CN110478365B

CN110478365B - 富氢水在制备促排氚中毒的饮用水或医用液体中的应用

Info

Publication number: CN110478365B
Application number: CN201910695966.4A
Authority: CN
Inventors: 李蓉; 王卫东; 李宏; 殷娅茹; 杨露勋; 卢丙慧; 刘晶; 曾一平; 高继宁; 贺尹娟; 粟永萍
Original assignee: Sichuan Cancer Hospital; Army Medical University
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110478365A

Abstract

本发明涉及一种富氢水在制备促排氚中毒饮用水或医用液体中的应用。本发明通过实验验证，富氢水能够使细胞受到刺激而升高的GSH(glutathione)、SOD(superoxide dismutase)、8‑OHDG逐渐回落到正常水平，而细胞内的氚含量由于富氢水的提前防护也显著减少。结果还显示0.6mmol/L富氢水对细胞的防护以及促排氚的效果比0.2mmol/L的好，这说明用高浓度的氢‑1可以将机体组织内的氚给替换出来，分子氢还能够清除细胞内由于氚的损伤而产生的大量自由基，提高细胞的活力。

Description

富氢水在制备促排氚中毒的饮用水或医用液体中的应用

技术领域

本发明属于医药应用领域，特别涉及富氢水在制备促排氚中毒的饮用水或医用液体中的应用。

背景技术

氚(³H,tritum)作为核电站运行和制造核武器的主要原料，在核工业和国防工业中应用广泛，影响的人群数量较大。如核工业***氚职业照射工种范围广、职业照射人数多，其中最典型的是核电***，无论是轻水压水堆还是重水压水堆都会产生一定数量的氚，尤其是在乏燃料水池和换料大修的反应堆水池周围。核设施运行过程中，氚产生、排放，进而被人体吸收，造成氚的内照射污染，直接影响到辐射人员的健康。氚是核电厂辐射人员体内可检出的最常见的人工内污染核素。随着国民经济迅猛发展，我国也需大力发展核电，以满足对能源的需求。氚职业照射人群不断扩大，辐射工作人员体内氚浓度明显增加。此外，氚在国家经济发展的多个部门，如工业、农业、生物学、医学、环境科学以及考古学等领域中均有重要的研究价值和广泛的用途，如在各种研究用的实验堆、放射性同位素生产堆、伴生矿、核潜艇动力堆以及一些核退役设施中也存在氚的职业照射。

氚在环境中主要以氚气和氚水(tritium oxide,HTO，T₂O)形式存在，在空气中氚气通过氧化反应和同位素交换反应生成氚水，导致环境中氚气和氚水的含量分别为0.1％和99％。氚极易经呼吸、消化道、皮肤等途径进入人体，其中影响最大的是氚水，人体对氚水的吸收能力比对氚气大4个数量级，氚水的毒性为核素氚的520倍。氚气通过吸气作用只有一小部分被人体吸收结合，剩余的都随呼气作用被迅速排出。而气态氚水的生物吸收效率非常高，吸入的氚水大约99％经血液循环被人体吸收；摄入的液态氚水也几乎全部被消化道吸收并很快地进入血液循环。含水量多的组织，氚含量相对较多，如肝脏和肌肉组织。通过同位素交换或酶促反应，体内部分氚掺入到有机分子中，成为组织结合氚，其中与有机分子中的氧、氮、硫、磷结合的氚，容易再交换出来，称为“可交换的有机结合氚”(Organicbonded tritium，OBT)；与碳结合的氚，因是通过酶促反应不易再交换出来，称为“牢固的有机结合氚”。氚水在体内分布的代谢动力学，可用三隔室模型描述，见图14。人类对氚的生物半排期约8～l0天，可造成一定的内照射危害。

氚的危害分为急性效应和慢性效应。氚发射的β粒子平均能量5.72kev，最大能量为18.6kev，在空气中平均射程为0.56μm。正常运行时，对人员产生的辐射危害主要是存在于空气中的氚水被吸入人体后产生的内照射。氚的β射线在体液中引起电离和激发，生成正负离子和自由基，与组织接触时，可发生辐射损害。单位质量的器官组织与体液接触的表面积越大，体液流动的速度越快，自由基和正负离子与组织接触的机会较多，辐射损伤也较严重。生物效应研究表明，氚水对机体的辐射危害有急性放射损伤效应(表现类似外照射急性放射病)、慢性放射病、生殖影响、致染色体畸变等确定性效应；致癌效应、致遗传效应等随机性效应也被证实。如有研究指出低水平慢性摄入氚水可导致白血病和其他恶性肿瘤，主要是由于摄入后与机体组织牢固结合而长期定位于蛋白质、糖元和DNA等大分子部位的有机结合氚。有机结合氚的贡献占总氚的比例，大约占急性照射的5％和慢性长期照射的10％，但长期滞留于体内，会产生剂量较大的累积辐射效应，长期与氚接触可能引起慢性放射病的发生。

