CN110501495A - 活化氨基固相颗粒与免疫氨基固相颗粒及其制备方法和应用及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫材料领域,具体而言,提供了一种活化氨基固相颗粒与免疫氨基固相颗粒及其制备方法和应用及试剂盒。本发明提供的活化氨基固相颗粒的制备方法,采用第一活化剂和第二活化剂均对氨基固相颗粒进行活化得到活化氨基固相颗粒,得到的活化氨基固相颗粒由于带有可与氨基反应的化学基团,所以可以直接作为固相载体与抗原分子偶联制备得到免疫氨基固相颗粒。
Description
技术领域
本发明涉及免疫材料领域,具体而言,涉及一种活化氨基固相颗粒与免疫氨基固相颗粒及其制备方法和应用及试剂盒。
背景技术
目前,现有技术中免疫检测或诊断的产品多为带有免疫活性的固相颗粒,即将抗原或抗体结合到某种固相颗粒表面,并保持其免疫活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗原或抗体)和标记抗原或抗体按不同的步骤与免疫固相颗粒表面的抗原或抗体起反应,再用洗涤的方法使固相颗粒上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相颗粒上的标记抗体或抗原与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅或光信号的强弱进行定性或定量分析。
固相颗粒多为乳胶或磁性颗粒,胶乳或磁性颗粒载体通常带有氨基、羧基、羟基或巯基等化学官能团,这些化学官能团可以与不同的免疫配基,例如活性蛋白、抗体、抗原、亲和素、生物素等,结合形成免疫固相颗粒。
实际应用中,常见的小分子或特殊的抗原抗体在与固相颗粒偶联包被时比较困难,以羧基为例,小的抗原分子和羧基的反应,通过EDC进行,但由于空间位阻的影响,免疫固相颗粒的免疫活性较低;以Tosyl为例,通过物理吸附及NH4SO4催化,也会由空间位阻造成免疫固相颗粒的免疫活性较低;以氨基磁珠为例,最常见的是通过SMCC活化磁珠以及2-IT活化抗体抗原,再将二者偶联制备得到免疫氨基磁珠,但该方法对于小分子,存在活化后的产物难以纯化以及偶联后副产物太多的问题。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种活化氨基固相颗粒的制备方法,以缓解现有技术中免疫氨基固相颗粒制备过程中,活化抗原分子后产物纯化困难,产率低,以及成本高的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种活化氨基固相颗粒,以缓解现有技术中免疫氨基固相颗粒的制备需要活化抗原分子的技术问题。
本发明的第三目的在于提供上述活化氨基固相颗粒在制备免疫氨基固相颗粒中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种免疫氨基固相颗粒,以缓解现有技术中免疫氨基固相颗粒成本高,灵敏度不够,检测背景值过高等问题。
本发明的第五目的在于提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法,以缓解现有技术中制备方法操作繁琐,成本过高,产品性能有待提高的问题。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种活化氨基固相颗粒的制备方法,对氨基固相颗粒进行二次活化,得到活化氨基固相颗粒;
所述二次活化包括a)或b):
a)氨基固相颗粒与第一活化剂共价反应,得到的第一反应产物带有马来酰亚胺基团,再将所述第一反应产物与第二活化剂发生共价反应,得到活化氨基固相颗粒,所述活化氨基固相颗粒带有可与氨基反应的基团;
b)氨基固相颗粒与第二活化剂共价反应,得到的第二反应产物带有疏基,再将所述第二反应产物与第一活化剂发生共价反应,得到活化氨基固相颗粒,所述活化氨基固相颗粒带有可与氨基反应的基团;
所述第一活化剂具有交联臂。
进一步地,所述氨基固相颗粒包括氨基磁珠或氨基乳胶。
进一步地,所述第一活化剂包括SM(PEG)2、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24、LC-SMCC、SMCC或Sulfo-SMCC;
优选地,所述第二活化剂包括2-IT、SATA、STAP、AMAS、GMBS或SMPH。
进一步地,第一活化剂和第二活化剂均独立地与氨基固相颗粒表面氨基的摩尔比为1:2-1:100;
优选地,a)中氨基固相颗粒与第一活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h;
优选地,a)中第一反应产物与第二活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h;
优选地,b)中氨基固相颗粒与第二活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h;
优选地,b)中第二反应产物与第一活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h。
上述制备方法制备得到的活化氨基固相颗粒。
上述活化氨基固相颗粒在制备免疫氨基固相颗粒中的应用。
一种免疫氨基固相颗粒,包括活化氨基固相颗粒,和,与活化氨基固相颗粒偶联的抗原分子。
进一步地,所述抗原分子包括E2、VD、T3、T4、HBsAg、C-peptide、HBeAg、HCV、TPN15或CCP。
