CN110476746A - 一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法 - Google Patents

一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法，本发明利用法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿伦磷酸能够竞争性结合到该酶催化活性中心，阻止底物与酶活性中心结合，从而抑制该酶的生物活性的特性，利用其作为活体验证小麦功能基因对有关农艺性状的影响，也对其它植物关键酶基因影响相关农艺性状的活体功能检测提供了有益的借鉴。该发明的技术操作相对简便，产生的小麦籽粒大小表型的差异性非常显著，实验稳定性好，可重复性高，形成的表型易观察、易测定，具有明显的特色和创新之处。

Description

一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法。
背景技术
类异戊二烯物质广泛存在于所有植物中，是植物光合作用、电子传递、应对环境胁迫等生长发育所必需的重要物质，包括叶绿素、类胡萝卜素等光合色素；细胞***素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯等生长物质和植物激素；谷甾醇等作为膜结构的一部分；质体醌等作为电子传递受体；多萜醇等作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体；异戊烯基蛋白等能调控细胞的生长。此外，很多类异戊二烯如橡胶、香料、维生素A、D、E、除虫菊素等具有重要的商业价值。这些物质主要通过植物甲羟戊酸代谢途径中的一系列酶催化合成的，其中法呢基焦磷酸合酶(FPS；EC2.5.1.1/EC2.5.1.10)是控制整个代谢途径分支点的关键限速酶。
植物基因功能验证，通常首先把基因克隆出来，然后进行体外表达蛋白质，再通过体外生化反应，测定有关蛋白(酶)的生物活性，或通过酶抑制剂体外检测其活性降低程度，但却无法验证其在整个植物生长体系中发挥的功能。
小麦是重要的粮食作物之一，其籽粒大小直接影响小麦产量，研究影响小麦籽粒大小的关键基因的生物学功能具有非常重要的意义。但现有技术中还没有公开或发表过关于利用法呢基焦磷酸合酶抑制剂处理正常生长的小麦穗部，进而研究该酶基因影响小麦籽粒大小等相关研究资料信息，也没有类似的在先技术出现过，因此如何填补这一空白，成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法，本发明利用法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿伦磷酸能够竞争性结合到该酶催化活性中心，阻止底物与酶活性中心结合，从而抑制该酶的生物活性的特性，利用其作为活体验证小麦功能基因对有关农艺性状的影响，也对其它植物关键酶基因影响相关农艺性状的活体功能检测提供了有益的借鉴。该发明的技术操作相对简便，产生的小麦籽粒大小表型的差异性非常显著，实验稳定性好，可重复性高，形成的表型易观察、易测定，具有明显的特色和创新之处。
本发明所用的法呢基焦磷酸合酶抑制剂为阿伦磷酸，其结构式如下：
阿伦磷酸是法呢基焦磷酸合酶底物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)(图2)的结构类似物，所述异戊烯焦磷酸的结构式如下：
本发明选用的阿伦磷酸能够竞争性结合到法呢基焦磷酸合酶催化活性中心，阻止上述的底物与酶活性中心结合，从而抑制该酶的生物活性。因此可以利用上述特性来检测法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的情况，提供更加可靠的实验数据，
发明人进一步提供了法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法，具体步骤如下：
(1)标穗：在大田正常种植的小麦抽穗后，从中选取穗下部小花与旗叶叶耳对齐，大小一致的穗子作为实验材料，进行挂牌；
(2)整穗：对符合标准的穗子，用镊子去除穗上部、穗下部和每排中部发育相对迟缓的小花；用剪刀沿着芒的基部，剪掉芒；每穗保留6排小花，每个处理需要整15穗以上备用；
(3)酶抑制剂阿伦磷酸的浓度及使用量：用于小麦小花滴注的阿伦磷酸使用浓度为25μmol/L，使用时必须用去离子水现用现配，置于冰盒中保存备用；使用量每朵小花滴注上述浓度的抑制剂或去离子水10μL；
(4)滴注：用手指沿剪掉芒的基部，将小花小心拨开露出雄蕊，利用移液器将10μL上述浓度的抑制剂注入其中，然后关闭小花；对照用相同量的去离子水，按照以上方法进行操作；全部小花滴注完毕，套上杂交袋以防溶液受热挥发，袋上需注明抑制剂或对照以及滴注时间相关信息；
(5)小麦生长：所有处理过的麦穗均在田间自然条件下生长发育至成熟；
(6)收获：待小麦成熟后，将每个处理穗收回，单独进行脱离、考种；
(7)数据统计：对每个处理的单穗，统计穗粒数、穗粒重和单粒重，并进行统计分析。
若处理组的各种参数比对照组都低，就证明法呢基焦磷酸合酶基因在决定小麦籽粒大小方面具有重要影响，对小麦产量水平的提高具有非常重要的作用，且说明处理组的小麦品种法呢基焦磷酸合酶基因正常；若实验结果不是上述情况，则表明该小麦法呢基焦磷酸合酶基因缺失或法呢基焦磷酸合酶基因发生了突变，可供进一步的研究分析或育种使用。按照本发明提供的操作步骤，能够准确验证功能基因所控制的表型。
通过上述检测方法，可以看到本发明通过小麦法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿伦磷酸抑制其催化活性，较之空白对照组显著改变了小麦籽粒的大小，进一步证明了小麦法呢基焦磷酸合酶基因在决定小麦籽粒大小方面具有重要影响，对小麦产量水平的提高具有非常重要的作用，且上述实验步骤易操作，重复性好，结果更加直观可靠，较之现有技术具有明显的进步。
附图说明
图1为实施例1中酶抑制剂处理后的和对照组的小麦籽粒表型图片，
其中A为对照籽粒，用去离子水处理；B为酶抑制剂处理后的籽粒，