氚是氢-1的放射性同位素，二者在物理化学性质上相似。放射性核素氚进入体内后，主要是参与体内稳定性核素氢-1的代谢过程，正如放射性碘参与体内稳定性核素碘-127的代谢，最终主要蓄积在甲状腺一样。同样，氚水与水的物理化学性质相似，无论氚水是以何种形式被人体吸收，一般在1-2h内分布于体内所有含水的组织和器官中，表现出和水相似的滞留特性。

目前氚的促排，国内外采用于多饮水及利尿剂，尚无更好的方法。我国也探索过中药如排氚片等对氚的促排作用，其机制也是通过中药产生的利尿作用，加速氚从体内的排除。

发明内容

本发明的目的是提供富氢水(hydrogen Rich water，HRW)在制备促排氚中毒的饮用水或医用液体中的应用。

所述富氢水中氢气的浓度为1.2-3.0ppM，溶于纯净水中，使用时按照需要配制成不同氢浓度的溶液使用。

所述氚中毒是有氚水暴露所致人体淋巴细胞的损伤。

所述人体淋巴细胞为AHH-1细胞。

所述氚中毒是遗传物质改变的损伤。

所述遗传物质改变的损伤为氚水暴露引起的骨髓嗜多染红细胞微核率增加、细胞染色体和/或DNA的损伤。

所述氚中毒是血液学的改变。

所述血液学的改变为外周血象变化。

所述外周血象变化为白细胞和/或血小板降低。

所述医用液体可以在富氢水中添加医学上可接受的辅料；或者将富氢水与其它对促排氚中毒的有预防或治疗作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料。

本发明所述应用，采用富氢水促排氚，为促排氚提供了一条良好的途径。如果给予含高浓度稳定性氢-1(分子氢¹H₂)，与其放射性同位素氚(³H)竞争机体内的结合位点，或与可交换的有机结合氚进行再交换，使氚释放出来，促进氚的排除，应该是一条很好的途径。富氢水是指通过高压通气、电解水等方法产生大量的分子氢(¹H₂)，这种分子氢含量较高的水称为富氢水。大量研究证实，分子氢可有效防治多种疾病和损伤，如已有多个研究证实氢可抗辐射损伤，改善脊髓缺血再灌注损伤，减轻单侧尿路梗阻诱发的肾损伤，改善甘油诱发的大鼠横纹肌溶解和肾损伤；对新生鼠坏死性小肠结肠炎、溃疡性结肠炎具有保护效应；减轻肝硬化，改善癌症患者的生活质量，治疗牙周炎、脓毒症和皮肤病，对急性氧化应激、一氧化碳中毒等的防治效果较好。虽然其具体作用机理及靶向分子机制尚未明确，但已有研究表明分子氢可与氧化性极强的羟自由基(·OH)和过氧亚硝酸根阴离子(ONOO^-)等发生反应，减轻或防治其引起的核酸裂解、脂类过氧化和蛋白活性丧失；此外其增强抗氧化酶的活性如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和加氧酶一1的作用有关；氢可通过抑制caspase-3的活性具有抗凋亡作用；在氧化应激诱导的炎性反应中，氢下调炎性反应因子IL-1β、IL-6、趋化因子和TNF-α水平而具有抗炎性反应。极少量的H₂(0.04mM)确实能调节多种基因的表达及蛋白质的磷酸化进程，起到较显著的防护治疗效果。最重要的氢气本身就是很好的抗氧化剂，具有以下优点：①进入体内后分散性好，因为氢气分子很小，进入体内能快速渗透至全身，并容易穿透细胞膜，进入线粒体及细胞核等细胞器；②与体内的OH^-、NO^-等自由基反应条件足够温和，中和成水排出体外，而不会影响其它良性活性氧(如SOD等)及器官功能；③分子氢几乎无毒，一方面，人体肠道本身就产生少量氢气；另一方面，吸入一定浓度的氢气在潜水医学也有应用。目前认为氢气对人体是相对安全的，即使呼吸几十个大气压的氢气也不会对身体造成毒性效应，仅有一定麻醉作用。因此，富氢水中的分子氢和水是适合氚促排的较好方法。