上述免疫氨基固相颗粒的制备方法,将抗原分子与活化氨基固相颗粒进行偶联,得到免疫氨基固相颗粒。
进一步地,抗原分子和活化氨基固相颗粒的质量比为(1-20):500,优选为(2-5):500;
优选地,偶联条件包括:15-45℃,15min-5h,优选为15-45℃,30min-2h;
优选地,偶联反应还包括回收免疫氨基固相颗粒和保存的步骤。
一种含有上述免疫氨基固相颗粒的试剂盒。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供的活化氨基固相颗粒的制备方法,采用第一活化剂和第二活化剂均对氨基固相颗粒进行活化得到活化氨基固相颗粒,得到的活化氨基固相颗粒由于带有可与氨基反应的化学基团,所以可以直接作为固相载体与抗原分子偶联制备得到免疫氨基固相颗粒,这种制备方法避免了需要用活化剂活化抗原分子以及需要纯化活化后的抗原分子的步骤,该方法解决了当包被的抗原分子为小分子类物质时,常规技术手段纯化抗原分子困难,不纯化包被效果不理想的技术问题。外加第一活化剂带有交联臂样结构,可以有效避免抗原分子由于空间位阻的影响导致包被不理想的问题。本申请的技术方案使得制备原料的利用率更高,操作更加简便,从而显著降低了生产成本。
上述制备方法制备得到的活化氨基固相颗粒,由于使用的第一活化剂带有交联臂样结构,该活化氨基固相颗粒可以更好的与抗原分子结合,避免了抗原分子为小分子或特殊抗原时由于空间位阻的影响降低免疫氨基固相颗粒的免疫活性及产率。
本发明提供的免疫氨基固相颗粒的制备方法简单易操作,实现活化氨基固相颗粒与抗原分子的一步制备,避免了对抗原分子进行预先处理的操作,降低了包被难度,同时节省了制备原料,从而极大地降低了生产成本。制备得到的免疫氨基固相颗粒性能稳定,纯化简单,免疫活性好,灵敏度更高同时检测背景值低。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明,本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种活化氨基固相颗粒的制备方法,对氨基固相颗粒进行二次活化,得到活化氨基固相颗粒,其中,第一活化剂具有交联臂,二次活化包括a)或b):
a)氨基固相颗粒与第一活化剂共价反应,得到的第一反应产物带有马来酰亚胺基团,再将所述第一反应产物与第二活化剂发生共价反应,得到活化氨基固相颗粒,所述活化氨基固相颗粒带有可与氨基反应的基团;
b)氨基固相颗粒与第二活化剂共价反应,得到的第二反应产物带有疏基,再将所述第二反应产物与第一活化剂发生共价反应,得到活化氨基固相颗粒,所述活化氨基固相颗粒带有可与氨基反应的基团。
本发明提供的活化氨基固相颗粒的制备方法,采用第一活化剂和第二活化剂均对氨基固相颗粒进行活化得到活化氨基固相颗粒,得到的活化氨基固相颗粒由于带有可与氨基反应的化学基团,所以可以直接作为固相载体与抗原分子偶联制备得到免疫氨基固相颗粒,这种制备方法避免了需要用活化剂活化抗原分子以及需要纯化活化后的抗原分子的步骤,该方法解决了当包被的抗原分子为小分子类物质时,常规技术手段纯化抗原分子困难,不纯化包被效果不理想的技术问题。外加第一活化剂带有交联臂样结构,可以有效避免抗原分子由于空间位阻的影响导致包被不理想的问题。本申请的技术方案使得制备原料的利用率更高,操作更加简便,从而显著降低了生产成本。
可以理解的是,利用第一活化剂和第二活化剂对氨基固相颗粒活化处理时,对两种活化剂的处理顺序并不作特定的限定,即:a)先用第一活化剂对氨基固相颗粒活化,再用第二活化剂进行二次活化,此时,第一活化剂先与氨基固相颗粒表面的氨基共价反应,生成的第一反应产物带有马来酰亚胺基团,然后第一反应产物再与第一活化剂发生共价反应,反应后氨基固相颗粒表面依次连有第一活化剂和第二活化剂,第二活化剂又含有可与氨基反应的化学基团,方便与抗原分子包被结合;b)先用第二活化剂对氨基固相颗粒活化,再用第一活化剂进行二次活化,此时,第二活化剂先与氨基固相颗粒表面的氨基共价反应,生成的第二反应产物带有疏基,然后第二反应产物再与第一活化剂发生共价反应,反应后氨基固相颗粒表面依次连有第二活化剂和第一活化剂,第一活化剂又含有可与氨基反应的化学基团,方便与抗原分子包被结合。
需要说明的是,氨基固相颗粒可以为现有技术中用于免疫检测或诊断的固相载体,并不作特定的限定,优选为氨基磁珠或氨基乳胶。可以理解的是,氨基磁珠在活化氨基磁珠制备过程中,可以利用磁性分离的方式来进行纯化和分离;氨基乳胶在活化氨基乳胶制备过程中,可以利用离心分离的方式进行纯化分离。
在优选地实施方式中,第一活化剂包括SM(PEG)2、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24、LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-[4-(N-马来酰亚胺甲基)]-环己烷-1-甲酸-(6-氨基己酸酯))、SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-caxboxylate)或Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-caxboxylate)。第一活化剂至少含有如下功能基团:a)与氨基固相颗粒或抗原分子发生共价反应的基团;b)与第二活化剂共价反应的基团。上述第一活化剂均带有交联臂,可以良好的解决包被的抗原分子为小分子或特殊抗原时由于空间位阻的影响包被效果不理想及免疫活性差的问题。SM(PEG)2、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24为带有不同数量聚乙二醇的SMCC衍生双功能交联剂。
