纤维，肌原纤维形成后细胞核也不在固定在细胞中间，而是缓缓向四周移动形成肌纤维。经研究和笔者试验，肌卫星细胞在传代至第5代之后，形态会发生变化，肌卫星细胞已经大量出现分化现象，细胞核不再位于中央，且形态模糊，不利于后续转染试验的开展。在研究肌卫星细胞分化的相关作用机理时，应当注意采用1-3代的肌卫星细胞，才能最大程度地保证试验效果及试验结果的可靠性。

肌卫星细胞是骨骼肌生长发育过程中的“备用军”，当骨骼肌组织受损修复时，肌卫星细胞就会从静止状态开始转变为活跃状态，同时它的生长发育过程会伴随着生肌调节家族中各个因子的大量表达。随着各种生理生化反应过程的进行，肌卫星细胞重新分化成为肌纤维，帮助恢复骨骼肌的结构与功能。经研究发现Myf5与MyoD可以促使肌卫星细胞的形态不再发生变化，而另外两个升级调节因子MyoG和MRF4在只在肌细胞分化末期发挥调控作用。

近期有研究学者发现USP22对干细胞神经元分化的影响。该研究从***因子1(Hes1)及其增强子入手，通过Notch信号传导途径抑制神经干细胞/祖细胞。以前的研究表明Hes1在小鼠胚胎干细胞和神经干细胞中均有振荡表达，并且这种表达现象可显著提高它们的功能和分化作用。该振荡表达取决于Hes1的稳定性，Hes1容易被遍布的蛋白—蛋白酶体途径快速降解。研究者通过使用Hes1特异性抗体分析了从小鼠胚胎干细胞纯化的Hes1相互作用的去泛素化酶，并鉴定了泛素特异性蛋白酶27x(Usp27x)是Hes1的新调节因子。最终他们发现Hes1被Usp27x及其同源物泛素特异性蛋白酶22(Usp22)和泛素特异性蛋白酶51(Usp51)进行去泛素化和稳定化。Usp22的敲降缩短了Hes1的半衰期，延迟了其振荡，并增强了小鼠发育中大脑的神经元分化。这些结果表明，这些去泛素化酶通过去除泛素分子调节Hes1蛋白动力学，从而调节干细胞的神经元分化。

本发明主要探索的是泛素特异性蛋白酶8与肌卫星细胞分化过程之间的相关性联系。众多研究结果已经表明，泛素-蛋白酶体***在骨骼肌萎缩中起重要作用，同时许多泛素连接酶在肌肉萎缩时被大量诱导表达，但是关于去泛素化酶在肌肉分化过程中的发挥的作用却少有人知。

目前针对USP8的研究主要集中在它对于神经相关信号通路的影响。比如，有研究者证明了在PC12细胞中，TrkA受体以NGF依赖性方式与去泛素化酶USP8/UBPy相互作用，并且它在体内和体外被USP8去泛素化。USP8过表达阻断了NGF诱导的神经突向外生长，催化失活的突变体USP8/UBPyC748A的过表达引起细胞分化的显着增加。生化实验已经指出USP8和TrkA部分在NGF刺激后共定位于内体中。最终得出结论，USP8敲低会增加TrkA半衰期，这表明USP8的去泛素化活性促进TrkA降解。

本发明从个体差异着手，结合芯片结果及文献查阅结果选择了研究USP8在肌卫星细胞分化过程的调控作用。通过验证敲降USP8前后mRNA及蛋白的表达水平，以及其他肌生成标志基因在转染前后的表达量，发现了USP8对肌肉细胞分化早期的抑制作用，最后用细胞免疫化学手段验证了试验结果。最后得出结论USP8在细胞分化早期会随着时间的增加而增加表达量，但其只在早期对细胞分化有抑制作用，对肌卫星细胞分化的中后期过程无显著影响。转染siRNA48h时，MyoG和Pax7基因的mRNA和蛋白水平的表达量均呈现显著上升趋势，表明USP8可通过调节MyoG和Pax7的转录表达水平来参与调控肌细胞的分化。转染siRNA48h时，MyoD基因的mRNA和蛋白水平的表达量均呈现上升趋势，但却没有出现显著差异。这是由于MyoD主要对细胞中末时期的分化过程有促进作用，对细胞分化早期则无显著影响。转染siRNA48h时，MyHC基因的mRNA呈现显著上升趋势，蛋白有上升趋势但却未呈现显著差异。这是由于蛋白的表达量有一个积累过程，前期mRNA的表达量虽然有显著升高，但是翻译为蛋白质还需要一定的时间，因此，该蛋白的表达量有上升趋势但却没有出现显著差异。