本发明通过实验验证，富氢水能够使细胞受到刺激而升高的GSH(glutathione)、SOD(superoxide dismutase)、8-OHDG逐渐回落到正常水平，而细胞内的氚含量由于富氢水的提前防护也显著减少。结果还显示0.6mmol/L富氢水对细胞的防护以及促排氚的效果比0.2mmol/L的好，这说明用高浓度的氢-1可以将机体组织内的氚给替换出来，分子氢还能够清除细胞内由于氚的损伤而产生的大量自由基，提高细胞的活力。

附图说明

图1为给予HRW后小鼠不同时间点尿氚、血清氚及组织OBT含量，其中，A为小鼠尿液排出量；B为暴露后不同时间小鼠经尿液排出放射性总量；C为不同时间点小鼠血清放射性活度；D为暴露后第7天，小鼠各脏器OBT的放射性活度。图中，*p<0.05,**p<0.01；

图2为HTO处理后不同时间点各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率比较；其中，A为小鼠骨髓嗜多染红细胞微核，B为HTO处理后不同时间点各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的比较，图中，*p<0.05,**p<0.01；

图3为各组小鼠微量全血彗星实验，其中，A为各组小鼠微量全血彗星实验荧光图片，DNA采用溴化乙锭染色；B为各组小鼠微量全血彗星实验细胞尾部DNA百分含量比较；*p<0.05，**p<0.01；C为各组小鼠微量全血彗星实验各组彗星细胞率，每组计数1000个细胞；*p<0.05，**p<0.01；

图4为HTO处理后各组小鼠0-14天外周血常规变化；其中，A：HTO处理后各组小鼠0-14天外周血白细胞数变化，*p<0.05，**p<0.01，与正常组比较；B：HTO处理后各组小鼠0-14天外周血血小板数变化，*p<0.05，**p<0.01，与正常组比较；

图5为HRW对不同放射性活度氚水暴露细胞增殖活性的影响；其中，A：HRW对不同浓度HTO暴露的细胞增殖活性的影响，*p<0.05，**p<0.01，与正常组相比；B：HRW对不同浓度HTO暴露的细胞凋亡的检测，早期凋亡的细胞位于图形的右下象限，晚期凋亡或坏死的细胞位于图形的右上象限；C：HRW对不同浓度HTO暴露的细胞凋亡的统计，包括早期凋亡和晚期凋亡，*p<0.05；

图6为不同HTO暴露剂量对AHH-1细胞双核细胞微核率及DNA损伤的影响。其中，A：HRW对不同HTO浓度处理AHH-1细胞的微核Gimsa染色图；B：HRW对不同HTO浓度处理AHH-1细胞的微核率，各组计数1000个双核细胞，计算其微核率，**p<0.01；C：HRW对不同HTO浓度处理AHH-1细胞的彗星电泳图；D：HRW对不同HTO浓度处理AHH-1细胞的彗星实验对尾DNA％的统计，**p<0.01；

图7为HRW对HTO暴露细胞ROS的影响。其中，A：HRW对不同浓度HTO暴露于AHH-1细胞后24h细胞内总的ROS水平；B：HRW对不同浓度HTO暴露于AHH-1细胞后不同时间点细胞内·OH水平；C：HRW对不同浓度HTO暴露于AHH-1细胞后不同时间点细胞内O₂ ^-水平，*p<0.05，与同一时间点相同浓度HTO组比较；

图8为富氢水对氚暴露细胞GSH含量的影响，其中，**p<0.01，*p<0.05，与正常组(normal组)比较；^##p<0.01，^#p<0.05，与0组比较；

图9为富氢水对氚暴露细胞SOD活力的影响，其中，**p<0.01，*p<0.05，与正常组比较；^##p<0.01，^#p<0.05，与0组比较；

图10为富氢水对氚暴露细胞MDA含量的影响，其中，**p<0.01，*p<0.05，与正常组比较；##p<0.01，#p<0.05，与0组比较；

图11为富氢水对氚暴露细胞8-OHDG含量的影响，其中，**p<0.01，*p<0.05，与正常组比较；^##p<0.01，^#p<0.05，与0组比较；

图12为富氢水对氚暴露细胞线粒体膜电位的影响，其中，**p<0.01，*p<0.05，与正常组比较；^##p<0.01，^#p<0.05，与0组比较；

图13为富氢水对氚暴露细胞内和培养基氚浓度的影响，其中，(A)为细胞内氚浓度；(B)为培养基氚浓度。**p<0.01，*p<0.05，与正常组比较；^##p<0.01，^#p<0.05，与0组比较；