在优选地实施方式中,第二活化剂包括2-IT(2-Iminothiolane HCl)、SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)、STAP(N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯)、AMAS(马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯)、GMBS(4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯)或SMPH(SucciniMidyl6-[(3-MaleiMido)propionaMido]-hexanoate)。第二活化剂至少含有如下功能基团:a)与氨基固相颗粒或抗原分子发生共价反应的基团;b)与第一活化剂共价反应的基团。第一活化剂和第二活化剂在氨基固相颗粒与抗原分子之间形成连接臂,将氨基固相颗粒与抗原分子连接起来,克服了空间位阻的影响。
在优选地实施方式中,第一活化剂和第二活化剂均独立地与氨基固相颗粒表面氨基的摩尔比为1:2-1:100,优选地,摩尔比为1:10-1:50。第一活化剂与氨基固相颗粒表面氨基的摩尔比,以及,第二活化剂与氨基固相颗粒表面氨基的摩尔比,过低导致活化剂的浪费,活化效率低;过高导致活化的氨基固相颗粒数量少,后期包被效率低。摩尔比典型但非限制性的为1:2、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。
在优选地实施方式中,步骤a)中的氨基固相颗粒与第一活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h,第一反应产物与第二活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h,优选为20-40℃,30min-2h。反应温度典型但非限制性的为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃,反应时间典型但非限制性的为30min、1h、1.5h或2h。
在优选地实施方式中,步骤b)中的氨基固相颗粒与第二活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h,第二反应产物与第一活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h,优选为20-40℃,30min-2h。反应温度典型但非限制性的为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃,反应时间典型但非限制性的为30min、1h、1.5h或2h。
本发明提供上述制备方法制备得到的活化氨基固相颗粒。由于使用的第一活化剂带有交联臂样结构,该活化氨基固相颗粒可以更好的与抗原分子结合,避免了抗原分子为小分子或特殊抗原时由于空间位阻的影响降低免疫氨基固相颗粒的免疫活性及产率。
本发明提供的活化氨基固相颗粒可以用于制备免疫氨基固相颗粒。
一种免疫氨基固相颗粒,该免疫氨基固相颗粒包括本发明提供的活化氨基固相颗粒,和,与活化氨基固相颗粒偶联的抗原分子。
该免疫氨基固相颗粒免疫活性高,性能稳定,检测时的背景值低同时灵敏度得到改善。
在优选地实施方式中,抗原分子包括E2(***)、VD(维生素D)、T3(血清三碘甲状腺原氨酸)、T4(血清甲状腺素)、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)、C-peptide(C肽)、HBeAg(乙型肝炎e抗原)、HCV(丙型肝炎抗原)、TPN15(梅毒15KD抗原)或CCP(环瓜氨酸肽)。本发明提供的活化氨基固相颗粒与小分子类的特殊抗原制备免疫氨基固相颗粒更具有优势,产率和性能更好。
本发明提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法,将抗原分子与活化氨基固相颗粒进行偶联,得到免疫氨基固相颗粒。
该制备方法简单易操作,实现活化氨基固相颗粒与抗原分子的一步制备,避免了对抗原分子进行预先处理的操作,降低了包被难度,同时节省了制备原料,从而极大地降低了生产成本。制备得到的免疫氨基固相颗粒性能稳定,纯化简单,免疫活性好,灵敏度更高同时检测背景值低。
在优选地实施方式中,抗原分子和活化氨基固相颗粒的质量比为(1-20):500,优选为(2-5):500。质量比典型但非限制性的为1:500、2:500、3:500、4:500、5:500、10:500、15:500或20:500。
在优选地实施方式中,偶联条件包括:15-45℃,15min-5h,优选为15-45℃,30min-2h。反应时间典型但非限制性的为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃,反应时间典型但非限制性的为30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h或5h。
