CN110470827B - 一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，属于新型纳米材料领域；本发明利用pH控制铁蛋白解离/重组的特性，首次采用三步法实现三(2‑苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3分子与纳米金Au NPs在铁蛋白表面的均一嵌合组装，制得一种以Ir(ppy)3为能量供体、以Au NPs为能量受体的具有共振能量转移特性的Ir(ppy)3‑铁蛋白‑Au三维杂化纳米结构；由于Ir(ppy)3的电致化学发光ECL激发光谱与Au NPs的紫外吸收光谱具有很好的光谱重叠，且二者在铁蛋白表面的距离小于10 nm，使得二者之间发生高效的电致化学发光‑共振能量转移ECL‑RET；本发明首次在铁蛋白表面建立了一种基于Ir(ppy)3与Au NPs之间共振能量转移的新研究模型，为ECL‑RET的理论研究提供了一种新的思路。

Description

一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法
技术领域
本发明属于新型纳米材料领域。
背景技术
电致化学发光是在化学发光基础上发展起来的一种新的传感技术，是化学发光与电化学技术相互渗透的产物，具有灵敏度高、背景噪声小、动态响应范围广、可控性强等优点。电致化学发光-共振能量转移（ECL-RET）是指当供体的 ECL 发射光谱与受体的吸收光谱发生有效光谱重叠时，电子激发能可通过偶极-偶极相互作用，以非辐射方式由供体传递给受体的过程。与荧光共振能量转移相比，ECL-RET 具有操作简单、背景信号干扰低、无需激发光源等优点。目前，ECL-RET已在核酸杂交分析、免疫分析测定、细胞分析检测等领域得到广泛应用。然而，ECL-RET体系的建立，离不开新型能量供/受体对的提出与应用；本发明首次提出了一种以三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3分子为能量供体，以纳米金Au NP为能量受体的新型ECL-RET能量供/受体对。
铁蛋白是动植物、微生物体内广泛存在的一类贮存铁的可溶性蛋白，其结构包括两部分：蛋白部分和铁核部分。铁蛋白具有pH引导的自解聚与自组装的优异特性，当pH值小于3或者大于10时，其蛋白质外壳会逐渐解离为游离的片段，然而当调节溶液pH恢复至7.5左右时，游离的外壳片段又可自组装成完整的蛋白质外壳；蛋白质外壳表面具有大量的氨基、羟基等官能团，能够通过金-氨键或静电吸附来连接适量的纳米金粒子与Ir(ppy)3分子，因此当将外接纳米金与Ir(ppy)3分子的铁蛋白片段混合均匀并调节其pH至7.5，即可得到一种外表面同时结合了能量供/受体的新型三维杂化纳米结构，该方法实现了ECL能量供、受体在铁蛋白表面的均一嵌合组装，不仅大大缩短供/受体的能量转移距离，更能显著了提高能量转移效率。由此可见，铁蛋白在此领域的深入研究与应用将会进一步推动ECL-RET分析的前进与发展。
发明内容
本发明的技术任务是为了弥补现有制备方法的不足，首次基于三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3与纳米金的共振能量转移原理，以铁蛋白为载体，在其表面设计合成了一种集能量供体、受体为一体的三维杂化纳米结构，大大缩短了能量供体与受体之间的距离，实现了单个铁蛋白表面共振能量的高效转移，具有明显的创造性，该方法操作简单、绿色环保无污染、省时省力，克服了传统制备方法复杂、耗时、易污染等弊端，在电致化学发光免疫分析领域有着巨大的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：将3 ~ 5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与0.5 ~ 2.5 mL、浓度为10mmol/L的三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3溶液混合，加入50 ~ 150 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，持续搅拌2 h后，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Ir(ppy)3溶液，置于4 °C下储存备用；
第二步：将3 ~ 5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与1.5 ~ 3.5 mL的纳米金AuNPs溶胶混合，加入50 ~ 150 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，避光搅拌6 h后，经过透析、纯化除去多余的Au NPs后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Au溶液，置于4 °C下储存备用；
第三步：将铁蛋白-Ir(ppy)3溶液与铁蛋白-Au溶液搅拌均匀，用0.1 mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至2.5 ~ 4.0，此时，铁蛋白的蛋白质外壳解离成单个的片段；继续搅拌3 h至均匀后，用0.1 mol/L的氨水溶液调节pH至7.0 ~ 8.0，此时，游离的铁蛋白外壳片段重新组装成完整的铁蛋白外壳，嵌合在外壳片段表面的Ir(ppy)3与纳米金均匀地组装在单个铁蛋白外表面，经过透析、纯化后，得到Ir(ppy)3-铁蛋白-Au的三维杂化纳米结构。