图14为体内氚代谢的三隔室模型示意图。

具体实施方式

一.试剂和仪器

富氢水(1mM)购于北京活力氢源有限公司，4℃铝袋保存；

HTO原浓度1mCi/mL(37MBq/mL)、液体闪烁剂购于美国PE公司，室温密封保存；

AHH-1细胞株购于北京迈莱博生物技术有限公司。

细胞增殖活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、凋亡检测试剂盒(FITC-Annexin V/propidium iodide，PI)购于日本Dojindo公司；

胎牛血清(FBS)、RPMI-1640干粉培养基、超氧化物阴离子(O₂ ^.-)荧光探针Dihydroethidium(DHE)、低熔点及正常熔点琼脂糖购于美国Invitrogen公司；

青霉素-链霉素溶液(Penicillin-Streptomycin solution)购于美国Hyclone公司；

吉姆萨染液、溴化乙锭(ethidium bromide，EB)、·OH检测试剂盒(2-[6-(4’-hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid，HPF)及细胞松弛素B购于美国Sigma公司；

活性氧(ROS)检测试剂盒(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)、总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、脂质氧化(MDA)检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购于上海碧云天生物技术有限公司。

还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法)、人8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)酶联免疫检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

二.具体实施例

实施例1富氢水(HRW)促进尿氚的排除增加

HTO处理动物

雄性BALB/c小鼠(4周龄，14-16g)购于中国人民解放军陆军军医大学实验动物中心，饲养于清洁级动物实验室。小鼠随机分为4组：(1)正常对照组：小鼠予以纯水喂养，不做任何处理(n＝10)；(2)HTO组：小鼠一次性按1.85MBq/kg腹腔注射HTO(约1mL)，予以纯水喂养至14天(n＝20)；(3)H₂O对照组：小鼠染毒后，按1mL/天/只予以纯水灌胃，小鼠纯水喂养至14天(n＝20)；(4)HRW组：小鼠染毒后，按1mL/天/只予以HRW灌胃，小鼠HRW喂养至14天(n＝20)。小鼠于染毒后当天转入小鼠代谢笼(泰尼百斯，意大利)喂养，记录并收集各组小鼠每日饮水量及尿液。于HTO注射后第2、4、7、14天处脱颈法死小鼠(5只/组/次)，股动脉取全血进行血常规及彗星实验(碱性单细胞凝胶电泳，文献：何启娜，吉永新，孙玉龙等“活性氧在900MHz微波辐射诱导小鼠骨髓基质细胞适应性反应中的作用”《环境与职业医学》，2016，(2)：100-104)；取双侧股骨进行微核实验；收集肝、脾、肾脏、小肠及睾丸，进行OBT测量。

采用代谢笼(丁在咸，秦环龙，严钱勤等“多功能大、小鼠生理实验代谢笼的研发及初步应用”《实验动物与比较医学》，2009，29(5)：319-324)记录了小鼠日常饮水量(或饮用HRW)及尿液排出体积，各组小鼠饮水量无显著性差异，约2～2.5mL/天，说明氚水(HTO)腹腔注射或HRW(或H₂O)灌胃不会显著影响小鼠的进食饮水行为。

由于灌胃增加了额外饮水，H₂O组及HRW组(组间无显著差异)小鼠尿液排出量显著高于正常对照组(Normal组)及HTO组(组间无显著差异)，平均约高出0.5-1mL。

进一步使用液体闪烁计数器测量了各组小鼠经尿液排出的总β活度，如图1A、1B所示，本底放射性活度约为1.2±0.3Bq/d。HTO暴露后，小鼠尿液放射性活度显著增加，于HTO暴露后24h内最高，并随着时间增加迅速降低，直至第4d，其尿液放射性活度基本降至正常。由于灌胃增加了小鼠额外饮水量，进而增加尿液排出量，H₂O组及HRW组小鼠前4天尿液排出总β放射性活度显著高于HTO组(前4天经尿液总排出约5×10⁴Bq)。然而，HRW组小鼠前4d排出的总活度(约6.8×10⁴Bq)显著高于H₂O组(约5.9×10⁴Bq)。