但在研究过程中，我们也发现了USP8和STAM形成的复合体，可参与细胞胞吞(endocytosis)信号通路，调节体内蛋白质的转运并引起其他细胞因子受体下调。该复合物对肌卫星细胞生长分化的影响仍然是未知数，期待后人可以对这个领域有进一步的探索。

5结论与创新点

5.1结论

本试验第一部分先对比了湖羊和杜湖杂交羊F1代部分肉质形状的差异，分析了两种羊的肌纤维密度与肌纤维直径。主要结论如下：

1.系水力和剪切力是衡量肌肉嫩度的重要指标。湖羊的股二头肌和背最长肌的剪切力与系水力均显著高于杂交羊，湖羊背最长肌的肌肉长度显著高于杂交羊，而湖羊臀中肌的重量和长度显著低于杂交羊。这说明湖羊的肌肉嫩度要强于杂交羊，口感相对较好。

2.湖羊背最长肌肌纤维的直径显著小于杂交羊，相应地，湖羊背最长肌肌纤维的密度显著大于杂交羊。肌纤维的密度与直径也同肌肉嫩度有关，肌纤维密度越大、直径越小则肉质嫩度越高，口感越好。

本实验第二部分研究了USP8对湖羊肌卫星细胞分化的影响，从mRNA和蛋白水平上验证了在不同分化阶段USP8的表达量；之后，使用RNA干扰对USP8进行了敲降处理，并检测了干扰48h后USP8及部分肌生成标志基因在细胞内mRNA和蛋白的表达水平，同时用ICC侧面验证了实验结果。主要结论如下：

1.使用分化培养基培养细胞后，可在显微镜下观察到初始状态到分化第五天细胞形态的变化，肌细胞在分化第一天开始慢慢融合发育成肌管，肌管再慢慢分化形成肌纤维。

2.开始对肌卫星细胞进行分化培养后，USP8在mRNA和蛋白水平上的表达量先逐渐升高，在48h时达到最高，此后逐渐下降；ICC结果显示，在干扰48h后，可以检测到MyHC基因的表达，但试验组和对照组二者无显著差异，这USP8对肌卫星细胞分化早期有调控作用，即在细胞分化早期，USP8对肌肉分化有抑制作用。

5.2创新点

本发明证了USP8与哺乳动物肌卫星细胞分化之间的关系，即在哺乳动物肌卫星细胞分化早期，USP8对其有抑制作用。研究结果可为进一步解析USPs-STAM复合物对肌卫星细胞分化的影响和湖羊新品种选育提供理论依据。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 泛素特异性蛋白酶8在调控湖羊肉质及育种中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ctgcttctgt tcctaatgga tggtctc 27

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

tgaggcactg tactgtggac ttga 24

Claims (2)

1.检测泛素特异性蛋白酶8表达量的引物在制备湖羊肉质性状检测试剂盒中的应用，其特征在于所述引物为：

上游引物：5'-CTGCTTCTGTTCCTAATGGATGGTCTC-3'；

下游引物：5'-TGAGGCACTGTACTGTGGACTTGA-3'。

2.检测泛素特异性蛋白酶8表达量的引物在湖羊肉质性状育种中的应用，其特征在于所述引物为：

上游引物：5'-CTGCTTCTGTTCCTAATGGATGGTCTC-3'

下游引物：5'-TGAGGCACTGTACTGTGGACTTGA-3'。

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