图2为实施例1中酶抑制剂处理后的和对照组的单个小麦籽粒表型图片，
其中A为对照籽粒，用去离子水处理；B为酶抑制剂处理后的籽粒，
图3为实施例1中单粒重的统计分析柱状图，
图中Control为对照，Ale为阿伦磷酸，误差线代表三次独立重复的SD通过t检验进行的显著性差异分析(**p<0.01)；
图4为实施例1中每穗穗粒数的统计分析柱状图，
图5为实施例2中酶抑制剂处理后的和对照组的小麦籽粒表型图片，
其中A为对照籽粒，用去离子水处理；B为酶抑制剂处理后的籽粒，
图6为实施例2中酶抑制剂处理后的和对照组的单个小麦籽粒表型图片，
其中A为对照籽粒，用去离子水处理；B为酶抑制剂处理后的籽粒，
图7为实施例2中单粒重的统计分析柱状图，
图中Control为对照，Ale为阿伦磷酸，误差线代表三次独立重复的SD通过t检验进行的显著性差异分析(**p<0.01)；
图8为实施例2中每穗穗粒数的统计分析柱状图。
具体实施方式
实施例1
1.实验材料
小麦品种济麦22种植于山东省农科院作物所试验田，于10月份适时大区播种，畦宽1.5米，行距0.25米，南北走向播种，每亩播种小麦基本苗18万。按正常小麦田间管理，进行田间浇水、施肥。
2.标穗、整穗及滴注
2018年4月21日上午9点进行挂牌标穗。由于边行效应的原因，所有实验材料均从畦内种植的第二行选穗备用；
检测具体步骤如下：
(1)标穗：在大田正常种植的小麦抽穗后，从中选取穗下部小花与旗叶叶耳对齐，大小一致的穗子作为实验材料，进行挂牌；
(2)整穗：对符合标准的穗子，用镊子去除穗上部、穗下部和每排中部发育相对迟缓的小花；用剪刀沿着芒的基部，剪掉芒；每穗保留6排小花，每个处理需要整15穗以上备用；
(3)酶抑制剂阿伦磷酸的浓度及使用量：用于小麦小花滴注的阿伦磷酸使用浓度为25μmol/L，使用时必须用去离子水现用现配，置于冰盒中保存备用；使用量每朵小花滴注上述浓度的抑制剂或去离子水10μL；
(4)滴注：用手指沿剪掉芒的基部，将小花小心拨开露出雄蕊，利用移液器将10μL上述浓度的抑制剂注入其中，然后关闭小花；对照用相同量的去离子水，按照以上方法进行操作；全部小花滴注完毕，套上杂交袋以防溶液受热挥发，袋上需注明抑制剂或对照以及滴注时间相关信息；
(5)小麦生长：所有处理过的麦穗均在田间自然条件下生长发育至成熟；
(6)收获：待小麦成熟后，将每个处理穗收回，单独进行脱离、考种；
(7)数据统计：对每个处理的单穗，统计穗粒数、穗粒重、单粒重，并进行统计分析。
3.实验结果
对本年度获得的经过酶抑制剂处理的及对照小麦成熟穗，进行了脱粒、称重及统计分析。结果表明，抑制剂处理的平均穗粒数、穗粒重、单粒重分别为19.21粒、0.84g和0.0436g，而对照的平均穗粒数、穗粒重、单粒重分别为19.42粒、0.92g和0.0474g(如表1)。由此可见，经过酶抑制剂处理的麦穗，其籽粒与对照相比显著变小，导致单粒重和整个穗粒重显著降低(图1B、图2B、图3)，而穗粒数与对照相比虽然减少，但差异不明显(图4)。以上数据证明，通过小麦法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿伦磷酸抑制其催化活性，显著改变了小麦籽粒大小，进一步证明了小麦法呢基焦磷酸合酶基因在决定小麦籽粒大小方面具有重要影响，对小麦产量水平的提高具有非常重要的作用。
表1. 2018年酶抑制剂处理和对照麦穗的统计结果
实施例2
1.实验材料
于2018年度相同，小麦品种济麦22种植于山东省农科院作物所试验田，于10月份适时大区播种，畦宽1.5米，行距0.25米，南北走向播种，每亩播种小麦基本苗18万。按正常小麦田间管理，进行田间浇水、施肥。
2.标穗、整穗及滴注
2019年4月19日上午9点进行挂牌标穗。由于边行效应的原因，所有实验材料均从畦内种植的第二行选穗备用；
检测具体步骤如下：
(1)标穗：在大田正常种植的小麦抽穗后，从中选取穗下部小花与旗叶叶耳对齐，大小一致的穗子作为实验材料，进行挂牌；
(2)整穗：对符合标准的穗子，用镊子去除穗上部、穗下部和每排中部发育相对迟缓的小花；用剪刀沿着芒的基部，剪掉芒；每穗保留6排小花，每个处理需要整15穗以上备用；
(3)酶抑制剂阿伦磷酸的浓度及使用量：用于小麦小花滴注的阿伦磷酸使用浓度为25μmol/L，使用时必须用去离子水现用现配，置于冰盒中保存备用；使用量每朵小花滴注上述浓度的抑制剂或去离子水10μL；
(4)滴注：用手指沿剪掉芒的基部，将小花小心拨开露出雄蕊，利用移液器将10μL上述浓度的抑制剂注入其中，然后关闭小花；对照用相同量的去离子水，按照以上方法进行操作；全部小花滴注完毕，套上杂交袋以防溶液受热挥发，袋上需注明抑制剂或对照以及滴注时间相关信息；
(5)小麦生长：所有处理过的麦穗均在田间自然条件下生长发育至成熟；
(6)收获：待小麦成熟后，将每个处理穗收回，单独进行脱离、考种；
(7)数据统计：对每个处理的单穗，统计穗粒数、穗粒重、单粒重，并进行统计分析。
3.实验结果
对本年度获得的经过酶抑制剂处理的及对照小麦成熟穗，进行了脱粒、称重及统计分析。结果表明，抑制剂处理的平均穗粒数、穗粒重、单粒重分别为19.88粒、0.67g和0.0337g，而对照的平均穗粒数、穗粒重、单粒重分别为21.29粒、0.84g和0.0393g(如表2)。由此可见，于上年度的实验结果一致，即经过酶抑制剂处理的麦穗，其籽粒与对照相比显著变小，导致单粒重和整个穗粒重显著降低(图5B、图6B、图7)，而穗粒数与对照相比虽然减少，但差异不显著(图8)。以上数据再次证明，通过小麦法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿伦磷酸抑制其催化活性，显著改变了小麦籽粒的大小，进一步证明了小麦法呢基焦磷酸合酶基因在决定小麦籽粒大小方面具有重要影响，对小麦产量水平的提高具有非常重要的作用。
表2. 2019年度酶抑制剂处理及对照麦穗的统计结果
由上述两个实施例可以看出，经过两年的研究结果表明，小麦法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿伦磷酸对该酶的抑制效果非常突出，对籽粒大小的影响非常明显。本发明所提供的检测方法易操作，重复性好，结果更加直观可靠，较之现有技术具有明显的进步。