结果：小鼠暴露于HTO后，通过多饮水增加尿液排出，可以促进尿氚的排出；而HRW促排效果显著强于H₂O，其原因是高浓度的¹H竞争³H的结合位点，通过同位素交换而促进氚的排出。

实施例2HRW促进滞留的血氚水平降低。

HTO进入体内后参与水的代谢，主要通过血液循环分布至各组织器官。通过液体闪烁计数法测定(李晓凤，曹娟，吴贤海“液体闪烁计数测氚的测量方法比较”《核电子学与探测技术》，2015，35(7)：707-711)了HTO暴露小鼠后第2、4、7、14d血清中β离子放射性活度。如图1C所示，正常小鼠血清本底放射性浓度约为2.3±0.4Bq/mL。HTO暴露后，小鼠血清放射性浓度显著增加，且随时间逐渐降低。与尿氚分析一致，H₂O组及HW组7d内血清中放射性浓度均低于HTO组，而HRW组与H₂O组相比，更能降低血清中的氚浓度。

结果：多饮水或HRW能降低氚在血液循环中的滞留，降低血液中放射性含量，且HRW效果优于H₂O。

实施例3HRW促进组织中组织结合氚(OBT)氚的含量降低

通过液体闪烁计数法测定HTO暴露于小鼠7d后，各组织器官的组织结合氚(OBT)。将小鼠组织经过马弗炉干灰化，称量灰化前组织的湿重，以及灰化后组织的干重，干重和湿重的比值，确定小鼠各脏器的含水量。其中睾丸、小肠及肾脏组织含水量最高，分别为80％、78％及75％，其次为肝脏和脾脏，分别为70％及65％。对组织匀浆液放射性浓度测定显示，如图1D所示，小鼠睾丸、小肠、脾脏、肾、肝的本底放射性水平分别约为10.5±0.8、12.3±0.7、13.3±0.6、9.8±0.5和11.2±0.3Bq/g。HTO暴露7天后，各脏器放射性活度显著提高，其中睾丸>肾脏>小肠>肝>脾，说明HTO参与水的代谢，主要掺入含水量较高的组织。H₂O或HRW灌胃小鼠后，除脾脏外，小鼠其余各器官OBT含量显著低于HTO组；且HRW组与H₂O组相比，其组织OBT含量进一步显著降低。

结果：多饮水或富氢水可以降低HTO暴露小鼠后组织OBT含量，从而降低OBT的放射性损伤，且HRW的效果好于H₂O。

实施例4HRW降低HTO暴露后小鼠遗传物质的损伤

1.HRW显著降低小鼠骨髓多染红细胞微核率

为了探讨HRW对HTO所致小鼠染色体损伤的影响，研究了各组小鼠骨髓MnPCEs，如图2A箭头所示为MnPCE。对小鼠注射HTO后，按照微核分析法(覃默，韦美艳，周芹等“6种明胶胶囊药壳对小鼠骨髓细胞微核率的影响”，《广东医学》，2015，36(13):1982-1986)，MnPCEs‰随时间呈现先升后降的趋势，至第4d最高。H₂O或HRW灌胃可显著降低HTO染毒小鼠骨髓MnPCEs‰。而与H₂O相比，HRW对HTO所致染色体损伤保护效应更强，如图2B所示。

2.HRW显著降低小鼠细胞染色体及DNA的损伤

采用微量全血彗星实验(碱性单细胞凝胶电泳，文献：何启娜，吉永新，孙玉龙等“活性氧在900MHz微波辐射诱导小鼠骨髓基质细胞适应性反应中的作用”《环境与职业医学》，2016，(2)：100-104)，研究了HTO处理不同时间点各组小鼠血液细胞DNA的损伤情况。如图12，DNA损伤随注入HTO呈现先升后降的趋势，其中第4d损伤最为严重，至14d已基本恢复。第4d，H₂O组及HRW组细胞彗星尾部荧光显著低于HTO组，参见图3A；采用CASP软件分析，显示注入HTO后第4d，H₂O组及HRW组细胞尾部DNA百分含量(Tail DNA％)显著低于HTO组，且HRW组细胞DNA损伤显著较H₂O组轻；计数1000个细胞，HRW组其彗星细胞个数也显著低于HTO组及H₂O组，参见图3B、图3C。

实验证明多饮水或HRW能显著降低HTO暴露所致的小鼠细胞染色体及DNA的损伤，且HRW保护效应强于H₂O。这可能是由于与H₂O相比，HRW具有选择性抗氧化及抗凋亡的功能，能有效保护细胞受到放射性氧化损伤。