在优选地实施方式中,偶联反应还包括回收免疫氨基固相颗粒和保存的步骤。当氨基固相颗粒为氨基磁珠时可以直接采用磁性分离得到免疫氨基磁珠,当氨基固相颗粒为氨基乳胶时可以直接采用离心分离得到免疫氨基乳胶,纯化后的免疫氨基固相颗粒采用稀释剂保存使用,稀释剂可以为常见的缓冲溶剂例如PBS(1%BSA,0.1%tween-20)等等。
本发明最后提供含有上述免疫氨基固相颗粒的试剂盒。该试剂盒根据氨基固相颗粒包被的抗原分子的不同,可以用于不同情境的免疫检测或诊断中,该试剂盒还可以含有免疫检测或诊断时所需要的其他缓冲液等试剂。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:0.1,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,45℃反应30min;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:0.1,将2-IT与氨基磁珠活化反应,15℃,2h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例2
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:100,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,15℃反应2h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:100,将2-IT与氨基磁珠活化反应,45℃,15min;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例3
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例4
本实施例提供一种活化氨基乳胶的制备方法:
1、将氨基乳胶用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基乳胶表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基乳胶活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基乳胶分离纯化,以2-IT与氨基乳胶表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基乳胶活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基乳胶分离纯化,得到活化氨基乳胶。
实施例5
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例6
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)4与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)4与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例7
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)6与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)6与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例8
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)8与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)8与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例9
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)12与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)12与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例10
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)24与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)24与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例11
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以LC-SMCC与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将LC-SMCC与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例12