2. 如权利要求1所述一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，其特征在于，所述纳米金溶胶按照以下步骤制备：
量取4.12 ~ 6.12 mL 1%的HAuCl4溶液和100 mL超纯水加到洁净干燥的250 mL的三口圆底烧瓶中；在不断搅拌下，向其中滴缓慢加入10 ~ 30 mL的柠檬酸钠溶液，加热回流15 ~ 45 min，等到溶液颜色最终变为酒红色后停止加热；经过冷却和过滤，最终得到滤液，储存在4 °C下备用。
本发明的有益成果
（1）本发明利用pH引导的蛋白解聚/重组法，基于Ir(ppy)3与纳米金的共振能量转移原理，首次在铁蛋白外壳上嵌合组装了三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3分子与纳米金AuNPs得到一种新型的三维杂化纳米结构，该结构以Ir(ppy)3为能量供体，以纳米金为ECL能量受体，是一种具有高效共振能量转移效率的纳米结构。
（2）本发明首次提出了一种操作简单、绿色环保的共振能量转移纳米结构的制备方法，解决了现有制备方法操作复杂、费时费力的问题，该方法对于电致化学发光ECL中共振能量转移的深度研究具有一定的指导意义，所制备的Ir(ppy)3-铁蛋白-Au在电致化学发光免疫传感分析中有着明显的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1. 一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：将3 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与0.5 mL、浓度为10 mmol/L的三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3溶液混合，加入50 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，持续搅拌2 h后，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Ir(ppy)3溶液，置于4 °C下储存备用；
第二步：将3 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与1.5 mL的纳米金Au NPs溶胶混合，加入50 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，避光搅拌6 h后，经过透析、纯化除去多余的Au NPs后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Au溶液，置于4 °C下储存备用；
第三步：将铁蛋白-Ir(ppy)3溶液与铁蛋白-Au溶液搅拌均匀，用0.1 mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至2.5，此时，铁蛋白的蛋白质外壳解离成单个的片段；继续搅拌3 h至均匀后，用0.1 mol/L的氨水溶液调节pH至7.0，此时，游离的铁蛋白外壳片段重新组装成完整的铁蛋白外壳，嵌合在外壳片段表面的Ir(ppy)3与纳米金可以均匀地组装在单个铁蛋白外表面，经过透析、纯化后，得到Ir(ppy)3-铁蛋白-Au的三维杂化纳米结构。
实施例2. 一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：将4 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与1.5 mL、浓度为10 mmol/L的三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3溶液混合，加入100 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，持续搅拌2 h后，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Ir(ppy)3溶液，置于4 °C下储存备用；
第二步：将4 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与2.5 mL的纳米金Au NPs溶胶混合，加入100 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，避光搅拌6 h后，经过透析、纯化除去多余的Au NPs后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Au溶液，置于4 °C下储存备用；
第三步：将铁蛋白-Ir(ppy)3溶液与铁蛋白-Au溶液搅拌均匀，用0.1 mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至3.5，此时，铁蛋白的蛋白质外壳解离成单个的片段；继续搅拌3 h至均匀后，用0.1 mol/L的氨水溶液调节pH至7.5，此时，游离的铁蛋白外壳片段重新组装成完整的铁蛋白外壳，嵌合在外壳片段表面的Ir(ppy)3与纳米金均匀地组装在单个铁蛋白外表面，经过透析、纯化后，得到Ir(ppy)3-铁蛋白-Au的三维杂化纳米结构。