3.HRW有效缓解HTO所致的小鼠血常规改变

对小鼠注射HTO后(方法同实施例1)，其外周血白细胞(WBC)计数下降后上升，参见图4A；血小板(PLT)总数也呈现先降后升的现象，参见图4B。H₂O及HRW灌胃干预能显著改善HTO引起的小鼠外周血WBC及PLT总数的下降，而HRW对HTO暴露小鼠血常规改变的改善强于H₂O，HRW处理小鼠的血常规在观察时间内基本正常。

实施例4HRW降低HTO所致AHH-1细胞的凋亡

细胞及处理

HRW对HTO暴露细胞后细胞活性的影响：

将AHH-1细胞在RPMI-1640培养基中培养(90％的RPMI-1640培养基，10％的胎牛血清FBS，1％的青霉素-链霉素溶液)，并以3000/孔接种于96孔细胞培养板中。正常组(Normal)：不做任何处理，每组3孔。氚水组(HTO)：分别用0.5，2.5，5，25，50，100μCi/mL的HTO处理，每组3孔。富氢水组(HRW)：用HRW(1mM)处理5分钟，然后加入0.5，2.5，5，25，50，100μCi/mL的HTO，每组3孔。将所有细胞孵育48小时。向各孔中加入10μL CCK-8溶液(细胞增殖活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8))，将细胞在37℃下在黑暗中培养2小时。通过多功能酶标仪(Spectra Max M4，Molecular Devices，USA)测量每个孔在450nm的吸光度，以计算细胞增殖活性。

HRW对HTO暴露细胞后细胞凋亡的影响：

将AHH-1细胞以3×10⁵/孔接种在6孔板中。正常组(Normal)：不做任何处理，每组3孔。氚水组(HTO)：分别用10，100μCi/mL的HTO处理，每组3孔。富氢水组(HRW)：用HRW(1mM)处理5分钟，然后加入10，100μCi/mL的HTO，每组3孔。将所有细胞培养48小时。通过凋亡检测试剂盒(FITC-Annexin V/propidium iodide，PI)进行检测，最后通过流式细胞术(C6，BD，USA)分析。通过流式细胞术检测凋亡探讨HRW保护HTO暴露所致放射性损伤的机制，研究HRW对HTO暴露下的AHH-1细胞增殖活性的影响。如图5A所示，AHH-1细胞暴露于HTO，低浓度HTO暴露对细胞增殖活性影响不大；增加HTO浓度，细胞增殖活性呈现了浓度依赖性降低，100μCi/mL(3.7×10⁶Bq/mL)HTO处理细胞，其增殖活性降低至80％左右。富氢水组(HRW)的细胞，其增殖活性无显著变化。如图5B所示，流式细胞术检测细胞凋亡显示，AHH-1细胞总凋亡率随着HTO暴露剂量的增加而升高，至100μCi/mL，其总凋亡率约为20％；如图5C所示，富氢水组(HRW)的细胞凋亡率显著降低。该实验说明HRW能有效减轻HTO所致AHH-1细胞的凋亡。

实施例5HRW降低HTO对AHH-1细胞的基因毒性

细胞及处理

将AHH-1细胞以3×10⁵/孔接种于6孔板中培养在RPMI-1640培养基(90％的RPMI-1640培养基，10％的胎牛血清FBS，1％的青霉素-链霉素溶液)中。正常组(Normal)：不做任何处理，每组3孔。氚水组(HTO)：分别用10，100μCi/mL的HTO处理，每组3孔。富氢水组(HRW)：用HRW(1mM)处理5分钟，然后加入10，100μCi/mL的HTO，每组3孔。

AHH-1微核率的测定(覃默，韦美艳，周芹等“6种明胶胶囊药壳对小鼠骨髓细胞微核率的影响”，《广东医学》，2015，36(13):1982-1986)，步骤同实施例4。

AHH-1细胞的彗星实验采用碱性单细胞凝胶电泳的方法(文献：何启娜，吉永新，孙玉龙等“活性氧在900MHz微波辐射诱导小鼠骨髓基质细胞适应性反应中的作用”《环境与职业医学》，2016，(2)：100-104)。结果表明如图6A所示，随着HTO暴露剂量增高，双核淋巴细胞MN也相应增加；如图6B所示，HRW能显著降低HTO暴露导致的MN的增加。如图6C所示，彗星实验显示，HTO暴露48h，细胞尾部荧光强度呈剂量依赖式增加，提示细胞TailDNA％逐渐升高；如图6D所示，HRW能显著降低较高剂量HTO(100μCi/mL)暴露于AHH-1细胞尾部DNA百分含量，提示HRW能降低HTO对细胞DNA的放射损伤。