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SMCC与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SMCC与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以2-IT与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将2-IT与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例13
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以SATA与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SATA与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例14
本实施例提供一种活化氨基磁珠的制备方法:
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h;
2、将步骤1中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,以STAP与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将STAP与氨基磁珠活化反应,25℃,1h;
3、将步骤2中的氨基磁珠用磁分离器分离纯化,得到活化氨基磁珠。
实施例15
本实施例提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法:
小分子CCP多肽以5μg/mg固相颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化氨基固相颗粒混合,15℃反应5h,纯化得到免疫氨基固相颗粒。
实施例16
本实施例提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法:
小分子CCP多肽以100μg/mg固相颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化氨基固相颗粒混合,45℃反应15min,纯化得到免疫氨基固相颗粒。
实施例17
本实施例提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法:
小分子CCP多肽以20μg/mg固相颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化氨基固相颗粒混合,45℃反应30min,纯化得到免疫氨基固相颗粒。
实施例18
本实施例提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法:
小分子CCP多肽以50μg/mg固相颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化氨基固相颗粒混合,15℃反应2h,纯化得到免疫氨基固相颗粒。
实施例19
本实施例提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法:
小分子CCP多肽以35μg/mg固相颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化氨基固相颗粒混合,30℃反应1h,纯化得到免疫氨基固相颗粒。
实施例20
本实施例提供一种免疫氨基固相颗粒的制备方法:
TPN15抗原以35μg/mg固相颗粒的比例,将TPN15抗原和活化氨基固相颗粒混合,30℃反应1h,纯化得到免疫氨基固相颗粒。
对比例1
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h,反应后氨基磁珠用磁分离器分离纯化;
2、以2-IT与小分子CCP多肽摩尔比为1:50,将2-IT与小分子CCP多肽活化反应,25℃反应1h,纯化活化的小分子CCP多肽;
3、将步骤1和2中活化过的氨基磁珠和小分子CCP多肽混合,30℃反应1h,纯化得到免疫氨基磁珠。
对比例2
1、将氨基磁珠用PBS进行重悬,以SM(PEG)2与氨基磁珠表面氨基摩尔比为1:50,将SM(PEG)2与氨基磁珠活化反应,25℃反应1h,反应后氨基磁珠用磁分离器分离纯化;
2、以2-IT与小分子CCP多肽摩尔比为1:50,将2-IT与小分子CCP多肽活化反应,25℃反应1h,得到反应溶液;
3、将步骤1中活化过的氨基磁珠和步骤2中的反应溶液混合,30℃反应1h,纯化得到免疫氨基磁珠。
对比例3
1、将羧基磁珠用0.1M pH6.0 Mes进行重悬,以EDC/NHS与羧基磁珠表面羧基摩尔比均为1:10,将EDC/NHS与羧基磁珠活化反应,25℃反应30min,反应后羧基磁珠用磁分离器分离纯化;
2、小分子CCP多肽以20μg/mg固相颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化羧基固相颗粒混合,25℃反应2h,纯化得到免疫羧基固相颗粒。
对比例4
1、将羧基磁珠用0.1M pH6.0 Mes进行重悬,以EDC/NHS与羧基磁珠表面羧基摩尔比均为1:10,将EDC/NHS与羧基磁珠活化反应,25℃反应30min,反应后羧基磁珠用磁分离器分离纯化;
2、TPN15抗原以20μg/mg固相颗粒的比例,将TPN15抗原和活化羧基固相颗粒混合,25℃反应2h,纯化得到免疫羧基固相颗粒。