实施例3. 一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：将5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与2.5 mL、浓度为10 mmol/L的三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3溶液混合，加入150 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，持续搅拌2 h后，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Ir(ppy)3溶液，置于4 °C下储存备用；
第二步：将5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与3.5 mL的纳米金Au NPs溶胶混合，加入150 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，避光搅拌6 h后，经过透析、纯化除去多余的Au NPs后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Au溶液，置于4 °C下储存备用；
第三步：将铁蛋白-Ir(ppy)3溶液与铁蛋白-Au溶液搅拌均匀，用0.1 mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至4.0，此时，铁蛋白的蛋白质外壳解离成单个的片段；继续搅拌3 h至均匀后，用0.1 mol/L的氨水溶液调节pH至8.0，此时，游离的铁蛋白外壳片段可重新组装成完整的铁蛋白外壳，嵌合在外壳片段表面的Ir(ppy)3与纳米金均匀地组装在单个铁蛋白外表面，经过透析、纯化后，得到Ir(ppy)3-铁蛋白-Au的三维杂化纳米结构。
实施例4.所述纳米金溶胶按照以下步骤制备：
量取4.12 mL 1%的HAuCl4溶液和100 mL超纯水加到洁净干燥的250 mL的三口圆底烧瓶中；在不断搅拌下，向其中滴缓慢加入10 mL的柠檬酸钠溶液，加热回流15 min，等到溶液颜色最终变为酒红色后停止加热；经过冷却和过滤，最终得到滤液，储存在4 °C下备用。
实施例5. 所述纳米金溶胶按照以下步骤制备：
量取5.12 mL 1%的HAuCl4溶液和100 mL超纯水加到洁净干燥的250 mL的三口圆底烧瓶中；在不断搅拌下，向其中滴缓慢加入20 mL的柠檬酸钠溶液，加热回流30 min，等到溶液颜色最终变为酒红色后停止加热；经过冷却和过滤，最终得到滤液，储存在4 °C下备用。
实施例6.所述纳米金溶胶按照以下步骤制备：
量取.12 mL 1%的HAuCl4溶液和100 mL超纯水加到洁净干燥的250 mL的三口圆底烧瓶中；在不断搅拌下，向其中滴缓慢加入30 mL的柠檬酸钠溶液，加热回流45 min，等到溶液颜色最终变为酒红色后停止加热；经过冷却和过滤，最终得到滤液，储存在4 °C下备用。

Claims (1)

1.一种基于铁蛋白的共振能量转移纳米结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：将3 ~ 5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与0.5 ~ 2.5 mL、浓度为10 mmol/L的三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3溶液混合，加入50 ~ 150 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，持续搅拌2 h后，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，离心后分散到1 mLpH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Ir(ppy)3溶液，置于4 °C下储存备用；
第二步：将3 ~ 5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与1.5 ~ 3.5 mL的纳米金Au NPs溶胶混合，加入50 ~ 150 μL、质量分数50%的戊二醛溶液作为交联剂，避光搅拌6 h后，经过透析、纯化除去多余的Au NPs后，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到铁蛋白-Au溶液，置于4 °C下储存备用；
第三步：将铁蛋白-Ir(ppy)3溶液与铁蛋白-Au溶液搅拌均匀，用0.1 mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至2.5 ~ 4.0，此时，铁蛋白的蛋白质外壳解离成单个的片段；继续搅拌3 h至均匀后，用0.1 mol/L的氨水溶液调节pH至7.0 ~ 8.0，此时，游离的铁蛋白外壳片段重新组装成完整的铁蛋白外壳，嵌合在外壳片段表面的Ir(ppy)3与纳米金均匀地组装在单个铁蛋白外表面，经过透析、纯化后，得到Ir(ppy)3-铁蛋白-Au的三维杂化纳米结构。
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