实施例六HRW降低HTO暴露于AHH-1诱导的ROS产量的升高

细胞及处理

将AHH-1细胞在RPMI-1640培养基中培养(90％的RPMI-1640培养基，10％的胎牛血清FBS，1％的青霉素-链霉素溶液)，并以3000/孔接种于96孔细胞培养板中。正常组(Normal)：不做任何处理，每组3孔孔。氚水组(HTO)：分别用0，10，100μCi/mL的HTO处理，每组3孔。富氢水组(HRW)：用HRW(1mM)处理5分钟，然后加入0，10，100μCi/mL的HTO，每组3孔每组3孔。

1.HRW显著降低细胞内ROS的产量

采用DCFH-DA方法(文献：谭灵莉，宋旭，张志荣等“聚苯乙烯纳米粒对细胞活性氧的影响”《华西药学杂志》，2017，5：493-494)。对不同浓度HTO暴露24h后细胞内总ROS产量进行测定。结果如图7A所示，AHH-1细胞随着HTO暴露剂量的增加，其总ROS产量增加不明显；但HRW组的细胞能显著降低细胞内ROS的产量。

2.HRW显著降低细胞内·OH的产量

采用·OH检测试剂盒(2-[6-(4’-hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid，HPF)测不同HTO暴露浓度于AHH-1细胞后不同时间点细胞内·OH的产量(按试剂盒说明书方法操作)，如图7B所示，细胞内·OH随着HTO暴露剂量及暴露时间的增加而增加；HRW组的细胞在HTO暴露后不同时间点不同剂量，其细胞内·OH显著降低。

3.HRW处理对细胞内O2^-

采用超氧化物阴离子(O₂ ^.-)荧光探针Dihydroethidium(DHE)测定不同时间点细胞内的O₂ ^.-的含量，对细胞内O2.-研究，如图7C所示，细胞内O2^-随HTO暴露剂量及暴露时间增加不明显，且HRW处理对细胞内O2^-其结果说明含量影响不大。

结果说明，HRW能减轻HTO暴露所致AHH-1细胞的损伤，主要原因是为其具有选择性抗氧化功能，选择性清除HTO暴露所致细胞内·OH的升高，而对其他自由基如O2-无明显影响。

结论：HRW灌胃能显著增加HTO暴露小鼠尿氚含量，降低血清氚含量，并有效降低组织OBT；升高HTO暴露引起的白细胞及血小板降低，降低小鼠骨髓MnPCE的发生并减轻血液细胞DNA的损伤。体外实验证明，与单纯HTO组相比，富氢培养条件下培养的AHH-1细胞，凋亡率显著降低，双核淋巴细胞微核率显著降低，彗星实验显示其DNA损伤程度显著降低，细胞内总ROS及羟基自由基(·OH)显著降低，而细胞内超氧阴离子(O2.-)无显著变化。

实施例七富氢水对氚水促排的机制

细胞及处理

富氢水对氚促排后对AHH-1细胞内GSH、MDA、8-OHDG含量以及SOD活力、线粒体膜电位的影响：给予AHH-1不同的物质，分为正常对照组、氚水组和富氢水组。。正常对照组：不加富氢水和氚水的正常对照组(Normal)，每组3孔。氚水组：加入氚水，使氚水的终浓度分别为1μCi/mL，10μCi/mL，100μCi/mL，每组3孔。富氢水组：分别向细胞中加入氢浓度分别为0、0.2mmol/l、0.6mmol/L的富氢水，5min后，加入氚水，使氚水的终浓度为1μCi/mL，10μCi/mL，100μCi/mL，每组3孔。培养24h后，通过3500rpm/min离心10min收集细胞，在细胞中加入100μL的PBS通过反复冻融的方法使细胞裂解，通过3500rpm/min离心10min取上清分别用GSH、MDA、8-OHDG以及总SOD活力检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒检测(按试剂盒说明操作)。