Claims (3)

1.一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)标穗：在大田正常种植的小麦抽穗后，从中选取穗下部小花与旗叶叶耳对齐，大小一致的穗子作为实验材料，进行挂牌；
(2)整穗：对符合标准的穗子，用镊子去除穗上部、穗下部和每排中部发育相对迟缓的小花；用剪刀沿着芒的基部，剪掉芒；每穗保留6排小花，每个处理需要整15穗以上备用；
(3)酶抑制剂阿伦磷酸的浓度及使用量：用于小麦小花滴注的阿伦磷酸使用浓度为25μmol/L，使用时必须用去离子水现用现配，置于冰盒中保存备用；使用量每朵小花滴注上述浓度的抑制剂或去离子水10μL；
(4)滴注：用手指沿剪掉芒的基部，将小花小心拨开露出雄蕊，利用移液器将10μL上述浓度的抑制剂注入其中，然后关闭小花；对照用相同量的去离子水，按照以上方法进行操作；全部小花滴注完毕，套上杂交袋以防溶液受热挥发，袋上需注明抑制剂或对照以及滴注时间相关信息；
(5)小麦生长：所有处理过的麦穗均在田间自然条件下生长发育至成熟；
(6)收获：待小麦成熟后，将每个处理穗收回，单独进行脱离、考种；
(7)数据统计：对每个处理的单穗，统计穗粒数、穗粒重、单粒重，并进行统计分析。
2.根据权利要求1所述的法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法，其特征在于：所述阿伦磷酸，其结构式如下：
3.一种法呢基焦磷酸合酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为阿伦磷酸，其结构式如下：
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