对比例5
1、将羧基胶乳用0.1M pH6.0 Mes进行重悬,以EDC/NHS与羧基胶乳表面羧基摩尔比均为1:50,将EDC/NHS与羧基胶乳活化反应,25℃反应30min,反应后离心纯化羧基胶乳;
2、小分子CCP多肽以20μg/mg固相胶乳颗粒的比例,将小分子CCP多肽和活化羧基固相颗粒混合,25℃反应2h,纯化得到免疫羧基固相胶乳颗粒。
试验例
将实施例3中活化氨基磁珠按照实施例15、16、17、18和20的制备方法制备免疫氨基磁珠,实施例1-14中的活化氨基固相颗粒按照实施例19的制备方法制备得到免疫氨基固相颗粒。将上述实施例的免疫固相颗粒与对比例1-5的免疫氨基固相颗粒进行检测,具体原理及过程:包被有CCP或TPN15抗原的固相磁珠捕获样本中的对应抗体,磁分离后重复清洗4次,再加入标记有碱性磷酸酶的抗人IgG二抗,最终形成磁珠-标记抗原-抗体抗人IgG二抗-ALP的复合物,磁分离后重复清洗4次,加入底物AMPPD后催化反应5-6min,仪器光电倍增管收集RLU并转化为数字信号RLU。
实施例4和对比例5在日立生化仪上进行测评,简要原理及过程如下:包被有CCP抗原的乳胶颗粒和加入样本中的CCP抗体反应,形成免疫复合物,使反应液出现浊度,利用比浊计测定光密度值,复合物的含量与光密度值成正比,仪器最终将光密度值转化为相应的反应度。
结果如下表所示:
从上述检测结果可以看出,本发明提供的活化免疫氨基固相颗粒可以高效生产免疫氨基固相颗粒,特别是针对常规的制备方法中对常见的小分子或特殊的抗原抗体在与固相颗粒偶联包被时比较困难的技术问题,整个过程中避免了对抗原分子的活化操作,大大降低了操作难度,对比例1中的制备方法,活化的小分子CCP多肽纯化极为困难,不纯化直接与固相载体偶联(对比例2),偶联效果也特别差,难以得到大量生产的目的,制备成本昂贵。而且本发明提供的免疫氨基固相载体灵敏度高,性能好,极大地降低了非常规抗原分子的免疫氨基固相颗粒的生产成本。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种活化氨基固相颗粒的制备方法,其特征在于,对氨基固相颗粒进行二次活化,得到活化氨基固相颗粒;
所述二次活化包括a)或b):
a)氨基固相颗粒与第一活化剂共价反应,得到的第一反应产物带有马来酰亚胺基团,再将所述第一反应产物与第二活化剂发生共价反应,得到活化氨基固相颗粒,所述活化氨基固相颗粒带有可与氨基反应的基团;
b)氨基固相颗粒与第二活化剂共价反应,得到的第二反应产物带有疏基,再将所述第二反应产物与第一活化剂发生共价反应,得到活化氨基固相颗粒,所述活化氨基固相颗粒带有可与氨基反应的基团;
所述第一活化剂具有交联臂。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述氨基固相颗粒包括氨基磁珠或氨基乳胶。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述第一活化剂包括SM(PEG)2、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24、LC-SMCC、SMCC或Sulfo-SMCC;
优选地,所述第二活化剂包括2-IT、SATA、STAP、AMAS、GMBS或SMPH。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法,其特征在于,第一活化剂和第二活化剂均独立地与氨基固相颗粒表面氨基的摩尔比为1:2-1:100;
优选地,a)中氨基固相颗粒与第一活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h;
优选地,a)中第一反应产物与第二活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h;
优选地,b)中氨基固相颗粒与第二活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h;
优选地,b)中第二反应产物与第一活化剂的共价反应条件包括:15-45℃,30min-2h。
5.权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的活化氨基固相颗粒。
6.权利要求5所述的活化氨基固相颗粒在制备免疫氨基固相颗粒中的应用。
7.一种免疫氨基固相颗粒,其特征在于,包括权利要求5所述的活化氨基固相颗粒,和,与活化氨基固相颗粒偶联的抗原分子。
8.根据权利要求7所述的免疫氨基固相颗粒,其特征在于,所述抗原分子包括E2、VD、T3、T4、HBsAg、C-peptide、HBeAg、HCV、TPN15或CCP。
9.权利要求7或8所述的免疫氨基固相颗粒的制备方法,其特征在于,将抗原分子与权利要求1-4任一项所述的活化氨基固相颗粒进行偶联,得到免疫氨基固相颗粒;
优选地,抗原分子和活化氨基固相颗粒的质量比为(1-20):500,优选为(2-5):500;
优选地,偶联条件包括:15-45℃,15min-5h,优选为15-45℃,30min-2h;
优选地,偶联反应还包括回收免疫氨基固相颗粒和保存的步骤。
10.一种含有权利要求7-9任一项所述免疫氨基固相颗粒的试剂盒。
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