1.细胞内GSH的变化

采用还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法)以及BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)进行测定细胞匀浆中的GSH含量(按试剂盒说明操作)，结果如图8所示，与正常对照组相比，给予各种浓度的氚水后，刺激细胞产生各种自由基，为了清除这些自由基，细胞会产生大量的GSH，使细胞内的GSH含量显著升高，而且各组的GSH含量都随着氚水浓度的升高而升高。提前给予0.6mmol/L富氢水的各组GSH含量发生极显著下降，而提前给予0.2mmol/L富氢水的各组GSH水平没有下降。当加氚水后，细胞受刺激产生大量的自由基，没有加富氢水的细胞会产生大量的GSH来清除这些自由基；提前给予细胞富氢水后，细胞会吸收大量的分子氢，分子氢对自由基产生清除作用，导致生成的GSH浓度不如氚水组高。

2.细胞内SOD酶活性的变化

采用总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)进行测定(按试剂盒说明操作)细胞匀浆中的SOD酶活力，结果如图9所示。与正常对照组(normal)相比，给予各种浓度的氚水后，刺激细胞产生超氧阴离子自由基，细胞为了清除超氧阴离子自由基，会合成大量的SOD酶，导致SOD活性上升，在1μCi/mL，10μCi/mL两个浓度组上升更显著。而在提前给予富氢水，各组SOD活力出现一定程度下降，但仍显著高于正常对照组，其中分子氢的浓度越高，其消除超氧化物阴离子的能力越强，导致产生的SOD活力不如氚水组明显增高。

3.细胞内MDA水平的变化

采用脂质氧化(MDA)检测试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)进行测定(按试剂盒说明操作)细胞匀浆中的MDA含量，结果如图10所示，与正常对照组相比，给予各种浓度的氚水后，10μCi/mL和100μCi/mL两个氚水组MDA的含量轻度上升，富氢水组MDA含量稍下降，但都无统计学差异参见图10。原因：可能与设置的氚水浓度较低，没有达到导致细胞损伤到MDA显著上升的程度。

4.细胞内8-OHDG水平的变化

8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2deoxyguanosine，8-OHDG)目前已成为DNA氧化损伤中最常用的生物标志物，可反应氚水对细胞内照射后DNA受损的程度。结果发现，与正常对照组相比，氚水组对细胞辐射损伤导致细胞内8-OHDG的含量显著性增加；而富氢水组随着分子氢浓度的增加，细胞内8-OHDG的含量比氚水组显著性降低，参见图11。说明富氢水中的氢分子可以防护氚水对细胞DNA的氧化损伤。

5.细胞线粒体膜电位水平的变化

线粒体内跨膜电位的降低，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它可引起线粒体膜发生一连串的生物化学变化，导致细胞凋亡一系列的级联反应。

与正常对照组相比，氚水组和0.2mmol/L富氢水组，线粒体膜电位显著上升；而0.6mmol/L富氢水组细胞线粒体膜电位显著下降，回落到正常水平，参见图12。

6.细胞内氚浓度和培养基氚浓度

采取液体闪烁计数法测量了细胞内氚浓度和培养基氚浓度，结果发现，与正常对照组相比，给予各种浓度的氚水后，细胞氚浓度显著上升；与氚水组相比，富氢水各浓度组的细胞氚浓度发生降低，其中给予0.6mmol/L富氢水的各组降低趋势更显著，参见图13A。

培养基氚浓度，与正常组相比，给予各种浓度的氚水后，培养基氚浓度显著上升。给予富氢水后，各浓度组的培养基氚浓度比氚水组更显著增高，参见图13B，这和细胞氚浓度的降低趋势是一致的。

结论：提前给予人类淋巴细胞和实验动物富氢水后，分子氢可以和氚竞争性结合细胞内的有机物，使氚不易形成有机结合氚，促进了氚的排出。

Claims

1.富氢水在制备促排体内氚中毒的饮用水或医用液体中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述富氢水中氢气的浓度为1.2-3.0ppM，溶于纯净水或蒸馏水中。

3.据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氚中毒是由氚水暴露所致人体淋巴细胞的损伤。

4.据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人体淋巴细胞为AHH-1细胞。

5.据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氚中毒是遗传物质改变的损伤。

6.据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述遗传物质改变的损伤为氚水暴露引起的骨髓嗜多染红细胞微核率增加、细胞染色体和/或DNA的损伤。

7.据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氚中毒是血液学的改变。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述血液学的改变为外周血象变化。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外周血象变化为白细胞和/或血小板降低。

10.据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述医用液体可以在富氢水中添加医学上可接受的辅料；或者将富氢水与其它对促排氚中毒的有预防或治疗作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料。